CN104988127A - 在大肠杆菌中表达胶原酶的dna分子、重组胶原酶的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达胶原酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E分泌的一种胶原酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)与核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。本发明提供含有上述胶原酶基因在大肠杆菌中的表达菌。本发明提供一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在宿主菌中导入所述的大肠杆菌重组表达载体得到的大肠杆菌菌株。本发明提供一种纯化所述重组胶原酶的方法及在降解鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白方面的应用。本发明的重组胶原酶，能够高效降解天然的Ⅰ型胶原蛋白纤维，效果显著，可应用于农副产品中胶原蛋白的开发利用、水产品胶原蛋白的加工与利用、医疗以及食品工业生产中胶原酶的应用。

Description

在大肠杆菌中表达胶原酶的DNA分子、重组胶原酶的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种胶原酶的DNA分子，及其在大肠杆菌中的表达、纯化重组胶原酶的方法及胶原酶在降解胶原蛋白方面的应用。

背景技术

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。根据胶原酶的来源可分为动物胶原酶与微生物胶原酶。

其中，微生物胶原酶以底物范围广、酶切位点多、生产成本低等优点被广泛应用。目前已发现的可产生胶原酶的微生物主要分布于芽孢杆菌属，其中典型的类型有：梭状芽孢杆菌(Clostridiumhistolycum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。但是由于这些微生物胶原酶是从微生物上清中提取的,成分复杂,有时可能还含有其它毒素,并且产量较低,因此,目前在应用中还存在不少问题。通过基因工程的手段大量生产微生物胶原酶可以克服这个问题。

目前，高纯度微生物胶原酶的生产制备工艺已成为国内外研究的热点，我国在微生物胶原酶的应用还处于刚起步阶段，由于高纯度胶原酶的提取工艺复杂，生产成本高，国内市场依赖大量高价进口胶原酶产品，限制了微生物胶原酶的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种表达胶原酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。

本发明的第一个目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E(保藏编号为：CGMCC NO.8614)分泌的一种胶原酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)与核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)。

本发明的第二个目的在于提供含有上述胶原酶基因在大肠杆菌中的表达 菌。

本发明的第三个目的在于提供一种纯化重组胶原酶的方法。

本发明的第四个目的在于提供上述胶原酶在降解胶原蛋白方面的应用。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种胶原酶蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种可编码胶原酶基因的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载体，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a质粒载体的多克隆位点插入所述的DNA分子得到的重组质粒。

所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间插入所述DNA分子得到的重组质粒。

一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在宿主菌中导入所述的大肠杆菌重组表达载体得到的大肠杆菌菌株，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株；所述大肠杆菌重组菌是将上述DNA分子通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到的大肠杆菌重组菌，该大肠杆菌重组菌命名为ColB-RZ1，保藏编号为CGMCC No.10684。

一种纯化所述重组胶原酶的方法，按照下述步骤进行：

(1)培养上述所得到的大肠杆菌重组菌ColB-RZ1，直至OD_600nm为0.6-0.8之间,向培养液中加入最终浓度为0.1mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在22℃条件下振荡诱导培养16h；

(2)室温下收集大肠杆菌菌体，用超声破碎的方法将菌体破碎，将破碎后的裂解液离心，离心后对含有可溶性重组胶原酶的上清组分过滤除菌，得到无菌上清重组胶原酶液；

(3)将步骤(2)中所述的无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)，挂柱条件为：①用5倍柱体积超纯水以1mL/min的流速洗柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)；②5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速过柱；③以0.1mL/min的流速将10倍柱体积无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)；④用5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱 (cOmpleteHis-TagPurification Column)；⑤用缓冲液2洗涤蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)，监测蛋白的洗脱情况，并收集洗脱下来的蛋白既得重组胶原酶；其中，缓冲液1的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及20mmol/L咪唑；缓冲液2的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及250mmol/L咪唑。

