CN112921048B - 一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法，包括如下步骤：步骤一、分别提取枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的基因组DNA；步骤二、以转录调控因子sinR和纳豆激酶编码基因aprN为目的基因，以枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的DNA为模板，分别设计第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，以得到sinR PCR产物和aprN PCR产物；步骤三、以sinR PCR产物和aprN PCR产物构建串联sinR与aprN的重组质粒；步骤四、将重组质粒转化感受态细胞，以得到阳性克隆菌落；步骤五、对阳性克隆菌落依次进行种子培养基培养和发酵培养。本发明将群体感应调控因子与纳豆激酶编码基因串联表达，提高纳豆激酶含量及活力。

Description

一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法。
背景技术
纳豆激酶类产品因具有非常强的溶解血栓的能力，具有非常广阔的应用价值。原因有三，其一，据柳叶刀等杂志报道，当前肆虐全球的新型冠状病毒引起的重型或危重型新冠肺炎（COVID-19）患者存在凝血功能异常。病毒感染机体后，攻击血管内皮细胞，致其损伤并诱发血管内弥漫性凝血，加之患者本身的基础疾病、激素使用等情况，极易形成血栓，进而导致全身器官衰竭危及生命。即使重症COVID-19患者经治疗恢复后，血管内弥漫存在的血栓同样会增加其静脉血栓栓塞症（VTE）的发生风险，留下长期的后遗症。其二，随着老龄化社会的到来，高血压、心肌梗塞、冠心病、脑溢血等血栓类疾病患者越来越多，且随着社会节奏加快和生活压力的增大该类疾病患者亦呈现年轻化趋势。其三，相较于其他纤溶酶，如组织型纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、蚓激酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂等，纳豆激酶无抗原性、活性高、半衰期长、不引发出血、作用迅速直接，而且这种纤溶酶具有多种其他药理特性，如控制高血压、抗血小板和抗凝血特性、抗动脉粥样硬化和降脂活性等，因此成为国内外研究的热点。
这种用于治疗和预防血栓类疾病的纳豆激酶药物可以通过构建基因工程菌进行工业化生产，造福于血栓类疾病患者。目前常用的表达宿主有大肠杆菌、毕赤酵母和枯草芽胞杆菌。大肠杆菌细胞壁含有内毒素，分泌的蛋白常常会因掺杂该种物质对人畜造成伤害，且其目的蛋白常常形成包涵体，不利于目的产物的分离纯化与回收。毕赤酵母作为真核生物，生长速度较慢，且常用的甲醇诱导表达系统具有一定毒性，不能用于食品生产。而枯草芽胞杆菌被美国食品药品管理局（FDA）列为原则上认为安全的微生物(GRAS)，因此在保健品、食品领域中的具有远大的应用前景，这是大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统所不能及的。构建枯草芽胞杆菌系统进行纳豆激酶工业化生产，国内外已有文献报导。但是否可以通过改造群体感应系统调控因子达到纳豆激酶的高效合成未为可知，以及群体感应系统调控因子参与下，外源基因诱导表达体系的优化条件如何变化，也同样未为可知。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法，目的是实现改造群体感应调控因子，使纳豆激酶高效合成。
基于上述目的，本发明提供了一种提高纳豆激酶活力的方法，包括如下步骤：
步骤一、分别提取枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的基因组DNA；
步骤二、以转录调控因子sinR和纳豆激酶编码基因aprN为目的基因，以枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的DNA为模板，分别设计第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，以得到sinR PCR产物和aprN PCR产物；
步骤三、以sinR PCR产物和aprN PCR产物构建串联sinR与aprN的重组质粒；
步骤四、将重组质粒转化枯草芽胞杆菌感受态细胞，以得到阳性克隆菌落；
步骤五、对阳性克隆菌落依次进行种子培养基培养和发酵培养。
所述第一引物对包括如SEQ ID No：3所示的第一上游引物和如SEQ ID No：4所示的第一下游引物；所述第二引物对包括如SEQ ID No：5所示的第二上游引物和如SEQ IDNo：6所示的第二下游引物。
所述步骤三中构建串联sinR与aprN的重组质粒的方法包括如下步骤：
A1、采用BamHI和NotI对sinR PCR产物和载体pHT43-His进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pHT-sinR；
A2、采用XbaI和SmaI对aprN PCR产物和重组质粒pHT-sinR进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pHT-sinR-aprN。
