NO177500B

NO177500B - Fremgangsmåte til fremstilling av en terapeutisk aktiv hirudinvariant

Info

Publication number: NO177500B
Application number: NO874905A
Authority: NO
Inventors: Michael Courtney; Eric Degryse; Gerard Loison; Yves Lemoine
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 1986-12-01
Filing date: 1987-11-25
Publication date: 1995-06-19
Also published as: AU617989B2; FI99211C; NO874905D0; CS276245B6; BG49719A3; DK173247B1; EP0273800A2; KR880007729A; PT86233B; PT86233A; ATE73462T1; DE3777367D1; HUT45564A; FR2607517B2; GR3004556T3; JPS63152987A; IE60544B1; ZA879011B; CA1341416C; EP0273800B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av en terapeutisk aktiv hirudinvariant hvor aminosyren i posisjon 47 kan være Arg, His eller Lys og/eller aminosyren i posisjon 63 kan være Glu eller Asp og hvor variantene er sulfaterte eller ikke.

I litteraturen er det beskrevet minst tre naturlige varianter av hirudin (Markwardt 1970; Petersen et al. 1976; Markwardt og Walsmann 1976; Chang 1983; Dodt et al., 1984, 1985, 1986; Harvey et al. 1986; fransk patentskrift 84.04755).

En sammenligning av sekvensene i disse tre variantene er vist på fig. 1.

Den første variant, HVI, svarer til hirudin som er isolert fra kroppen til blodigler, den annen variant, HV2 (Harvey et al, 1986), avviker fra den første mht. hi aminosyrer, den tredje variant (Dodt et al. 1986), er identisk med HV2 til og med serin 32, men har 10 aminosyrer som er annerledes i C-terminal-partiet, som i tillegg inneholder en ekstra aminosyre (Ala63). Denne tredje variant vil heretter bli kalt HV3.

Disse sekvenser inneholder 65 eller 66 aminosyrer og kan ses på som to domener: et globulært N-terminalparti som inneholder tre disulfidbroer, og et surt C-terminalparti som oppviser en homologi med det sted som spaltes av trombin i protrombinmole-kylet. Denne homologi antyder at området rundt posisjon 47 kan være bindingsstedet for hirudin til trombin.

Videre inneholder naturlig hirudin et sulfatert tyrosin i posisjon 63 (Chang, 1983). I varianten HV3 dukker dette tyrosin opp igjen i posisjon 64. Heretter vil dette tyrosin bli betegnet som "posisjon 63" for alle variantene, idet dets funksjon er den samme uavhengig av posisjonen.

En sammenlignende analyse av sekvensene i den naturlige variant av hirudin gjør det mulig teoretisk å forutsi dannelsen av nye varianter hvor egenskapene til de naturlige molekyler er kombinert på forskjellige måter.

HVI og HV3 har lysin i posisjon 47 mellom to prolinmolekyler, som antageligvis er ansvarlig for å blokkere det aktive sted på trombin (Dodt et al. 1984 og 1985).

Siden HV2 ikke har en basisk aminosyre i denne posisjon, men et aspargin, synes det ønskelig å innføre lysin eller et arginin på dette punkt for å gjøre molekylet mer overensstem-mende med det man forventer av en trombininhibitor (Chang 1985), eller alternativt et histidin, som ikke er forenlig med å være et godt substrat for trombin, men som muligens kan øke den inhiberende effekt av hirudinet.

Videre representerer sulfatering av tyrosin i posisjon 63 en forskjell mellom naturlig hirudin og hirudin fremstilt ved genetisk rekombinasjon, som kan slå tilbake på dets aktivitet som antydet av kinetiske undersøkelser gjort av Stone og Hofsteenge (1986). Et forsøk kan gjøres på å etterligne det naturlige protein ved å substituere tyrosinet med en sur aminosyre såsom Glu eller Asp.

Det er således hensikten med foreliggende oppfinnelse å fremskaffe varianter av hirudin som inneholder en aminosyre forskjellig fra den naturlige som finnes i posisjon 47 og 63.

Denne hensikt er oppfylt ved foreliggende oppfinnelse som angitt i kravene.

