PL157254B1 - Sposób wytwarzania wariantów hirudyny PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania wariantów hirudyny PL PLInfo
- Publication number
- PL157254B1 PL157254B1 PL1987269164A PL26916487A PL157254B1 PL 157254 B1 PL157254 B1 PL 157254B1 PL 1987269164 A PL1987269164 A PL 1987269164A PL 26916487 A PL26916487 A PL 26916487A PL 157254 B1 PL157254 B1 PL 157254B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hirudin
- variant
- gly
- glu
- asn
- Prior art date
Links
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 title claims abstract description 78
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 17
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims abstract description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- FNXOZWPPOJRBRE-XGEHTFHBSA-N Cys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CS)N)O FNXOZWPPOJRBRE-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims description 5
- BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 5
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 5
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 claims description 5
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N Thr-Asp-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N 0.000 claims description 3
- UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N Cys-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 claims description 2
- RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 2
- AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asn Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N Ile-Thr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N 0.000 claims description 2
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 claims description 2
- FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 claims description 2
- NKUGCYDFQKFVOJ-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NKUGCYDFQKFVOJ-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims description 2
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- FODVBOKTYKYRFJ-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FODVBOKTYKYRFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- AECPDLSSUMDUAA-ZKWXMUAHSA-N Asn-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N AECPDLSSUMDUAA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 1
- WJZLEENECIOOSA-WDSKDSINSA-N Gly-Asn-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O WJZLEENECIOOSA-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims 1
- FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N Ile-Leu-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N 0.000 claims 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 claims 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 claims 1
- 108010010968 hirudin HV2 Proteins 0.000 abstract description 3
- 108010010967 hirudin HV1 Proteins 0.000 abstract 1
- 108010010961 hirudin HV3 Proteins 0.000 abstract 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 26
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 26
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 11
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 2
- LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N Thr-Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 2
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZQKLNLLWFQONU-LKXGYXEUSA-N Asp-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DZQKLNLLWFQONU-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101100436100 Caenorhabditis elegans asp-6 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OXFOKRAFNYSREH-BJDJZHNGSA-N Cys-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N OXFOKRAFNYSREH-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 241001275117 Seres Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- YKZVPMUGEJXEOR-JYJNAYRXSA-N Val-Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N YKZVPMUGEJXEOR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 150000002410 histidine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical class [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000013037 reversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
1. Sposób wytwarzania wariantów hirudyny HV1, HV2 i HV3, zawierajacych w pozycji 47 do 63 aminokwas inny, niz aminokwas formy naturalnej, który to aminokwas wybrany jest z grupy obejmujacej lizyne, kwas glutaminowy, arginine, histydyne i kwas asparaginowy, zna- mienny tym, ze w srodowisku hodowlanym prowadzi sie fermentacje szczepu drozdzy Saccha- romyces cerevisiae transformowanych blokiem funkcyjnym ekspresji sekwencji kodujacej wariant hirudyny, a nastepnie po fermentacji odzyskuje sie wytworzony w srodowisku hodowla- nym wariant hirudyny w postaci dojrzalej, lub w postaci prekursora dojrzewajacego in vitro. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wariantów hirudyny użytecznych jako inhibitory trombiny.
W literaturze opisane są co najmniej 3 naturalne warianty hirudyny (Markwardt 1970; Petersen i in., 1976; Markwardt i Walsmann 1976; Chang 1983; Dodt i in., 1984,1985,1986; Harvey i in. 1986; francuski opis patentowy 8404755).
Porównywalne sekwencje tych 3 naturalnych wariantów przedstawione są na fig. 1.
1. Z Dodt i in., Tebs, Letters, 1984, 165, 180-183.
2. Z Harvey i in., Proc. Natl. Acad. USA, 1986, 83, 1084-1088.
3. Z Dodt i in., Biol. Chem. Hoppi-Seyler, 1986, 367, 803-811.
Wariant pierwszy, HV1, odpowiada hirudynie wydzielonej z ciała pijawki; wariant drugi, HV2 (Harvey i in., 1986), różni się od pierwszego 9-cioma aminokwasami; wariant trzeci (Dodt i in.,
157 254
1986) jest identyczny z HV2 aż do seryny 32, lecz różni się 10-cioma aminokwasami w części C-terminalnej, zawierającej ponadto aminokwas dodatkowy (ala63). Ten trzeci wariant będzie poniżej oznaczany jako HV3.
Sekwencje te obejmują 65 lub 66 aminokwasów i mogą być uważane za dwuzakresowe: posiadają jedną część N-terminalną kulistą zawierającą 3 mostki disiarczkowe i jedną część C-terminalną kwasową mającą homologię z miejscem rozszczepienia przez trombinę w cząsteczce protrombiny. Homologia ta pozwala przypuszczać, że region otaczający pozycję 47 mógłby być miejscem umieszczenia hirudyny na trombinie.
Z drugiej strony naturalna hirudyna zawiera w pozycji 63 siarczanowaną tyrozynę (Chang, 1983). Taka siarczanowana tyrozyna pojawia się ponownie w pozycji 64 w wariancie HV3. Będzie ona oznaczana w dalszym opisie jako „pozycja 63“ dla wszystkich wariantów, przy czym jej funkcja jest jednakowa niezależnie od jej pozycji.
Analiza porównawcza naturalnych sekwencji hirudyny pozwala na rozważenie, teoretycznie, tworzenia nowych wariantów, w których charakterystyki cząsteczek naturalnych połączone są w sposób odmienny.
HV1 i HV3 posiadają lizynę w pozycji 47, umieszczoną pomiędzy 2 prolinami, odpowiedzialną prawdopodobnie za blokowanie miejsca aktywnego trombiny (Dodt i in., 1984 i 1985).
Ponieważ HV2 nie posiada w tej pozycji reszty zasadowej lecz asparaginę, byłoby pożądane podstawienie tam lizyny lub argininy, aby uczynić tę cząsteczkę bardziej odpowiednią dla pełnienia funkcji inhibitora trombiny (Chang 1985), lub też alternatywnie podsta wienie histydyny, która nie jest zgodna, będąc dobrym substratem trombiny, lecz mogłoby podwyższać moc inhibitującą hirudyny.
Z drugiej strony, siarczanowanie tyrozyny 63 stanowi różnicę pomiędzy hirudyną naturalną a hirudyną otrzymaną przez rekombinację genetyczną, co może wpływać na aktywność tej ostatniej, jak to sugerują badania kinetyczne Stone'a i Hofsteenge'a (1986). Można usiłować naśladować proteinę naturalną, zastępując tyrozynę resztą kwasową jak Glu lub Asp.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wariantów hirudyny HV1, HV2 i HV3 zawierających w pozycji 47 lub 63 aminokwas inny, niż aminokwas formy naturalnej, który to aminokwas wybrany jest z grupy obejmującej lizynę, kwas glutaminowy, argininę, histydynę i kwas asparaginowy. Sposób według wynalazku polega na tym, że w środowisku hodowlanym prowadzi się fermentację szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae transformowanych blokiem funkcyjnym ekspresji sekwencji kodującej wariant hirudyny, a następnie po fermentacji odzyskuje się wytworzony w środowisku hodowlanym wariant hirudyny w postaci dojrzałej, lub w postaci prekursora dojrzewającego in vitro.
Spośród wariantów hirudyny wytworzonych sposobem według wynalazku należy przytoczyć:
— warianty, w których aminokwas Tyr63 został zastąpiony resztą kwasową, zwłaszcza Glu lub
Asp;
— warianty, w których aminokwas w pozycji 47 w formie naturalnej został zastąpiony przez Arg lub His;
— warianty, w których Asn47 w formie naturalnej HV2 został zastąpiony przez Lys.
W szczególności należy przytoczyć następujące korzystne warianty: [Lys47]HV2; [Arg47]HV2; [His47]HV2; [Glu63]HV2; [Asp63]HV2.
Wariant wytwarzany sposobem według wynalazku, to znaczy [Lys47]HV2 [lub „rHV2-Lys 47“], odpowiada następującej sekwencji aminokwasowej: ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLY CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN.
Różne warianty zachowujące Ty^3 stosuje się w postaci siarczanowanej lub nie. Siarczanowanie można przeprowadzić drogą chemiczną lub biologiczną.
W praktyce, warianty hirudyny można otrzymać syntetycznie, półsyntetycznie i/lub technikami znanymi w manipulacji genetycznej. I tak, na przykład, klonowanie i ekspresję różnych sekwencji kodujących HV1, HV2 i HV3, zwłaszcza HV2, oraz otrzymywanie odpowiednich hirudyn z hodowli drożdży opisano w zgłoszeniu patentowym EP-A-200655.
157 254
Warianty hirudyny wytwarza się według wynalazku podobnymi technikami, stosując zmodyfikowane sekwencje kodujące, na przykład przez mutagenezę sterowaną.
W szczególności, przez mutagenezę sterowaną in vitro zbudowano warianty, w których asparginę 47 zastąpiono lizyną, argininą lub histydyną, i w których tyrozynę 63 zastąpiono kwasem glutaminowym.
W sposobie według wynalazku stosuje się funkcyjne bloki ekspresji; takie funkcyjne bloki DNA mogą być niesione przez plazmid-wektor.
Dla kierowania ekspresją genów odpowiadających różnym wariantom i w celu osiągnięcia sekrecji, integruje się je w wektorze drożdży zawierającym, korzystnie, następujące elementy opisane w zgłoszeniu patentowym EP-A-200655:
— miejsce początku replikacji plazmidu drożdży 2 μ, — gen ura3 — miejsce początku replikacji w E. coli i marker oporności na antybiotyk, — promotor transkrypcji, sekwencję liderową i sekwencję pre-pro prekursora czynnika alfa, przyłączoną w fazie, powyżej sekwencji kodującej dany wariant, — terminator transkrypcji genu PGK drożdży, umieszczony poniżej genu kodującego dany wariant hirudyny.
Według wynalazku stosuje się drożdże transformowane omówionymi wyżej wektorami lub blokiem funkcyjnym DNA.
W sposobie według wynalazku wytwarza się wariant hirudyny przez fermentację drożdży i odzyskanie wytworzonej w środowisku hodowlanym hirudyny w postaci dojrzałej lub w postaci prekursora dojrzewającego in vitro.
Zastosowane techniki opisano już szczegółowo w zgłoszeniach patentowych EP-A-200 655 i EP-87 401 649.6.
Tak otrzymane warianty hirudyny mogą być stosowane jako inhibitor trombiny, zarówno in vivo jak i in vitro, jak to opisano w zgłoszeniu patentowym EP-A-200 655.
W szczególności, warianty te mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych, same lub w połączeniu z innymi składnikami aktywnymi lub też w testach bądź w diagnostyce, in vivo lub in vitro. W tym ostatnim przypadku może okazać się korzystne znakowanie wariantów, na przykład znacznikiem radioaktywnym, fluoroscencyjnym, enzymatycznym, bądź innym.
Niniejszy wynalazek ilustrują podane niżej przykłady, odniesione do rys. 1 przedstawiającego sekwencje 3 naturalnych wariantów hirudyny, tzn. HV1, HV2iHV3,orazdorys. 2 przedstawiającego procent inhibitowania aktywności proteolitycznej trombiny na chromozymie w funkcji objętości supernatantów hodowli drożdży produkujących hirudynę HV2 lub jej warianty.
Przykład I. Konstrukcje różnych wariantów HV2 przez mutagenezę in vitro.
Dla przeprowadzenia mutagenezy sterowanej in vitro, fragment DNA, który zamierza się modyfikować, klonuje się w formie replikacyjnej jednoniciowego faga; oddziela się genom faga rekombinującego i poddaje hybrydyzacji z syntetycznym oligonukleotydem zawierającym sekwencję mutowaną. Oligonukleotyd ten służy do zapoczątkowania syntezy komplementarnego włókna a DNA uczyniony w ten sposób dwu-niciowym stosuje się do transformacji bakterii receptorowej, która wyprodukuje fag zawierający pożądaną mutację (Zoller i Smith, 1983).
Plazmid pTG720, opisany w opisie patentowym EP-A-158 564, jest wektorem ekspresji hirudyny w E. coli. Plazmid pTG730 powstał z pTG720 przez przyłączenie miejsca EcoRI na początku sekwencji kodującej hirudyny. Miejsce EcoRI pozwala odzyskać sekwencję kodującą hirudyny przez trawienie EcoRI z jednej strony oraz Ciał z drugiej strony.
Fragment Clal-EcoRI pokrywa całość regionu kodującego hirudyny oprócz kilku kodonów 5'-terminalnych. Fragment Clal-EcoRI klonowano pomiędzy miejscami AccI i EcoRI pochodnej faga M13, zwanej M13TG131 (Kieny i in., 1983). Fag pochodzący od M13TG131 i zawierający tę sekwencję hirudyny nazwano M13TG1919.
Dokonano syntezy trzech oligonukleotydów, z których każdy zdolny do łączenia się w parę z sekwencją 5'-GTACACCGAACCCTGAAAG-3' faga M13TG1919, z wyjątkiem regionu centralnego, odpowiadającego pożądanej mutacji. Sekwencje tych oligonukleotydów są następujące: TG435 5'-CTTTCAGGGTGCGGTGTAC-3' TG436 5'-CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-3'
157 254
TG437 5'-CTTTCAGGGCGCGGTGTAC-3'. Oligonukleotydy te zostały utworzone dla umożliwienia podstawienia kodonu AAC (Asn) faga M13TG1919 przez odpowiednio CAC (His) lub AAA (Lys) lub CGC (Arg).
120 pikomoli każdego oligonukleotydu fosforylowano w 120μ1 środowiska reakcji; około 20 pikomoli fosforylowego oligonukleotydu hybrydyzowano z 1 pikomolem jednoniciowego DNA faga M13TG1919 w 25 μΐ buforu hybrydyzacyjnego.
Po hybrydyzacji, mieszaninę DNA poddano działaniu polimerazy Klenowa i ligazy faga T4. Każada tak potraktowana mieszanina służyła do przeniesienia szczepu E. coli 71/18 (mut L) na podłoże z bakterii JM103 (Messing i in., 1981). Zakażone komórki są oznaczalne, gdyż tworzą strefy wolniej rosnącej; kolonie zostały przepikowane do środowiska kompletnego a następnie przeniesione na bibułę Whatmana 540 w celu odsiania komórek zawierających fagi mutowane.
Odsianie to przeprowadzono przez hybrydyzację „in situ z oligonukleotydem służącym poprzednio jako inicjator. Otrzymano w ten sposób trzy nowe fagi posiadające poszukiwaną sekwencję mutowaną:
M13TG1921 (Asn47-A\rg), M13TG1924 (Asn47-His) i M13TG1925 (Asn47-Lys).
Z drugiej strony, takie samo doświadczenie przeprowadzono z oligonukleotydem TG434 o sekwencji 5'-ATTGTAACTCTTCTTCTG-3'. Nukleotyd ten hybrydyzuje się z sekwencją 5'CAGAAGAATATTTACAAT umieszczoną w regionie 3' sekwencji kodującej dla HV2, z niesparowanym tripletem przeznaczonym do podstawienia kodonu TAT (Tyr63) przez GAG (Glu). Otrzymano w ten sposób fag mutowany odpowiadający M13TG1922 (Ty^-^Glu).
Przykład II. Podstawienie fragmentu Pstl-Hindlll (0,6kb) pTG1828 przez fragment mutowany.
Plazmid pTG1828 (opisany w zgłoszeniu patentowym EP-87 401649.6) niesie sekwencję kodującą hirudyny, poprzdzoną sekwencjami pre-pro genu fermonu płciowego alfa drożdży; całość umieszczona jest pod kontrolą promotora PGK. Przez takie połączenie pomiędzy sekwencjami pre-pro MFa i hirudyny, wyrażona proteina przechodzi normalną drogą wydzielania i dojrzewania drożdży w taki sposób, że hirudyna oprocesowana i aktywna pojawia się w środowisku hodowlanym.
Plazmid ten został użyty do wyrażenia sekwencji hirudyny mutowanej, zamiast hirudyny rodzimej.
Trawienie pTG1828 przez Pstl i Hindlll uwalnia pięć fragmentów o przybliżonych wymiarach odpowiednio 3,8, 1,9, 1,5, 1,1 i 0,6 kb. Ostatni fragment zawiera sekwencję połączoną pre-pro-hirudyna. Fragment ten zawiera tylko jedno miejsce AccI i jedno miejsce EcoRI. Region połączony przez te dwa miejsca obejmuje całość sekwencji hirudyny prócz kilku kodonów 5'terminalnych. Fragment Hindlll-Pstl o 0,6 kb został wstawiony pomiędzy miejsca Hindlll i Pstl wektora nie posiadającego ani miejsca EcoRI ani miejsca AccI.
Tak rekonstytuowany plazmid (pTG 1960) posiada więc pojedyncze miejsce AccI i pojednycze miejsce EcoRI zlokalizowane odpowiednio na początku sekwencji hirudyny i na jej końcu. Trawienie pTG1960 przez AccI i EcoRI uwalnia fragment zawierający quasi całość sekwencji hirudyny i resztę plazmidu.
Duży fragment DNA pozbawionego sekwencji hirudyny oczyszczono na żelu i zmieszano z produktem trawienia AccI-EcoRI w formie replikacyjnej każdego z fagów mutowanych opisanych w przykładzie I, w celu rekonstytuowania połączenia pre-pro-hirudyna z nowymi wariantami HV2 otrzymanymi przez mutagenezę sterowaną. Wyselekcjonowano cztery nowe plazmidy: pTG 1963 (Asn47—Arg), pTG1964 (Tyi^-Glu), pTG1965 (Asn47-His) i pTG1966 (Asn47-Lys), różniące się od pTG1960 tylko mutowanymi kodonami.
Otrzymane sekwencje zawierające kodony mutowane mogą być odzyskane w formie fragmentów Pstl-Hindlll w celu reklonowania ich w wektorze pTG1828 zamiast oryginalnego fragmentu Pstl-Hindlll.
Otrzymano w ten sposób 4 nowe plazmidy: pTG1977 (Asn47—Arg), pTG1978 (Ty^^Glu), pTG’979 (Asn47—His) i pTG198O (As;^—Lys), różniące się od opisanego wyżej pTG 1828 tylko mutacjami wytworzonymi in vitro.
Przykładni. Transformacja TGYlsp4 przez DNA plazmidów pTG1977, pTG1978, pTG1979 i pTG1980.
157 254
Komórki S. cerevisiae TGYlsp4 (Mata ura 3.-251.373.382 his-3.11.15) przekształcono przez DNA plazmidów pTG1977, pTG1978, pTG1979 i pTG1980. W każdym przypadku otrzymano transformanty ura+. Posiadano więc 4 szczepy TGYsp4 pTG1977, TGYlsp4 pTG1978, TGYlsp4 pTGI979 i TGYIsp4 pTG1980. Porównano produkcje hirudyny z tych 4 szczepów i z TGYlsp4 pTG1828.
ml hodowli (YNBG + CAS-aminokwasy 0,5%) o DO660 0,02 zaszzczpiono każdym zz szczepów. Po 48 godzinach mieszania w temperaturze 30°C hodowle odwirowano (5000 obr./min., 5 min.) i oznaczono nadsącze. Jako kontrolę użyto hodowlę TGYsp4 pTG881 (plazmid nie zawierający sekwencji kodującej dla HV2).
Aktywność surowych nadsączy mierzono za pomocą ich działania inhibitującego aktywność trombiny (aktywność proteolityczna na substracie syntetycznym, chromozymie TH-Bochringer Mannheim). Procent inhibitowania w funkcji objętości nadsączu podano na fig. 2.
Stwierdzono, że działanie inhibitujące wywołane przez warianty Arg47 i Lys47 jest co najmniej równe działaniu inhibitującemu rodzimego HV2. Warianty Glu03 i His4? inhibitują nieco słabiej od HV2.
P r z y k ł a d IV. Inhibitowanie aktywności trombiny. Dla wyraźniejszego wykazania korzyści z wariantów hirudyny wytwarzanych sposobem według wynalazku, podano niżej przykłady porównawcze ilustrujące własności inhibitujące w stosunku do trombiny wariantu HV2 i dwóch innych wariantów formy HV2, w których aminokwas w pozycji 47 zstąpiony jest przez Arg lub przez Lys, przy czym wszystkie te warianty otrzymano przez rekombinację DNA. Dla zbadania kinetyki inhibitowania trombiny przez te warianty użyto teorii inhibitorów o silnym powinowactwie, takiej jak opisana w pracy J. W. Williamsa i J. F. Morrisona, Methods in Enzymo^gy 63, str. 437-467 (1979), gdyż hirudyna jest inhibitorem odwracalnym trombiny.
Użyto warianty hirudyny o czystości 95% oraz trombinę ludzką czystą Sigma, której aktywność mierzona oznaczaniem miejsca aktywnego wynosi powyżej 92%. Stężenie trombiny ludzkiej było dla wszystkich pomiarów jednakowe i wynosiło 5,5 · 10~9M. Środowiskiem był bufor sodowy PIPES 0,05 M, pH 7,9; Kcl 0,18 M i PEG 0,1% w temperaturze 37°C. Substratem trombiny był chromozym PL Boehringera. Przestrzegano 2-minutnwρgo czasu preinkubacji dla trombiny i hirudyny, po czym rozpoczęto reakcję z substratem.
W poniższej tabeli zestawiono oznaczone eksperymentalnie wartości ilości hirudyny potrzebnej do inhibitowania 95% takiej samej ilości trombiny ludzkiej (5,5· W^M).
Ilość dla uzyskania 95% inhibicji trombiny (10_9m)
HV2 Lys47 7,6
HV2 Arg47 8,5
HIV2 32,2
Okazało się więc, że dla inhibitowania takiej samej ilości trombiny ludzkiej potrzeba około 4 razy mniej hirudyny HV2 Arg47 i HV2 Lys47 niż hirudyny HV2.
Proponowane warianty wykazują więc wyraźnie lepsze własności inhibitowania trombiny.
PrzykładV. Wstępne badanie farmakologiczne dwóch wariantów rekombinowanej hirudyny rHV2 i rHV2-Lys 47 porównanych ze standardową heparyną.
1. Cel badania.
Ocena dwóch wariantów rekombinowanej hirudyny rHV2 (lub HV2) i rHV2-Lys 47 [lub (Lys47)HV2] i porównanie ich skuteczności przeciwzakrzepowej ze standardową heparyną. Oba te warianty są pozbawione siarczanowania post-transkrypcyjnego ugrupowania Tyr 63.
2. Warunki doświadczenia.
a) Aktywność przeciwzakrzepową swoistą (trombina ludzka i bydlęca) obu rekombinowanych hirudyn w serum fizjologicznym oznaczano przez inhibitowanie aktywności proteolitycznej trombiny na chromozymie.
b) Aktywność antykoagulującą obu hirudyn porównano in vitro w plazmie szczura i królika przez przedłużenie czasu trombinowego; efekt anty-IIa mierzono chromogenicznie.
c) Kinetykę plazmatycznego zaniku hirudyny po iniekcji drogą i. v. bolus śledzono przez pomiar efektu anty-IIa za pomocą czasu trombinowego oraz chromogen^nie za pomocą krzywych kalibracji.
157 254 Ί
d) Stężenia plazmatyczne uzyskane po 30 minutach ciągłej perfuzji dożylnej u królika oznaczono przy użyciu tych samych technik.
e) Aktywność przeciwzakrzepową obu wariantów hirudyny i standardowej heparyny badano na modelu Wesslera u królika i szczura, z tromboplastyną jako środkiem trombogennym i na modelu skrzepu u królika (Fareed). Leki podano królikowi przez ciągłą perfuzję a szczurowi drogą
i. v. bolus. Zastosowane modele były następujące: Model Wesslera u królików.
W badaniu tym użyto króliki nowozelandzkie, samiec o wadze 2,5-3 kg. Po uśpieniu przez iniekcję dożylną pentobarbitalu sodowego (30 mg/kg), kaniulowano lewą tętnicę szyjną i oddzielono dwie żyły szyjne; na każdej z nich wykonano dwa luźne podwiązania, w odległości 2,5 cm jedno od drugiego. Następnie króliki otrzymały bądź serum fizjologiczne bądź roztwory hirudyny lub heparyny w perfuzji ciągłej przez 30 minut, w ilości 2,5 ml/godzinę. Na dwie minuty przed zakończeniem perfuzji dokonano dwóch pobrań tętniczych w celu oznaczenia wskaźników plazmatycznych antykoagulantów. Na minutę przed zakończeniem perfuzji do aorty wstrzyknięto poprzez tętnicę szyjną tromboplastynę ludzką (Manchester Comparative Reagents Ltd) w dawce 600/fg/kg, w ciągu dokładnie 30 sekund. Po 30 sekundach zatrzymano perfuzję i spowodowano przekrwienie bierne poprzez ściśnięcie podwiązań obu segmentów żylnych w ciągu 15 minut. Otworzono żyły szyjne i wyekstrahowano skrzepy, które wypłukano serum fizjologicznym i zważono po odciśnięciu na bibule filtracyjnej. Model Wesslera u szczurów.
Użyto szczury Sprague-Dawley (CD-COBS), samce o wadze około 300 g. Po uśpieniu pentobarbitalem sodowym drogą dootrzewnową (30 mg/kg) i laparotomii środkowej, odsłonięto główną żyłę dolną na 1 cm od splotu nerkowego. Na miejscu przeprowadzono dwa luźne podwiązania w odległości 0,7 cm.
Badane produkty, rozcieńczone serum fizjologicznym, wstrzyknięto drogą i. v. bolus w dawce 1 mg/kg w ciągu 5 minut 40 sekund lub 1 minuty (heparyna) przed wywołaniem zastoju żylnego. Na 40 sekund przed tym zastojem wstrzyknięto środek trombogenny (tromboplastyna królicza E. Dade) w dawce 25 mg/ml/kg do żyły penisa w ciągu ściśle 30 sekund. Po 10 sekundach od zakończenia iniekcji spowodowano zastój przez ściśnięcie obu podwiązań, najpierw bliższego a następnie dalszego. Zastój utrzymywano w ciągu 10 minut, po czym pobrano skrzep, zanurzono go w roztworze cytrynianu o stężeniu 0,38%, odciśnięto w bibule i zważono następnego dnia po wysuszeniu w ciągu 1 godziny w temperaturze 50°C. Model trombozy przez przekrwienie bierne u królików.
W badaniu tym użyto króliki nowozelandzkie, samce o wadze 2,5-3 kg. Po uśpieniu drogą dożylną za pomocą pentabarbitalu sodowego (30 mg/kg) kaniulowano lewą tętnicę szyjną i wyizolowano dwie żyły szyjne; na każdej z nich wykonano dwa luźne podwiązania w odległości 2,5 cm jedno od drugiego. Następnie króliki otrzymały serum fizjologiczne bądź roztwory hirudyny lub heparyny w perfuzji ciągłej w ciągu 30 minut, w ilości 2,5 ml/godzinę. Na dwie minuty przed zakończeniem perfuzji przeprowadzono dwa podwiązania tętnicze w celu określenia wskaźników plazmatycznych antykoagulantów. Równocześnie z zakończeniem perfuzji wywołano zastój przez ściśnięcie czterech podwiązań (najpierw bliższego, następnie dalszego). Zastój utrzymywano w ciągu 2 godzin, po czym otworzono żyły szyjne i wyesktrahowano skrzepy, które przemyto serum fizjologicznym i zważono po osuszeniu na bibule filtracyjnej.
- Wyniki
a) Dla preparatu roztworu macierzystego o stężeniu 1 mg/ml, aktywność przeciwzakrzepową swoistą obu wariantów hirudyny w stosunku do trombiny ludzkiej i zwierzęcej wyrażono w poniższej tabeli 1.
Tabela 1
| rHV2 | rHV2-Lys 47 | |
| dla trombiny ludzkiej | 14800 | 19000 |
| dla trombiny bydlęcej | 15500 | 19200 |
| (spodziewane wyniki dla | ||
| trombiny ludzkiej) | (13300) | (16000) |
Aktywność przeciwzakrzepową swoista wariantu rHV2 hirudyny wynosi ±15000 ATU/mg oraz ±19000 ATU/mg dla wariantu rHV2-Lys 47. Aktywności te są wyższe od oczekiwanych. Aktywność swoista jest identyczna dla trombiny ludzkiej i bydlęcej.
157 254
b) Aktywność antykoagulacyjna w plazmie szczura i królika oznaczona czasem trombinowym jest równocenna dla niskich stężeń obu hirudyn. Dla wyższych stężeń nieco lepszy jest wariant rHV2-Lys 47. Ilość resztkowej trombiny w plazmie szczura i królika, oznaczona przez substrat chromogenny, jest porównywalna po dodaniu obu hirudyn do 60 ATU/ml. Dla dalszego zneutralizowania śladów resztkowej trombiny bardziej skuteczny jest wariant rHV2-Lys 47. Odzwierciedla to różnica w wartościach Ki.
c) Kinetyka plazmatycznego zaniku obu hirudyn po iniekcji drogą i. v. bolus jest porównywalna dla oznaczenia metodą chromogenną, lecz nieco różna dla oznaczenia metodą czasu trombinowego (tabela 2). Hirudyny zanikają według dwóch wykładników. Pierwsza faza (dystrybucja) z t 1/2 a około 3 minut redukuje o 60% ilość początkową w ciągu 5 minut dla obu hirudyn; druga faza (eliminacja) z 11/2 β 16 minut dla rHV2-Lys 47 i 28 minut dla rHV2 jeśli bierze się pod uwagę czas trombinowy oraz odpowiednio 28 i 30 minut jeśli stosuje się metodę chromogenną. Standardowa heparyna zanika w jednej fazie wykładniczej (t 1/2 = 9 minut).
Tabela 2
Czas półtrwania (w minutach) hirudyn po iniekcji i. v. bolus u królika
| Metoda | t 1/2 a | t 1/2 β | ||
| TT | SC | TT | SC | |
| rHV2 | 2,5 | 3,0 | 28 | 28 |
| rHV2-Lys 47 | 1,8 | 3,0 | 16 | 30 |
TT: czas trombinowy SC: substrat chromogenny
d) Stężenia plazmatyczne obu wariantów hirudyny uzyskane po 30 minutach perfuzji ciągłej drogą dożylną u królika są zależnie liniowo od wprowadzonych dawek.
e) Efekty przeciwzakrzepowe.
| Królik u. v. perfuzja | Szczur i. v. bolus | |
| μ/kg/h | Pg/kg | |
| Produkty | Wessler Zastój | Wessler |
| -5 min. 40 sek. -1 min |
| rHV2 | 375 | _ | 240 | — |
| rHV2-Itys 47 | 20 | 47 | 160 | — |
| heparyna standardowa | 110 | 110 | 160 | 110 |
Na podstawie uzyskanych wyżej wyników wstępnych badań farmakologicznych okazało się, że przy perfuzji ciągłej u królika wariant rekombinowanej hirudyny rHV2-Lys 47 ma wyższą aktywność przeciwzakrzepówą od aktwyności rHV2 i heparyny. Farmakokinetyka obu wariantów hirudyny jest identyczna.
Przykład VI. Porównanie stosunku aktywność przeciwzakrzepowa/ryzyko krwotocze dla hirudyny rHV2-Lys 47 i standardowej heparyny.
Przeprowadzone badania wykazały, że ryzyko krwotoczne u królika lub wydłużenie czasu krwawienia u szczura potraktowanego rHV2-Lys 47 jest niższe niż dla heparyny w odniesieniu, dla każdego gatunku, do dawek o takiej samej aktywności w modelu zastoju. Złożenie szczepów reprezentatywnych według wynalazku. Następujące szczepy złożono w dniu 6 listopada 1986 r. w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Instytutu Pasteura, 28 Rue du Docteur Roux, Paris (15):
TGYlsp4 pTG1977 (HV2-Arg47) pod numerem 1-621
TGYlsp4 pTG1980 (HV2-Lys47) pod numerem 1-622.
Szczep odniesienia zgłoszono w dniu 6 czerwca 1986:
TGYlsp4 pTG1828 pod numerem 1-569.
Literatura cytowana
1. Chang J. Y., Febs Letters 164, 307-313 (1983).
2. Chang J. Y., Eur. J. Biochem. 151, 217-224 (1985).
157 254
3. Dodt J. i in., Febs Letters 165, 180-184 (1984).
4. Dodt J. i in., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985).
5. Dodt J. i in., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986).
6. Harvey R. P. i in., Proe. Natl. Aead. Sei. USA 83, 108^1088 (1986).
7. Kieny M.P., Lathe R., Leeoeq J. P., Gene 26, 91-99 (1983).
8. Krajewski T., Blomback B., Acta Chemica Scandinavica 22, 1339-1346 (1968).
9. Markwardt F., Methods Enzymol 19, 924-932 (1970).
10. Messing J., Crea R., Seeburg P. H., Nuel. Ae. Res. 9, 309 (1981).
11. Petersen T. E. i in., Protides, Biol., Fluids, Proe. Collog. 23, 1-45-149 (1976).
12. Stone S. R.,Hofsteenge, J. Bioehem. 25, 4622-4628 (1986).
13. Zoller M. J., Smith Μ. N., Methods in Enzymol. 100, 4ó9 (1983).
• ρΤ6182θ pTG19S0
O pTG197T
O pTS1970 FIG.2 * pTG1979 λ ρΐΕβ81
FIG.1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | |
| 1 HV1 | VAL | VAL | TYR | THR | ASP | CYS | THR | GLU | SER | GLY | GLN | ASN | LEU | cys | LEU |
| 2HV2 | ILE | THR | TYR | THR | ASP | CY5 | THR | GLU | SER | GLY | GLN | ASN | LEU | CYS | LEU |
| 3 HV3 | ILE | THR | TYR | THR | ASP | CYS | THR | GLU | SER | GLY | GLN | ASN | LEU | CYS | LEU |
17 1β 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY
CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY
CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY
CLN
LYS
LYS
| GLY ASN | LYS | CYS | ILE | LEU |
| GLY ASN | LYS | CYS | ILE | LEU |
| GLY ASN | LYS | CYS | ILE | LEU |
| 31 32 | 33 | 34 | 35 |
| GLY SER | ASP | GLY | CLU |
| GLY SER | ASN | GLY | LYS |
| GLY 5ER | CLN | GLY | LYS |
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
LYS
GLY
ASP
ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO
ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO
ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO
LYS
ASN
LYS
49 50 51 52
54 55 56 57 58 59 60 61
63 64 63
LEU CLN
LEU CLN
ASP GLU 65 66
Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 5000 zł.
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania wariantów hirudyny HV1, HV2 i HV3, zawierających w pozycji 47 do 63 aminokwas inny, niż aminokwas formy naturalnej, który to aminokwas wybrany jest z grupy obejmującej lizynę, kwas glutaminowy, argininę, histydynę i kwas asparaginowy, znamienny tym, że w środowisku hodowlanym prowadzi się fermentację szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae transformowanych blokiem funkcyjnym ekspresji sekwencji kodującej wariant hirudyny, a następnie po fermentacji odzyskuje się wytworzony w środowisku hodowlanym wariant hirudyny w postaci dojrzałej, lub w postaci prekursora dojrzewającego in vitro.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako blok funkcyjny ekspresji sekwencji kodującej stosuje się wektor lub blok funkcyjny DNA zawierający; miejsce początku replikacji plazmidu drożdży 2μ, gen ura3, miejsce początku replikacji w E. coli i marker oporności na antybiotyk, promotor transkrypcji, sekwencję liderową i sekwencję pre-pro prekursora czynnika alfa, przyłączoną w fazie, powyżej sekwencji kodującej wariant hirudyny, oraz terminator transkrypcji genu PGK drożdży, umieszczony poniżej genu wariantu hirudyny.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny, w którym aminokwas Tyr w pozycji 63 w formie naturalnej zastąpiony jest resztą kwasu Glu lub Asp.
- 4. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny, w którym aminokwas w pozycji 47 w formie naturalnej jest zastąpiony przez Arg lub His.
- 5. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny w którym aminokwas 47 formy naturalnej HV2- Asnzastąpiony jest przez Lys.
- 6. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, albo zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny wybrany z grupy obejmującej; (Lys47)HV2, (Arg47)HV2, (His47)HV2, (Glu63)HV2, (Asp63)HVl.
- 7. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, albo zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencję kodującą wariant hirudyny o następującej sekwencji Aminokwasowej; ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN.
- 8. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, albo zastrz. 5, albo zastrz. 6, albo zastrz. 7, znamienny tym, że wariant hirudyny poddaje się siarczanowaniu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR868616723A FR2607517B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL269164A1 PL269164A1 (en) | 1988-08-18 |
| PL157254B1 true PL157254B1 (pl) | 1992-05-29 |
Family
ID=9341393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL1987269164A PL157254B1 (pl) | 1986-12-01 | 1987-12-01 | Sposób wytwarzania wariantów hirudyny PL PL |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650301A (pl) |
| EP (1) | EP0273800B1 (pl) |
| JP (1) | JP2567263B2 (pl) |
| KR (1) | KR960011918B1 (pl) |
| AT (1) | ATE73462T1 (pl) |
| AU (1) | AU617989B2 (pl) |
| BG (1) | BG49719A3 (pl) |
| CA (1) | CA1341416C (pl) |
| CS (1) | CS276245B6 (pl) |
| DE (1) | DE3777367D1 (pl) |
| DK (1) | DK173247B1 (pl) |
| ES (1) | ES2032465T3 (pl) |
| FI (1) | FI99211C (pl) |
| FR (1) | FR2607517B2 (pl) |
| GR (1) | GR3004556T3 (pl) |
| HU (1) | HU213871B (pl) |
| IE (1) | IE60544B1 (pl) |
| MC (1) | MC1884A1 (pl) |
| NO (1) | NO177500C (pl) |
| PL (1) | PL157254B1 (pl) |
| PT (1) | PT86233B (pl) |
| RO (1) | RO106890B1 (pl) |
| SU (1) | SU1687032A3 (pl) |
| ZA (1) | ZA879011B (pl) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2628429B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1990-12-28 | Transgene Sa | Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir |
| GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
| GB8817161D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Modified proteins |
| US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| FR2656531B1 (fr) * | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
| US5118790A (en) * | 1990-07-24 | 1992-06-02 | Sri International | Analogs of hirudin |
| DK0511393T3 (da) * | 1990-11-08 | 1996-12-09 | Japan Energy Corp | Hirudin-mutant, fremstilling af denne, antikoagulant, sekretorisk vektor, mikroorganisme transformeret af vektoren og fremstilling af produkt ud fra mikroorganismen |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| US5407822A (en) * | 1991-10-02 | 1995-04-18 | Sanofi | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast |
| EP3838911A4 (en) * | 2019-04-16 | 2021-12-01 | Sungen Bioscience Co., Ltd. | PROCESS FOR EXTRACTING AND PURIFYING A HIRUDIN MUTANT AND ASSOCIATED USE |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341414C (fr) * | 1984-03-27 | 2002-12-31 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| EP0209061B1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel |
-
1986
- 1986-12-01 FR FR868616723A patent/FR2607517B2/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-11-25 NO NO874905A patent/NO177500C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-27 IE IE323987A patent/IE60544B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-27 AU AU81880/87A patent/AU617989B2/en not_active Expired
- 1987-11-27 PT PT86233A patent/PT86233B/pt unknown
- 1987-11-30 DE DE8787402696T patent/DE3777367D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 AT AT87402696T patent/ATE73462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 ES ES198787402696T patent/ES2032465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 CA CA000553153A patent/CA1341416C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-30 RO RO130679A patent/RO106890B1/ro unknown
- 1987-11-30 EP EP87402696A patent/EP0273800B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 SU SU874203831A patent/SU1687032A3/ru active
- 1987-11-30 DK DK198706276A patent/DK173247B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 PL PL1987269164A patent/PL157254B1/pl unknown
- 1987-12-01 ZA ZA879011A patent/ZA879011B/xx unknown
- 1987-12-01 FI FI875295A patent/FI99211C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 HU HU875394A patent/HU213871B/hu unknown
- 1987-12-01 BG BG82035A patent/BG49719A3/xx unknown
- 1987-12-01 JP JP62305504A patent/JP2567263B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-01 KR KR1019870013708A patent/KR960011918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 MC MC871932A patent/MC1884A1/xx unknown
- 1987-12-01 CS CS878732A patent/CS276245B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-05-12 GR GR920400903T patent/GR3004556T3/el unknown
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,511 patent/US5650301A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5258288A (en) | Vector containing DNA encoding mature human protein S | |
| PL157254B1 (pl) | Sposób wytwarzania wariantów hirudyny PL PL | |
| AU643306B2 (en) | Anticoagulant polypeptides | |
| JP2667405B2 (ja) | 生物学的に活性な第ｘ▲ｉｉｉ▼因子の発現 | |
| WO1989000192A1 (en) | Production of kallikrein | |
| EP0687731A1 (en) | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism | |
| US5858970A (en) | Polypeptide having Factor Xa inhibitory activity | |
| US5464774A (en) | Bovine basic fibroblast growth factor | |
| US5420252A (en) | Human antithrombin III mutants | |
| US5286487A (en) | Covalent angiogenin/RNase hybrids | |
| US5270204A (en) | Covalent angiogenin/RNase hybrids | |
| EP0677107B1 (de) | Thrombininhibitor aus speichel von protostomiern | |
| Courtney et al. | Production and evaluation of recombinant hirudin | |
| WO1990015072A1 (en) | Platelet aggregation inhibitors and related molecules | |
| EP0696198B1 (en) | Novel polypeptide having factor xa inhibitory activity | |
| EP0454765A1 (en) | Pregnancy specific proteins applications | |
| NZ219608A (en) | Minactivin (urokinase-type plasminogen activator inhibitor) peptides, dna coding it and its production via recombinant dna methods | |
| US5837808A (en) | Analogs of hirudin | |
| WO1993004082A1 (en) | Analogs of hirudin | |
| JPH02167076A (ja) | ポリペプチド化合物 | |
| JP2553425B2 (ja) | トロンビン結合性物質及びその製造法 |