所述步骤四中得到阳性克隆菌落的方法包括如下步骤：
B1、将重组质粒pHT-sinR-aprN加入E. coli DH5α感受态细胞中，以扩增质粒pHT-sinR-aprN；
B2、将质粒pHT-sinR-aprN利用电转化法转化B. subtilis 168感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，经培养后得到BS168/pHT-sinR- aprN的阳性克隆菌落。
所述B1中扩增质粒pHT-sinR-aprN的方法是对加入重组质粒pHT-sinR-aprN的E. coli DH5α感受态细胞混匀后，先在冰浴上放置30 min，之后放入42℃循环水浴中热激90s；然后转移至冰浴中冷却2-3min后，加LB培养基37℃摇床温育45min，再取菌液涂布于氨苄青霉素的LB琼脂平板上，经37℃培养后，提取质粒。
所述B2中培养是在37℃恒温培养箱中培养12-16h。
所述种子培养基培养是将阳性克隆菌落从斜面培养基上挑取至LB种子培养基中，于37°C恒温培养箱中培养24 h。
所述发酵培养采用的发酵培养基成分为：每L含有甘油4-7 g，豆粕粉1-3 g，Na2HPO4·12H2O 0.2-0.8 g，KH2PO4 0.06-0.15 g，MgSO4·7H2O 0.04-0.08 g，CaCl2 0.006-0.015 g，蛋氨酸0.015-0.025 g，色氨酸0.008-0.012 g，苯丙氨酸0.01 g，酪氨酸0.01 g，pH7.0-7.5。通过此配方形成的发酵培养基，使得群体感应调控因子与纳豆激酶编码基因串联表达后，克隆载体达到更高效的表达。
所述发酵培养的温度为37℃，转速为200-250 r/min。
优选的，发酵培养至OD为1.2，菌液中加入IPTG ，且使IPTG的浓度为0.2 mmol/L，之后22℃培养12h。OD值太小，生物量低，生长偶联型代谢产物纳豆激酶蛋白含量较低；OD值太大，生物量高，生长偶联型代谢产物纳豆激酶蛋白含量较高，但活力不强。加入的IPTG浓度太小，生物量影响不大，但不利于外源基因表达，纳豆激酶含量及活力都不高；浓度太大，生物量降低，纳豆激酶含量及活力不高。培养温度高于22℃，易形成包涵体，纳豆激酶活力降低；低于这个温度，不利于菌体生长，也不利于纳豆激酶含量的提升。
本发明的有益效果：
1、本发明创造性的将用来调控细菌间信号传递的群体感应调控因子与纳豆激酶编码基因串联表达，达到提高纳豆激酶含量及活力的目的。其与现有技术中通过克隆载体的修饰方法并不相同。
2、本发明的发酵培养条件适宜，配方科学合理，使得群体感应调控因子与纳豆激酶编码基因串联表达后，克隆载体达到更高效的表达。
3、本发明构建的BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力达到7748±69 U/mL，可应用于工业化液体发酵生产。
4、本发明的实验结果表明，sinR的大量表达对于促进aprN的转录翻译，具有非常明显的促进作用。当在B. subtilis 168中大量表达sinR基因时，纳豆激酶活力比B. subtilis 168提高了2.4倍，sinR和aprN同时大量表达，纳豆激酶活力达到了最大，比B. subtilis natto提高了2.5倍。
5、本发明的方法构建的基因工程菌可广泛应用于纳豆激酶药物的工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为三种工程菌的构建示意图；
图2为琼脂糖凝胶电泳验证DNA片段大小的电泳图；其中，泳道1：DNA Marker；2，3：sinR；4，5：aprN；
图3为菌落PCR验证工程菌是否构建成功的电泳图；其中，泳道1：DNA Marker；2，3：BS168/pHT-sinR；4，5：BS168/pHT-aprN；6，7：BS168/pHT-sinR-aprN菌株；
图4为原始菌和重组菌的生物量及纳豆激酶活力比较图；
图5为原始菌与重组菌中sinR和aprN转录表达水平比较图；
图6为不同诱导条件下BS168/pHT-sinR-aprN纳豆激酶蛋白电泳图；泳道M: 蛋白Marker; 1: OD值为0.6；2: OD值为1.2；3: OD值为1.8；4：IPTG浓度为0.1；5：IPTG浓度为0.2；6：IPTG浓度为0.4；7：IPTG添加后诱导温度为16℃；8：IPTG添加后诱导温度为22℃；9：IPTG添加后诱导温度为28℃；
图7为不同条件下工程菌BS168/pHT-sinR-aprN生物量和纳豆激酶活力比较图。泳道M: 蛋白Marker; 1: OD值为0.6；2: OD值为1.2；3: OD值为1.8；4：IPTG浓度为0.1；5：IPTG浓度为0.2；6：IPTG浓度为0.4；7：IPTG添加后诱导温度为16℃；8：IPTG添加后诱导温度为22℃；9：IPTG添加后诱导温度为28℃。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂等均购于上海生工生物工程股份有限公司；质粒购于优宝生物；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、大肠杆菌DH5α菌株、纳豆芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌168购于天根生物公司；引物购于英潍捷基（上海）贸易有限公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。
实施例1
以B. subtilis 168和B. subtilis natto（Bacillus subtilis natto）MH-1为出发菌株，按照图1构建基因工程菌，具体操作过程依次按照下列步骤进行：
1、分别将B. subtilis 168和B. subtilis natto（Bacillus subtilis natto）MH-1培养在50 mL LB培养基中37°C摇床培养24 h。
2、取3 mL菌液10,000×g离心5 min弃去上清，按照试剂盒说明提取基因组DNA。
3、以转录调控因子sinR和纳豆激酶编码基因aprN为目的基因，分别以B. subtilis 168和B. subtilis natto MH-1的DNA为模板设计引物对（第一引物对和第二引物对）如下：
Primer-F 5'-CGC GGATCC TTGATTGGCCAGCGTATTAAAC 3'（ SEQ ID No：3）
Primer-R 5'-ATTTGCGGCCGCCTACTCCTCTTTTTGGGATTTTC 3'（ SEQ ID No：4）
Primer-F 5'-CCC TCTAGA GTGAGAAGCAAAAAATTGTG 3'（ SEQ ID No：5）
Primer-R 5'-TCC GCGGCCGCTTGTGCAGCTGCTTGTACG 3'（ SEQ ID No：6）
其中，第一引物对包括如SEQ ID No：3所示的第一上游引物和如SEQ ID No：4所示的第一下游引物；第二引物对包括如SEQ ID No：5所示的第二上游引物和如SEQ ID No：6所示的第二下游引物；上游引物酶切位点为BamHI（sinR-F中所示下划线部分，对应上述SEQID No：3中下划线部分）和XbaI（aprN-F中下划线部分，对应上述SEQ ID No：5中下划线部分），下游引物酶切位点为NotI（sinR-R中下划线部分，对应上述SEQ ID No：4中下划线部分）和SmaI（aprN-F中下划线部分，对应上述SEQ ID No：6中下划线部分）。
PCR扩增体系为：DNA 0.5 uL，5×Primer star Buffer 5 uL，上下游引物各0.5uL，dNTP 2 uL，Primer star 0.25 uL，ddH2O补至25 uL，PCR扩增条件：94 ℃ 变性5 min，30个循环（95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s），最后72℃延伸10 min。反应结束后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。由图2可知，目的片段大小约为300 bp和1100 bp左右，与sinR（336 bp）和aprN（1146 bp）的长度一致。对目的片段按照OMEGA凝胶回收试剂盒说明书进行切胶回收。
4、扩增产物纯化后，用BamHI和NotI对sinR PCR产物和载体pHT43-His进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4 h，得到重组质粒pHT-sinR。
用XbaI和SmaI对aprN PCR产物和载体pHT43-His进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4 h，得到重组质粒pHT-aprN。
用XbaI和SmaI对aprN PCR产物和重组质粒pHT-sinR进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4 h，得到重组质粒pHT-sinR-aprN。
5、10 μL重组质粒pHT-sinR、pHT-aprN、pHT-sinR- aprN加入200 μL新鲜制备的E. coli DH5α感受态细胞中，混匀内容物，冰浴上放置30 min后放入42℃循环水浴中，热激90s。快速转移到冰浴中，使之冷却2～3 min。每管加LB培养基800 μL，在37℃摇床上（转速不超过225 rpm）温育45 min。取200 μL菌液均匀涂布到含有100 μg/μL 氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将平板置于37℃温箱中培养12 h，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA并鉴定，得到多拷贝质粒pHT-sinR、pHT-aprN、pHT-sinR- aprN。
6、将从E. coli DH5α提取得到的多拷贝质粒pHT-sinR、pHT-aprN、pHT-sinR- aprN利用电转化法转化B. subtilis 168感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，于37°C恒温培养箱中培养过夜（12-16 h）。从转化平板中挑取单菌落，菌落PCR验证结果（见图3）表明提取菌落均为BS168/pHT-sinR、BS168/pHT-aprN、BS168/pHT-sinR- aprN的阳性克隆。
7、将阳性克隆菌落从斜面培养基上挑取至40 mL LB种子培养基中进行培养，于37°C恒温培养箱中培养24 h。
8、分别将B. subtilis 168、B. subtilis natto原始菌株和重组菌BS168/pHT-sinR、BS168/pHT-aprN、BS168/pHT-sinR- aprN种液分别按5%的接种量接入含100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中。摇瓶发酵培养基(w/v%)成分为：甘油6.96，豆粕粉1.25，Na2HPO4·12H2O 0.4，KH2PO4 0.1，MgSO4·7H2O 0.06，CaCl2 0.01，蛋氨酸0.02，色氨酸0.01，苯丙氨酸0.01，酪氨酸0.01，pH7.3。37°C下220 r/min培养至OD为1.2，重组菌菌液中加入IPTG 0.2 mmol/L后接着22°C培养12 h，B. subtilis 168、B. subtilis natto原始菌株37°C下220 r/min培养到与重组菌相同的时间。发酵结束后，B. subtilis 168、B. subtilis natto原始菌株和重组菌BS168/pHT-sinR、BS168/pHT-aprN、BS168/pHT-sinR- aprN菌体生物量分别为达到4.3±0.23、8.9±0.45、2.4±0.25、2.8±0.26、2.0±0.21 g/L（见图4）。采用SYBR Green Real-Time qPCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，测得BS168/pHT-sinR、BS168/pHT-aprN、BS168/pHT-sinR-aprN菌株sinR表达水平是B. subtilis 168的3.2、1和2.6倍，aprN表达水平是B. subtilis 168的1、2.9和2.4倍（见图5）。
9、取1 mL发酵液，8000×g离心2 min，稀释一定浓度后取10 μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18 h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。由图4可以看出，B. subtilis 168、B. subtilis natto原始菌株和重组菌BS168/pHT-sinR、BS168/pHT-aprN、BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力分别为248±14、3120±62、589±23、4520±78、7748±69 U/mL（见图5）。由此可以看出，B. subtilisnatto中纳豆激酶活力较高，这与其菌体内含有编码纳豆激酶的基因aprN有关。当将该基因转入B. subtilis 168中大量表达，纳豆激酶活力比B. subtilis 168提高了18倍，比B. subtilis natto提高了1.4倍。sinR的大量表达对于促进aprN的转录翻译，具有非常明显的促进作用。当在B. subtilis 168中大量表达sinR基因时，纳豆激酶活力比B. subtilis168提高了2.4倍，sinR和aprN同时大量表达，纳豆激酶活力达到了最大，比B. subtilisnatto提高了2.5倍。
实施例2
本实施例与实施例1的不同点在于，1、将BS168/pHT-sinR- aprN种液分别按5%的接种量接入含100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中。摇瓶发酵培养基(w/v%)成分为：甘油4.48，豆粕粉2.15，Na2HPO4·12H2O 0.3，KH2PO4 0.15，MgSO4·7H2O 0.02，CaCl2 0.008，蛋氨酸0.025，色氨酸0.012，苯丙氨酸0.01，酪氨酸0.01，pH7.3。37°C下220 r/min培养至OD为0.6，重组菌菌液中加入IPTG 0.2 mmol/L后接着22°C培养12 h。发酵结束后，SDS-PAGE检测重组菌BS168/pHT-sinR- aprN纳豆激酶含量较低（见图6），菌体生物量为1.1±0.21 g/L（见图7）。
2、取1 mL发酵液，8000×g离心2 min，稀释一定浓度后取10 μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18 h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。重组菌BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力分别为3021±65 U/mL（见图7）。
实施例3
本实施例与实施例1的不同点在于，1、将BS168/pHT-sinR- aprN种液分别按5%的接种量接入含100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中。摇瓶发酵培养基(w/v%)成分为：甘油5.21，豆粕粉1.15，Na2HPO4·12H2O 0.25，KH2PO4 0.09，MgSO4·7H2O 0.04，CaCl2 0.007，蛋氨酸0.018，色氨酸0.01，苯丙氨酸0.01，酪氨酸0.01，pH7.3。37°C下220 r/min培养至OD为1.8，重组菌菌液中加入IPTG 0.2 mmol/L后接着25°C培养12 h。发酵结束后，SDS-PAGE检测重组菌BS168/pHT-sinR- aprN纳豆激酶含量较高（见图6），菌体生物量为2.9±0.25 g/L（见图7）。
