CN104593343A - 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达法 - Google Patents
一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104593343A CN104593343A CN201510017906.9A CN201510017906A CN104593343A CN 104593343 A CN104593343 A CN 104593343A CN 201510017906 A CN201510017906 A CN 201510017906A CN 104593343 A CN104593343 A CN 104593343A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- expression
- fusion protein
- thrombolytic
- rpa
- hv12p
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 title claims abstract description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 19
- 108010051412 reteplase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 10
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 229960002917 reteplase Drugs 0.000 claims description 5
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 10
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 abstract description 9
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 abstract 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 7
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 7
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 6
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 101150006605 rpa gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940127217 antithrombotic drug Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108010010961 hirudin HV3 Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000010993 response surface methodology Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物制药领域，具体涉及到一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白-水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白（HV12p-rPA）的高效表达法。本方法筛选优化了大肠杆菌工程菌摇瓶培养条件中的七个主要因素（培养基的配制、接种量、诱导时间、转速、诱导温度、补料方式、微量元素），确定出影响目标蛋白表达量的三个最重要因素为转速、温度及钙离子浓度，并使目标蛋白HV12p-rPA的表达量达到36.15%。本法简单、易行、高效，成本相对低，具有良好应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及新型抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞普替酶融合蛋白（HV12p-rPA）在pET21a-HrP/BL21大肠杆菌工程菌中的高效表达方法。
背景技术
本发明中的高效表达目标为水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白（HV12p-rPA），是通过一个(Gly)3柔性肽基团将重组水蛭素HV3的C末端12肽与rPA基因融合而成的一种同时具有抗凝溶栓双功能的全新蛋白（专利号：ZL 2006 1 0022457.8）。该蛋白通过目前最常用的表达系统--大肠杆菌进行表达，其表达水平的高低直接影响后续的研究及其产业化的进展，但该融合蛋白在大肠杆菌中的表达量很低，韦利军等在 “抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽--瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达” （[J].药物生物技术，2007，14（3）：168-172）中得到的HV12p-rPA融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的12%。蛋白表达量过低，不仅加大了后续分离纯化等工作的研究难度，且限制了该蛋白在药物研究与开发方面的应用潜力。因此，选用适当的方法筛选优化工程菌发酵条件，建立一套完善的目标蛋白高表达的方案将十分必要。
目前，已有很多文献针对第三代溶栓药r-PA的表达进行了报道，如，孔扬在“重组组织型纤溶酶原激活剂变异体工程菌的培养与体外复性的研究”（[D].山东：山东大学微生物学系，2005.）中，构建了E.coli pTPA3/BL21，并通过单因素法优化其培养条件，表明40℃、200rpm、20-40ummol/l的IPTG诱导4-5h，可表达得到rPA约占细胞总蛋白的36.2%。赵友春等在“组织型纤溶酶原激活剂重组变异体Reteplase的克隆表达和分离纯化”（[J].山东大学学报工学版，2003，33（2）：216-220）中，构建了大肠杆菌工程菌pTPA3/BL21，该菌种在37℃、1mmol/l的IPTG诱导4h，表达的r-PA占菌体蛋白的40%。孙雄华等在“瑞替普酶在大肠杆菌中的表达与活性测定”（[J].中国血液流变学杂志，2006，16（4）：534-536）中，成功在大肠杆菌中表达了带组氨酸标签的r-PA，但其目的在于简化下游分离纯化步骤，而非提高目标蛋白表达产率，因而于180rpm、1mmol/l的IPTG诱导5h，表达后电泳仅可见目标蛋白条带，表达量未报道。王伟等在“瑞替普酶融合蛋白的表达、纯化及分子伴侣对其复性的影响”（[J].安徽医科大学学报，2013，48（11）：1287-1291）中，成功构建了工程菌PET-32a-r-PA/ BL21，并在37℃、150-250rpm、0.5umol/l的IPTG诱导3h条件下实现了r-PA的表达，表达量未说明。
本项发明在前期工作中已成功构建了大肠杆菌HV12p-rPA /BL21工程菌。经发酵、诱导后，获得HV12p-rPA融合蛋白。该融合蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌细胞中，经复性及纯化、体外生物学活性检测及动物体内药效研究后，已被证实具有抗凝、溶栓双重功能。因此，该融合蛋白在研发成为兼具抗凝溶栓双重功能的新一代抗血栓药方面具备巨大的潜力。但鉴于HV12p-rPA是一种全新的、兼具抗凝溶栓双功能的融合蛋白，目前还没有文献对其高表达条件进行研究和报道。采用上述文献中的表达条件进行该新型蛋白的表达，均不能获得高表达结果。
