PL157254B1

PL157254B1 - Sposób wytwarzania wariantów hirudyny PL PL

Info

Publication number: PL157254B1
Application number: PL1987269164A
Authority: PL
Inventors: Michael Courtney; Eric Degryse; Gerard Loison; Yves Lemoine
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 1986-12-01
Filing date: 1987-12-01
Publication date: 1992-05-29
Also published as: DE3777367D1; HUT45564A; SU1687032A3; EP0273800B1; ZA879011B; CS276245B6; FI99211B; CS8708732A2; DK627687D0; RO106890B1; DK627687A; PT86233B; NO177500B; KR960011918B1; NO177500C; NO874905D0; EP0273800A2; BG49719A3; MC1884A1; US5650301A

Abstract

1. Sposób wytwarzania wariantów hirudyny HV1, HV2 i HV3, zawierajacych w pozycji 47 do 63 aminokwas inny, niz aminokwas formy naturalnej, który to aminokwas wybrany jest z grupy obejmujacej lizyne, kwas glutaminowy, arginine, histydyne i kwas asparaginowy, zna- mienny tym, ze w srodowisku hodowlanym prowadzi sie fermentacje szczepu drozdzy Saccha- romyces cerevisiae transformowanych blokiem funkcyjnym ekspresji sekwencji kodujacej wariant hirudyny, a nastepnie po fermentacji odzyskuje sie wytworzony w srodowisku hodowla- nym wariant hirudyny w postaci dojrzalej, lub w postaci prekursora dojrzewajacego in vitro. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wariantów hirudyny użytecznych jako inhibitory trombiny.

W literaturze opisane są co najmniej 3 naturalne warianty hirudyny (Markwardt 1970; Petersen i in., 1976; Markwardt i Walsmann 1976; Chang 1983; Dodt i in., 1984,1985,1986; Harvey i in. 1986; francuski opis patentowy 8404755).

Porównywalne sekwencje tych 3 naturalnych wariantów przedstawione są na fig. 1.

1. Z Dodt i in., Tebs, Letters, 1984, 165, 180-183.

2. Z Harvey i in., Proc. Natl. Acad. USA, 1986, 83, 1084-1088.

3. Z Dodt i in., Biol. Chem. Hoppi-Seyler, 1986, 367, 803-811.

Wariant pierwszy, HV1, odpowiada hirudynie wydzielonej z ciała pijawki; wariant drugi, HV2 (Harvey i in., 1986), różni się od pierwszego 9-cioma aminokwasami; wariant trzeci (Dodt i in.,

157 254

1986) jest identyczny z HV2 aż do seryny 32, lecz różni się 10-cioma aminokwasami w części C-terminalnej, zawierającej ponadto aminokwas dodatkowy (ala63). Ten trzeci wariant będzie poniżej oznaczany jako HV3.

Sekwencje te obejmują 65 lub 66 aminokwasów i mogą być uważane za dwuzakresowe: posiadają jedną część N-terminalną kulistą zawierającą 3 mostki disiarczkowe i jedną część C-terminalną kwasową mającą homologię z miejscem rozszczepienia przez trombinę w cząsteczce protrombiny. Homologia ta pozwala przypuszczać, że region otaczający pozycję 47 mógłby być miejscem umieszczenia hirudyny na trombinie.

Z drugiej strony naturalna hirudyna zawiera w pozycji 63 siarczanowaną tyrozynę (Chang, 1983). Taka siarczanowana tyrozyna pojawia się ponownie w pozycji 64 w wariancie HV3. Będzie ona oznaczana w dalszym opisie jako „pozycja 63“ dla wszystkich wariantów, przy czym jej funkcja jest jednakowa niezależnie od jej pozycji.

Analiza porównawcza naturalnych sekwencji hirudyny pozwala na rozważenie, teoretycznie, tworzenia nowych wariantów, w których charakterystyki cząsteczek naturalnych połączone są w sposób odmienny.

HV1 i HV3 posiadają lizynę w pozycji 47, umieszczoną pomiędzy 2 prolinami, odpowiedzialną prawdopodobnie za blokowanie miejsca aktywnego trombiny (Dodt i in., 1984 i 1985).

Ponieważ HV2 nie posiada w tej pozycji reszty zasadowej lecz asparaginę, byłoby pożądane podstawienie tam lizyny lub argininy, aby uczynić tę cząsteczkę bardziej odpowiednią dla pełnienia funkcji inhibitora trombiny (Chang 1985), lub też alternatywnie podsta wienie histydyny, która nie jest zgodna, będąc dobrym substratem trombiny, lecz mogłoby podwyższać moc inhibitującą hirudyny.