2、取1 mL发酵液，8000×g离心2 min，稀释一定浓度后取10 μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18 h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。重组菌BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力分别为2452±67 U/mL（见图7）。
实施例4
本实施例与实施例1的不同点在于，1、将BS168/pHT-sinR- aprN种液分别按5%的接种量接入含100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中。摇瓶发酵培养基(w/v%)成分为：甘油6.28，豆粕粉1.95，Na2HPO4·12H2O 0.45，KH2PO4 0.09，MgSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.007，蛋氨酸0.023，色氨酸0.009，苯丙氨酸0.01，酪氨酸0.01，pH7.0。37°C下220 r/min培养至OD为0.8，重组菌菌液中加入IPTG 0.1 mmol/L后接着22°C培养12 h。发酵结束后，SDS-PAGE检测重组菌BS168/pHT-sinR- aprN纳豆激酶含量较低（见图6），菌体生物量为2.7±0.21 g/L（见图7）。
2、取1 mL发酵液，8000×g离心2 min，稀释一定浓度后取10 μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18 h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。重组菌BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力分别为3245±58 U/mL（见图7）。
实施例5
本实施例与实施例1的不同点在于，1、将BS168/pHT-sinR- aprN种液分别按5%的接种量接入含100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中。摇瓶发酵培养基(w/v%)成分为：甘油4.48，豆粕粉2.15，Na2HPO4·12H2O 0.3，KH2PO4 0.15，MgSO4·7H2O 0.02，CaCl2 0.008，蛋氨酸0.025，色氨酸0.012，苯丙氨酸0.01，酪氨酸0.01，pH7.3。37°C下220 r/min培养至OD为0.6，重组菌菌液中加入IPTG 0.4 mmol/L后接着22°C培养12 h。发酵结束后，SDS-PAGE检测重组菌BS168/pHT-sinR- aprN纳豆激酶含量较低（见图6），菌体生物量为1.2±0.21 g/L（见图7）。
2、取1 mL发酵液，8000×g离心2 min，稀释一定浓度后取10 μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18 h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。重组菌BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力分别为6421±64 U/mL（见图7）。
实施例6
本实施例与实施例1的不同点在于，1、将BS168/pHT-sinR- aprN种液分别按5%的接种量接入含100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中。摇瓶发酵培养基(w/v%)成分为：甘油4.96，豆粕粉2.21，Na2HPO4·12H2O 0.6，KH2PO4 0.11，MgSO4·7H2O 0.07，CaCl2 0.009，蛋氨酸0.022，色氨酸0.008，苯丙氨酸0.01，酪氨酸0.01，pH7.3。37°C下220 r/min培养至OD为1.0，重组菌菌液中加入IPTG 0.2 mmol/L后接着16°C培养12 h。发酵结束后，SDS-PAGE检测重组菌BS168/pHT-sinR- aprN纳豆激酶含量较低（见图6），菌体生物量为0.9±0.23 g/L（见图7）。
2、取1 mL发酵液，8000×g离心2 min，稀释一定浓度后取10 μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18 h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。重组菌BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力分别为5698±59 U/mL（见图7）。
实施例7
本实施例与实施例1的不同点在于，1、将BS168/pHT-sinR- aprN种液分别按5%的接种量接入含100 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中。摇瓶发酵培养基(w/v%)成分为：甘油6.87，豆粕粉2.72，Na2HPO4·12H2O 0.34，KH2PO4 0.12，MgSO4·7H2O 0.06，CaCl2 0.008，蛋氨酸0.025，色氨酸0.012，苯丙氨酸0.01，酪氨酸0.01，pH7.3。37°C下220 r/min培养至OD为0.9，重组菌菌液中加入IPTG 0.2 mmol/L后接着28°C培养12 h。发酵结束后，SDS-PAGE检测重组菌BS168/pHT-sinR- aprN纳豆激酶含量高（见图6），菌体生物量为3.1±0.18 g/L（见图7）。
2、取1 mL发酵液，8000×g离心2 min，稀释一定浓度后取10 μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18 h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。重组菌BS168/pHT-sinR-aprN菌体中纳豆激酶活力分别为2389±61 U/mL（见图7）。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽工程大学
<120> 一种纳豆激酶工程菌及提高纳豆激酶活力的方法
<130> 1
<141> 2021-03-05
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 336
<212> DNA
<213> 转录调控因子(sinR)
<400> 1
ttgattggcc agcgtattaa acaataccgt aaagaaaaag gctactcact atcagaacta 60
gctgaaaaag ctggggtagc gaagtcttat ttaagctcaa tagaacgaaa tctacaaacg 120
aacccctcca ttcaatttct cgaaaaagtc tccgctgttc tggacgtctc ggttcatact 180
ttgctcgatg agaaacatga aaccgaatac gatggtcaat tagatagtga atgggagaaa 240
ttggttcgcg atgcgatgac atccggggta tcgaaaaaac aatttcgtga atttttagat 300
tatcaaaaat ggagaaaatc ccaaaaagag gagtag 336
<210> 2
<211> 1146
<212> DNA
<213> 纳豆激酶编码基因(aprN)
<400> 2
gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60
gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120
gtcggattta agcagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180
gaaaaaggcg gaaaggttca aaagcaattt aagtatgtta acgcggccgc agcaacattg 240
gatgaaaaag ctgtaaaaga attgaaaaaa gatccgagcg ttgcatatgt ggaagaagat 300
catattgcac atgaatatgc gcaatctgtt ccttatggca tttctcaaat taaagcgccg 360
gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420
attgactctt ctcatcctga cttaaacgtc agaggcggag caagcttcgt tccttctgaa 480
acaaacccat accaggacgg cagttctcac ggtacgcatg tcgccggcac gattgccgct 540
cttaataact caatcggtgt tctgggcgta gcgccaagcg catcattata tgcagtaaaa 600
gtgcttgatt caacaggaag cggccaatat agctggatta ttaacggcat tgagtgggcc 660
atttccaaca atatggatgt tatcaacatg agccttggcg gacctactgg ttctacagcg 720
ctgaaaacag tagttgataa agcggtttcc agcggtatcg tcgttgctgc cgcagccgga 780
aacgaaggtt catccggaag cacaagcaca gtcggctacc ctgcaaaata tccttctact 840
attgcagtag gtgcggtaaa cagcagcaac caaagagctt cattctccag cgtaggttct 900
gagcttgatg taatggctcc tggcgtgtcc atccaaagca cacttcctgg aggcacttac 960
ggcgcttata acggaacgtc catggcgact cctcacgttg ccggagcagc agcgctaatt 1020
ctttctaagc acccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca 1080
acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140
caataa 1146
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
cgcggatcct tgattggcca gcgtattaaa c 31
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 4
atttgcggcc gcctactcct ctttttggga ttttc 35
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 5
ccctctagag tgagaagcaa aaaattgtg 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 6
tccgcggccg cttgtgcagc tgcttgtacg 30

Claims (10)

1.一种提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、分别提取枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的基因组DNA；
步骤二、以转录调控因子sinR和纳豆激酶编码基因aprN为目的基因，以枯草芽胞杆菌与纳豆芽胞杆菌的DNA为模板，分别设计第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，以得到sinR PCR产物和aprN PCR产物；
步骤三、以sinR PCR产物和aprN PCR产物构建串联sinR与aprN的重组质粒；
步骤四、将重组质粒转化枯草芽胞杆菌感受态细胞，以得到阳性克隆菌落；
步骤五、对阳性克隆菌落依次进行种子培养基培养和发酵培养。
2.根据权利要求1所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述第一引物对包括如SEQ ID No：3所示的第一上游引物和如SEQ ID No：4所示的第一下游引物；所述第二引物对包括如SEQ ID No：5所示的第二上游引物和如SEQ ID No：6所示的第二下游引物。
3.根据权利要求1所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述步骤三中构建串联sinR与aprN的重组质粒的方法包括如下步骤：
A1、采用BamHI和NotI对sinR PCR产物和载体pHT43-His进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pHT-sinR；
A2、采用XbaI和SmaI对aprN PCR产物和重组质粒pHT-sinR进行双酶切，回收产物用T4连接酶连接得到重组质粒pHT-sinR-aprN。
4.根据权利要求3所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述步骤四中得到阳性克隆菌落的方法包括如下步骤：
B1、将重组质粒pHT-sinR-aprN加入E. coli DH5α感受态细胞中，以扩增质粒pHT-sinR-aprN；
B2、将质粒pHT-sinR-aprN利用电转化法转化B. subtilis 168感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，经培养后得到BS168/pHT-sinR- aprN的阳性克隆菌落。
5.根据权利要求4所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述B1中扩增质粒pHT-sinR-aprN的方法是对加入重组质粒pHT-sinR-aprN的E. coli DH5α感受态细胞混匀后，先在冰浴上放置30 min，之后放入42℃循环水浴中热激90 s；然后转移至冰浴中冷却2-3 min后，加LB培养基37℃摇床温育45min，再取菌液涂布于氨苄青霉素的LB琼脂平板上，经37℃培养后，提取质粒。
6.根据权利要求4所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述B2中培养是在37℃恒温培养箱中培养12-16 h。
7.根据权利要求1所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述发酵培养采用的发酵培养基成分为：每L含有甘油4-7 g，豆粕粉1-3 g，Na2HPO4·12H2O 0.2-0.8 g，KH2PO40.06-0.15 g，MgSO4·7H2O 0.04-0.08 g，CaCl2 0.006-0.015 g，蛋氨酸0.015-0.025 g，色氨酸0.008-0.012 g，苯丙氨酸0.01 g，酪氨酸0.01 g，pH7.0-7.5。
8.根据权利要求1所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为37℃，转速为200-250r/min。
9.根据权利要求8所述提高纳豆激酶活力的方法，其特征在于，发酵培养至OD为1.2，菌液中加入IPTG ，且使IPTG的浓度为0.2 mmol/L，之后22℃培养12h。
10.一种纳豆激酶工程菌，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述方法构建得到。
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