基因工程菌细胞高密度培养是获得高产量外源蛋白的一种重要策略。大肠杆菌是多种重组蛋白表达时的首选宿主， 筛选优化大肠杆菌发酵条件的常用方法有单因素法、正交法、响应面法等。单因素法耗时长，操作中偶然因素影响大，此外，各因素间的交互作用无法考察，致使试验结果的准确度较低；正交法可筛选多水平多因素中的较优条件组合，但由于无法拟合影响因素与响应值间的函数关系，不能对所有因素进行面分析，故一般难以得到最优条件；响应面法则试验次数少，周期短，既可充分考察各因素间的交互作用，也可通过解析回归方程求出最优参数值，大大提高了实验的精确度，可弥补以上优化方法的不足。本发明同时采用上述这些筛选手段对HV12p-rPA这种崭新的蛋白进行高效表达条件的研究，建立了HV12p-rPA到目前为止表达量达36%的高效方法。
发明内容
本发明提供了一种重组大肠杆菌高效表达新型抗凝溶栓双功能融合蛋白--水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白（HV12p-rPA）的方法，如下：
以体积比1%的接种量，将15%甘油管保存的、含有HV12p-rPA融合基因的pET21a-HrP/BL21大肠杆菌工程菌菌种接种至含100ug/ml Amp的新鲜LB液体培养基中，于37℃，200rpm条件下，培养12h，使菌种得到活化，然后向培养基中加入0.5-1.5 mmol/L CaCl2或20mmol/L MgCl2至少一种，再以体积比5%接种量加入活化菌液，于37-39℃，180-220rpm下发酵培养3h，最后加入终浓度为1mmol/L的IPTG作为诱导剂，37-39℃和180-220rpm条件下摇瓶培养4h，结束后，收菌，即4℃下以8000rpm离心3min，所得菌体沉淀以PBS（pH7.4）吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体，超声破菌后获得表达量为20-36%的目标蛋白。
采用正交法结合响应面法对含有HV12p-rPA融合基因的pET21a-HrP/BL21大肠杆菌工程菌培养条件进行筛选及优化，确立了发酵培养的最佳条件，即温度38.06℃，转速207.84 rpm，Ca2+浓度1.05 mmol/L,最佳平均表达量为36.15%。
上述重组大肠杆菌高效表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法，在发酵培养阶段，通过控制转速间接控制通氧量，使培养基中的重组大肠杆菌大量繁殖，缩短了发酵周期。在诱导阶段，适当提高培养温度，既促进菌体生长，又有利于提高工程菌的表达量。该方法的优点在于易于操作、工艺简单，且表达量高、成本相对低，具有良好应用价值。
具体实施方式：
实施例一：
1.重组大肠杆菌工程菌表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法：
①摇瓶发酵：用蒸馏水新鲜配制LB液体培养基，加入100ug/ml的Amp溶液，再以1%的接种量，将15%甘油管保存的菌种接种至培养基中，37℃、200rpm培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5%的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含Amp100ug/ml，Ca2+ 1mmol/L、Mg2+20mmol/L，继续培养3h后，加1.5mmol/L IPTG作为诱导剂，39℃、200rpm诱导4h。
②收菌：诱导结束后，于4℃条件下，以8000rpm离心3min，所得菌体沉淀以PBS（pH7.4）吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体。
③菌体的破碎：以Tris-Cl（pH 8.0）重悬菌体，250W，5s×10s，冰浴超声累计5min，12000rpm,4℃离心20min得包涵体，-20℃保存。
2.结果鉴定：所得包涵体蛋白经12%SDS-PAGE电泳后，以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后进行扫描，所得目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量为31%。
实施例二：
1.重组大肠杆菌工程菌表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法：
①摇瓶发酵：用蒸馏水新鲜配制LB液体培养基，加入100ug/ml的Amp溶液，再以1%的接种量，将15%甘油管保存的菌种接种至培养基中，37℃、200rpm培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5%的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含Amp100ug/ml，Ca2+ 1mmol/L、Mg2+20mmol/L，继续培养3h后，加1mmol/L IPTG作为诱导剂，38℃、200rpm诱导4h。
②收菌：诱导结束后，于4℃条件下，以8000rpm离心3min，所得菌体沉淀以PBS（pH7.4）吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体。
③菌体的破碎：以Tris-Cl（pH 8.0）重悬菌体，250W，5s×10s，冰浴超声累计5min，12000rpm,4℃离心20min得包涵体，-20℃保存。
2.结果鉴定：所得包涵体蛋白经12%SDS-PAGE电泳后，以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后进行扫描，所得目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量为36%。
实施例三：
1.重组大肠杆菌工程菌表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法：
①摇瓶发酵：用蒸馏水新鲜配制LB液体培养基，加入100ug/ml的Amp溶液，再以1%的接种量，将15%甘油管保存的菌种接种至培养基中，37℃、200rpm培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5%的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含Amp100ug/ml，Ca2+ 1.05mmol/L、Mg2+20mmol/L，继续培养3h后，加1mmol/L IPTG作为诱导剂，38.06℃、207.84rpm诱导4h。
②收菌：诱导结束后，于4℃条件下，以8000rpm离心3min，所得菌体沉淀以PBS（pH7.4）吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体。
③菌体的破碎：以Tris-Cl（pH 8.0）重悬菌体，250W，5s×10s，冰浴超声累计5min，12000rpm,4℃离心20min得包涵体，-20℃保存。
2.结果鉴定：所得包涵体蛋白经12%SDS-PAGE电泳后，以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后进行扫描，所得目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量为36.15%。
Claims (2)
