DK173247B1 - Varianter af hirudin HV2, disse varianter til anvendelse som lægemiddel, specielt som thrombinihibitorer, et præparat til a - Google Patents
Varianter af hirudin HV2, disse varianter til anvendelse som lægemiddel, specielt som thrombinihibitorer, et præparat til a Download PDFInfo
- Publication number
- DK173247B1 DK173247B1 DK198706276A DK627687A DK173247B1 DK 173247 B1 DK173247 B1 DK 173247B1 DK 198706276 A DK198706276 A DK 198706276A DK 627687 A DK627687 A DK 627687A DK 173247 B1 DK173247 B1 DK 173247B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hirudin
- variant
- variants
- thrombin
- sequence
- Prior art date
Links
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 title claims description 6
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 title claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 4
- 108010010968 hirudin HV2 Proteins 0.000 title claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 60
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 49
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 49
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 26
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 26
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 108700003599 Lys(47)- hirudin Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 11
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 11
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 11
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 3
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 2
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FNXOZWPPOJRBRE-XGEHTFHBSA-N Cys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CS)N)O FNXOZWPPOJRBRE-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005164 penile vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
i DK 173247 B1
Den foreliggende opfindelse angår varianter af hirundin HV2, disse varianter til anvendelse som lægemiddel, specielt som thrombininhibitorer, et præparat til anvendelse som antikoagu-lationsmiddel samt en fremgangsmåde til fremstilling af en variant 5 af hirundin HV2.
Mindst 3 naturlige hirudinvarianter er beskrevet i litteraturen (Markwardt 1970; Petersen et al. 1976; Markwardt og Walsmann 1976; Chang 1983; Dodt et al. 1984, 1985, 1986; Harvey et al. 1986; FR 10 84.04755). Sammenligninger mellem disse 3 varianters sekvens er vist i fig. 1.
Den første variant, HV1, svarer til hirudin, som isoleres fra blodiglens krop; den anden, HV2 (Harvey et al. 1986) adskiller sig 15 fra den første med 9 aminosyrer; den tredje (Dodt et al. 1986) er identisk med HV2 indtil serin 32, roen adskiller sig derfra med 10 aminosyrer i den C-terminale del, som desuden omfatter en yderligere aminosyre (Ala63). Denne tredje variant betegnes HV3 i det følgende.
20
Disse sekvenser omfatter 65 eller 66 aminosyrer og kan betragtes som 2 områder: en kugleformet N-terminal del, som indeholder 3 disulfidbroer, og en sur C-terminal del, som er homolog med spaltningsstedet for thrombin i prothrombinmolekylet. Denne 25 homologi tillader en formodning om, at den region, som omgiver stilling 47, kan være bindingsstedet for hirudin til thrombin. På den anden side indeholder naturligt hirudin en sulfateret tyrosinrest i stilling 63 (Chang, 1983). Denne sulfaterede tyrosinrest findes i stilling 64 i HV3-varianten.
30 Den betegnes i det følgende "stilling 63" for alle varianterne, da dens funktion er den samme uanset dens stilling.
En sammenligningsanalyse af sekvenserne af de naturlige hirudinvarianter gør det muligt teoretisk at forestille sig dannelse af 35 nye varianter, hvor de naturlige molekylers karakteristika er kombineret på forskellig måde.
2 DK 173247 B1 HV1 og HV3 har en lysinrest i stilling 47 beliggende mellem 2 prolinrester, hvilken lysinrest formodentlig er ansvarlig for blokeringen af det aktive sted for thrombin (Dodt et al. 1984 og 5 1985).
Da HV2 ikke har nogen basisk rest i denne stilling, men en asparaginrest, forekommer det at være ønskeligt her at erstatte den med en lysinrest eller en argininrest for at få den til at 10 stemme bedre overens med det, der forventes af en thrombinin-hibitor (Chang 1985), eller en histidinrest, som ikke er overensstemmende med et godt thrombinsubstrat, men som kan forøge hirudinets inhiberende evne.
15 På den anden side udgør sulfateringen af tyrosin 63 en forskel mellem naturligt hirudin og hirudin, der er vundet ved genetisk rekombination, hvilket kan have konsekvenser for dets aktivitet, hvad de kinetiske undersøgelser, der er foretaget af Stone og Hofsteenge (1986), antyder. Man kan forsøge at efterligne det 20 native protein ved at erstatte tyrosin med en sur rest såsom Glu eller Asp.