一种所述重组胶原酶在降解鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白方面的应用，具体步骤如下：

(1)将纯化所得的重组胶原酶按照1:40的体积比与草鱼鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白混合，在37℃水浴条件下反应；

(2)在步骤(1)中所述的反应分别进行至0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min时，终止反应，对反应产物做SDS-PAGE电泳分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的由基因工程菌株生产胶原酶的工艺具有易操作、产量大等特点，有利于胶原酶制剂应用于工业生产中。

2、本发明的重组胶原酶，能够高效降解天然的Ⅰ型胶原蛋白纤维，效果显著，可应用于农副产品中胶原蛋白的开发利用、水产品胶原蛋白的加工与利用、医疗以及食品工业生产中胶原酶的应用，例如：细胞培养时去除细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、降解富含胶原的肉食品(如牛肉)中过多的胶原进而使肉制品鲜嫩可口、临床治疗一些胶原沉积性疾病如:烧伤、手术后过度增殖性瘢痕的降解、腰椎间盘突出症等等。

3、本发明的重组胶原酶经检测其活力高于目前市场上广泛应用的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶8.65倍，表明本发明的重组胶原酶具有极强的实际应用价值，对于解决国内胶原酶长期依赖国外产品的困境有显著的应用前景与战略意义。

附图说明

图1所示为本发明蜡样芽孢杆菌R75E菌株胶原酶基因的PCR扩增结果，图中：M为DNA标准；1为胶原酶基因扩增片段；

图2所示为本发明构建的pET28a/Collagenase重组质粒经BamH Ⅰ与Xho Ⅰ 两个限制性内切酶双酶切后产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，

图中：M为DNA标准；1为双酶切后的产物；其中分子量大的条带是pET28a质粒载体片段，分子量小的条带是胶原酶基因片段；

图3为本发明构建的pET28a/Collagenase重组质粒的图谱；pET28a/Collagenase重组质粒的分子大小共为8230bp，将长度为2895bp(不含终止子密码子)的编码胶原酶的DNA分子片段插入pET28a质粒载体(全长5335bp)中的BamHⅠ与XhoⅠ两个酶切位点之间；

图4所示为IPTG诱导前后大肠杆菌中重组胶原酶表达情况的SDS-PAGE电泳分析结果，

图中：M为蛋白标准；1为IPTG诱导前的重组菌体蛋白；2为IPTG诱导后的重组菌体蛋白；3为IPTG诱导后的重组菌体经破碎、离心后的沉淀组分中的蛋白；4为IPTG诱导后的重组菌体经破碎、离心后的上清组分中的蛋白；

图5所示为胶原酶重组蛋白经亲和层析纯化后产物的SDS-PAGE电泳检测结果；图中：M为蛋白标准；1-7为缓冲液2洗脱下来的重组胶原酶蛋白；

图6所示为重组胶原酶对鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白降解产物的SDS-PAGE电泳检测结果；图中：M为蛋白标准；1-8分别为5μL浓度为62.14μg/mL的重组胶原酶与200μL浓度1mg/mL的草鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白在37℃条件下反应0min，10min，20min，30min，40min，50min，60min，120min后的反应产物。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实验材料： 

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)R75E保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，邮政编码为100101，保藏日期为2013年12月20日，保藏编号为CGMCC No.8614。本发明涉及的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E(CGMCC NO.8614)分泌的一种胶原酶已申请专利(申请公布号为CN 104017761 A)。

pET28a表达载体购自Novagen公司；感受态大肠杆菌Trans10、感受态大肠杆菌BL21(DE3)、T4DNA连接酶均购自Promega公司；限制性内切酶BamHI、 XhoI、细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA快速回收试剂盒均购自Takara公司；KOD DNA聚合酶购自TOYOBO公司；His-Tag蛋白纯化预装柱购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；卡那霉素、氯化钠、咪唑等无机化学试剂均购自AMRESCO公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；牛跟腱来源的I型胶原蛋白、梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶均购自SIGMA-ALDRICH公司。

LB液体培养基的组成成分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水用水定容至1L，于121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min后冷却待用。

实施例1工程菌ColB-RZ1的构建

(1)pET28a-Collagenase重组质粒的构建

以在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.8614的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)R75E的基因组DNA为模板，基因组DNA按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明方法进行提取。根据SEQ ID NO:2所示的胶原酶基因序列设计如SEQ ID NO:3所示的上游引物P1和SEQ ID NO:4所示的下游引物P2。以如下表1所示的反应体系及条件进行PCR反应。

表1.扩增蜡样芽孢杆菌胶原酶基因的PCR反应体系

加样顺序	名称	体积(μL)
			1	10×PCR缓冲	5
2	上游引物P1(10mM)	1
			3	下游引物P2(10mM)	1
4	MgSO4(25mM)	2.4
			5	KOD DNA聚合酶	0.5
6	菌株R75E的基因组DNA	1(50ng)
			7	dNTP(2mM)	5
8	水	34.1

 扩增反应条件为：

PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶电泳的浓度为1％，电泳条件为110V，40min。电泳结果如图1所示：在分子量约为3000bp的DNA标准附近可清晰的观察到扩增出了一段DNA片段，分子量与目标的collagenase基因片段2907bp(两端分别含有一个限制性酶切位点，不含终止子密码子)接近，表明成功扩增出了Collagenase基因。利用琼脂糖凝胶DNA快速回收试剂盒将目标基因片段从凝胶中回收纯化，随后将回收的目的片段以及pET28a质粒表达载体分别用BamHI和XhoI两种限制性内切酶按照表2与表3所示的酶切反应体系进行双酶切。

表2 目标Collagenase基因片段的双酶切反应体系

加样顺序	反应物	体积(μL)
			1	水	0
2	10×酶切缓冲液K	3
			3	Collagenase基因片段	25(1200ng)
4	BamH I	1
			5	Xho I	1

表3. pET28a表达载体的双酶切反应体系

在37℃水浴条件下，双酶切12小时后进琼脂糖凝胶电泳(凝胶中琼脂糖浓度为1％，电泳条件为110V，40min)，利用琼脂糖凝胶DNA快速回收试剂盒割胶回收并纯化双酶切产物。随后，按照表4所述的连接体系将目标Collagenase基因片段与pET28a表达载体进行连接：

表4 目标Collagenase基因片段与pET28a表达载体的连接体系

加样顺序	反应物	体积(μL)
			1	酶切Collagenase基因片段	7.5
2	酶切后的pET28a载体	1
			3	10×连接酶缓冲液	1
4	T4DNA连接酶	0.5

连接反应于22℃水浴条件下充分连接12小时。将所得连接体系通过化学转化法转化至感受态大肠杆菌Trans10中，将转化产物在含有34μg/ml卡那霉素的LB平板上于37℃下培养16h，随机挑取4个单菌落接种于5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜，提取质粒后用BamHI和XhoI双酶切后利用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(凝胶中琼脂糖浓度为1％，电泳条件为110V，40min)，鉴定结果如图2所示：在泳道1中由上至下可依次是分子量为5335bp的线性化pET28a载体片段，以及分子量为2907bp的两端含有限制性酶切位点但不含终止子密码子的目标Collagenase基因片段。随后将该重组质粒送往英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。经测序，本实施例所得的重组质粒(质粒图谱如图3所示)中的Collagenase基因片段序列正确，可用于重组胶原酶蛋白，将该质粒命名为pET28a/Collagenase。

(2)pET28a/Collagenase重组质粒的转化与保存

将本实施例步骤(1)中得到的pET28a/Collagenase重组质粒通过化学转化法转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化产物在含有34ug/ml卡那霉素的LB平板上于37℃下培养16h，筛选得到的阳性克隆即为表达重组胶原酶的大 肠杆菌工程菌株ColB-RZ1。在含有34μg/ml卡那霉素的LB平板上挑取菌株ColB-RZ1接种至两管5mL LB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150r/min，培养12h。培养结束后于1.5mL无菌离心管分别加入0.8mL菌液和0.2mL浓度为80％(V/V)的无菌甘油溶液，混合均匀后可长期保存于-80℃冰箱中。

上述菌株ColB-RZ1于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC NO.10684。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁文分类命名为：Escherichia coli。

实施例2重组胶原酶的诱导、表达与纯化

(1)重组胶原酶的诱导表达及检测

将实施例1中成功构建的菌株ColB-RZ1培养后挑取单克隆至5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min条件下培养12h。将所得培养物接种至1L含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养2.5-3h，至菌株ColB-RZ1的OD600值为0.6-0.8时向培养液中加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L。在22℃、150r/min条件下振荡诱导培养16h。

将1L经IPTG诱导培养后的ColB-RZ1菌株培养液于12000rpm/min、4℃条件下离心30min收集菌体，弃去上清，随后用50ml缓冲液1重悬菌体沉淀。其中，缓冲液1的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含500mmol/L NaCl、1mmol/L PMSF及20mmol/L咪唑。将重悬后的菌液在0℃冰水浴中用超声波破碎，400W功率间歇破碎90次，每超声3s，间隔7s。将超声波破碎后的菌液于12000rpm/min、4℃条件下离心30min，收集上清液,将上清液用0.45μm膜过滤后所得的滤液于4℃条件下保存。对诱导前、诱导后的大肠杆菌菌液、诱导后菌体经超声破碎得到的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳检测(分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，电泳条件为110V，90min)。电泳结果如图4所示：将泳道1与2对照后可知重组胶原酶在0.1mmol/L IPTG的诱导下成功表达；由泳道3、4结果可以确定破碎得到的大肠杆菌上清中含有大量的重组胶原酶。

(2)重组胶原酶的纯化

启动AKTA蛋白纯化系统，首先用超纯水洗蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)，再将5倍柱体积的缓冲液1以1 mL/min的流速过柱平衡纯化柱。随后以0.1mL/min的流速将10mL步骤(1)中得到的破碎上清液加入到蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)。完成后，用5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱(cOmpleteHis-TagPurification Column)。洗涤完成后用缓冲液2洗脱蛋白并利用紫外检测仪在280nm下监测蛋白的洗脱情况，并收集洗脱下来的蛋白。缓冲液2的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及250mmol/L咪唑。对洗脱得到的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测(分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，电泳条件为110V，90min)，结果如图5所示：泳道1-7所示的为洗脱样品，根据图中结果可知洗脱产物中含有分子量约为114kDa的目标蛋白，经凝胶成像系统Protein Simple FC3分析可知1-7号中目标蛋白占总蛋白的比例均高于90％，其中2号洗脱样品中的目标蛋白占总蛋白的比例达到98.5％。最终，通过Bradford法(Bradford,M.,M.,Anal.Biochem.,72(1976)248-254.)以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，测得2号洗脱样品中的蛋白浓度为62.14μg/mL。综上，通过本实施例的上述步骤成功得到了高纯度的重组胶原酶。

实施例3重组胶原酶的活性分析

(1)重组胶原酶的比活力测定

采用通用的Mandl胶原酶活力测定方法(Mandl,I.,Maclennan,J.,D.,Howes,E.,L.,J.Clin.Invest.,12(1953)1323-1329.)测定重组胶原酶的比活力。该方法中将1个活力单位(U)的定义为：每毫升的胶原酶与牛跟腱来源的Ⅰ型胶原蛋白在37℃、pH值为7.4的反应条件下反应，在5小时内每生成1μmoL游离氨基酸即对应1个活力单位(1U)。胶原酶比活力由每毫升胶原酶的酶活力单位总数(U)与每毫升胶原酶蛋白质量(mg)的比值(U/mg)表示。活力测定的具体步骤为：

a、L-甘氨酸标准曲线的绘制

①用缓冲液3(50mmoL/L Tris-HCl，pH值为7.4，内含0.36mmoL/L CaCl₂)配制浓度分别为0μmoL/mL、0.2μmoL/mL、0.4μmoL/mL、0.6μmoL/mL、0.8μmoL/mL、1.0μmoL/mL、1.2μmoL/mL的L-甘氨酸标准溶液；