1.一种高效表达新型抗凝溶栓双功能水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法，其表达条件为：将终浓度为100μg/ml的Amp+溶液加入到新鲜的LB液体培养基中，以体积比1%的接种量将含有HV12p-rPA融合基因的pET21a-HrP/BL21大肠杆菌工程菌菌种接种至培养基中，于37℃，200rpm条件下，培养12h，使菌种得到活化，然后向培养基中加入0.5-1.5 mmol/L CaCl2或20mmol/L MgCl2至少一种，再以体积比5%接种量加入活化菌液，于37-39℃，180-220rpm下发酵培养3h，最后加入终浓度为1mmol/L的IPTG作为诱导剂，37-39℃和180-220rpm条件下摇瓶培养4h，获得表达量为20-36%的目标蛋白。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：培养重组大肠杆菌的最优温度为38.06℃ ，最佳转速为207.84 rpm，最佳Ca2+浓度为 1.05 mmol/L,最佳表达量为36.15%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510017906.9A CN104593343A (zh) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510017906.9A CN104593343A (zh) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104593343A true CN104593343A (zh) | 2015-05-06 |
Family
ID=53119400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510017906.9A Pending CN104593343A (zh) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104593343A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113150168A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-07-23 | 武汉真福医药股份有限公司 | 一种qk纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白的制备方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101386639A (zh) * | 2008-04-25 | 2009-03-18 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的凝胶层析复性方法 |
| CN102250992A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-11-23 | 四川大学 | 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达 |
-
2015
- 2015-01-14 CN CN201510017906.9A patent/CN104593343A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101386639A (zh) * | 2008-04-25 | 2009-03-18 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的凝胶层析复性方法 |
| CN102250992A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-11-23 | 四川大学 | 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 余蓉 等: "抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达", 《药物生物技术》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113150168A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-07-23 | 武汉真福医药股份有限公司 | 一种qk纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白的制备方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101255438A (zh) | 表达人组织激肽释放酶的转基因莱茵衣藻的构建方法 | |
| CN106754601A (zh) | 一种应用磷脂酶c将胞内蛋白在胞外表达的方法 | |
| CN103864914B (zh) | 高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法 | |
| CN103320461B (zh) | 在Pichia pastoris中组成型表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法 | |
| CN102181469A (zh) | 枯草芽孢杆菌表面展示人血清白蛋白重组芽孢及其制备方法 | |
| CN102618552A (zh) | 一种重组艾塞那肽的生产工艺 | |
| CN109266675A (zh) | 一种生产脂肽的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN118772263A (zh) | 一种可促进细胞迁移的重组人源ⅲ型胶原蛋白及其制备方法、应用 | |
| WO2025092054A1 (zh) | 一种新的i型重组胶原蛋白、其生产方法及用途 | |
| CN110257314B (zh) | 一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用 | |
| CN112175839B (zh) | 一种d-泛解酸内酯水解酶及其产生菌、基因工程菌及它们的应用 | |
| CN106939315A (zh) | 一种草酸脱羧酶的制备方法及应用 | |
| CN103103205B (zh) | 编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用 | |
| CN102898511B (zh) | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原i12c制备中的纯化方法 | |
| CN104131021A (zh) | 抗菌肽共表达载体及其构建和表达方法 | |
| CN104593343A (zh) | 一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达法 | |
| CN106034738B (zh) | 一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法 | |
| KR101426441B1 (ko) | 두날리엘라 유래의 탄산 무수화 효소 및 파이오덱틸룸 트리코뉴툼 ｃｃｍｐ637 유래의 포스포에놀피부르산 카르복실아제를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유기산의 생산방법 | |
| CN105940956B (zh) | 一种以柞蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法 | |
| CN105274128A (zh) | 一种利用基因工程高效表达酰胺化ec07的方法 | |
| CN108948163A (zh) | 澳洲坚果植物防御素及其应用 | |
| CN105087725B (zh) | 一种提高大肠杆菌中可溶性重组原动蛋白2β表达水平的方法 | |
| CN109868281A (zh) | 一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法 | |
| CN108441501B (zh) | 莲子草假隔链格孢菌效应子Na2-g9900及其蛋白和应用 | |
| CN102344900A (zh) | 表达降血压肽的工程菌及制备降血压肽方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150506 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |