CN101225398A - 由原核细胞制备活性t-PA的技术 - Google Patents

Abstract

本发明为一种高表达含多个二硫键的非糖大分子蛋白质或糖基对其功能无重要影响的蛋白质的原核细胞表达系统。更具体的是用于表达有生物活性的突变型人纤维蛋白溶酶元激活剂(mt－PA)的原核细胞表达系统，其主要特征为：1)突变型人纤维蛋白溶酶元激活剂表达序列(mt－PA)；2)构建由阿拉佰糖(arabinose)操纵子P_BAD启动子和其调控基因araC组成的表达调控元件的、含有细菌OmpA分泌信号肽的原核表达载体及其表达mt－PA的表达质粒；3)构建同分异构酶DsbC或无信号肽DsbC的表达质粒；4)表达质粒mt－PA和DsbC或无信号肽DsbC的表达质粒共转化trxB/gov突变的感受态宿主菌，构建成高水平表达、有生物活性的分泌型人mt－PA工程菌。

Description

由原核细胞制备活性t-PA的技术

技术领域

本发明涉及人组织型纤维蛋白酶元激活物(t-PA，下同)表达结构的构建及其在工程化改造的原核细胞内的高效表达。其产物具有生物活性，可用于血栓性疾病的治疗。  所在的技术领域与生命医药和生物技术有关。

背景技术

人t-PA在人体内的凝血和溶血系统中起着十分重要的生理作用。t-PA由527个氨基酸编码组成，在蛋白结构上有18个二硫链，其形成的构形与蛋白生理功能有极为重要的作用。在蛋白质结构上，人t-PA由五个不同的功能区构成，它们分别是(1).环状手指功能区；(2).生长因子功能区；(3).和(4).两个相似功能的区域，Kringle 1和Kringle2，此功能性区可特异性结合于纤维蛋白凝块；(5).丝氨酸蛋白酶，负责激活纤溶酶元，使其转化为纤溶酶，降解纤维蛋白，溶解血栓。

由于t-PA具有上述溶血栓的重要生理功能，在临床上可用于治疗急性心肌梗塞、脑血栓形成、肺梗塞和其他血栓性疾病。因此世界各国科学家对其进行了广泛深入的研究和开发，包括功能结构上的改构和各种表达系统方面的(Cleary S，et al，Biochem.1989，28(4)：1884-91；Jarvis DL，et al，Mol Cell Biol 1989，9(1)：214-23；Anne M.F.et al，Biotech.And Applied Biochem.1988，10，454-464；Canion J.Refino，et al，Thrombosis and Haemostasis，1993，70(2)313-39；Kenichi F.et al.Circulation 1997，95(3)：715-722)以达到增强其溶栓功能和延长血液半衰期或达到低成本生产之目的。

以前在原核细胞表达系统中对人t-PA的大多数研究证明原核细胞可以表达人t-PA，但最主要的问题是原核细胞表达的人t-PA在胞浆内形成包涵体，且不具有生物活性，因此，需要耗时、复杂繁琐的复性工艺。研究还发现其主要原因是表达的人t-PA蛋白质在细胞浆内不能形成正确的蛋白质空间构形。

随着分子、细胞生物学研究技术的发展，复杂大分子蛋白质在原核细胞表达系统表达的研究有重大突破，使人t-PA在原核细胞内进行商业化生产成为可能。如前所述，由于人t-PA结构上有18个二硫键，由此形成的蛋白空间构形对人t-PA的生物活性起着决定性的作用。细胞中蛋白质二硫键的形成是一个十分复杂的过程，是细胞内多种与二硫化物氧化还原作用有关的酶类相互作用有关，即细胞中与二硫键形成有关的DsbA、DsbB、DsbD和DsbC，都是细菌周质Dsb家族中的成员，直接或间接参与二硫键的形成，其中尤以DsbC的作用最强。研究表明DsbC是一种二硫键同分异构酶，是二硫键同分异构作用的良好催化剂。