Oppfinnelsen angår fremstilling av varianter av hirudin som inneholder en aminosyre forskjellig fra den aminosyre som eksisterer i den naturlige versjon i posisjon 47 eller 63.

En slik variant er fortrinnsvis en variant av hirudin HVI,

HV2 eller HV3.

Blant de aktuelle varianter bør følgende nevnes:

fi 3

- varianter hvor aminosyren Tyr er byttet ut med en sur aminosyre, spesielt Glu eller Asp;

- varianter hvor aminosyren i posisjon 47 i den naturlige

form er byttet ut med Arg eller His;

4 7 - varianter hvor Asn i den naturlige form av HV2 er byttet ut med Lys.

Følgende foretrukne varianter bør nevnes spesielt:

(Lys<47>) HV2

(Arg<47>) HV2

(His<47>) HV2

(Glu<63>) HV2

(Asp<63>) HV2

Varianten (Lys<47>) HV2 (eller "rrn^-Lys47") som er nevnt ovenfor, svarer til følgende formel:

De forskjellige varianter som har beholdt Tyr 6 3, kan brukes

i sulfatert eller annen form. Denne sulfatering kan utføres kjemisk eller biologisk.

Oppfinnelsen omfatter de biologiske og/eller kjemiske metoder som de før nevnte varianter kan fremstilles ved.

Disse varianter kan oppnås syntetisk, semisyntetisk og/eller ved de kjente teknikker til genmanipulasjon.

For eksempel er kloning og ekspresjon av de forskjellige sekvenser som koder for HVI, HV2 og HV3, spesielt HV2, og produksjon av det korresponderende hirudin fra gjærkulturer beskrevet i patentsøknad EP-A-200 655.

Variantene kan fremstilles ifølge denne oppfinnelse ved ekvi-valente teknikker etter modifisering av de kodende sekvenser som er nevnt ovenfor, f.eks. ved rettet mutagenese.

Spesielt ved in vitro-rettet mutagenese ble det fremstilt varianter hvor asparaginet 47 er erstattet av et lysin, et arginin eller et histidin, og hvor tyrosinet 63 er erstattet av en glutaminsyre.

Spesielt er det mulig å bruke funksjonelle ekspresjonsblokker som beskrevet i patentsøknad EP-A-200 655, hvor hirudinsekvensen koder for de nevnte varianter. Disse funksjonelle DNA-blok-ker kan bæres av et vektorplasmid.

For å dirigere gjærekspresjon og -sekresjon av genene svarende til de forskjellige varianter (i gjær) blir disse integrert i en vektor for gjær som fortrinnvis har følgende elementer, som er beskrevet i patentsøknad EP-A-200 655:

- replikasjonsutgangspunktet (ORI) for 2 ^-plasmidet av gjær,

- ura3-genet,

- ORI for E. coli og en markør for antibiotikaresistens,

- en transkripsjonspromotor, ledersekvensen og preprosekvensen for forløperen til alfafaktoren, idet denne sekvens er plassert i fase oppstrøms fra den sekvens som koder for varianten av hirudin, - transkripsjonsterminatoren for PGK-genet til gjær, som vil være plassert nedstrøms fra genet til den nevnte variant.

Oppfinnelsen angår også dyrking av gjærceller som er transformert av disse vektorer eller av denne funksjonelle DNA-blokk, og deres anvendelse til fremstilling av varianter av hirudin.

Spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av en variant av hirudin ved dyrking av en gjær i henhold til oppfinnelsen og utvinning av det hirudin som produseres i kulturmediet, i moden form eller i form av en forløper som kan modnes in vitro.

Den anvendte teknikk er allerede beskrevet nærmere i patent-søknadene EP-A-200 655 og EP 87 401649.6.

De varianter av hirudin som fås ved disse metoder, kan som beskrevet i patentsøknad EP-A-200 655 brukes som en trombininhibitor, både in vivo og in vitro.

Spesielt kan variantene brukes i farmasøytiske sammen-setninger, alene eller i kombinasjon med andre aktive elementer, eller alternativt i sammenheng med tester eller diagnoser, in vitro eller in vivo. I forbindelse med bruk in vivo kan det være fordelaktig å merke variantene, f.eks. med en radioaktiv, fluorescerende, enzymatisk eller annen markør.

De følgende eksempler belyser anvendeligheten av produktet fremstilt ifølge fremgangsmåten samt fresmtillingen ved hjelp av fig. 1, som viser sekvensene for tre naturlige varianter av hirudin, nemlig HVI, HV2 og HV3, og ved hjelp av fig. 2, som viser prosentuell inhibering av den proteolytiske aktivitet av trombin på kromozymet uttrykt som volum av supernatanter av gjærkulturer som produserer hirudinet rHV2 eller varianter av dette.

Eksempel 1

Fremstilling av forskjellige varianter av HV2 ved mutagenese in vitro.

Ved utførelse av in vitro mutagenese blir de DNA-fragmentene som man ønsker å modifisere, klonet inn i den replikative form av en enkelttrådet fag, genomet til den rekombinante fag isolert og hybridisert med et syntetisk fremstilt oligonukleotid som bærer den muterte sekvens. Dette oligonukleotid tjener som en primer for syntesen av den komplementære tråd, og DNAet, som på denne måte gjøres dobbelttrådet, brukes til å transformere en mottakerbakterie som vil produsere fagen som bærer den ønskede mutasjon (Zoller og Smith, 1983).

Plasmid pTG720, som er beskrevet i patentsøknad EP-A-158 564, er en vektor for ekspresjon av hirudin i E. coli. Plasmid pTG730 ble avledet fra pTG720 ved tilføyelse av et EcoRI-sete nedstrøms fra den sekvens som koder for hirudin. EcoRI-setet gjør det mulig å gjenvinne sekvensen som koder for hirudin, ved digerering med EcoRI på den ene siden og Clal på den andre siden.

Clal-EcoRI-fragmentet dekker hele den region som koder for hirudin, bortsett fra noen få 5<1->terminale kodoner. Dette Clal-EcoRI-fragment ble klonet mellom AccI- og EcoRI-stedene til et derivat av fag M13, som betegnes som M13TG131 (Kieny et al., 1983). Den fag som avledes fra M13TH131, og som inneholder denne hirudinsekvens, benevnes M13TG1919.

Tre oligonukleotider ble syntetisert, og alle kunne parres med sekvensen 5'-GTACACCG AACCCTGAAAG-3' av M13TG1919, bortsett fra deres sentrale område som svarer til den ønskede mutasjon. Sekvensene til disse oligonukleotider er som følger:

Disse oligonukleotider ble konstruert for å gjøre det mulig for AAC(Asn)-kodonet av M13TG1919 å erstattes med CAC (His), AAA (Lys) eller CGC (Arg).

120 picomol av hvert av oligonukleotidene ble fosforylert i 100 ul reaksjonsmedium, og omtrent 20 picomol fosforylert oligonukleotid ble hybridisert med 1 picomol enkelttrådet DNA fra fag M13TG1919 i 25 mikroliter hybridiseringsbuffer.

Etter hybridisering ble blandingen av DNA utsatt for virk-ningen av Klenow-polymerase og fag T4-ligase. Hver av de blandinger som var behandlet på denne måte, ble brukt til å transfisere E. coli-stammen 71/18 (mut L) på tepper (lawns) med indikatorbakterier JM103 (Messing et al., 1981). De infiserte bakterier kan identifiseres fordi de danner kolonier som vokser saktere enn de andre; disse kolonier ble videre-foredlet på fullstendig medium og deretter overført til Whatman 540-papir for å sortere ut de celler som inneholder de mutante fager.

Denne utsortering utføres ved hybridisering in situ med de ovenfor brukte oligonukleotider som primer. Tre nye fager inneholdende de ønskede mutantsekvenser ble oppnådd på denne måte:

Videre ble samme type forsøk utført med et oligonukleotid TG434 med sekvensen 5'-ATTGTAA CTCTTCTTCTG-3'. Dette oligonukleotid hybridiserer med sekvensen 5'-CAGAAGAA TATTTACAAT som er lokalisert i 3'-regionen til sekvensen som koder for HV2, med en uparret triplet beregnet på å erstatte kodonet TAT (Tyr 6 3) med GAG (Glu). Den korresponderende mutantfag M13TG1922 (Tyr<63>—>Glu) ble derved oppnådd.