②分别取200μL上述不同浓度的L-甘氨酸标准溶液，依次加入200μL 乙酸钠-乙酸缓冲(乙酸钠浓度为2moL/L,pH5.4)及加入400μL 2％(W/V)茚三酮溶液(内含7.1mmoL/L SnCl₂)；

③沸水浴加热5min后迅速置于冰水中冷却，于570nm处测其吸光度；

④以吸光度值为Y轴纵坐标(单位为1)，L-甘氨酸浓度为X轴横坐标(单位为mmoL/L),绘制游离氨基酸标准曲线(曲线方程为Y＝1.1221X，R²＝0.999)

b、将由缓冲液3(50mmoL/L Tris-HCl，pH值为7.4，内含0.36mmoL/L CaCl₂)配制的牛跟腱来源的Ⅰ型胶原蛋白溶液在37℃恒温水浴中预热5min；

c、按下表5所示的程序操作：

表5 重组胶原酶的活力测定体系

d、计算

根据步骤a中所得的游离氨基酸标准曲线(曲线方程为Y＝1.1221X，R²＝0.999)及步骤c中操作9所测得对照组及反应组于570nm处测得的吸光度 值得出相应的游离氨基酸浓度(反应组数值在计算时取平均值，误差不超过3％)，根据如下公式F1计算胶原酶的比活力：

E＝(D×0.2/0.005)/P     …………………(F1)

式中：E为胶原酶的比活力，单位为：U/mg；

D为反应组游离氨基酸浓度(单位为μmoL/L)与对照组游离氨基酸浓度(单位为μmoL/L)的差值；

0.2指胶原酶与胶原蛋白反应终止后的体积即：5μL酶液+95μL Ⅰ型胶原蛋白溶液+100μL HCl溶液，共计0.2mL；

0.005指反应体系中胶原酶的体积0.005mL；

P为胶原酶蛋白的浓度(单位为mg/mL)。

综上，测得实施例2中步骤(2)所纯化得到的重组胶原酶的酶活力数据如下表6所示：

表6 重组胶原酶的酶活力参数

蛋白浓度(mg/mL)	0.06214
		酶活力单位数(U/mL)	67.44
比活力值(U/mg)	1085.37

(2)重组胶原酶与商品化的微生物胶原酶的活力比较

目前，商业应用最广泛、研究起步的最早的是梭状芽孢杆菌(Clostridiumhistolycum)所产的Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，货号：c0130)。商业化的微生物胶原酶被应用于细胞培养时去除细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)、降解富含胶原的肉食品(如牛肉)中过多的胶原进而使肉制品鲜嫩可口等等。而且临床也广泛应用微生物胶原酶治疗一些胶原沉积性疾病如:烧伤、手术后过度增殖性瘢痕的降解、腰椎间盘突出症等等，都取得了非常好的疗效。

本发明对商品化的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，货号：c0130)，按照本实施例步骤(1)所述的方法测得商品化的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶的比活力值为125.00U/mg，此结果也与其产品说明书所示数据相符。因此，本发明所得到的重组胶原酶较梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶的比活力高8.68倍，表明，本发明中大肠杆菌重组表达的胶原酶具有比商品化 Ⅰ型胶原酶更高的比活力，具有很高的市场应用价值。

(2)重组胶原酶对鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的降解

使用实施例2步骤(2)中制备的重组胶原酶与草鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白进行降解反应，降解反应在1.5mL离心管中进行，反应体系为：5μL实施例2中步骤(2)制备的重组胶原酶+200μL由50mmol/L、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制的浓度为1mg/mL草鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白。反应在37℃水浴条件下进行120min，分别在反应进行0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min时加入40μLSDS上样缓冲液，在100℃下加热10min后进行SDS-PAGE凝胶电泳(分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％，电泳条件为110V，90min)。其中，SDS上样缓冲液为：250mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)，内含0.5％(V/V)溴酚兰，50％(V/V)甘油，10％(W/V)十二烷基硫酸钠，5％(V/V)β-巯基乙醇。