Z drugiej strony, siarczanowanie tyrozyny 63 stanowi różnicę pomiędzy hirudyną naturalną a hirudyną otrzymaną przez rekombinację genetyczną, co może wpływać na aktywność tej ostatniej, jak to sugerują badania kinetyczne Stone'a i Hofsteenge'a (1986). Można usiłować naśladować proteinę naturalną, zastępując tyrozynę resztą kwasową jak Glu lub Asp.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wariantów hirudyny HV1, HV2 i HV3 zawierających w pozycji 47 lub 63 aminokwas inny, niż aminokwas formy naturalnej, który to aminokwas wybrany jest z grupy obejmującej lizynę, kwas glutaminowy, argininę, histydynę i kwas asparaginowy. Sposób według wynalazku polega na tym, że w środowisku hodowlanym prowadzi się fermentację szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae transformowanych blokiem funkcyjnym ekspresji sekwencji kodującej wariant hirudyny, a następnie po fermentacji odzyskuje się wytworzony w środowisku hodowlanym wariant hirudyny w postaci dojrzałej, lub w postaci prekursora dojrzewającego in vitro.

Spośród wariantów hirudyny wytworzonych sposobem według wynalazku należy przytoczyć:

— warianty, w których aminokwas Tyr⁶³ został zastąpiony resztą kwasową, zwłaszcza Glu lub

Asp;

— warianty, w których aminokwas w pozycji 47 w formie naturalnej został zastąpiony przez Arg lub His;

— warianty, w których Asn⁴⁷ w formie naturalnej HV2 został zastąpiony przez Lys.

W szczególności należy przytoczyć następujące korzystne warianty: [Lys⁴7]HV2; [Arg⁴7]HV2; [His⁴7]HV2; [Glu6³]HV2; [Asp6³]HV2.

Wariant wytwarzany sposobem według wynalazku, to znaczy [Lys47]HV2 [lub „rHV2-Lys 47“], odpowiada następującej sekwencji aminokwasowej: ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLY CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN.

Różne warianty zachowujące Ty^³ stosuje się w postaci siarczanowanej lub nie. Siarczanowanie można przeprowadzić drogą chemiczną lub biologiczną.

W praktyce, warianty hirudyny można otrzymać syntetycznie, półsyntetycznie i/lub technikami znanymi w manipulacji genetycznej. I tak, na przykład, klonowanie i ekspresję różnych sekwencji kodujących HV1, HV2 i HV3, zwłaszcza HV2, oraz otrzymywanie odpowiednich hirudyn z hodowli drożdży opisano w zgłoszeniu patentowym EP-A-200655.

157 254

Warianty hirudyny wytwarza się według wynalazku podobnymi technikami, stosując zmodyfikowane sekwencje kodujące, na przykład przez mutagenezę sterowaną.

W szczególności, przez mutagenezę sterowaną in vitro zbudowano warianty, w których asparginę 47 zastąpiono lizyną, argininą lub histydyną, i w których tyrozynę 63 zastąpiono kwasem glutaminowym.

W sposobie według wynalazku stosuje się funkcyjne bloki ekspresji; takie funkcyjne bloki DNA mogą być niesione przez plazmid-wektor.

Dla kierowania ekspresją genów odpowiadających różnym wariantom i w celu osiągnięcia sekrecji, integruje się je w wektorze drożdży zawierającym, korzystnie, następujące elementy opisane w zgłoszeniu patentowym EP-A-200655:

— miejsce początku replikacji plazmidu drożdży 2 μ, — gen ura3 — miejsce początku replikacji w E. coli i marker oporności na antybiotyk, — promotor transkrypcji, sekwencję liderową i sekwencję pre-pro prekursora czynnika alfa, przyłączoną w fazie, powyżej sekwencji kodującej dany wariant, — terminator transkrypcji genu PGK drożdży, umieszczony poniżej genu kodującego dany wariant hirudyny.

Według wynalazku stosuje się drożdże transformowane omówionymi wyżej wektorami lub blokiem funkcyjnym DNA.

W sposobie według wynalazku wytwarza się wariant hirudyny przez fermentację drożdży i odzyskanie wytworzonej w środowisku hodowlanym hirudyny w postaci dojrzałej lub w postaci prekursora dojrzewającego in vitro.

Zastosowane techniki opisano już szczegółowo w zgłoszeniach patentowych EP-A-200 655 i EP-87 401 649.6.

Tak otrzymane warianty hirudyny mogą być stosowane jako inhibitor trombiny, zarówno in vivo jak i in vitro, jak to opisano w zgłoszeniu patentowym EP-A-200 655.

W szczególności, warianty te mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych, same lub w połączeniu z innymi składnikami aktywnymi lub też w testach bądź w diagnostyce, in vivo lub in vitro. W tym ostatnim przypadku może okazać się korzystne znakowanie wariantów, na przykład znacznikiem radioaktywnym, fluoroscencyjnym, enzymatycznym, bądź innym.

Niniejszy wynalazek ilustrują podane niżej przykłady, odniesione do rys. 1 przedstawiającego sekwencje 3 naturalnych wariantów hirudyny, tzn. HV1, HV2iHV3,orazdorys. 2 przedstawiającego procent inhibitowania aktywności proteolitycznej trombiny na chromozymie w funkcji objętości supernatantów hodowli drożdży produkujących hirudynę HV2 lub jej warianty.

Przykład I. Konstrukcje różnych wariantów HV2 przez mutagenezę in vitro.

Dla przeprowadzenia mutagenezy sterowanej in vitro, fragment DNA, który zamierza się modyfikować, klonuje się w formie replikacyjnej jednoniciowego faga; oddziela się genom faga rekombinującego i poddaje hybrydyzacji z syntetycznym oligonukleotydem zawierającym sekwencję mutowaną. Oligonukleotyd ten służy do zapoczątkowania syntezy komplementarnego włókna a DNA uczyniony w ten sposób dwu-niciowym stosuje się do transformacji bakterii receptorowej, która wyprodukuje fag zawierający pożądaną mutację (Zoller i Smith, 1983).

Plazmid pTG720, opisany w opisie patentowym EP-A-158 564, jest wektorem ekspresji hirudyny w E. coli. Plazmid pTG730 powstał z pTG720 przez przyłączenie miejsca EcoRI na początku sekwencji kodującej hirudyny. Miejsce EcoRI pozwala odzyskać sekwencję kodującą hirudyny przez trawienie EcoRI z jednej strony oraz Ciał z drugiej strony.

Fragment Clal-EcoRI pokrywa całość regionu kodującego hirudyny oprócz kilku kodonów 5'-terminalnych. Fragment Clal-EcoRI klonowano pomiędzy miejscami AccI i EcoRI pochodnej faga M13, zwanej M13TG131 (Kieny i in., 1983). Fag pochodzący od M13TG131 i zawierający tę sekwencję hirudyny nazwano M13TG1919.

Dokonano syntezy trzech oligonukleotydów, z których każdy zdolny do łączenia się w parę z sekwencją 5'-GTACACCGAACCCTGAAAG-3' faga M13TG1919, z wyjątkiem regionu centralnego, odpowiadającego pożądanej mutacji. Sekwencje tych oligonukleotydów są następujące: TG435 5'-CTTTCAGGGTGCGGTGTAC-3' TG436 5'-CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-3'

157 254

TG437 5'-CTTTCAGGGCGCGGTGTAC-3'. Oligonukleotydy te zostały utworzone dla umożliwienia podstawienia kodonu AAC (Asn) faga M13TG1919 przez odpowiednio CAC (His) lub AAA (Lys) lub CGC (Arg).

120 pikomoli każdego oligonukleotydu fosforylowano w 120μ1 środowiska reakcji; około 20 pikomoli fosforylowego oligonukleotydu hybrydyzowano z 1 pikomolem jednoniciowego DNA faga M13TG1919 w 25 μΐ buforu hybrydyzacyjnego.

Po hybrydyzacji, mieszaninę DNA poddano działaniu polimerazy Klenowa i ligazy faga T4. Każada tak potraktowana mieszanina służyła do przeniesienia szczepu E. coli 71/18 (mut L) na podłoże z bakterii JM103 (Messing i in., 1981). Zakażone komórki są oznaczalne, gdyż tworzą strefy wolniej rosnącej; kolonie zostały przepikowane do środowiska kompletnego a następnie przeniesione na bibułę Whatmana 540 w celu odsiania komórek zawierających fagi mutowane.

Odsianie to przeprowadzono przez hybrydyzację „in situ z oligonukleotydem służącym poprzednio jako inicjator. Otrzymano w ten sposób trzy nowe fagi posiadające poszukiwaną sekwencję mutowaną:

M13TG1921 (Asn⁴⁷-A\rg), M13TG1924 (Asn⁴⁷-His) i M13TG1925 (Asn⁴⁷-Lys).

Z drugiej strony, takie samo doświadczenie przeprowadzono z oligonukleotydem TG434 o sekwencji 5'-ATTGTAACTCTTCTTCTG-3'. Nukleotyd ten hybrydyzuje się z sekwencją 5'CAGAAGAATATTTACAAT umieszczoną w regionie 3' sekwencji kodującej dla HV2, z niesparowanym tripletem przeznaczonym do podstawienia kodonu TAT (Tyr⁶³) przez GAG (Glu). Otrzymano w ten sposób fag mutowany odpowiadający M13TG1922 (Ty^-^Glu).

Przykład II. Podstawienie fragmentu Pstl-Hindlll (0,6kb) pTG1828 przez fragment mutowany.

Plazmid pTG1828 (opisany w zgłoszeniu patentowym EP-87 401649.6) niesie sekwencję kodującą hirudyny, poprzdzoną sekwencjami pre-pro genu fermonu płciowego alfa drożdży; całość umieszczona jest pod kontrolą promotora PGK. Przez takie połączenie pomiędzy sekwencjami pre-pro MFa i hirudyny, wyrażona proteina przechodzi normalną drogą wydzielania i dojrzewania drożdży w taki sposób, że hirudyna oprocesowana i aktywna pojawia się w środowisku hodowlanym.

Plazmid ten został użyty do wyrażenia sekwencji hirudyny mutowanej, zamiast hirudyny rodzimej.

Trawienie pTG1828 przez Pstl i Hindlll uwalnia pięć fragmentów o przybliżonych wymiarach odpowiednio 3,8, 1,9, 1,5, 1,1 i 0,6 kb. Ostatni fragment zawiera sekwencję połączoną pre-pro-hirudyna. Fragment ten zawiera tylko jedno miejsce AccI i jedno miejsce EcoRI. Region połączony przez te dwa miejsca obejmuje całość sekwencji hirudyny prócz kilku kodonów 5'terminalnych. Fragment Hindlll-Pstl o 0,6 kb został wstawiony pomiędzy miejsca Hindlll i Pstl wektora nie posiadającego ani miejsca EcoRI ani miejsca AccI.

Tak rekonstytuowany plazmid (pTG 1960) posiada więc pojedyncze miejsce AccI i pojednycze miejsce EcoRI zlokalizowane odpowiednio na początku sekwencji hirudyny i na jej końcu. Trawienie pTG1960 przez AccI i EcoRI uwalnia fragment zawierający quasi całość sekwencji hirudyny i resztę plazmidu.

Duży fragment DNA pozbawionego sekwencji hirudyny oczyszczono na żelu i zmieszano z produktem trawienia AccI-EcoRI w formie replikacyjnej każdego z fagów mutowanych opisanych w przykładzie I, w celu rekonstytuowania połączenia pre-pro-hirudyna z nowymi wariantami HV2 otrzymanymi przez mutagenezę sterowaną. Wyselekcjonowano cztery nowe plazmidy: pTG 1963 (Asn47—Arg), pTG1964 (Tyi^-Glu), pTG1965 (Asn47-His) i pTG1966 (Asn47-Lys), różniące się od pTG1960 tylko mutowanymi kodonami.

Otrzymane sekwencje zawierające kodony mutowane mogą być odzyskane w formie fragmentów Pstl-Hindlll w celu reklonowania ich w wektorze pTG1828 zamiast oryginalnego fragmentu Pstl-Hindlll.

Otrzymano w ten sposób 4 nowe plazmidy: pTG1977 (Asn47—Arg), pTG1978 (Ty^^Glu), pTG’979 (Asn47—His) i pTG198O (As;^—Lys), różniące się od opisanego wyżej pTG 1828 tylko mutacjami wytworzonymi in vitro.

Przykładni. Transformacja TGYlsp4 przez DNA plazmidów pTG1977, pTG1978, pTG1979 i pTG1980.

157 254

Komórki S. cerevisiae TGYlsp4 (Mata ura 3.-251.373.382 his-3.11.15) przekształcono przez DNA plazmidów pTG1977, pTG1978, pTG1979 i pTG1980. W każdym przypadku otrzymano transformanty ura+. Posiadano więc 4 szczepy TGYsp4 pTG1977, TGYlsp4 pTG1978, TGYlsp4 pTGI979 i TGYIsp4 pTG1980. Porównano produkcje hirudyny z tych 4 szczepów i z TGYlsp4 pTG1828.

ml hodowli (YNBG + CAS-aminokwasy 0,5%) o DO660 0,02 zaszzczpiono każdym zz szczepów. Po 48 godzinach mieszania w temperaturze 30°C hodowle odwirowano (5000 obr./min., 5 min.) i oznaczono nadsącze. Jako kontrolę użyto hodowlę TGYsp4 pTG881 (plazmid nie zawierający sekwencji kodującej dla HV2).