DsbC的氧化还原状态与细胞正确地拼装多个二硫键的蛋白质的能力紧密有关。在正常状态下，细菌周质处于氧化态，野生型DsbC蛋白质活性区在细菌周质处于还原态时才具有催化活性(Arne R.et al.J.Baterio.1997，179(21)：6602-6608)，故二硫键很容易在周质形成，不会在还原态的细菌胞内形成。而细菌胞内还原态是硫氧还蛋白还原酶(trsB)/谷胱甘肽还原酶(gov)基因控制的。一旦这二种基因发生突变，将使细菌胞内还原态转变为氧化态，这将大大有利于无信号肽DsbC催化二硫键在氧化态的细菌胞内形成，提高含多个二硫键蛋白质的转录和合成。

在正常状态下，当原核细胞表达一种含多个二硫键的复杂蛋白质时，原核细胞本身催化二硫键形成的相关酶功能不足，不能使表达的复杂大分子蛋白质形成正确构形，故不能合成有生物活性的t-PA。这是表达蛋白不具有生物活性的主要原因。然而，通过将克隆的DsbC基因转入表达原核宿主菌进行表达，将显著增强其催化功能，使复杂蛋白的多二硫键得以形成而具有生物活性。

此外，在原核细胞内表达外源蛋白质需要一种在原核细胞内可驱动编码外源蛋白质的DNA分子转录的原核细胞表达载体。这种载体不但需要有一种强启子，而且还要能紧密控制这种强启子驱动的调控元件。研究证实含有由阿拉佰糖arabinose操纵子的P_BAD启动子和其调控基因araC组成的表达调控元件的表达载体符合上述要求。调控基因araC是一个正负调控因子，控制着P_BAD启动子的转录开启功能，其转录开启功能和转录强弱能力取决于诱导剂阿拉佰糖arabinose是否存在和使用量的多少(luz M.G.et al.J Bacterio.1995，177(14)：4121-4130)。

同样，为了便于表达活性蛋白的分离纯化，研究人员也一直试图通过一种转膜信号多肽和目的基因的触合，达到能将表达目的基因产物蛋白质分泌到培养液之目的。目前研究应用的转膜信号多肽有PelB、LamB、MalE、PhoA和OmpA等(J.Pratap.et al.Mol.Gen.Genet(1998)258：-333)，但各忡转膜信号多肽和目的基因产物蛋白的分离率不一，可能与使用的表达宿主细菌不同有关。

人t-PA是一种具有显著治疗效果和巨大市场应用前景的重组药物。目前在临床上应用的人t-PA，包括其突变体，都是经由真核细胞CHO系统生产的，故不能避免遇到生产的人源重组T-PA产品虽有生物活性，但产量较低，产品成本高昂的瓶颈。价格昂贵，非一般病人所能承受。因此采用新的途径开发出成本更低、半衷期更长、溶栓功能更强的新一代人源重组T-PA产品药物，在我国将具有广阔的市场前景，并将产生良好的社会效益和巨大的经济效益。

发明内容

本发明的目的是构建一种融合有跨膜信号肽的突变型人组识型纤溶酶原激活剂(mt-PA，下同)的、由阿拉佰糖arabinose操纵子的P_BAD启动子和其调控基因araC组成的表达调控元件的表达质粒，并通过mt-PA表达质粒与DsbC表达质粒共转化(texB)/(gov)基因突变的宿主菌，形成高表达、可分泌的、具有生物活性人mt-PA的工程菌，因而能成为一种可进行人mt-PA产生化生产的原核细胞表达系统。

为达成本发明的目的，提供了以下几个方面的发明内容：

本发明的第一方面，提供了一种突变型人t-PA分子结构，该分子结构中t-PA的野生型蛋白酶功能P区内与纤溶酶激活剂抑制因子-1结合的氨基酸296-299(Lys-His-Arg-Arg)突变为(Ala-Ala-Ala-Ala)，因而具有更强溶栓功能和较长半衰期。

本发明的第二方面，提供了一种含有信号肽OmpA的，由阿拉佰糖arabinose操纵子的P_BAD启动子驱动和其调控因子araC组成表达调控元件的原核细胞表达载体。因而，此表达载体具有紧密调控、高水平表达和分泌外源表达蛋白质的功能。

本发明的第三方面，提供了一种融合OmpA信号信与突变型mt-PA的表达结构，由阿拉佰糖arabinose操纵子的P_BAD启动子驱动和其调控因子araC基因组成调控元件的mt-PA表达质粒。

本发明的第四方面，提供了一种由启动子T7和LacZ调控的、表达同分异构酶DsbC基因的表达质粒。

在另一优选例中，提供了一种由启动子T7和LacZ调控的、表达无信号肽的同分异构酶DsbC的表达质粒。

本发明的第五方面，提供了一种由人mt-PA表达质粒和DsbC表达质粒或无信号肽DsbC表达质粒共转化texB/gov基因突变的原核表达宿主菌，构成表达人mt-PA的工程菌。

在另一优选例中，提供了一种人mt-PA表达质粒转化经DsbC表达质粒或无信号肽DsbC表达质粒预先转化的texB/gov基因突变的原核感受态表达宿主菌，构成表达人mt-PA的工程菌。

附图说明

图1：野生型人t-PA和突变型人t-PA的内切酶酶切图谱：用内切酶Xba1和Not1消化野生型人t-PA；用内切酶Nco1、Hind111和Not1消化突变型人t-PA，电泳分离。第一道为DNA分子量标准物；第二道和第三道分别为野生型和突变型人t-PA。

图2：为含有分泌信号肽OmpA和人mt-PA表达序列的、由阿拉佰糖arabinose操纵子的P_BAD启动子驱动和其调控因子araC基因组成调控元件的mt-PA表达质粒图谱。

图3：SDS-PAG E蛋白电泳的人mt-PA表达图谱：第一道为蛋白质分子量标准物；第二道、第三道、第四道和第五道分别为末诱导、1小时、2小时和3小时诱导的mt-PA和DsbC蛋白产物。箭头所指为表达蛋白质产物，在上的为mt-PA，在下的为DsbC。

图4：SDS-PAGE蛋白电泳的分泌至细胞培养液中的t-PA表达产物，箭头为表达产物.第一道为蛋白质分子量标准物；第二道为3小时诱导的mt-PA蛋白产物；第三道为1小时诱导的mt-PA蛋白产物。箭头所指为表达蛋白质产物。

图5：细胞培养液中的人mt-PA表达产物的生物活性检测。第一道和第二道分别为3小时诱导和1小时诱导的mt-PA蛋白产物。箭头所指白色条带为有生物活性表达蛋白质产物。

图6：细菌内表达人mt-PA的生物活性检测。第一道和第二道分别为1号和2号工程菌2小时诱导的mt-PA蛋白产物。箭头所指白色条带为有生物活性表达蛋白质产物。

具体实施方式

一、野生型人t-PA的突变：其方法是采用基因突变技术，使野生型人t-PA的野生型蛋白酶功能P区内与纤溶酶激活剂抑制因子-1结合的氨基酸296-299(Lys-His-Arg-Arg)突变为(Ala-Ala-Ala-Ala)。并在突变区形成新的核苷酸内切酶Not1位点。

1).以野生型人t-PA为模板，用人工合成的引物1和引物2，引物3和引物4分别进行PCR扩增。

引物设计如下：

引物1：(27mer，并引入Nco1内切酶位点，字符框边)

5’-gcg

gagc cagatcttac caag-3’

引物2：(34mer，并引入Not1内切酶位点，字符框边)

5’-ccgctccgggcgat

ggcaaagat-3’

引物3：(34mer，并引入Not1内切酶位点，字符框边)

5’-ttgcc

tcgcccggagagcggtt-3’

引物4：(33mer，并引入Hind111内切酶位点，字符框边)

5’-gc

tcacggtcgcatgttgtcacgaatc-3’

PCR扩增产物分别经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体。转化细菌后，进行扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

将中含上述DNA片段的T-easy载体质粒DNA分别用Nco1和Not1，Not1和Hind111完全酶切消化，将Nco1-Not1和Not1-Hind111二个DNA片段，分离纯化后备用。

二、含有核糖体结合位点(-AGGAGG-)分泌信号肽OmpA的原核细胞表达载体pBAD33构建：

1).人工合成如下含有核糖体结合位点(-AGGAGG-)分泌信号肽OmpA DNA片段：(5’-3’，核糖体结合位点为浅黑色区；在其5’-末端引入Nhe1、在其3’-末端分别引入Nco1和Sac1内切酶位点，字符框边)

tttcc

aggaggaaa cgatgaaaaa gacagctatc gcgattgcag tggcactggc tggtttcgctaccgtag

ccggta

2).分别用Nhe1和Sac1内切酶消化分泌信号肽OmpA DNA片段和原核细胞表达载体pBAD33，经电泳分离纯化后，进行拼接，转化感受态细菌。然后筛选成功转化的菌株进行质粒DNA扩增，抽提纯化。最后用前述二种Nhe1和Sac1内切酶消化证实。

三、含融合分泌信号肽OmpA和mt-PA表达序列的原核表达质粒的构建：

1).用Nco1和Hind111内切酶消化含有分泌信号肽OmpA的原核细胞表达载体pBAD33，分离纯化；

2).将实施例一中对人t-PA进行PCR反应后，分离纯化备用的Nco1-Not 1的DNA片段和Not1-Hind111的DNA片段与分离纯化的Nco1-Hind111的原核细胞表达载体pBAD33片段进行拼接，并转化感受态细菌。然后进行扩增、抽提和纯化质粒DNA。最后用酶切图谱证实对pBAD33/mt-PA表达质粒构建。

四、含同分异构酶DsbC表达质粒的构建：

1).应用PCR法对DsbC基因进行改造。以DsbC基因为模板，用人工合成的引物进行PCR反应。

引物设计如下：

引物1：(24mer，在其5’-端引入Nde1内切酶位点，字符框边)

5’-cggata

atgaagaa aggt-3’

引物2：(25mer，在其5’-端引入Nde1内切酶位点，字符框边)

5’-gc

ttatttaccgctggtca-3’

PCR扩增产物分别经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体。转化细菌后，进行扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

应用Nde1和Hind111内切酶消化含有DsbC的T-easy质粒DNA，分离纯化DsbC酶切片段备用；

2).用Nde1和Hind111内切酶消化原核细胞表达质粒Pcal-n(源自stratagene公司)，分离纯化备用；

3).将1)和2)中的DsbC酶切片段和原核细胞表达质粒Pcal-n酶切片段进行拼接反应，并转化感受态细菌，进行扩增、抽提、纯化，最后用酶切图谱证实对Pcal-n/DsbC表达质粒构建。

五、含无信号肽同分异构酶DsbC表达质粒的构建：

1).应用PCR法对DsbC基因进行改造。以DsbC基因为模板，用人工合成的引物进行PCR反应。

引物设计如下：

引物1：(26mer，在其5’-端引入Nde1内切酶位点，字符框边)

5’-ta

ga tgacgcggca attcaa-3’

引物2：(25mer，在其5’-端引入Nde1内切酶位点，字符框边)

5’-gc

ttatttaccgctggtca-3’

PCR扩增产物分别经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体。转化细菌后，进行扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。

应用Nde1和Hind111内切酶消化含有DsbC的T-easy质粒DNA，分离纯化DsbC酶切片段备用；

2).用Nde1和Hind111内切酶消化原核细胞表达质粒Pcal-n(源自stratagene公司)，分离纯化备用；

3).将1)和2)中的DsbC酶切片段和原核细胞表达质粒Pcal-n酶切片段进行拼接反应，并转化感受态细菌，进行扩增、抽提、纯化，最后用酶切图谱证实对无信号肽Pcal-n/DsbC表达质粒构建。

六、构建高水平表达、有生物活性的分泌型人mt-PA工程菌：

应用本发明中构建pBAD33/mt-PA表达质粒和Pcal-n/DsbC表达质粒或无信号肽的Pcal-/DsbC表达质粒，按常规实验操作方法，共转化texB/gov基因突变的原核感受态表达宿主菌Origami(DE3)，筛选高表达、有生物活性的mt-PA菌株，确定表达人mt-PA的工程菌。

七、表达的人mt-PA的生物活性检测：

采用纤维素板法检测本发明中表达的mt-PA生物活性。具体操作如下：

首先，按0.1％(重量/体积)a-酪氨酸和每毫升含10微克的纤溶蛋白酶原的比例，共聚胶形成浓度为12％的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙酰胺胶；

其次，上样后，在温度摄氏4度，低电压电泳过夜。次日用2.5％的TritonX-100漂洗聚丙酰胺胶1小时，去除胶中的十二烷基硫酸钠(SDS)。然后，用大量的蒸馏水漂洗聚丙酰胺胶以去除Triton X-100；

再其次，将上述的聚丙酰胺胶用pH为8.3、浓度为0.1摩尔的甘氨酸缓冲液在摄氏37温度孵化5小时。最后用卡马氏亮兰对聚丙酰胺胶染色15分钟并进行脱色。

结果评估：有生物活性的人t-PA及其衍生物在胶中显示为一条亮白的条带。其强弱与t-PA及其衍生物的便用量和活性有关。

                                   序列表

Street：广州国际企业孵化器A区610房

City：广州

State：广东

Country：中国

PostalCode：510633

<110>LastName：王

<110>FirstName：尚武

Sequence

--------

<210>1

<211>Length：95

    SequenceName：OmpA信号肽

    SequenceDescription：

<212>Type：DNA

<213>OrganismName：细菌

<400>PreSequenceString：1

tttccgctag caggaggaaa cgatgaaaaa gacagctatc gcgattgcag tggcactggc    60

tggtttcgct accgtagcca tggccgagct cggta                               95

<210>2

<211>Length：23

    SequenceName：OmpA信号肽

    SequenceDescription：

<212>Type：PRT

<213>OrganismName：细菌

<400>PreSequenceString：5

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe

1               5                   10                  15

Ala Thr Val Ala Met Ala Glu Leu Gly

                20              24

<210>3

<211>Length：1609

    SequenceName：人源突变型纤溶酶原激活剂(mt-PA)

    SequenceDescription：

<212>Type：DNA

<213>OrganismName：人工序列

<400>PreSequenceString：3

gcgccatggg agccagatct taccaagtga tctgcagaga tgaaaaaacg cagatgatat     60

accagcaaca tcagtcatgg ctgcgccctg tgctcagaag caaccgggtg gaatattgct    120

ggtgcaacag tggcagggca cagtgccact cagtgcctgt caaaagttgc agcgagccaa    180

ggtgtttcaa cgggggcacc tgccagcagg ccctgtactt ctcagatttc gtgtgccagt    240

gccccgaagg atttgctggg aagtgctgtg aaatagatac cagggccacg tgctacgagg    300

accagggcat cagctacagg ggcacgtgga gcacagcgga gagtggcgcc gagtgcacca    360

actggaacag cagcgcgttg gcccagaagc cctacagcgg gcggaggcca gacgccatca    420

ggctgggcct ggggaaccac aactactgca gaaacccaga tcgagactca aagccctggt    480

gctacgtctt taaggcgggg aagtacagct cagagttctg cagcacccct gcctgctctg    540

agggaaacag tgactgctac tttgggaatg ggtcagccta ccgtggcacg cacagcctca    600

ccgagtcggg tgcctcctgc ctcccgtgga attccatgat cctgataggc aaggtttaca    660

cagcacagaa ccccagtgcc caggcactgg gcctgggcaa acataattac tgccggaatc    720

ctgatgggga tgccaagccc tggtgccacg tgctgaagaa ccgcaggctg acgtgggagt    780

actgtgatgt gccctcctgc tccacctgcg gcctgagaca gtacagccag cctcagtttc    840

gcatcaaagg agggctcttc gccgacatcg cctcccaccc ctggcaggct gccatctttg    900

ccgcggccgc tgcatcgccc ggagagcggt tcctgtgcgg gggcatactc atcagctcct    960

gctggattct ctctgccgcc cactgcttcc aggagaggtt tccgccccac cacctgacgg   1020

tgatcttggg cagaacatac cgggtggtcc ctggcgagga ggagcagaaa tttgaagtcg   1080

aaaaatacat tgtccataag gaattcgatg atgacactta cgacaatgac attgcgctgc   1140

tgcagctgaa atcggattcg tcccgctgtg cccaggagag cagcgtggtc cgcactgtgt   1200

gccttccccc ggcggacctg cagctgccgg actggacgga gtgtgagctc tccggctacg   1260

gcaagcatga ggccttgtct cctttctatt cggagcggct gaaggaggct catgtcagac   1320

tgtacccatc cagccgctgc acatcacaac atttacttaa cagaacagtc accgacaaca   1380

tgctgtgtgc tggagacact cggagcggcg ggccccaggc aaacttgcac gacgcctgcc   1440

agggcgattc gggaggcccc ctggtgtgtc tgaacgatgg ccgcatgact ttggtgggca   1500

tcatcagctg gggcctgggc tgtggacaga aggatgtccc gggtgtgtac accaaggtta   1560

ccaactacct agactggatt cgtgacaaca tgcgaccgtg aaagcttgc               1609

<210>4

<211>Length：531

    SequenceName：人源突变型纤溶酶原激活剂(mt-PA)

    SequenceDescription：

<212>Type：PRT

<213>OrganismName：人工序列

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Met Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr

1               5                   10                  15

Gln Met Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu

                20                  25                  30

Arg Ser Asn Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala

                35                  40                  45

Gln Cys His Ser Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys

                50                  55                  60

Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe

                65                  70                  75

Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile

                80                  85                  90

Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg

                95                  100                 105

Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp

                110                 115                 120

Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro

                125                 130                 135

Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn

                140                 145                 150

Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly

                155                 160                 165

Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly

                170                 175                 180

Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr

                185                 190                 195

His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser

                200                 205                 210

Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala

                215                 220                 225

Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp

                230                 235                 240

Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu

                245                 250                 255

Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu

                260                 265                 270

Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe

                275                 280                 285

Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Ala

                290                 295                 300

Ala Ala Ala Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu

                305                 310                 315

Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu

                320                 325                 330

Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr

                320                 320                 345

Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys

                350                 355                 360

Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp

                365                 370                 375

Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln

                380                 385                 390

Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu

                395                 400                 405

Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys

                410                 415                 420

His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala

                425                 430                 435

His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu

                440                 445                 450

Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr

                455                 460                 465

Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly

                470                 475                 480

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr

                485                 490                 495

Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp

                500                 505                 510

Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile

                515                 520                 525

Arg Asp Asn Met Arg Pro

                    531

<210>5

<211>Length：728

     SequenceName：DsbC

     SequenceDescription ：

<212>Type：DNA

<213>OrganismName：细菌

<400>PreSequenceString：5

cggcatatga agaaaggttt tatgttgttt actttgttag cggcgttttc aggctttgct     60

caggctgatg acgcggcaat tcaacaaacg ttagccaaaa tgggcatcaa aagcagcgat    120

attcagcccg cgcctgtagc tggcatgaag acagttctga ctaacagcgg cgtgttgtac    180

atcaccgatg atggtaaaca tatcattcag gggccaatgt atgacgttag tggcacggct    240

ccggtcaatg tcaccaataa gatgctgtta aagcagttga atgcgcttga aaaagagatg    300

atcgtttata aagcgccgca ggaaaaacac gtcatcaccg tgtttactga tattacctgt    360

ggttactgcc acaaactgca tgagcaaatg gcagactaca acgcgctggg gatcaccgtg    420

cgttatcttg ctttcccgcg ccaggggctg gacagcgatg cagagaaaga aatgaaagct    480

atctggtgtg cgaaagataa aaacaaagcg tttgatgatg tgatggcagg taaaagcgtc    540

gcaccagcca gttgcgacgt ggatattgcc gaccattacg cacttggcgt ccagcttggc    600

gttagcggta ctccggcagt tgtgctgagc aatggcacac ttgttccggg ttaccagccg    660

aaagagatga aagaattcct cgacgaacac caaaaaatga ccagcggtaa ataaaagctt    720

gc                                                                   722

<210>6

<211>Length：235

     SequenceName：DsbC

     SequenceDescription：

<212>Type：PRT

<213>OrganismName：细菌

<400>PreSequenceString：6

Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser

1               5                   10                  15

Gly Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala

                20                  25                  30

Lys Met Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala

                35                  40                  45

Gly Met Lys Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr

                50                  55                  60

Asp Asp Gly Lys His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser

                65                  70                  75

Gly Thr Ala Pro Val Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln

                80                  85                  90

Leu Asn Ala Leu Glu Lys Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln

                95                  100                 105

Glu Lys His Val Ile Thr Val Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr

                110                 115                 120

Cys His Lys Leu His Glu Gln Met Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly

                125                 130                 135

Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Gln Gly Leu Asp Ser

                140                 145                 150

Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp Cys Ala Lys Asp Lys

                155                 160                 165

Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys Ser Val Ala Pro

                170                 175                 180

Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala Leu Gly Val

                185                 190                 195

Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser Asn Gly

                200                 205                 210

Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Met Lys Glu Phe Leu

                215                 220                 225

Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys

                230                 235

<210>7

<211>Length：656

     SequenceName：无信号肽DsbC

     SequenceDescription：

<212>Type：DNA

<213>OrganismName：人工序列

<400>PreSequenceString：7

tacatatgga tgacgcggca attcaacaaa cgttagccaa aatgggcatc aaaagcagcg     60

atattcagcc cgcgcctgta gctggcatga agacagttct gactaacagc ggcgtgttgt    120

acatcaccga tgatggtaaa catatcattc aggggccaat gtatgacgtt agtggcacgg    180

ctccggtcaa tgtcaccaat aagatgctgt taaagcagtt gaatgcgctt gaaaaagaga    240

tgatcgttta taaagcgccg caggaaaaac acgtcatcac cgtgtttact gatattacct    300

gtggttactg ccacaaactg catgagcaaa tggcagacta caacgcgctg gggatcaccg    360

tgcgttatct tgctttcccg cgccaggggc tggacagcga tgcagagaaa gaaatgaaag    420

ctatctggtg tgcgaaagat aaaaacaaag cgtttgatga tgtgatggca ggtaaaagcg    480

tcgcaccagc cagttgcgac gtggatattg ccgaccatta cgcacttggc gtccagcttg    540

gcgttagcgg tactccggca gttgtgctgagcaatggcac acttgttccg ggttaccagc     600

cgaaagagat gaaagaattc ctcgacgaac accaaaaaat gaccagcggt aaataa    656

<210>8

<211>Length：216

     SequenceName：无信号肽DsbC

     SequenceDescription：

<212>Type：PRT

<213>OrganismName：人工序列

<400>PreSequenceString：8

Met Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met Gly Ile

1               5                   10                  15

Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys Thr

                20                  25                  30

Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys

                35                  40                  45

His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro

                50                  55                  60

Val Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu

                65                  70                  75

Glu Lys Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val

                80                  85                  90

Ile Thr Val Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu

                95                  100                 105

His Glu Gln Met Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg

                110                 115                 120

Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys

                125                 130                 135

Glu Met Lys Ala Ile Trp Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe

                140                 145                 150

Asp Asp Val Met Ala Gly Lys Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp

                155                 160                 165

Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala Leu Gly Val Gln Leu Gly Val

                170                 175                 180

Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser Asn Gly Thr Leu Val Pro

                185                 190                 195

Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Met Lys Glu Phe Leu Asp Glu His Gln