Eksempel 2

Substitusjon av (0,6-kb)-PstI-HindIII-fragmentet av pTGl828 ved hjelp av mutantfragmentet.

Plasmid pTGl828 (beskrevet i patentsøknad EP-87 401649.6) bærer den kodende sekvens for hirudin etter preprosekvensene av genet for alfa-kjønnsferomonet til gjær; systemet er satt under kontroll av PGK-promotoren. Ved hjelp av denne fusjon mellom preprosekvensene av MF o( og hirudin følger det ut-trykte protein den normale prosess i gjær med sekresjon og modning, slik at behandlet og aktivt hirudin opptrer i kulturmediet.

Dette plasmid ble anvendt igjen til ekspresjon av sekvensene av mutert hirudin istedenfor naturlig hirudin.

Digerering av pTGl828 med Pstl og Hindlll frigjør fem fragmenter med omtrentlig størrelse på henholdsvis 3,8, 1,9, 1,5, 1,1 og 0,6 kb. Det siste fragment omfatter den sammenføyde preprohirudinsekvens. Dette fragment inneholder bare ett enkelt Accl-sted og ett enkelt EcoRI-sted. Den region som begrenses av disse to steder, omfatter hele hirudinsekvensen bortsett fra noen få 5'-terminale kodoner. 0,6 kb-Hindlll-Pstl-fragmentet ble satt inn mellom Hindlll- og Pstl-setene til en vektor som har verken EcoRI- eller Accl-seter.

Det plasmid som gjendannes på denne måten (pTGl9 60), inneholder således et enkelt Accl-sted og et enkelt EcoRI-sted lokalisert henholdsvis ved begynnelsen av hirudinsekvensen og nedstrøms i forhold til denne. Digerering av pTGl960 med AccI og EcoRI frigjør et fragment som inneholder stort sett hele hirudinsekvensen og resten av plasmidet.

Det store DNA-fragment som hirudinsekvensen er fjernet fra, renses på gel og blandes med produktet fra AccI/EcoRI-digerering av den replikative form av hver av de mutante fager beskrevet i eksempel 1, med det formål å gjendanne preprohiru-din med de nye HV2-varianter fremstilt ved rettet mutagenese.

4 7

Fire nye plasmider ble valgt: pTGl963 (Asn —^Arg), pTG1964 (Tyr<63>—^Glu), pTGl965 (Asn<47>—)His) ogpTG1966 (Asn47—> Lys), som avviker fra pTGl9 60 bare med hensyn til de muterte kodoner.

Disse sekvenser, som bærer de muterte kodoner, kan gjenvinnes

i form av PstI-HindIII-fragmenter og reklones i vektoren pTGl828 istedenfor det originale PstI-HindIII-fragment.'

Fire nye plasmider ble fremstilt på denne måte: pTGl977 (Asn<47>—>Arg), pTGl978 (Tyr<63>—>Glu), pTGl979 (Asn<47>—>His)

og pTGl9 80 (Asn 47—>Lys), som avviker fra det ovenfor beskrevne pTGl828 bare med hensyn til de mutasjoner som er skapt in vitro.

Eksempel 3

Transformasjon av TGYlsp4 med DNA fra pTHl977, pTGl978, pTGl979 og pTGl980.

S. cerevisia TGYlsp4(Mat-Ot -ura3 .251.373.382-his-3.11.15)-celler ble transformert med DNA fra pTGl977, pTGl978, pTGl979 og pTGl980. ura<+->transformanter ble oppnådd i alle tilfel-lene .

Fire stammer, TGYlsp4 pTGl9 77, TGYlsp4 pTGl978, TGYlsp4 pTGl979 og TGYlsp4 pTGl980 ble således oppnådd. Produksjonen av hirudin til disse fire typer og til TGYlsp4 pTGl828 ble

sammenlignet.

20 ml kultur (YNBG + 0,5% kasaminosyrer) ved OD^.0.02 ble

660

sådd med hver stamme. Etter 48 timers omrøring ved 30 C ble kulturen sentrifugert (5000 o/min, 5 min) og supernatantene undersøkt. En kultur av TGYlsp4 pTG881 (plasmid som ikke bærer den sekvens som koder for HV2) ble brukt som sammenligning.

Aktiviteten til de rå supernatanter blir målt i form av deres inhibitoriske virkning på trombinaktivitet (proteolytisk aktivitet på et syntetisk substrat, kromozym TH - Boehringer Mannheim). Prosentvis inhibering uttrykt som volum av supernatantene er gitt på fig. 2.

Det er observert at den inhibitoriske virkning som skaffes av

47 47

Arg - og Lys -variantene, er minst lik den som skaffes av naturlig HV2. Glu<63-> og His4^-variantene er noe mindre inhibitoriske enn HV2.

Eksempel 4

Inhibering av trombinaktivitet.

For klarere å demonstrere verdien av de varianter av hirudin som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, spesielt med hensyn til deres farmasøytiske anvendelse, vil de sammenlignende eksempler som følger, belyse de inhibitoriske egenskaper med hensyn til trombin av varianten HV2 og to andre varianter av HV2-typen, hvor aminosyren i posisjon 47 er skiftet ut med Arg eller Lys, alle fremstilt ved hjelp av rekombinant DNA.

For å studere kinetikken til disse varianters inhibering av trombin anvendes teorien om høyaffinitetsinhibitorer som beskrevet av J.W. Williams og J.F. Morrison i Methods in Enzym-ology 63 pp. 437-467, 1979, da hirudin er en reversibel inhibitor av trombin.

De anvendte varianter av hirudin er renset til 95%, og det Sigma-rene human-trombin har en aktivitetsprosent målt ved titrering av det aktive sete på over 92%. Konsentrasjonen av humantrombin er den samme for alle målingene, nemlig 5,5 x

_Q

10 M. Mediet er en 0,05 M natrium PIPES-buffer, pH 7,9,

0,18 M KC1 og 0,1% PEG ved 3 7°C. Trombinsubstratet er Boehringer-kromozym PL. Man overholder en preinkubasjonstid på 2 min for trombin og hirudin, og reaksjonen blir deretter initiert med substratet.

Den følgende tabell oppsummerer eksperimentelt bestemte verdier for den mengde hirudin som er nødvendig for 95%'s inhi--9

bering av den samme mengde humantrombin (5,5 x 10 M).

Det vil således ses at fire ganger mindre hirudin HV2 Arg4 7 og HV2 Lys<47> enn HV2 er nødvendig for oppnåelse av den samme inhibering av den samme mengde humantrombin.

De foreslåtte varianter har derfor vesentlig forbedrede inhibitoriske egenskaper med hensyn til trombin.

Eksempel 5

Foreløpig farmasøytisk studium av to varianter av rekombinant hirudin, rHV2 og rHV2-Lys 47, sammenlignet med standard heparin.

1 - FORMÅLET MED UNDERSØKELSEN

Å undersøke to varianter av rekombinant hirudin, rHV2 (eller HV2) og rHV2-Lys 47 (eller (Lys 47)HV2), og sammenligne deres antitrombotiske effekt med standard-heparin. Begge disse varianter er frie for post-transkripsjonell sulfatering av Tyr 63-gruppen.

2 - FORSØKSBETINGELSER

(a) Den spesifikke antitrombinaktivitet (human- og storfetrombin) til de to rekombinante hirudiner i fysiologisk saltvann blir bestemt på basis av inhiberingen av den

protolytiske aktivitet av trombin på kromozym.

(b) Antikoagulant-aktiviteten av de to hirudiner blir sammenlignet in vitro i rotte- og kaninplasma uttrykt som en forlengelse av koaguleringstiden, og anti-IIA-effekten

blir målt kromogent.

(c) Kinetikken til minskningen i konsentrasjonen av hirudin fra plasma etter i.v. boløs injeksjon blir fulgt ved måling av anti-IIA-effekten ved bruk av koagulasjonstid

og kromogent ved hjelp av kalibreringskurver.

(d) De oppnådde plasmakonsentrasjoner etter 3 0 min kontinuerlig i.v.-perfusjon i kaniner blir bestemt ved de samme

teknikker.

(e) Antitrombose-aktiviteten til de to varianter av hirudin og til standard-heparin blir undersøkt i Wesslers kanin-og rottemodell med tromboplastin som trombogen-reagens og i modellen med stase i kaniner (Fareed). Forbindelsene administreres ved kontinuerlig perfusjon i kaniner og ved i.v. injeksjon (boløs) i rotter.

De brukte modeller er som følger:

Wesslers modell på kaniner

I denne undersøkelse ble det brukt New Zealand-hann-kaniner med vekt mellom 2,5 og 3 kg. Etter bedøving ved intravenøs injeksjon av natrium-pentobarbital (30 ml/kg), ble det i venstre arteria carotis lagt inn en kanyle og de to vena jugularis isolert; to løse ligaturer ble lagt rundt hver av dem med ca. 2,5 cm avstand mellom ligaturene. Kaninene mottok deretter enten fysiologisk saltvann eller en oppløsning av hirudin eller heparin ved kontinuerlig perfusjon i 30 min svarende til 2,5 ml/h. To min før perfusjonen ble avsluttet ble det tatt arterielle blodprøver for å fastslå plasmanivået til antikoagulantene. Ett minutt før perfusjonen ble avsluttet ble humant tromboplastin (Manchester Comparative

Reagents Ltd), standardisert i henhold til M. Buchanans prose-dyre, injisert i en dose på 600 ^ig/kg i nøyaktig 30 sekunder i aorta via arteria carotis. Tretti sekunder senere ble perfusjonen stanset og blodstase frembragt ved stramming av ligaturene på de to venøse segmenter i 15 min. De jugulare vener ble så åpnet og trombene tatt ut, skyllet i fysiologisk saltvann og veid etter å være tørket med filterpapir.

Wesslers modell på rotter

Det ble anvendt hannrotter av typen (CD-COBS) Sprague-Dawley med kroppsvekt på ca. 300 g. Etter bedøvning med natrium-pentobarbital i.p. (30 mg/kg) og medial laparotomi, ble vena cava inferior lagt fri over et parti på 1 cm målt fra vena renalis. To fleksible ligaturer ble lagt 0,7 cm fra hverandre.

Testproduktene fortynnet i fysiologisk saltvann ble injisert i.v. boløst i en mengde på 1 ml/kg i 5 min og 40 s eller i 1 min (heparin) før venestase ble fremkalt. 40 s før stasen ble satt på ble trombogenmiddel (kanintromboplastrin, E'. Dade) injisert i en dose svarende til 25 mg/ml/kg inn i vena penis i løpet av 3 0 s, målt meget nøyaktig. 10 s etter at injek-sjonen var avsluttet ble stasen etablert ved stramming av de to ligaturer, først den proksimale og deretter den distale. Stasen ble opprettholdt i 10 min, og tromben ble så fjernet, senket ned i en 0,3 8%'s oppløsning av citrat, tørket med almin-nelig absorberende papir og veid neste dag etter 1 times tørking ved 50°C.

Modell for trombose fremkalt ved blodstase i kaniner

I denne undersøkelsen ble det brukt New Zealand-kaniner med kroppsvekt mellom 2,5 og 3 kg. Etter intravenøs bedøving med natrium-pentobarbital (30 mg/kg) ble det i venstre arteria carotis lagt inn en kanyle og begge arteria jugularis isolert; to løse ligaturer ble lagt rundt hver av dem med ca. 2,5 cm mellomrom mellom ligaturene. Kaninene fikk deretter enten fysiologisk saltvann eller oppløsninger av heparin eller hirudin i kontinuerlig perfusjon i 30 min i en mengde på 2,5 ml/h. To min før perfusjonen ble avsluttet ble det tatt arterielle blodprøver for bestemmelse av plasmanivået av antikoagulantene. Samtidig som perfusjonen ble stanset ble det fremkalt blodstase ved at de fire ligaturer ble strammet (først de proksimale, deretter de distale). Stasen ble opprettholdt i to timer, hvoretter venene ble åpnet og' trombosene fjernet, skyllet i fysiologisk saltvann, tørket med filterpapir og veid.

3 - RESULTATER

a) For et preparat av standard oppløsning ved en konsentra-sjon på 1 mg/ml, er den spesifikke antitrombinaktivitet

til de to varianter av hirudin i forbindelse med human- og storfetrombin uttrykt i tabell 1.

