CN115397992A

CN115397992A - 胶原蛋白酶剂及其用途

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Publication number: CN115397992A
Application number: CN202180025486.2A
Authority: CN
Inventors: 扫部正浩; 结城健介; 谷内宽之
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2022-11-25
Also published as: EP4130277A4; JPWO2021200955A1; US20230114818A1; WO2021200955A1; EP4130277A1

Abstract

本发明的课题在于提供对食品或医疗用途有用的安全性高的胶原蛋白酶及其用途。提供一种以由与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分的酶剂。该酶剂对胶原蛋白三肽的制造、食用肉的嫩化有用。

Description

胶原蛋白酶剂及其用途

技术领域

本发明涉及以胶原蛋白酶为有效成分的酶剂(胶原蛋白酶剂)及其用途。

背景技术

已知为功能性肽的胶原蛋白肽的全球市场预计会增长。胶原蛋白肽中，作为胶原蛋白的最小单位的三肽Gly-X-Y(胶原蛋白三肽。以下，有时简称为“CTP”)在体内的吸收性高，另外具有各种功能性，因此认为其利用价值高。

为了高效地制造CTP，能够在胶原蛋白或明胶的Gly残基位置特异性切断且分解至三肽的蛋白酶(胶原蛋白酶)是有用的。作为胶原蛋白酶的例子，已知有来自梭菌(Clostridium)属、弧菌(Vibrio)属的胶原蛋白酶、蜡样芽孢杆菌胶原蛋白酶(属于微生物胶原蛋白酶 (EC.3.4.24.3))，但胶原蛋白酶产生菌为生物安全等级2(BSL2)，对其安全性存在担忧，因此可以说不适于制造食品用途、医疗用途等所使用的CTP。

作为可利用于食品用途的胶原蛋白酶，已知有来自链霉菌 (Streptomyces)属的胶原蛋白酶(专利文献1)，但并不清楚是否可利用于制造CTP。另外，现有的胶原蛋白酶通常稳定性差。作为被认为稳定性优异且比活性也高的来自微生物的胶原蛋白酶，已知有来自霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)的胶原蛋白酶(专利文献2中的来自弧菌属(Vibrio sp)1706B菌株的胶原蛋白酶)(专利文献2、专利文献3)。但是，来自霍利斯弧菌(Vibriohollisae)的胶原蛋白酶的热稳定性为30℃以下，在实用上并不充分。

另外，已知存在性质不同的各种胶原蛋白酶。例如，来自溶组织梭状芽胞杆菌属的胶原蛋白酶已知有2种不同的胶原蛋白酶类型(I、II)，胶原蛋白酶I与胶原蛋白酶II相比对胶原蛋白和明胶具有高活性且对短链肽具有低活性(专利文献4)。进而，已知来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原蛋白酶从胶原蛋白样序列中切出CTP的降解率低(专利文献5)。

适于由胶原蛋白制造食品用途中能够使用的CTP的胶原蛋白酶要求胶原蛋白酶产生菌为安全菌、具有胶原蛋白降低能力或明胶降低能力、以及具有CTP生成能力，另外，优选还要求稳定性高，但尚未已知有满足这样的条件并实用化的胶原蛋白酶。

另一方面，适于食用肉嫩化用途的胶原蛋白酶要求胶原蛋白酶产生菌为安全菌、胶原蛋白特异性(不作用于日瘦肉)，另外，优选还要求稳定性高。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特公平5－16832号公报

专利文献2：日本特开平8－70853号公报

专利文献3：日本特开2010－263880号公报

专利文献4：日本特表2001－510331号公报

专利文献5：日本特开2018－183106号公报

发明内容

在上述背景下，本发明的课题在于提供对CTP的制造等食品或医疗用途有用的安全性高的蛋白酶(胶原蛋白酶)及其用途等。

本发明人等为了获得CTP生成能力高、而且安全性高的胶原蛋白酶，对来自微生物的酶进行了广泛筛选。其结果判明纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)的特定菌株产生与目的相一致的胶原蛋白酶。该胶原蛋白酶表现出胶原蛋白酶降解能力、明胶降解能力和CTP 生成能力，而且，可以期待特异性地作用于胶原蛋白、明胶，产业上的利用价值高。另一方面，进一步研究的结果，成功地鉴定并获得了编码该胶原蛋白酶的基因，并且明确了该胶原蛋白酶的特性。需要注意的是显示热稳定性高、即便在碱性区域也具有较稳定的活性这样的作为包含碳酸氢钠等碱性pH调节剂的嫩肉剂所优选的特性。

[1]一种酶剂，以由与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分。

[2]根据[1]所述的酶剂，其中，胶原蛋白酶来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)。

[3]根据[1]或[2]所述的酶剂，用于制造胶原蛋白三肽。

[4]根据[1]或[2]所述的酶剂，用于嫩化食用肉。

[5]一种胶原蛋白三肽的制造方法，其特征在于，使[3]所述的酶剂作用于胶原蛋白或明胶。

[6]一种食用肉的嫩化方法，其特征在于，使[4]所述的酶剂作用于食用肉。

[7]一种胶原蛋白酶，由与序列号1的氨基酸序列具有99％以上的同源性的氨基酸序列构成。

[8]一种基因，编码[7]所述的胶原蛋白酶。

[9]根据[8]所述的基因，由序列号3或4的碱基序列构成。

附图说明

图1表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) 57413株的胶原蛋白酶的氨基酸序列。框里表示预测信号序列。下划线表示前序列((pro sequence))。

图2表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) 57413株的胶原蛋白酶的最适温度。

图3表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) 57413株的胶原蛋白酶的温度稳定性。

图4表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) 57413株的胶原蛋白酶的最适pH。

图5表示来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) 57413株的胶原蛋白酶的pH稳定性。

图6表示胶原蛋白酶的低温反应性。

图7表示确认作为胶原蛋白三肽的Gly-Glu-Arg的生成能力的结果。

图8表示确认作为胶原蛋白三肽的Gly-Pro-Hyp的生成能力的结果。

图9表示确认作为胶原蛋白三肽的Gly-Pro-Ala的生成能力的结果。

图10表示测定猪五花肉的嫩化效果的结果。

图11表示测定牛肩颈肉的嫩化效果的结果。

具体实施方式

1.胶原蛋白酶剂及其有效成分(胶原蛋白酶)

本发明的第1方面涉及一种酶剂(胶原蛋白酶剂)。本发明的酶剂 (以下，也称为“本酶剂”)含有胶原蛋白酶(以下，也称为“本酶”) 作为有效成分。本发明的酶剂对胶原蛋白三肽的制造、肉的嫩化等有用 (详细情况进行后述)。有效成分的胶原蛋白酶、即本酶由序列号1所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列等效的氨基酸序列构成。这里的“等效的氨基酸序列”是指与基准的氨基酸序列(序列号1的氨基酸序列)一部分不同，但该不同不会对蛋白质的功能(这里为胶原蛋白降解能力) 造成实质影响的氨基酸序列。因此，具有等效的氨基酸序列的酶催化胶原蛋白的降低反应。活性的程度只要能够发挥作为胶原蛋白酶的功能，就没有特别限定。其中，优选与由作为基准的氨基酸序列构成的酶(具有序列号1的氨基酸序列)为相同程度或比其高。

序列号1的氨基酸序列为来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)的胶原蛋白酶的氨基酸序列(成熟体)。应予说明，将还具有信号肽和前序列的来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)的胶原蛋白酶的氨基酸序列示于序列号2。

“氨基酸序列的一部分不同”例如通过构成氨基酸序列的氨基酸中的1个或多个氨基酸的缺失、取代，对氨基酸序列附加、插入1个或多个氨基酸，或者它们的任意组合而产生。氨基酸序列的一部分不同只要保持胶原蛋白降解活性就可被允许(活性可以有稍许变动)。只要满足该条件，氨基酸序列不同的位置就没有特别限定。另外，氨基酸序列的不同可以在多个位置(地方)产生。

造成氨基酸序列的一部分不同的氨基酸的个数为相当于构成氨基酸序列的总氨基酸的例如约小于10％的个数，优选为相当于约小于8％的个数，更优选为相当于约6％的个数，进一步优选为相当于约小于4％的个数，更进一步优选为相当于约小于2％的个数，最优选为相当于约小于1％的个数。因此，等效蛋白质与基准的氨基酸序列具有例如约90％以上、优选约92％以上、更优选约94％以上、进一步优选约96％以上、更进一步优选约98％以上、最优选约99％以上的同源性。

“氨基酸序列的一部分不同”的典型例之一通过构成氨基酸序列的氨基酸中的1～40个(优选为1～30个，更优选为1～10个，进一步优选为1～7个，更进一步优选为1～5个，进一步优选为1～3个)的氨基酸的缺失、取代、对氨基酸序列附加、插入1～40个(优选为1～30个，更优选为1～10个，进一步优选为1～7个，更进一步优选为1～5 个，进一步优选为1～3个)的氨基酸、或者它们的组合而使氨基酸序列产生变异(变化)。

优选通过使对胶原蛋白降解能力非必需的氨基酸残基产生保守氨基酸取代而得到等效的氨基酸序列。这里的“保守氨基酸取代”是指将某个氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而分类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链 (例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这样的几个家族。保守氨基酸取代优选为相同家族内的氨基酸残基间的取代。

然而，二个氨基酸序列的同源性(％)例如可以按照以下步骤来确定。首先，以能够进行最佳比较的方式对二个序列进行排列(例如，可以在第一序列导入空位(Gap)来优化与第二序列的比对)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基)与第二序列中的对应位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。二个序列的同源性是这二个序列共用的相同位置的数量的函数(即，同源性(％)＝相同位置的数量/位置的总数×100)，优选将优化比对所需的空位的个数和尺寸也纳入考虑。

二个序列的比较和同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为可用于序列的比较的数学算法的具体例，有Karlin和Altschul(1990)Proc. Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68中记载并在Karlin和Altschul(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于此。这样的算法已被编入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10 中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)中。为了得到与基准的氨基酸序列等效的氨基酸序列，例如，可以利用XBLAST程序以 score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等(1997)Amino Acids Research 25(17):3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST和Gapped BLAST的情况下，可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST) 的默认参数。详细而言，请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。作为可用于序列的比较的其它数学算法的例子，有Myers和Miller(1988) Comput Appl Biosci.4:11-17中记载的算法。这样的算法例如已被编入GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中可利用的ALIGN程序。在氨基酸序列的比较中利用ALIGN程序时，例如，可以使用PAM120权重残基表，使空位长罚分＝12，空位罚分＝ 4。

可以使用GCG软件包的GAP程序，利用Blossom 62矩阵或 PAM250矩阵，使空位权重＝12、10、8、6或4，空位长权重＝2、3或4 来确定二个氨基酸序列的同源性。

作为本酶剂的有效成分的胶原蛋白酶、即本酶可以为更大的蛋白质 (例如融合蛋白质)的一部分。作为融合蛋白质中附加的序列，例如，可举出多重组氨酸残基这样的有助于纯化的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。

本酶可以通过培养产生该胶原蛋白酶的微生物(胶原蛋白酶产生菌株)、例如纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)而得到。胶原蛋白酶产生菌株可以为野生株，也可以为变异株(例如通过照射紫外线而得到变异株)。胶原蛋白酶产生菌株的具体例为纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)IFO 3528(NBRC 15717)。纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)IFO 3528(NBRC15717)为保存于 NBRC(独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术中心)的菌株，可以通过经过规定手续而收到其分售品。

本酶可以通过产生本酶的微生物的培养液和/或菌体来制备。培养条件、培养法只要可生产本酶，就没有特别限定。即，可以将可生产本酶作为条件，适当地设定适于培养所使用的微生物的方法、培养条件。作为培养法，可以为液体培养、固体培养中的任一种，优选利用液体培养。以液体培养为例对其培养条件进行说明。

作为培养基，只要是所使用的微生物能够生长的培养基，就没有特别限定。例如，可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，进一步添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或者明胶、蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麸皮、肉提取物等氮源，进一步添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进所使用的微生物的生长，可以添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调节至约3～ 8、优选约4～7左右，培养温度通常为约20～40℃，优选为约25～35℃左右，在需氧的条件下培养1～20天、优选3～10天左右。作为培养法，例如可以利用振荡培养法、利用发酵罐进行的需氧深层培养法。

按照以上条件进行培养后，从培养液或菌体中回收目标酶。从培养液中回收时，例如可以通过将培养上清液进行过滤、离心处理等而除去不溶物后，适当地组合基于超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种色谱法等进行分离、纯化而得到本酶。另一方面，从菌体内回收时，例如可以通过将菌体利用加压处理、超声波处理等破碎后，与上述同样地进行分离、纯化而得到本酶。应予说明，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。

本酶也可以利用基因工程学方法而容易地制备。例如可以通过由编码本酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)，回收转化体内表达的蛋白质而制备。将回收的蛋白质根据目的适当地进行纯化。只要如此以重组蛋白质的形式得到目标酶，就可以进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入相同的载体，并使用该载体进行重组蛋白质的生产，则能够得到由连接有任意的肽或蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。另外，也可以实施糖链和/或脂质的附加、或者产生N末端或C末端的处理这样的修饰。通过如上所述的修饰，能够实现重组蛋白质的提取、纯化的简化或生物学功能的附加等。

通常，如上所述利用适当的宿主－载体系统进行基因的表达～表达产物(本酶)的回收，但也可以利用无细胞合成系统。这里，“无细胞合成系统(无细胞转录系统、无细胞转录/翻译系统)”是指不使用活细胞，而是使用来自活细胞的(或者利用基因工程学方法得到的)核糖体、转录·翻译因子等，由作为模板的核酸(DNA、mRNA)在体外合成其所编码的mRNA、蛋白质。无细胞合成系统中一般使用将细胞破碎液根据需要纯化而得到的细胞提取液。细胞提取液一般包含蛋白质合成所需的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等各种酶。进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能源、磷酸肌酸等、蛋白质的合成所需的其它物质。当然，在蛋白质合成时，也可以根据需要补充另行准备的核糖体、各种因子和/或各种酶等。

还报告了重建蛋白质合成所需的各分子(因素)的转录/翻译系统的开发(Shimizu,Y.et al.:Nature Biotech.,19,751-755,2001)。该合成系统中，将由构成细菌的蛋白质合成系统的3种起始因子、3种伸长因子、参与终止的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨基酰基tRNA 合成酶和甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶构成的31种因子的基因由大肠杆菌基因组扩增，使用它们在体外重建蛋白质合成系统。本发明中也可以利用这样重建的合成系统。

术语“无细胞转录/翻译系统”可以与无细胞蛋白质合成系统、体外翻译系统或体外转录/翻译系统交换使用。体外翻译系统中使用RNA 作为模板来合成蛋白质。可使用总RNA、mRNA、体外转录产物等作为模板RNA。其它体外转录/翻译系统中可使用DNA作为模板。模板 DNA应包含核糖体结合区域，优选还包含适当的终止子序列。应予说明，在体外转录/翻译系统中，设定添加各反应所需的因子以使转录反应和翻译反应连续进行的条件。

也可以将如上所述得到的纯化酶通过例如冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等制成粉末而提供。此时，可以预先将纯化酶预先溶解于乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、GOOD的缓冲液。优选可以使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，这里，作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。

酶的纯化度没有特别限定，例如可以纯化至Pz-肽降解活性为2～20 (U/g)的状态。另外，最终的形态可以液体状，也可以为固体状(包括粉体状)。

根据本发明人等的研究，由序列号1的氨基酸序列构成的来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)的胶原蛋白酶的各性质如下确定(详细参照后述的实施例)。因此，也可以根据以下的酶化学性质来确定本酶。应予说明，评价各酶化学的性质时的胶原蛋白酶活性的测定条件、测定步骤等的详细内容示于后述的实施例。

(1)作用

本酶为胶原蛋白酶，作用于胶原蛋白、明胶而生成胶原蛋白三肽。

(2)最适温度

本酶的最适温度为40℃。

(3)温度稳定性

本酶即便在Tris-盐酸缓冲液中、在pH7的条件下、在40℃以下 (0℃～40℃)的条件下处理30分钟，实质的活性也没有降低。

(4)最适pH

本酶的最适pH约为7。对于最适pH，例如，在pH4～6的pH区域基于在乙酸缓冲液中测定的结果进行判断，在pH6～7的pH区域基于在 PIPES缓冲液中测定的结果进行判断，在pH7～9的pH区域基于在Tris- 盐酸缓冲液(Tris-HCl)中测定的结果进行判断。

(5)pH稳定性

本酶在pH5～9.5的pH区域表现出稳定的活性。例如，如果供于处理的酶溶液的pH在该范围内，则30℃、30分钟的处理后显示最大活性的85％以上的活性。对于pH稳定性，例如，在pH4～6的pH区域基于在乙酸缓冲液中测定的结果进行判断，在pH6～7的pH区域基于在 PIPES缓冲液中测定的结果进行判断，在pH7～9的pH区域基于在Tris- 盐酸缓冲液(Tris-HCl)中测定的结果进行判断，在pH9～11的pH区域基于在甘氨酸缓冲液中测定的结果进行判断。

(6)低温反应性

将本酶的反应温度40℃下的酶活性设为100％时，本酶的反应温度 30℃下的相对活性为40％以上，本酶的反应温度20℃下的相对活性为 10％以上。

通过使本酶作用于胶原蛋白或明胶，能够得到N末端具有Gly(甘氨酸)的Gly-Glu-Arg、Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Ala-Hyp等 (Pro：脯氨酸，Hyp：羟脯氨酸，Ala：丙氨酸)的胶原蛋白三肽Gly-X- Y(CTP)。本酶的特征在于，在作用于胶原蛋白或明胶时，作为功能性肽的Gly-Glu-Arg的生成量特别高。

本酶剂中的有效成分(本酶)的含量没有特别限定，例如，可以以每1g本酶剂的Pz-肽降解活性为1U～500U、优选为10U～300U的方式设定或调整有效成分的含量。本发明的酶剂通常以固体状(例如，将该酶固定化于能够在颗粒、粉体、二氧化硅、多孔聚合物等的表面或内部固定酶的原材料而得的固定化酶)或液体状提供。本酶剂除了有效成分(本酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D- 甘露糖醇、麦芽糊精、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

2.基因

本发明的第2方面提供一种与本酶相关的核酸。即，提供编码本酶的基因、能够作为用于鉴定编码本酶的核酸的探针使用核酸、能够作为用于使本酶的核酸扩增或突变等的引物使用的核酸。一个方式中，本发明的基因由编码序列号1的氨基酸序列的DNA构成。该方式的具体例为由序列号3所示的碱基序列构成的DNA和由序列号4所示的碱基序列构成的DNA。前者的DNA(序列号3)仅编码成熟体的氨基酸序列(序列号1)，后者的DNA(序列号4)除了编码成熟体(序列号1的氨基酸序列)以外，还编码信号肽和前序列。

编码本酶的基因典型地用于制备本酶。根据使用编码本酶的基因的基因工程学制备法，能够得到更均质状态的本酶。另外，该方法可以说是在制备大量的本酶的情况下也优选的方法。应予说明，编码本酶的基因的用途不限于本酶的制备。例如，也可以利用该核酸作为以阐明本酶的作用机制等为目的的实验用工具、或者用于设计或制作本酶的变异体(变体)的工具。

本说明书中“编码本酶的基因”是指在使其表达的情况下可得到本酶的核酸，自然包括与本酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，还包括对这样的核酸附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，还考虑密码子的简并性。

本发明的核酸可以参考本说明书或附加的序列表所公开的序列信息，使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法、化学合成、PCR法(例如重叠PCR)或它们的组合而制备成分离的状态。

本发明的其它方式中，提供在与编码本酶的基因的碱基序列进行比较时，虽然与其所编码的蛋白质的功能等同，但一部分中碱基序列不同的核酸(以下，也称为“等效核酸”。另外，也将规定等效核酸的碱基序列称为“等效碱基序列”)。作为等效核酸的例子，可以举出由以编码本发明的本酶的核酸的碱基序列为基准包含1个或多个碱基的取代、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列构成且编码对本酶具有特征性的酶活性(即胶原蛋白酶活性)的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位产生。这里的“多个”也根据该核酸所编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40个碱基，优选为 2～20个碱基，更优选为2～10个碱基。等效核酸与作为基准的碱基序列 (序列号3或序列号4)具有例如90％以上、优选92％以上、更优选 94％以上、进一步优选96％以上、更进一步优选约98％以上、最优选 99％以上的同源性。

如上所述的等效核酸例如可以通过利用限制性内切酶处理、利用外切核酸酶、DNA连接酶等的处理、基于定位突变导入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、随机突变导入法(MolecularCloning,Third Edition,Chapter 13,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)导入变异等而得到。另外，也可以利用紫外线照射等其它方法而得到等效核酸。

本发明的其它方式涉及一种具与编码本发明的本酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的又一方式提供相对于编码本发明的本酶的基因的碱基序列或与其互补碱基序列具有至少约90％、92％、 94％、96％、98％或99％相同的碱基序列的核酸。

本发明的再一方式涉及一种具有在严格的条件下对编码本发明的本酶的基因的碱基序列或与其等效碱基序列的互补的碱基序列进行杂交的碱基序列的核酸。这里的“严格的条件”是指形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。这样的严格的条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照Molecular Cloning(Molecular Cloning(Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)、Currentprotocols in molecular biology(Frederick M.Ausubel等人著,1987)而设定。作为严格的条件，例如，可以举出如下条件：使用杂交液(50％甲酰胺、10 ×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS，10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约50℃进行孵育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃进行清洗。作为进一步优选的严格的条件，例如，可以举出使用 50％甲酰胺、5×SSC(0.15MNaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、1× Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))作为杂交液的条件。

本发明的又一方式提供具有编码本发明的本酶的基因的碱基序列或与其互补碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这样的核酸片段可以用于对具有编码本发明的本酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定和/或扩增等。核酸片段例如涉及成至少包含与在编码本发明的本酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10个～约100个碱基长，优选为约20个～约100个碱基长，进一步优选为约30个～约100个碱基长)杂交的部分的方式设计。作为探针利用的情况下，可以对核酸片段进行标志化。标志化例如可以使用荧光物质、酶、放射性同位元素。

本发明的又一方面涉及包含本发明的基因(编码本酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形式提供。本说明书中术语“载体”是指能够将插入该载体的核酸输送至细胞等靶内的核酸性分子。

可以根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，并且考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其变体、λ噬菌体或其变体、pBR322或其变体(pB325、pAT153、 pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可例示pYepSec1、pMFa、 pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可例示pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可例示pCDM8、pMT2PC等。

本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入该载体的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内且能够在该细胞内表达的载体。表达载体通常包含插入的核酸表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择标记的表达载体。使用上述表达载体时，可以利用选择标记来确认有无导入表达载体(和其程度)。

本发明的核酸向载体的插入、选择标记基因的插入(在需要的情况下)、启动子的插入(在需要的情况下)等可以使用标准的重组DNA技术(例如，可以参照MolecularCloning,Third Edition,1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，使用限制性内切酶和DNA连接酶的公知的方法)而进行。

作为宿主细胞，从操作的容易性的方面考虑，优选使用大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等微生物，只要是重组DNA能够复制且本酶的基因能够表达的宿主细胞就可以利用。作为大肠杆菌的例子，在利用T7系启动子的情况下，可以举出大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，在不利用T7系启动子的情况下，可以举出大肠杆菌JM109。另外，作为酿酒酵母的例子，可以举出酿酒酵母SHY2、酿酒酵母AH22或酿酒酵母 INVSc1(Invitrogen公司)。

本发明的又一方面涉及一种保有本发明的重组DNA的微生物(即，转化体)。本发明的微生物可以通过使用上述本发明的载体的转染或转化而得到。例如，可以利用氯化钙法(Journal of Molecular Biology(J.Mol. Biol.)，第53卷，第159页(1970))、Hanahan法(Journal of Molecular Biology，第166卷，第557页(1983))、SEM法(Gene，第96卷，第 23页(1990)〕、Chung等人的方法(Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe USA，第86卷，第2172页(1989))、磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165 (1984))、脂转染(Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 84,7413-7417(1984))等来实施。应予说明，本发明的微生物可以利用于生产本发明的本酶。

3.本酶剂的用途

本发明的再一方面涉及本酶剂的用途。作为第1用途，提供胶原蛋白三肽(CTP)的制造方法(以下，称为“CTP制造方法”)。本发明的 CTP制造方法中，使本酶剂作用于胶原蛋白或明胶(变性胶原蛋白)。例如，将本酶剂添加于胶原蛋白或明胶的溶液中，在例如20～50℃、优选 30～40℃的条件下反应规定时间(例如1小时～12小时)。通过作为本酶剂的有效成分的胶原蛋白酶进行降低反应，结果生产胶原蛋白三肽。制造物中的CTP的组成、比率等会根据所使用的底物(胶原蛋白或明胶) 的种类、来源等而变动，根据本发明的制造方法，可得到含有N末端具有Gly的三肽(例如，Gly-Glu-Arg、Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala、Gly-Ala-Hyp)的组合物，即含有CTP的物质。可以通过单独使用本酶剂而生成CTP也为本发明的特征之一。其中，也可以并用其它胶原蛋白酶、蛋白酶或肽酶而实现制造效率的提高等。

所使用的胶原蛋白/明胶的来源没有特别限定，作为其例子，可以举出鱼、猪、牛、鸡。也可以使用市售的胶原蛋白或明胶。胶原蛋白或明胶的制备法也没有特别限定。例如，将原料(动物的皮肤、骨、腱或鱼鳞等)水洗并使其干燥后，根据需要使用盐酸等而进行脱灰处理，清洗后，通过氢氧化钠、盐酸等的处理而得到粗胶原蛋白。另外，可以通过对粗胶原蛋白进行热处理来提取明胶。

通过本酶剂进行酶反应后，为了实现不溶成分的除去、纯度的提高、或者脱色、除臭等，根据需要进行纯化处理(例如，过滤、离子交换、活性碳处理)。

本酶剂的第2用途为食用肉的品质改良。更具体而言，将本发明的酶剂用于食用肉的嫩化。即，提供一种肉嫩化方法。如果使用本发明的酶剂，则能够将食用肉中的胶原蛋白特异性切断，得到口感提高的食用肉(典型而言，抑制干柴感且口感柔软的食用肉)。使酶反应的食用肉没有特别限定，富含胶原蛋白的食用肉(例如小腿肉、筋膜肉)为理想的处理对象。如后述的实施例所示，确认了本酶剂具有猪排骨的红肉不嫩化而使含有大量胶原蛋白的肥肉嫩化的作用，进而具有将牛肩颈肉的筋膜肉嫩化的作用。术语“食用肉”作为还包含食用肉加工品的含义使用。因此，也可以将本发明的肉嫩化方法应用于提高成型肉、火腿和香肠类等的口感。本发明的肉嫩化方法中，使本酶剂作用于食用肉。只要利用将食用肉浸渍于酶液(酶剂的溶液)的方法、进行加压处理使酶液渗透于食用肉的方法、将酶液注入于食用肉的方法、将酶液注入于食用肉并进行翻滚(机械渗透酶液的处理)的方法等而使本酶剂作用于食用肉即可。作用时的温度条件例如为4～40℃，优选为4～30℃，更优选为 4～25℃，进一步优选为4～20℃，作用时间(反应时间)例如为1小时～1天。

实施例

1.胶原蛋白酶产生菌株的筛选

为了找出可用于食品的胶原蛋白酶，首先，作为1次筛选，从天野酶株式会社的文库中以胶原蛋白酶活性为指标而实施筛选，挑选出113 种显示高活性的生物安全等级1(BSL1)产生菌。

接着，作为2次筛选，使挑选出的113种产生菌的培养上清液与明胶反应，评价反应产物中的N末端具有Gly的肽的含有率，挑选出19种产生菌。总肽量用茚三酮试剂进行定量。另一方面，N末端具有Gly的肽的量使用胶原蛋白定量试剂盒(Cosmo Bio制)进行定量。

作为3次筛选，由19种产生菌的培养上清液和明胶反应产物利用凝胶过滤色谱对三肽进行部分纯化后，通过反相色谱进行分析。根据分析结果，将被认为有希望的产生菌的培养上清液进行部分纯化后，对胶原蛋白酶的CTP生成能力进行评价，由此最终挑选出胶原蛋白酶产生菌纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)57413株。

2.57413株的胶原蛋白酶粗酶液的制备和纯化

将57413株用含有明胶的培养基(5％鱼明胶，0.5％酵母提取物， 2％NaCl)以30℃进行2天通气搅拌培养。将得到的培养液离心分离后，将上清进行硅藻土过滤而得到粗酶液。进一步利用疏水色谱(Pheny HP, GE Healthcare Life Science公司制)、阴离子交换色谱(DEAE FF,GE Healthcare Life Science公司制)将酶纯化。

3.57413株胶原蛋白酶的基因序列的确认

将57413株用SCD液体培养基在30℃培养过夜后，利用离心分离回收菌体。将回收的菌体悬浮在TE缓冲液中，使用NucleoSpin(注册商标)Microbial DNA(Takara Bio株式会社制)提取DNA。将提取的 DNA作为模板，使用以下的上游和下游引物以及PrimeSTAR(注册商标)Max DNA Polymerase(Takara Bio株式会社制)来实施PCR。对扩增后的PCR产物实施使用与结构基因内外具有同源性的引物的碱基序列解析，由此确认序列(图1)。

上游：正向引物:GGAAACAATCTAAATGTGTCT(序列号5)

下游：反向引物：CCGCCTTTAAAGGCTCTCCGA(序列号6)

4.胶原蛋白酶的重组表达

通过将57413株胶原蛋白酶基因(序列号2)导入pColdIII(Takara Bio株式会社制)来构建表达质粒。使用构建的表达质粒，利用常规方法对大肠杆菌BL21进行转化。将转化体用LB培养基(添加氨苄青霉素) 以37℃培养过夜后，将其培养液以1％容量接种于LB培养基(添加氨苄青霉素)，以37℃培养2小时后，添加IPTG，以15℃培养过夜。由该培养液利用离心分离回收菌体，利用超声波破碎将菌体破碎后，利用离心分离回收上清液，制成重组粗酶液。通过以下的测定方法来确认该粗酶液的酶活性，结果可知具有胶原蛋白降解活性、Pz-肽降解活性和CTP生成能力。此外，不具有酪蛋白降解活性，特异性作用于胶原蛋白、明胶的可能性极高。

＜Pz-肽降解活性＞

在1mg/mL Pz-肽(Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH,BACHEM制)、 20mM CaCl₂200mM Tris盐酸盐缓冲液900μL中添加酶液100μL，以 37℃开始反应。在反应开始后10分钟和20分钟时取样100μL反应液，添加于25mM柠檬酸液200μL，由此制成反应终止液。在该反应终止液中添加1mL的乙酸乙酯，搅拌10秒后进行离心分离(12000×g 10分钟)，回收上清液的乙酸乙酯层。测定所回收的上清的乙酸乙酯层的 320nm的吸光度，由此求出因胶原蛋白酶而游离的Pz-Pro-Leu量。酶活性通过由10分钟后和20分钟后的Pz-Pro-Leu生成量算出每1分钟的Pz- Pro-Leu生成速度而进行评价。将以1分钟分解1μmol Pz peptide(使 1μmolPz-Pro-Leu游离的)酶量定义为1U。

＜胶原蛋白酶活性＞

胶原蛋白酶活性使用PROTAZYME OL TABLETS(Megazyme公司制)进行测定。将1片OL利用10mMCaCl₂ 200mM Tris缓冲液悬浮，将得到的底物溶液一边搅拌一边分注300μL于1.5mL管中并置于冰上。在分注后的底物溶液中添加混合酶液100μL，用设定为40℃的生物摇床搅拌30分钟，由此使其反应。反应30分钟后，添加2％磷酸三钠溶液 1mL，由此使酶反应终止，进行离心分离(13000g,10分钟)。将上清液 200μL移至微量滴定板，测定590nm的吸光度。由以30分钟上升的 590nm值来判断胶原蛋白酶活性的强度。

＜酪蛋白降解活性＞

酪蛋白降解活性使用PROTAZYME AK TABLETS(Megazyme公司制)进行测定。将1片AK利用10mMCaCl₂ 200mM Tris缓冲液悬浮，将得到的底物溶液一边搅拌一边分注300μL于1.5mL管并置于冰上。在分注后的底物溶液中添加混合酶液100μL，用设定为40℃的生物摇床搅拌 30分钟，由此使其反应。反应30分钟后，添加2％磷酸三钠溶液1mL，由此使酶反应终止，进行离心分离(13000g,10分钟)。将上清200μL移至微量滴定板，测定590nm的吸光度。由以30分钟上升的590nm值来判断酪蛋白降解活性的强度。

＜CTP生成能力的确认＞

使阶段稀释后的酶液与明胶(终浓度2％明胶)反应12小时后，煮沸10分钟，由此使反应终止。将该反应终止液用超纯水进行10倍稀释后，利用Superdex peptide7.5/300进行凝胶过滤分析，由此确认CTP生成量。凝胶过滤的条件如下。

Superdex_peptide7.5/300

缓冲液：含有0.25M NaCl的0.02M磷酸缓冲液,pH 7

流速：0.28mL/min

进样量(Apply amount)：100μL

检测：214nm

系统：AKTA/低温柜

5.57413株胶原蛋白酶的酶学性质

(1)最适温度

确认温度对本酶的反应性的影响。使用以Pz-肽为底物的测定法，使反应时的温度从30℃变化到60℃而测定活性。用将最大活性(活性的最高值)设为100％而得的相对活性进行评价。如图2所示，最适温度在 40℃附近。

(2)温度稳定性

调查本酶的温度稳定性。将本酶液用20mMCaCl₂、200mM Tris盐酸盐缓冲液进行5倍稀释，将得到的样品以各温度(0℃、30℃、40℃、 50℃、60℃)进行30分钟处理后，利用以Pz-肽为底物的测定法来测定活性。如图3所示，可知从0℃(冰上)处理到40℃处理，活性未降低，稳定至40℃。

(3)最适pH

调查pH对本酶的反应性的影响。将溶解Pz-肽的缓冲液由20mM CaCl₂、200mM Tris盐酸盐缓冲液变更为20mM CaCl₂、200mM的各缓冲液(pH4、5、6使用乙酸缓冲液，pH6、7使用PIPES缓冲液，pH7、8、 9使用Tris盐酸盐缓冲液，pH9、10、11使用甘氨酸缓冲液)，测定活性。用将最大活性设为100％而得的相对活性进行评价。如图4所示，可知最适pH在7附近。

(4)pH稳定性

调查本酶的pH稳定性。将本酶溶液用20mM CaCl₂、200mM的各缓冲液(pH4、5、6使用乙酸缓冲液，pH6、7使用PIPES缓冲液，pH7、 8、9使用Tris盐酸盐缓冲液，pH9、10、11使用甘氨酸缓冲液)进行5 倍稀释，以30℃处理30分钟后，利用以Pz-肽为底物的测定法来测定活性。将用20mM CaCl₂、200mM的Tris盐酸盐缓冲液、pH7进行5倍稀释后在0℃(冰上)保管时的酶活性设为100％的相对活性进行评价。如图5所示，可知在pH约5～约9.5的范围维持高活性(85％以上)，且在该pH区域稳定。

6.胶原蛋白酶的低温反应性

＜方法＞

对上述的57413株胶原蛋白酶(本发明的酶)以及比较用的来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶测定低温反应性。胶原蛋白酶活性使用PROTAZYME OLTABLETS(Megazyme公司制，底物为AZCL- collagen)进行测定。将1片OL利用10mM CaCl₂、200mM Tris缓冲液悬浮，将得到的底物溶液一边搅拌一边分注150μL于1.5mL管并置于冰上。在分注的底物溶液中添加混合酶液50μL，一边用设定为任意温度的生物摇床一边搅拌一边进行反应。通过添加2％磷酸三钠溶液500μL来终止反应，然后进行离心分离(13000g,10分钟)。将上清液200μL移至微量滴定板中，测定590nm的吸光度。用590nm处的吸光度上升来评价胶原蛋白酶活性的强度。

＜结果＞

将结果示于表1和图6。本发明的胶原蛋白酶的20～30℃时的相对活性高于比较用的酶。

[表1]

7.胶原蛋白三肽生成能力的确认

＜方法＞

使用57413株胶原蛋白酶(本发明的酶)以及比较用的来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶进行以下的实验。

(天然胶原蛋白降解活性测定法)

在包含25mg来自牛跟腱的不溶性I型胶原蛋白(SIGMA公司制)、 0.36mM CaCl₂的50mMTES缓冲液(pH7.4)5mL中添加0.1mL的酶溶液以37℃反应5小时，对反应液进行滤纸过滤。在滤液100μL中添加含有 0.1M柠檬酸(pH5.0)的茚三酮试剂1mL后以100℃加热20分钟并冷却后，添加50％1-丙醇5mL，测定570nm处的吸光度的上升。1个胶原蛋白降解单元(CDU)定义为在Ca离子存在下以37℃、pH7.4进行5小时孵育时的从胶原蛋白中游离出相当于1.0μmol的亮氨酸的肽的酶量。

(胶原蛋白三肽生成确认)

使阶段稀释后的酶液与5％鱼明胶A型(新田明胶公司制)反应20 小时后，煮沸10分钟，由此终止反应。将该反应终止液用乙醇进行4倍稀释后，通过离心分离除去沉淀物后，将上清液用超纯水稀释至以明胶换算计为50ppm，进行MF(0.45μm)处理后，利用LC-MS分析来评价 CTP中的Gly-Pro-HypGly-Pro-Ala、Gly-Glu-Arg的峰面积。将本酶的 CTP生成能力与来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶进行比较。

(LC-MS分析)

柱子：TSK gel ODS-80TM 150mm

溶剂：超纯水+0.1％甲酸

流速：1mL/min

注入量：1μL

检测：正离子模式，SIM法

＜结果＞

将结果示于图7～图9。

发现本酶显示与来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶等同的Gly-Pro-Hyp和Gly-Pro-Ala的生成量，进而Gly-Glu-Arg生成能力比来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶优异。

8.肉嫩化效果的确认

使用57413株胶原蛋白酶(本发明的酶)和比较用的来自链霉菌 (Streptomyces)的胶原蛋白酶进行以下实验。

8－1.猪五花肉的嫩化效果

＜方法＞

将包含30CDU/mL胶原蛋白酶的腌制液(食盐1.5w/v％,碳酸氢钠 1.5w/v％,乳酸钙0.7w/v％)13.5mL随机注射至猪五花肉140g中，用手揉搓后在低温柜(约5℃)中保管3天。然后将猪五花肉分割成4份并通过炖煮处理10分钟后，分成肥肉和瘦肉，分别利用流变仪(太阳科学制) 来评价物性。以下表示测定深度3mm处的负荷而得的结果。负荷的值越低意味着越柔软。

＜结果＞

将结果示于图10。

表明本酶与来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶不同，具有不使瘦肉嫩化而使肥肉嫩化的效果。

8－2.牛肩颈肉的嫩化效果

＜方法＞

将牛肩颈肉的筋膜部位切成1cm见方的立方体后，浸渍于酶溶液 (30CDU/mL)30mL，在低温柜(约5℃)中处理3天。处理后，不进行加热而直接利用流变仪来评价物性(断裂强度和深度3mm处的负荷)。断裂强度、负荷均作为嫩化程度的指标使用，值越低表示越柔软。

＜结果＞

将结果示于图11。

判明本酶与来自链霉菌(Streptomyces)的胶原蛋白酶相比，断裂强度、负荷均为低值，具有使牛肩颈肉的筋膜部位容易咬断且变得柔软的效果。

产业上的可利用性

本发明的酶剂以来自安全性高的微生物的胶原蛋白酶为有效成分。因此，适于在食品、医疗用途的领域中使用，产业上的利用价值高。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限定。在不脱离专利请求的范围的记载的情况下本领域技术人员可以容易想到的范围的各种变形方式也包含于本发明。本说明书的中明示的论文、日本公开专利公报和日本专利公报等内容的全部内容通过援引而引用。

[序列表自由文本]

序列号5：人工序列的说明：正向引物

序列号6：人工序列的说明：反向引物。

序列表

<110> 天野酶制品株式会社

<120> 胶原蛋白酶剂及其用途

<130> F21605A-WO

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 987

<212> PRT

<213> 纺缍形赖氨酸芽孢杆菌

<400> 1

Asp Thr Gln Gln Leu Gln Glu Gln Tyr Ser Met Ala Glu Leu Asn Asn

1 5 10 15

Met Ser Asn Arg Glu Leu Ile His Thr Leu Gly Ser Ile Arg Trp Tyr

20 25 30

Gln Ile Thr Asp Leu Phe Gln Phe Asn Asp Asp Thr Lys Ala Phe Tyr

35 40 45

Gln Asn Glu Glu Arg Met Gln Val Ile Ile Asn Glu Leu Gly Asn Arg

50 55 60

Gly Asn Ser Phe Thr Lys Glu Asp Ser Lys Gly Ile Glu Thr Phe Val

65 70 75 80

Glu Val Leu Arg Ser Ala Phe Tyr Val Ala Phe Tyr Asn Asn Glu Leu

85 90 95

Gly Tyr Leu Asn Glu Arg Ser Phe Gln Asp Lys Cys Leu Pro Ala Leu

100 105 110

Asn Glu Ile Ala Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu Gly Thr Asp Glu Gln

115 120 125

Asp Lys Val Val Ser Ala Tyr Gly Lys Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ser

130 135 140

Asp Val Glu Thr Val Gln His Ala Thr Asn Ile Leu Lys Gln Tyr Asn

145 150 155 160

Glu Asn Leu Ser Thr Tyr Glu Ser Glu Asn Ser Lys Gly Gln Ala Ile

165 170 175

Tyr Asp Ile Ile His Gly Ile Asp Tyr Asp Leu Gln Ser Tyr Leu Tyr

180 185 190

Asp Thr Arg Lys Glu Ala Asn Thr Thr Met Trp Tyr Gly Lys Ile Asp

195 200 205

Ser Phe Ile Glu Glu Val Asn Asn Ile Ala Leu Ile His Asn Val Thr

210 215 220

Asp Ser Asn Ser Trp Leu Ile Asn Asn Gly Ile Tyr Tyr Ala Gly Arg

225 230 235 240

Leu Gly Gln Phe His Ser Asn Pro Asn Lys Gly Leu Glu Val Val Thr

245 250 255

Gln Ala Met His Met Tyr Pro Tyr Leu Ser Glu Ala Tyr Phe Val Ala

260 265 270

Val Glu Gln Ile Thr Thr Asn Tyr Gly Gly Arg Asp Leu Asn Gly Asn

275 280 285

Thr Val Asp Leu Gln Lys Val Arg Glu Glu Gly Lys Lys Gln Tyr Leu

290 295 300

Pro Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Asp Gly Ser Ile Val Phe Lys Thr Gly

305 310 315 320

Asp Gln Val Thr Glu Asp Lys Ile Gln Arg Leu Tyr Trp Ala Ala Lys

325 330 335

Glu Val Lys Ala Gln Tyr His Arg Val Ile Gly Asn Asp Gln Ala Leu

340 345 350

Glu Pro Gly Asn Ala Asp Asp Ile Leu Thr Val Val Ile Tyr Asn Ser

355 360 365

Pro Asp Gln Tyr Arg Leu Asn Arg Gln Leu Tyr Gly Tyr Glu Thr Asn

370 375 380

Asn Gly Gly Ile Tyr Ile Glu Glu Thr Gly Thr Phe Phe Thr Tyr Glu

385 390 395 400

Arg Thr Pro Glu Gln Ser Ile Tyr Ser Leu Glu Glu Leu Phe Arg His

405 410 415

Glu Tyr Thr His Phe Leu Gln Gly Arg Phe Glu Val Pro Gly Leu Phe

420 425 430

Gly Thr Gly Asp Met Tyr Gln Asn Glu Arg Leu Thr Trp Phe Gln Glu

435 440 445

Gly Asn Ala Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg Thr Asn Asp Val Val

450 455 460

Pro Arg Lys Ser Ile Ile Ser Gly Leu Ser Gln Asp Pro Ser Gln Arg

465 470 475 480

Tyr Thr Ala Glu Gln Thr Met Phe Ala Thr Tyr Gly Ser Trp Asp Phe

485 490 495

Tyr Asn Tyr Ser Phe Ala Leu Gln Ser Tyr Met Tyr Thr His Gln Phe

500 505 510

Asp Met Phe Asp Arg Ile Gln Asp Leu Ile Arg Ala Asn Asp Val Lys

515 520 525

Asn Tyr Asp Ala Tyr Arg Asp Thr Leu Ser Lys Asp Ser Gln Leu Asn

530 535 540

Met Glu Tyr Gln Ala Tyr Met Gln Gln Leu Ile Asp Asn Gln Glu Thr

545 550 555 560

Tyr Glu Val Pro Gln Val Ala Glu Asp Tyr Leu Met Pro His Glu Pro

565 570 575

Lys Ala Leu Asn Glu Val Gln Gln Glu Ile Val Asp Ile Ala His Val

580 585 590

Lys Asp Ala Asn Met Thr Lys His Gln Ser Gln Phe Phe Asn Thr Phe

595 600 605

Thr Leu Glu Gly Thr Tyr Val Gly Ser Ala Thr Gln Gly Glu Ser Gln

610 615 620

Asp Trp Lys Thr Met Ser Lys Gln Val Asn Gln Met Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

Ser Gln Lys Glu Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Met Thr Ala Tyr Phe Val

645 650 655

Asn Tyr Arg Val Asn Ala Ala Asn Gln Phe Glu Tyr Asp Val Val Phe

660 665 670

His Gly Val Ser Thr Asp Asp Gly Glu Thr Gln Ala Pro Ile Val Gln

675 680 685

Val Asn Gly Pro Tyr Thr Gly Met Ile Asn Glu Lys Ile Gln Phe Asn

690 695 700

Ser Asp Gly Ser Lys Asp Thr Asp Gly Glu Ile Val Ser Tyr Leu Trp

705 710 715 720

Asp Phe Gly Asp Gly Ala Thr Ser Glu Ala Ala Asn Pro Thr His Val

725 730 735

Tyr Glu Asn Glu Gly Thr Tyr Lys Val Thr Leu Thr Val Lys Asn Asn

740 745 750

Lys Gly Gln Glu Ser Lys Gly Gln Thr Thr Ala Thr Val Gln Lys Gly

755 760 765

Gly Gln Thr Gly Gln Glu His Ala Met Ile Ile Pro Phe Asn Lys Pro

770 775 780

Leu Lys Gly Ser Leu Ile Glu Asn Asp Thr Asn Val Tyr Gln Phe Asp

785 790 795 800

Ile Thr Ser Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ser Val Val Asn Glu Asn Gln

805 810 815

Ile Gly Met Thr Trp Val Leu Tyr His Glu Ser Asp Lys Glu Asn Tyr

820 825 830

Val Ala Tyr Gly Gln Glu Asp Gly Gln Thr Ile Lys Gly Lys Tyr Asn

835 840 845

Ala Lys Pro Gly Lys Tyr Tyr Leu Tyr Val Tyr Lys Phe Asp Asp Glu

850 855 860

Asp Gly Thr Tyr Thr Val Gln Val Gln Asn Ser Thr Lys Thr Glu Ile

865 870 875 880

Glu Pro Asn Asn Arg Pro Glu Glu Ala Thr Met Leu Pro Phe His Thr

885 890 895

Pro Leu Ser Gly Ser Leu Met Glu Asp Asp His Thr Asp Val Tyr Glu

900 905 910

Phe Asn Val Thr Ser Pro Lys Glu Ile Asp Ile Ser Val Leu Asn Glu

915 920 925

Asn Gln Ile Gly Met Thr Trp Val Leu Tyr His Glu Ser Asp Ser Gln

930 935 940

Asn Tyr Ala Ser Phe Gly Gln Glu Asp Gly Asn Met Ile Asn Gly Lys

945 950 955 960

Leu Asn Ala Lys Pro Gly Lys Tyr Tyr Leu Tyr Val Tyr Lys Phe Glu

965 970 975

Asn Glu Asn Gly Thr Tyr Thr Val His Val Gln

980 985

<210> 2

<211> 1072

<212> PRT

<213> 纺缍形赖氨酸芽孢杆菌

<400> 2

Met Lys Lys Lys Phe Thr Phe Asn Gln Leu Leu Ile Gly Val Ser Thr

1 5 10 15

Met Ala Ile Ser Leu Gly Gly Leu Gln Ala Glu Ala Ser Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Thr Pro Tyr Asn Val Leu Gln Met Lys Pro Ile Gly Ile Glu Met

35 40 45

Ser Lys Asp Glu Met Val His Ser Thr Met Ala Glu Glu Thr Leu Ser

50 55 60

Tyr Glu Glu Arg Leu Glu Met Gly Asp Phe Ser Gln Arg Pro Ala Pro

65 70 75 80

Ile Met Glu Gln Met Asp Thr Gln Gln Leu Gln Glu Gln Tyr Ser Met

85 90 95

Ala Glu Leu Asn Asn Met Ser Asn Arg Glu Leu Ile His Thr Leu Gly

100 105 110

Ser Ile Arg Trp Tyr Gln Ile Thr Asp Leu Phe Gln Phe Asn Asp Asp

115 120 125

Thr Lys Ala Phe Tyr Gln Asn Glu Glu Arg Met Gln Val Ile Ile Asn

130 135 140

Glu Leu Gly Asn Arg Gly Asn Ser Phe Thr Lys Glu Asp Ser Lys Gly

145 150 155 160

Ile Glu Thr Phe Val Glu Val Leu Arg Ser Ala Phe Tyr Val Ala Phe

165 170 175

Tyr Asn Asn Glu Leu Gly Tyr Leu Asn Glu Arg Ser Phe Gln Asp Lys

180 185 190

Cys Leu Pro Ala Leu Asn Glu Ile Ala Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu

195 200 205

Gly Thr Asp Glu Gln Asp Lys Val Val Ser Ala Tyr Gly Lys Leu Ile

210 215 220

Gly Asn Ala Ser Ser Asp Val Glu Thr Val Gln His Ala Thr Asn Ile

225 230 235 240

Leu Lys Gln Tyr Asn Glu Asn Leu Ser Thr Tyr Glu Ser Glu Asn Ser

245 250 255

Lys Gly Gln Ala Ile Tyr Asp Ile Ile His Gly Ile Asp Tyr Asp Leu

260 265 270

Gln Ser Tyr Leu Tyr Asp Thr Arg Lys Glu Ala Asn Thr Thr Met Trp

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Asp Ser Phe Ile Glu Glu Val Asn Asn Ile Ala Leu

290 295 300

Ile His Asn Val Thr Asp Ser Asn Ser Trp Leu Ile Asn Asn Gly Ile

305 310 315 320

Tyr Tyr Ala Gly Arg Leu Gly Gln Phe His Ser Asn Pro Asn Lys Gly

325 330 335

Leu Glu Val Val Thr Gln Ala Met His Met Tyr Pro Tyr Leu Ser Glu

340 345 350

Ala Tyr Phe Val Ala Val Glu Gln Ile Thr Thr Asn Tyr Gly Gly Arg

355 360 365

Asp Leu Asn Gly Asn Thr Val Asp Leu Gln Lys Val Arg Glu Glu Gly

370 375 380

Lys Lys Gln Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Asp Gly Ser Ile

385 390 395 400

Val Phe Lys Thr Gly Asp Gln Val Thr Glu Asp Lys Ile Gln Arg Leu

405 410 415

Tyr Trp Ala Ala Lys Glu Val Lys Ala Gln Tyr His Arg Val Ile Gly

420 425 430

Asn Asp Gln Ala Leu Glu Pro Gly Asn Ala Asp Asp Ile Leu Thr Val

435 440 445

Val Ile Tyr Asn Ser Pro Asp Gln Tyr Arg Leu Asn Arg Gln Leu Tyr

450 455 460

Gly Tyr Glu Thr Asn Asn Gly Gly Ile Tyr Ile Glu Glu Thr Gly Thr

465 470 475 480

Phe Phe Thr Tyr Glu Arg Thr Pro Glu Gln Ser Ile Tyr Ser Leu Glu

485 490 495

Glu Leu Phe Arg His Glu Tyr Thr His Phe Leu Gln Gly Arg Phe Glu

500 505 510

Val Pro Gly Leu Phe Gly Thr Gly Asp Met Tyr Gln Asn Glu Arg Leu

515 520 525

Thr Trp Phe Gln Glu Gly Asn Ala Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg

530 535 540

Thr Asn Asp Val Val Pro Arg Lys Ser Ile Ile Ser Gly Leu Ser Gln

545 550 555 560

Asp Pro Ser Gln Arg Tyr Thr Ala Glu Gln Thr Met Phe Ala Thr Tyr

565 570 575

Gly Ser Trp Asp Phe Tyr Asn Tyr Ser Phe Ala Leu Gln Ser Tyr Met

580 585 590

Tyr Thr His Gln Phe Asp Met Phe Asp Arg Ile Gln Asp Leu Ile Arg

595 600 605

Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Asp Ala Tyr Arg Asp Thr Leu Ser Lys

610 615 620

Asp Ser Gln Leu Asn Met Glu Tyr Gln Ala Tyr Met Gln Gln Leu Ile

625 630 635 640

Asp Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Val Pro Gln Val Ala Glu Asp Tyr Leu

645 650 655

Met Pro His Glu Pro Lys Ala Leu Asn Glu Val Gln Gln Glu Ile Val

660 665 670

Asp Ile Ala His Val Lys Asp Ala Asn Met Thr Lys His Gln Ser Gln

675 680 685

Phe Phe Asn Thr Phe Thr Leu Glu Gly Thr Tyr Val Gly Ser Ala Thr

690 695 700

Gln Gly Glu Ser Gln Asp Trp Lys Thr Met Ser Lys Gln Val Asn Gln

705 710 715 720

Met Leu Glu Gln Leu Ser Gln Lys Glu Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Met

725 730 735

Thr Ala Tyr Phe Val Asn Tyr Arg Val Asn Ala Ala Asn Gln Phe Glu

740 745 750

Tyr Asp Val Val Phe His Gly Val Ser Thr Asp Asp Gly Glu Thr Gln

755 760 765

Ala Pro Ile Val Gln Val Asn Gly Pro Tyr Thr Gly Met Ile Asn Glu

770 775 780

Lys Ile Gln Phe Asn Ser Asp Gly Ser Lys Asp Thr Asp Gly Glu Ile

785 790 795 800

Val Ser Tyr Leu Trp Asp Phe Gly Asp Gly Ala Thr Ser Glu Ala Ala

805 810 815

Asn Pro Thr His Val Tyr Glu Asn Glu Gly Thr Tyr Lys Val Thr Leu

820 825 830

Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly Gln Glu Ser Lys Gly Gln Thr Thr Ala

835 840 845

Thr Val Gln Lys Gly Gly Gln Thr Gly Gln Glu His Ala Met Ile Ile

850 855 860

Pro Phe Asn Lys Pro Leu Lys Gly Ser Leu Ile Glu Asn Asp Thr Asn

865 870 875 880

Val Tyr Gln Phe Asp Ile Thr Ser Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ser Val

885 890 895

Val Asn Glu Asn Gln Ile Gly Met Thr Trp Val Leu Tyr His Glu Ser

900 905 910

Asp Lys Glu Asn Tyr Val Ala Tyr Gly Gln Glu Asp Gly Gln Thr Ile

915 920 925

Lys Gly Lys Tyr Asn Ala Lys Pro Gly Lys Tyr Tyr Leu Tyr Val Tyr

930 935 940

Lys Phe Asp Asp Glu Asp Gly Thr Tyr Thr Val Gln Val Gln Asn Ser

945 950 955 960

Thr Lys Thr Glu Ile Glu Pro Asn Asn Arg Pro Glu Glu Ala Thr Met

965 970 975

Leu Pro Phe His Thr Pro Leu Ser Gly Ser Leu Met Glu Asp Asp His

980 985 990

Thr Asp Val Tyr Glu Phe Asn Val Thr Ser Pro Lys Glu Ile Asp Ile

995 1000 1005

Ser Val Leu Asn Glu Asn Gln Ile Gly Met Thr Trp Val Leu Tyr

1010 1015 1020

His Glu Ser Asp Ser Gln Asn Tyr Ala Ser Phe Gly Gln Glu Asp

1025 1030 1035

Gly Asn Met Ile Asn Gly Lys Leu Asn Ala Lys Pro Gly Lys Tyr

1040 1045 1050

Tyr Leu Tyr Val Tyr Lys Phe Glu Asn Glu Asn Gly Thr Tyr Thr

1055 1060 1065

Val His Val Gln

1070

<210> 3

<211> 2964

<212> DNA

<213> 纺缍形赖氨酸芽孢杆菌

<400> 3

gatacacagc aattgcagga gcagtactcg atggcagagc ttaataatat gagcaatcgt 60

gagcttatcc atacgcttgg cagtatccgt tggtaccaaa ttacagactt attccaattc 120

aatgatgaca caaaagcttt ttatcaaaat gaagagcgca tgcaagtaat catcaatgaa 180

ttagggaata gaggaaattc gtttacgaag gaagattcaa aggggatcga aacatttgtt 240

gaggtattgc gttctgcttt ttatgtagcg ttttataata atgaactagg ctatttaaat 300

gagagaagtt tccaagataa gtgtttacca gcattaaatg aaatagccaa aaatccaaac 360

tttaaacttg gtacagatga gcaagataaa gttgtatctg cctatggaaa attaataggt 420

aatgcttcta gtgatgtgga aaccgttcaa catgctacga acattttaaa acaatataat 480

gaaaatcttt ctacctatga aagtgagaat tcaaaaggac aagctattta cgatataata 540

cacggcattg attatgattt gcagtcttat ttatatgaca ctcgtaaaga ggccaataca 600

acgatgtggt atgggaagat tgatagcttc atagaggaag ttaataacat tgccctaata 660

cataatgtga cggatagcaa tagttggtta attaataatg gcatttatta tgcagggcgt 720

ttagggcagt tccatagcaa tcctaataag ggtttagaag tcgttacaca agcgatgcat 780

atgtatccct atttaagtga agcttatttt gtggcagtag agcaaattac gacaaattat 840

ggtggacgtg acttaaacgg aaatacggtt gatttacaaa aagtacgtga agaaggaaaa 900

aaacagtatc taccgaaaac atatacattt gatgatggat caattgtatt caaaacggga 960

gatcaagtaa cggaagataa aattcaaaga ttatactggg ctgcaaaaga ggtaaaggca 1020

caatatcatc gtgtaatcgg gaatgatcaa gcactagagc ctggtaatgc tgacgatatc 1080

ttaaccgttg tcatttataa ctctcccgat cagtaccgat taaaccgaca attgtacgga 1140

tatgaaacaa ataatggtgg tatttatatt gaagagactg gaacattctt tacatatgaa 1200

cgtacacctg agcaaagtat ttatagctta gaagagctgt tccgtcatga atatacgcac 1260

tttttacaag gtagatttga ggtgcctggt ctattcggga cgggtgatat gtatcaaaat 1320

gagcgactaa catggttcca ggaagggaat gcagaatttt ttgcagggtc aacacgtaca 1380

aatgacgttg tgcctcgtaa gagcattatt agtggattgt cacaggatcc atcacaacgc 1440

tatactgctg aacaaacaat gtttgccaca tatggttcct gggattttta taattattca 1500

tttgcattac agtcttatat gtatacgcat caattcgata tgtttgatag aattcaagat 1560

ttaatccgcg cgaacgatgt gaaaaattat gatgcctatc gtgacacttt aagtaaagat 1620

tcacagctga atatggaata ccaagcatat atgcagcaat tgatcgataa ccaagaaaca 1680

tacgaagtac cacaagtagc agaggattat ttaatgccgc atgaaccaaa agcgttaaac 1740

gaagtacagc aagaaattgt cgatattgca catgtgaaag atgcaaatat gacgaaacac 1800

cagtctcaat tttttaatac gtttacactc gagggaacat atgtaggtag tgcaacacag 1860

ggtgaatctc aagattggaa aacgatgagt aagcaagtaa accaaatgct ggagcaactg 1920

tctcaaaaag agtggagcgg ctataaaaca atgactgcgt actttgtcaa ctatcgtgta 1980

aatgcggcaa accagttcga gtatgatgta gtcttccatg gcgtttccac tgatgacgga 2040

gaaacgcaag caccaattgt acaagtaaat ggtccatata ctggcatgat caatgaaaaa 2100

attcaattta atagtgatgg gtcaaaggat acggatggag aaatagtttc ttatctttgg 2160

gattttggtg atggcgcgac aagtgaagca gcaaatccta ctcatgtata cgaaaatgaa 2220

ggaacttaca aagtgacgtt aaccgtgaaa aataataagg gacaagaaag taaagggcaa 2280

acaactgcca ctgtacagaa aggaggacag acagggcaag aacatgcgat gattattcca 2340

tttaataaac cactaaaagg tagtttgata gaaaatgata caaatgtcta tcaatttgac 2400

attacatcgc cagaagaaat agatatttct gtcgtaaatg aaaatcaaat tggcatgaca 2460

tgggtgcttt atcatgaatc tgataaggaa aactatgtag cgtatggaca ggaagatgga 2520

cagacaataa aaggtaagta caatgcgaaa ccaggaaagt attatttata cgtttataag 2580

tttgatgatg aagatggaac atataccgtt caagtacaaa atagtacaaa aacggagata 2640

gaaccaaaca atcgtccaga agaagccact atgcttccat ttcatacacc actaagcggt 2700

agtttaatgg aggatgatca tacggatgta tacgaattca atgttacatc tcctaaagaa 2760

atagatatat ctgttttaaa tgaaaaccaa attggcatga catgggtgct ttatcatgaa 2820

tcagatagcc aaaattatgc gtcttttgga caggaagacg gaaacatgat aaacggtaaa 2880

ttgaatgcaa agcctggaaa gtattattta tatgtttata aatttgaaaa tgagaacgga 2940

acatataccg ttcatgtaca gtaa 2964

<210> 4

<211> 3219

<212> DNA

<213> 纺缍形赖氨酸芽孢杆菌

<400> 4

atgaagaaaa aatttacatt caatcagttg ttaattgggg ttagtacaat ggccatttcg 60

ttaggtggat tacaggcgga agcatcggca gcagaaaaaa cgccgtataa tgtattacaa 120

atgaaaccca ttggcataga aatgtcgaaa gatgaaatgg tgcattcgac aatggctgaa 180

gaaacattat cctatgaaga acgtttagaa atgggagatt tttcacaacg tccagcacca 240

attatggaac agatggatac acagcaattg caggagcagt actcgatggc agagcttaat 300

aatatgagca atcgtgagct tatccatacg cttggcagta tccgttggta ccaaattaca 360

gacttattcc aattcaatga tgacacaaaa gctttttatc aaaatgaaga gcgcatgcaa 420

gtaatcatca atgaattagg gaatagagga aattcgttta cgaaggaaga ttcaaagggg 480

atcgaaacat ttgttgaggt attgcgttct gctttttatg tagcgtttta taataatgaa 540

ctaggctatt taaatgagag aagtttccaa gataagtgtt taccagcatt aaatgaaata 600

gccaaaaatc caaactttaa acttggtaca gatgagcaag ataaagttgt atctgcctat 660

ggaaaattaa taggtaatgc ttctagtgat gtggaaaccg ttcaacatgc tacgaacatt 720

ttaaaacaat ataatgaaaa tctttctacc tatgaaagtg agaattcaaa aggacaagct 780

atttacgata taatacacgg cattgattat gatttgcagt cttatttata tgacactcgt 840

aaagaggcca atacaacgat gtggtatggg aagattgata gcttcataga ggaagttaat 900

aacattgccc taatacataa tgtgacggat agcaatagtt ggttaattaa taatggcatt 960

tattatgcag ggcgtttagg gcagttccat agcaatccta ataagggttt agaagtcgtt 1020

acacaagcga tgcatatgta tccctattta agtgaagctt attttgtggc agtagagcaa 1080

attacgacaa attatggtgg acgtgactta aacggaaata cggttgattt acaaaaagta 1140

cgtgaagaag gaaaaaaaca gtatctaccg aaaacatata catttgatga tggatcaatt 1200

gtattcaaaa cgggagatca agtaacggaa gataaaattc aaagattata ctgggctgca 1260

aaagaggtaa aggcacaata tcatcgtgta atcgggaatg atcaagcact agagcctggt 1320

aatgctgacg atatcttaac cgttgtcatt tataactctc ccgatcagta ccgattaaac 1380

cgacaattgt acggatatga aacaaataat ggtggtattt atattgaaga gactggaaca 1440

ttctttacat atgaacgtac acctgagcaa agtatttata gcttagaaga gctgttccgt 1500

catgaatata cgcacttttt acaaggtaga tttgaggtgc ctggtctatt cgggacgggt 1560

gatatgtatc aaaatgagcg actaacatgg ttccaggaag ggaatgcaga attttttgca 1620

gggtcaacac gtacaaatga cgttgtgcct cgtaagagca ttattagtgg attgtcacag 1680

gatccatcac aacgctatac tgctgaacaa acaatgtttg ccacatatgg ttcctgggat 1740

ttttataatt attcatttgc attacagtct tatatgtata cgcatcaatt cgatatgttt 1800

gatagaattc aagatttaat ccgcgcgaac gatgtgaaaa attatgatgc ctatcgtgac 1860

actttaagta aagattcaca gctgaatatg gaataccaag catatatgca gcaattgatc 1920

gataaccaag aaacatacga agtaccacaa gtagcagagg attatttaat gccgcatgaa 1980

ccaaaagcgt taaacgaagt acagcaagaa attgtcgata ttgcacatgt gaaagatgca 2040

aatatgacga aacaccagtc tcaatttttt aatacgttta cactcgaggg aacatatgta 2100

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gtttcttatc tttgggattt tggtgatggc gcgacaagtg aagcagcaaa tcctactcat 2460

gtatacgaaa atgaaggaac ttacaaagtg acgttaaccg tgaaaaataa taagggacaa 2520

gaaagtaaag ggcaaacaac tgccactgta cagaaaggag gacagacagg gcaagaacat 2580

gcgatgatta ttccatttaa taaaccacta aaaggtagtt tgatagaaaa tgatacaaat 2640

gtctatcaat ttgacattac atcgccagaa gaaatagata tttctgtcgt aaatgaaaat 2700

caaattggca tgacatgggt gctttatcat gaatctgata aggaaaacta tgtagcgtat 2760

ggacaggaag atggacagac aataaaaggt aagtacaatg cgaaaccagg aaagtattat 2820

ttatacgttt ataagtttga tgatgaagat ggaacatata ccgttcaagt acaaaatagt 2880

acaaaaacgg agatagaacc aaacaatcgt ccagaagaag ccactatgct tccatttcat 2940

acaccactaa gcggtagttt aatggaggat gatcatacgg atgtatacga attcaatgtt 3000

acatctccta aagaaataga tatatctgtt ttaaatgaaa accaaattgg catgacatgg 3060

gtgctttatc atgaatcaga tagccaaaat tatgcgtctt ttggacagga agacggaaac 3120

atgataaacg gtaaattgaa tgcaaagcct ggaaagtatt atttatatgt ttataaattt 3180

gaaaatgaga acggaacata taccgttcat gtacagtaa 3219

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 5

ggaaacaatc taaatgtgtc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 6

ccgcctttaa aggctctccg a 21

Claims

1.一种酶剂，以由与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列构成的胶原蛋白酶为有效成分。

2.根据权利要求1所述的酶剂，其中，胶原蛋白酶来自纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)。

3.根据权利要求1或2所述的酶剂，用于制造胶原蛋白三肽。

4.根据权利要求1或2所述的酶剂，用于嫩化食用肉。

5.一种胶原蛋白三肽的制造方法，其特征在于，使权利要求3所述的酶剂作用于胶原蛋白或明胶。

6.一种食用肉的嫩化方法，其特征在于，使权利要求4所述的酶剂作用于食用肉。

7.一种胶原蛋白酶，由与序列号1的氨基酸序列具有99％以上的同源性的氨基酸序列构成。

8.一种基因，编码权利要求7所述的胶原蛋白酶。

9.根据权利要求8所述的基因，由序列号3或4的碱基序列构成。