Aktywność surowych nadsączy mierzono za pomocą ich działania inhibitującego aktywność trombiny (aktywność proteolityczna na substracie syntetycznym, chromozymie TH-Bochringer Mannheim). Procent inhibitowania w funkcji objętości nadsączu podano na fig. 2.

Stwierdzono, że działanie inhibitujące wywołane przez warianty Arg⁴⁷ i Lys⁴⁷ jest co najmniej równe działaniu inhibitującemu rodzimego HV2. Warianty Glu0³ i His4^? inhibitują nieco słabiej od HV2.

P r z y k ł a d IV. Inhibitowanie aktywności trombiny. Dla wyraźniejszego wykazania korzyści z wariantów hirudyny wytwarzanych sposobem według wynalazku, podano niżej przykłady porównawcze ilustrujące własności inhibitujące w stosunku do trombiny wariantu HV2 i dwóch innych wariantów formy HV2, w których aminokwas w pozycji 47 zstąpiony jest przez Arg lub przez Lys, przy czym wszystkie te warianty otrzymano przez rekombinację DNA. Dla zbadania kinetyki inhibitowania trombiny przez te warianty użyto teorii inhibitorów o silnym powinowactwie, takiej jak opisana w pracy J. W. Williamsa i J. F. Morrisona, Methods in Enzymo^gy 63, str. 437-467 (1979), gdyż hirudyna jest inhibitorem odwracalnym trombiny.

Użyto warianty hirudyny o czystości 95% oraz trombinę ludzką czystą Sigma, której aktywność mierzona oznaczaniem miejsca aktywnego wynosi powyżej 92%. Stężenie trombiny ludzkiej było dla wszystkich pomiarów jednakowe i wynosiło 5,5 · 10~⁹M. Środowiskiem był bufor sodowy PIPES 0,05 M, pH 7,9; Kcl 0,18 M i PEG 0,1% w temperaturze 37°C. Substratem trombiny był chromozym PL Boehringera. Przestrzegano 2-minutnwρgo czasu preinkubacji dla trombiny i hirudyny, po czym rozpoczęto reakcję z substratem.

W poniższej tabeli zestawiono oznaczone eksperymentalnie wartości ilości hirudyny potrzebnej do inhibitowania 95% takiej samej ilości trombiny ludzkiej (5,5· W^M).

Ilość dla uzyskania 95% inhibicji trombiny (10^_9m)

HV2 Lys4⁷ 7,6

HV2 Arg47 8,5

HIV2 32,2

Okazało się więc, że dla inhibitowania takiej samej ilości trombiny ludzkiej potrzeba około 4 razy mniej hirudyny HV2 Arg47 i HV2 Lys47 niż hirudyny HV2.

Proponowane warianty wykazują więc wyraźnie lepsze własności inhibitowania trombiny.

PrzykładV. Wstępne badanie farmakologiczne dwóch wariantów rekombinowanej hirudyny rHV2 i rHV2-Lys 47 porównanych ze standardową heparyną.

1. Cel badania.

Ocena dwóch wariantów rekombinowanej hirudyny rHV2 (lub HV2) i rHV2-Lys 47 [lub (Lys⁴7)HV2] i porównanie ich skuteczności przeciwzakrzepowej ze standardową heparyną. Oba te warianty są pozbawione siarczanowania post-transkrypcyjnego ugrupowania Tyr 63.

2. Warunki doświadczenia.

a) Aktywność przeciwzakrzepową swoistą (trombina ludzka i bydlęca) obu rekombinowanych hirudyn w serum fizjologicznym oznaczano przez inhibitowanie aktywności proteolitycznej trombiny na chromozymie.

b) Aktywność antykoagulującą obu hirudyn porównano in vitro w plazmie szczura i królika przez przedłużenie czasu trombinowego; efekt anty-IIa mierzono chromogenicznie.

c) Kinetykę plazmatycznego zaniku hirudyny po iniekcji drogą i. v. bolus śledzono przez pomiar efektu anty-IIa za pomocą czasu trombinowego oraz chromogen^nie za pomocą krzywych kalibracji.

157 254 Ί

d) Stężenia plazmatyczne uzyskane po 30 minutach ciągłej perfuzji dożylnej u królika oznaczono przy użyciu tych samych technik.

e) Aktywność przeciwzakrzepową obu wariantów hirudyny i standardowej heparyny badano na modelu Wesslera u królika i szczura, z tromboplastyną jako środkiem trombogennym i na modelu skrzepu u królika (Fareed). Leki podano królikowi przez ciągłą perfuzję a szczurowi drogą

i. v. bolus. Zastosowane modele były następujące: Model Wesslera u królików.

W badaniu tym użyto króliki nowozelandzkie, samiec o wadze 2,5-3 kg. Po uśpieniu przez iniekcję dożylną pentobarbitalu sodowego (30 mg/kg), kaniulowano lewą tętnicę szyjną i oddzielono dwie żyły szyjne; na każdej z nich wykonano dwa luźne podwiązania, w odległości 2,5 cm jedno od drugiego. Następnie króliki otrzymały bądź serum fizjologiczne bądź roztwory hirudyny lub heparyny w perfuzji ciągłej przez 30 minut, w ilości 2,5 ml/godzinę. Na dwie minuty przed zakończeniem perfuzji dokonano dwóch pobrań tętniczych w celu oznaczenia wskaźników plazmatycznych antykoagulantów. Na minutę przed zakończeniem perfuzji do aorty wstrzyknięto poprzez tętnicę szyjną tromboplastynę ludzką (Manchester Comparative Reagents Ltd) w dawce 600/fg/kg, w ciągu dokładnie 30 sekund. Po 30 sekundach zatrzymano perfuzję i spowodowano przekrwienie bierne poprzez ściśnięcie podwiązań obu segmentów żylnych w ciągu 15 minut. Otworzono żyły szyjne i wyekstrahowano skrzepy, które wypłukano serum fizjologicznym i zważono po odciśnięciu na bibule filtracyjnej. Model Wesslera u szczurów.

Użyto szczury Sprague-Dawley (CD-COBS), samce o wadze około 300 g. Po uśpieniu pentobarbitalem sodowym drogą dootrzewnową (30 mg/kg) i laparotomii środkowej, odsłonięto główną żyłę dolną na 1 cm od splotu nerkowego. Na miejscu przeprowadzono dwa luźne podwiązania w odległości 0,7 cm.

Badane produkty, rozcieńczone serum fizjologicznym, wstrzyknięto drogą i. v. bolus w dawce 1 mg/kg w ciągu 5 minut 40 sekund lub 1 minuty (heparyna) przed wywołaniem zastoju żylnego. Na 40 sekund przed tym zastojem wstrzyknięto środek trombogenny (tromboplastyna królicza E. Dade) w dawce 25 mg/ml/kg do żyły penisa w ciągu ściśle 30 sekund. Po 10 sekundach od zakończenia iniekcji spowodowano zastój przez ściśnięcie obu podwiązań, najpierw bliższego a następnie dalszego. Zastój utrzymywano w ciągu 10 minut, po czym pobrano skrzep, zanurzono go w roztworze cytrynianu o stężeniu 0,38%, odciśnięto w bibule i zważono następnego dnia po wysuszeniu w ciągu 1 godziny w temperaturze 50°C. Model trombozy przez przekrwienie bierne u królików.

W badaniu tym użyto króliki nowozelandzkie, samce o wadze 2,5-3 kg. Po uśpieniu drogą dożylną za pomocą pentabarbitalu sodowego (30 mg/kg) kaniulowano lewą tętnicę szyjną i wyizolowano dwie żyły szyjne; na każdej z nich wykonano dwa luźne podwiązania w odległości 2,5 cm jedno od drugiego. Następnie króliki otrzymały serum fizjologiczne bądź roztwory hirudyny lub heparyny w perfuzji ciągłej w ciągu 30 minut, w ilości 2,5 ml/godzinę. Na dwie minuty przed zakończeniem perfuzji przeprowadzono dwa podwiązania tętnicze w celu określenia wskaźników plazmatycznych antykoagulantów. Równocześnie z zakończeniem perfuzji wywołano zastój przez ściśnięcie czterech podwiązań (najpierw bliższego, następnie dalszego). Zastój utrzymywano w ciągu 2 godzin, po czym otworzono żyły szyjne i wyesktrahowano skrzepy, które przemyto serum fizjologicznym i zważono po osuszeniu na bibule filtracyjnej.

- Wyniki

a) Dla preparatu roztworu macierzystego o stężeniu 1 mg/ml, aktywność przeciwzakrzepową swoistą obu wariantów hirudyny w stosunku do trombiny ludzkiej i zwierzęcej wyrażono w poniższej tabeli 1.

Tabela 1

	rHV2	rHV2-Lys 47
dla trombiny ludzkiej	14800	19000
dla trombiny bydlęcej	15500	19200
(spodziewane wyniki dla
trombiny ludzkiej)	(13300)	(16000)

Aktywność przeciwzakrzepową swoista wariantu rHV2 hirudyny wynosi ±15000 ATU/mg oraz ±19000 ATU/mg dla wariantu rHV2-Lys 47. Aktywności te są wyższe od oczekiwanych. Aktywność swoista jest identyczna dla trombiny ludzkiej i bydlęcej.

157 254

b) Aktywność antykoagulacyjna w plazmie szczura i królika oznaczona czasem trombinowym jest równocenna dla niskich stężeń obu hirudyn. Dla wyższych stężeń nieco lepszy jest wariant rHV2-Lys 47. Ilość resztkowej trombiny w plazmie szczura i królika, oznaczona przez substrat chromogenny, jest porównywalna po dodaniu obu hirudyn do 60 ATU/ml. Dla dalszego zneutralizowania śladów resztkowej trombiny bardziej skuteczny jest wariant rHV2-Lys 47. Odzwierciedla to różnica w wartościach Ki.

c) Kinetyka plazmatycznego zaniku obu hirudyn po iniekcji drogą i. v. bolus jest porównywalna dla oznaczenia metodą chromogenną, lecz nieco różna dla oznaczenia metodą czasu trombinowego (tabela 2). Hirudyny zanikają według dwóch wykładników. Pierwsza faza (dystrybucja) z t 1/2 a około 3 minut redukuje o 60% ilość początkową w ciągu 5 minut dla obu hirudyn; druga faza (eliminacja) z 11/2 β 16 minut dla rHV2-Lys 47 i 28 minut dla rHV2 jeśli bierze się pod uwagę czas trombinowy oraz odpowiednio 28 i 30 minut jeśli stosuje się metodę chromogenną. Standardowa heparyna zanika w jednej fazie wykładniczej (t 1/2 = 9 minut).

Tabela 2

Czas półtrwania (w minutach) hirudyn po iniekcji i. v. bolus u królika

Metoda	t 1/2 a	t 1/2 β
TT	SC	TT	SC
rHV2	2,5	3,0	28	28
rHV2-Lys 47	1,8	3,0	16	30

TT: czas trombinowy SC: substrat chromogenny

d) Stężenia plazmatyczne obu wariantów hirudyny uzyskane po 30 minutach perfuzji ciągłej drogą dożylną u królika są zależnie liniowo od wprowadzonych dawek.

e) Efekty przeciwzakrzepowe.

	Królik u. v. perfuzja	Szczur i. v. bolus
	μ/kg/h	Pg/kg
Produkty	Wessler Zastój	Wessler
		-5 min. 40 sek. -1 min

rHV2	375	_	240	—
rHV2-Itys 47	20	47	160	—
heparyna standardowa	110	110	160	110

Na podstawie uzyskanych wyżej wyników wstępnych badań farmakologicznych okazało się, że przy perfuzji ciągłej u królika wariant rekombinowanej hirudyny rHV2-Lys 47 ma wyższą aktywność przeciwzakrzepówą od aktwyności rHV2 i heparyny. Farmakokinetyka obu wariantów hirudyny jest identyczna.

Przykład VI. Porównanie stosunku aktywność przeciwzakrzepowa/ryzyko krwotocze dla hirudyny rHV2-Lys 47 i standardowej heparyny.

Przeprowadzone badania wykazały, że ryzyko krwotoczne u królika lub wydłużenie czasu krwawienia u szczura potraktowanego rHV2-Lys 47 jest niższe niż dla heparyny w odniesieniu, dla każdego gatunku, do dawek o takiej samej aktywności w modelu zastoju. Złożenie szczepów reprezentatywnych według wynalazku. Następujące szczepy złożono w dniu 6 listopada 1986 r. w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Instytutu Pasteura, 28 Rue du Docteur Roux, Paris (15):

TGYlsp4 pTG1977 (HV2-Arg⁴⁷) pod numerem 1-621

TGYlsp4 pTG1980 (HV2-Lys⁴⁷) pod numerem 1-622.

Szczep odniesienia zgłoszono w dniu 6 czerwca 1986:

TGYlsp4 pTG1828 pod numerem 1-569.