Den spesifikke antitrombinaktiviteten til hirudinvarianten rHV2 er +/- 15.000 ATU/mg, og +/- 19.000 ATU/mg for varianten rHV2-Lys 47. Disse spesifikke aktiviteter er større enn de forventede. Spesifikk aktivitet er identisk for humant og storfe trombin.

b) Den antikoagulerende aktivitet i rotte- og kaninplasma målt som koaguleringstid er ekvivalent for lave konsentrasjoner av de to hirudiner. Varianten rHV2-Lys 4 7 er vesentlig bedre ved høye konsentrasjoner. Mengden av resttrombin i plasmaet til rotter og kanin fastslått ved bruk av kromogent substrat er sammenlignbar etter addering av de to hirudiner opp til 60 ATU/ml. For videre nøytralisering av sporene etter resttrombin, er varianten rHV2-Lys 4 7 mer effektiv enn rHV2. Dette gjenspeiler forskjellen i Ki-verdiene. c) Kinetikken i forsvinningen av de to hirudiner fra plasmaet etter i.v. boløs injeksjon er sammenlignbar for den kromo-gene bestemmelse, men litt annerledes for bestemmelse ved koaguleringstid (tabell 2). Hirudin forsvinner i samsvar med to eksponensialkurver. En første fase (fordeling) med en t 1/2 o( på omtrent 3 min, som reduserer den første opprinnelige mengde med 60% i løpet av 5 min for begge hirudinvarianter; og en annen fase (eliminasjon) med en t 1/2 |S på 16 min for rHV2-Lys 47 og 28 min for rHV2 når koagulasjonstiden måles, og 28 resp. 30 min når den kromo-gene metode anvendes. Standard-heparinet forsvinner iht. en enkel eksponentfase (t 1/2 = 9 min).

TT: koaguleringstid

CS: kromogent substrat

d) Plasmakonsentrasjonene til de to varianter av hirudin oppnådd etter 30 minutters kontinuerlig i.v. perfusjon i

kaniner stod i et lineært forhold til de perfuserte doser.

e) Antitrombose-virkninger:

på grunnlag av disse foreløpige undersøkelser synes det som

varianten av rekombinant hirudin rHV2-Lys 47 ved kontinuerlig perfusjon i kaniner har en antitrombose-virkning som er den for rHV2 og standard-heparin overlegen. Farmakokinetikken til de to variantene av hirudin ér den samme.

Eksempel 6

Sammenligning av forholdet mellom antitrombosevirkning og risikoen for blødning for hirudin rHV2-Lys 47 og standard-heparin .

De utførte undersøkelser viser at risikoen for blødning i kaniner og forlengelsen av blødningstiden i rotter som behandles med rHV2-Lys 47, er mindre enn den hos dyr behandlet med standard-heparin, på basis av doser som har lik aktivitet i en trombosemodell, for hver art.

Deponering av stammer som representerer oppfinnelsen

Følgende stammer ble deponert i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ved Pasteurinstituttet, 28 Rue du Docteur Roux, Paris (15), 6. november 1986:

TGYlsp4 pTGl977 (HV2-Arg<47>) under nr. 1-621

TGYlsp4 pTGl980 (HV2-Lys<47>) under nr. 1-622.

Referansestammen ble deponert 6. juni 1986:

TGYlsp4 pTGl828 under nr. 1-569.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en terapeutisk aktiv variant av hirudin gitt i fig. 1, hvor aminosyren i posisjon 47 kan være Arg, His eller Lys og/eller aminosyren i posisjon 63 kan være Glu eller Asp og hvor variantene er sulfaterte eller ikke, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en gjærstamme som er transformert med et plasmid eller funksjonell DNA-blokk som koder hirudinvarianten, og som er i stand til å uttrykke hirudinvarianten. j

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en gjærstamme som er transformert med et plasmid inneholdende: utgangspunktet for replikasjon (ORI) av 2 u-plasmidet av gjær, ura3-genet, ORI i E. coli og en markør for resistens overfor et antibiotikum, en transkripsjonspromotor, "leder"-sekvensen og preprosekvensen til forlø- peren til alfafaktoren, idet disse sekvenser er koblet sammen i fase opp- strøms fra den sekvens som koder for varianten av hirudin, og transkripsjonsterminatoren for PGK-genet til gjær, som vil være plassert nedstrøms fra genet for den nevnte variant.