重组胶原酶对草鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白降解情况如图6所示，泳道1为反应0min时的对照，在该泳道中可以清晰的观察到两条重叠在一起的α1链(分子量为126kDa)与一条α2链(分子量为116kDa)以及一条高分子量的β链，结果与江南大学周鹏教授报道的Ⅰ型胶原蛋白的电泳特性相符(Liu，D.,Liang,L.,Regenstein,J.,M.,Zhou,P.,Food Chem.,133(2012)1441-1448.)；泳道2-8分别为重组胶原酶与草鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白反应10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min后的产物，结果表明随着反应时间的增加，Ⅰ型胶原蛋白的α1链、α2链、β链逐渐减少，而小分子水解肽的比例逐渐增加，反应进行至120min时Ⅰ型胶原蛋白中的α1链、α2链、β链完全消失，进而表明本发明所得的重组胶原酶可以将天然构象的Ⅰ型胶原蛋白完全降解。

综上，本发明采用基因工程表达的方法生产高活性的胶原酶，比活力达到1085U/mg,对Ⅰ型胶原蛋白的降解作用显著。通过纯化可获得纯度达95％以上的目标蛋白重组胶原酶产物，该重组胶原酶的纯化步骤简易可行，为蜡样芽孢杆菌胶原酶的的推广使用提供方法。

Claims (7)

1.一种胶原酶蛋白质分子，其特征是，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种可编码胶原酶基因的DNA分子，其特征是，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.一种含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载体，其特征是，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a质粒载体的多克隆位点插入所述的DNA分子得到的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的含有所述可编码胶原酶基因的DNA分子的大肠杆菌重组表达载体，其特征是，所述大肠杆菌重组表达载体为在pET28a载体的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间插入所述DNA分子得到的重组质粒。

5.一种含有表达所述DNA分子的重组大肠杆菌，其特征是，所述重组大肠杆菌是在宿主菌中导入权利要求3或4所述的大肠杆菌重组表达载体得到的大肠杆菌菌株，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株；所述重组大肠杆菌是将权利要求2所述的DNA分子通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌命名为ColB-RZ1，保藏编号为CGMCCNo.10684。

6.一种纯化重组胶原酶的方法，其特征是，按照下述步骤进行：

(1)培养上述权利要求5得到的的重组大肠杆菌，直至OD_600nm为0.6-0.8之间,向培养液中加入最终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,在22℃条件下振荡诱导培养16h；

(2)室温下收集大肠杆菌菌体，用超声破碎的方法将菌体破碎，将破碎后的裂解液离心，离心后对含有可溶性重组胶原酶的上清组分过滤除菌，得到无菌上清重组胶原酶液；

(3)将步骤(2)中所述的无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱，挂柱条件为：①用5倍柱体积超纯水以1mL/min的流速洗柱；②5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速过柱；③以0.1mL/min的流速将10mL柱体积无菌上清重组胶原酶液加入蛋白纯化柱；④用5倍柱体积的缓冲液1以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱；⑤用缓冲液2洗涤蛋白纯化柱，监测蛋白的洗脱情况，并收集洗脱下来的蛋白既得重组胶原酶；其中，缓冲液1的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及20mmol/L咪唑；缓冲液2的组成为：20mmol/L PBS,pH值为7.4,内含1mmol/L PMSF及250mmol/L咪唑。

7.一种重组胶原酶在降解鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白方面的应用，其特征是，具体步骤如下：

(1)将权利要求6纯化所得的重组胶原酶按照1:40的体积比与草鱼鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白混合，在37℃水浴条件下反应；

(2)在步骤(1)中所述的反应分别进行至0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min时，终止反应，对反应产物做SDS-PAGE电泳分析。