Literatura cytowana

1. Chang J. Y., Febs Letters 164, 307-313 (1983).

2. Chang J. Y., Eur. J. Biochem. 151, 217-224 (1985).

157 254

3. Dodt J. i in., Febs Letters 165, 180-184 (1984).

4. Dodt J. i in., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985).

5. Dodt J. i in., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986).

6. Harvey R. P. i in., Proe. Natl. Aead. Sei. USA 83, 108^1088 (1986).

7. Kieny M.P., Lathe R., Leeoeq J. P., Gene 26, 91-99 (1983).

8. Krajewski T., Blomback B., Acta Chemica Scandinavica 22, 1339-1346 (1968).

9. Markwardt F., Methods Enzymol 19, 924-932 (1970).

10. Messing J., Crea R., Seeburg P. H., Nuel. Ae. Res. 9, 309 (1981).

11. Petersen T. E. i in., Protides, Biol., Fluids, Proe. Collog. 23, 1-45-149 (1976).

12. Stone S. R.,Hofsteenge, J. Bioehem. 25, 4622-4628 (1986).

13. Zoller M. J., Smith Μ. N., Methods in Enzymol. 100, 4ó9 (1983).

• ρΤ6182θ pTG19S0

O pTG197T

O pTS1970 FIG.2 * pTG1979 λ ρΐΕβ81

FIG.1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

1 HV1

VAL

TYR

THR

ASP

CYS

THR

GLU

SER

GLY

GLN

ASN

LEU

cys

LEU

2HV2

ILE

THR

TYR

THR

ASP

CY5

THR

GLU

SER

GLY

GLN

ASN

LEU

CYS

LEU

3 HV3

ILE

THR

TYR

THR

ASP

CYS

THR

GLU

SER

GLY

GLN

ASN

LEU

CYS

LEU

17 1β 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY

CLN

LYS

GLY ASN	LYS	CYS	ILE	LEU
GLY ASN	LYS	CYS	ILE	LEU
GLY ASN	LYS	CYS	ILE	LEU

31 32	33	34	35
GLY SER	ASP	GLY	CLU
GLY SER	ASN	GLY	LYS
GLY 5ER	CLN	GLY	LYS

37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

LYS

GLY

ASP

ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO

LYS

ASN

LYS

49 50 51 52

54 55 56 57 58 59 60 61

63 64 63

LEU CLN

ASP GLU 65 66

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 5000 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania wariantów hirudyny HV1, HV2 i HV3, zawierających w pozycji 47 do 63 aminokwas inny, niż aminokwas formy naturalnej, który to aminokwas wybrany jest z grupy obejmującej lizynę, kwas glutaminowy, argininę, histydynę i kwas asparaginowy, znamienny tym, że w środowisku hodowlanym prowadzi się fermentację szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae transformowanych blokiem funkcyjnym ekspresji sekwencji kodującej wariant hirudyny, a następnie po fermentacji odzyskuje się wytworzony w środowisku hodowlanym wariant hirudyny w postaci dojrzałej, lub w postaci prekursora dojrzewającego in vitro.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako blok funkcyjny ekspresji sekwencji kodującej stosuje się wektor lub blok funkcyjny DNA zawierający; miejsce początku replikacji plazmidu drożdży 2μ, gen ura3, miejsce początku replikacji w E. coli i marker oporności na antybiotyk, promotor transkrypcji, sekwencję liderową i sekwencję pre-pro prekursora czynnika alfa, przyłączoną w fazie, powyżej sekwencji kodującej wariant hirudyny, oraz terminator transkrypcji genu PGK drożdży, umieszczony poniżej genu wariantu hirudyny.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny, w którym aminokwas Tyr w pozycji 63 w formie naturalnej zastąpiony jest resztą kwasu Glu lub Asp.
4. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny, w którym aminokwas w pozycji 47 w formie naturalnej jest zastąpiony przez Arg lub His.
5. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny w którym aminokwas 47 formy naturalnej HV2- Asnzastąpiony jest przez Lys.
6. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, albo zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny wybrany z grupy obejmującej; (Lys⁴⁷)HV2, (Arg⁴⁷)HV2, (His⁴⁷)HV2, (Glu⁶³)HV2, (Asp⁶³)HVl.
7. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, albo zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny o następującej sekwencji Aminokwasowej; ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN.
8. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, albo zastrz. 5, albo zastrz. 6, albo zastrz. 7, znamienny tym, że wariant hirudyny poddaje się siarczanowaniu.