                200                 205                 210

Lys Met Thr Ser Gly Lys

                215

Claims (6)

1.一种由原核细菌跨膜信号肽OmpA融合mt-PA的表达序列，由阿拉佰糖(arabinose)操纵子P_BAD启动子和其调控基因araC组成表达调控元件的表达质粒。

其主要特征为：

a).人组织型纤维蛋白溶酶元激活物(t-PA)的分子中与纤维蛋白溶酶元激活物抑制因子1(PAI-1，下同)结合区域中位于P区氨基酸296-299 lys-His-Arg-Arg突变成Ala-Ala-Ala-Ala，并在突变区形成新的Not1内切酶位点的突变型人mt-PA(下同)，其他氨基酸及其排序与野生型t-PA一致；

b).人mt-PA的N-末端以Nco1酶切点连接于原核表达载体pBAD33分泌信号肽OmpA的C-末端，分泌信号肽OmpA的N-末端含有核糖体结合位点的核苷酸序列-AGGAGG-；分泌信号肽OmpA由24个氨基酸组成；

c).本发明所用的原核表达载体pBAD33为新构成的含有核糖体结合位点(-AGGAGG-)分泌信号肽OmpA的原核细胞表达载体pBAD33。此分泌信号肽OmpA分别以N-端的Hhe1和C-端的Sac1连接于原型表达载体，成为由阿拉佰操纵子的P_BAD启动子驱动、具有紧密调控和高水平表达的一种分泌型原核细胞表达载体。

2.一种含有同分异构酶DsbC或无信号肽DsbC的、由T7启动子和LacZ组成表达调控元件的原核细胞表达质粒构建。

其主要特征在于：

a).原核细胞表达质粒的骨架是以pcal-n表达载体为基础的，此载体经Nde1和Hind111消化后，切除了钙调素结合区片段(Calmodelin-binding unit)；

b).细菌同分异构酶DsbC或无信号肽DsbC是以Nde1和Hind111酶切片段重组于前述的pcal-n，形成由T7启动子和LacZ组成表达调控元件的原核细胞表达质粒pcal-Dsbc。

3.一种同分异构酶DsbC或无信号肽DsbC原核细胞表达质粒转化的感受态宿主箘Origami(DE3)。

其主要特征在于：

a).该宿主菌的硫氧还蛋白还原酶(trsB)/谷胱甘肽还原酶(gov)基因已经突变，其胞浆还原态转变为有利于二硫键形成的氧化态；

b).此宿主菌是为同分异构酶DsbC或无信号肽DsbC原核细胞表达质粒所转化的表达宿主菌；

c).这些转化的细菌表达同分异构酶DsbC或无信号肽DsbC蛋白质；

d).上述这些转化的细菌也能被表达人mt-pa的表达质粒所转化；

e).此宿主菌也能用于其他多二硫键的复杂大分子蛋白质的表达。

本权利要求不仅限于描叙的宿主箘Origami(DE3)，也包括其他的表达宿主菌，如BL21、BL21plus，BL21(DE3)plysS、Origami(DE3)、Origami B(DE3)和Origami(DE3)plsS。

4.一种高表达分泌性人mt-PA的工程菌。

其主要特征在于：

a).此工程菌由本发明的权利要求第1、第2和第3项所述的表达质粒和原核细胞感受态表达宿主菌共同构成的一个的系统工程菌；

b).此工程菌分泌高表达、有生物活性的人mt-PA蛋白到培养液。

5.权利要求4所述工程菌表达蛋白对治疗急性心肌梗塞、脑血栓形成和肺梗塞等相关疾病的制剂中的用途。

6.除本发明所述mt-PA外，包含mt-PA的突变体K2S(由Kringle2和丝氨酸蛋白酶，p区组成)及其变构衍生物、尿激酶及其变构衍生物和其他有药用价值的基因在本发明权利要求第2和第3项所述的表达质粒和原核细胞宿主菌共同构成的一个的表达DsbC或无信号肽DsbC感受态原核表达菌中的应用。

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