Den foreliggende opfindelse angår varianter af hirundin HV2, der er ejendommelig ved, at de i stilling 47 omfatter en aminosyre, 25 Lys eller Arg, som er forskellig fra den aminosyre, Asn, der findes i den naturlige form.
Den foretrukne variant ifølge den foreliggende opfindelse, nemlig (Lys17) HV2 [eller "rHV2-Lys47”] , har følgende formel: 30
ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS
GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER
ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO
GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU
35 GLN.
3 DK 173247 B1
Varianter, som har bevaret Tyr63, kan anvendes i enten sulfateret eller ikke-sulfateret form. Denne sulfatering kan opnås kemisk eller ad biologisk vej.
5 Den foreliggende opfindelse angår biologiske og/eller kemiske fremgangsmåder, ved hvilke de ovenfor nævnte varianter kan fremstilles.
Disse varianter kan fås ved syntese, hemisyntese og/eller ved 10 kendte genetiske manipulationsteknikker.
Kloning og ekspression af de forskellige sekvenser, som koder for HV2, og opnåelse af tilsvarende hirudiner ud fra gærkulturer, er fx beskrevet i EP 200 655.
15
Varianterne ifølge opfindelsen kan fås ved tilsvarende teknikker, efter at ovennævnte kodende sekvenser er blevet modificeret, fx ved styret mutagenese.
20 Der er især ved styret mutagenese in vitro konstrueret varianter, hvor asparagin 47 er erstattet med lysin eller arginin.
Der er især muligt at anvende funktionelle ekspressionsblokke som beskrevet i EP 200 655, i hvilke hirudinsekvensen koder for oven-25 nævnte varianter; disse funktionelle DNA-blokke kan bæres af en plasmidvektor.
For at styre ekspressionen og sekretionen ved hjælp af gærgener svarende til de forskellige varianter indsættes disse i en 30 gærvektor, der fortrinsvis omfatter følgende elementer, som er beskrevet i EP 200 655: - replikationsinitieringsstedet fra gærplasmidet 2μ, ura3-genet, 35 - et replikationsinitieringssted fra E. coli og en markør for antibiotikaresistens, 4 DK 173247 B1 en transkriptionspromotor, "leder"-sekvensen og præ-pro-sekvensen fra precursoren for or-faktoren fusioneret i fase opstrøms for den sekvens, der koder for hirudinvarianten, og transkriptionsterminatoren fra PGK-gærgenet, som anbringes 5 nedstrøms for genet for den pågældende variant.
Opfindelsen angår også gær transformeret med disse vektorer eller med den funktionelle DNA-blok samt deres anvendelse ved fremstilling af hirudinvarianterne.
10
Opfindelsen angår især en fremgangsmåde til fremstilling af en hirudinvariant ved fermentering af en gærstamme ifølge opfindelsen og isolering af det fremstillede hirudin i dyrkningsmediet i moden form eller i form af en precursor, der kan modnes in vitro.
15
De anvendte teknikker er beskrevet mere detaljeret i EP 200 655 og EP 87 401649.6.
De således vundne hirudinvarianter kan anvendes som beskrevet i EP 20 200 655 som thrombininhibitor, både in vivo og in vitro.
Varianterne kan især anvendes i farmaceutiske præparater, alene eller sammen med andre aktivstoffer, eller til tests eller diagnose in vitro eller in vivo. I sidstnævnte tilfælde kan det 25 være interessant at mærke varianterne, fx ved hjælp af radioaktiv, fluorescerende eller enzymatisk mærkning eller en anden mærkning.
Den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved nedenstående eksempler og tegningen, hvor 30 - fig. 1 viser sekvenserne af 3 naturlige hirudinvarianter, nemlig HVl, HV2 og HV3, og fig. 2 viser den procentvise inhibering af den proteolytiske aktivitet af thrombin på chromozymet som funktion af volumenerne af supernatanter fra gærkulturer, der producerer 35 rHV2-hirudin eller en variant deraf.
5 DK 173247 B1 EKSEMPEL 1
Konstruktion af forskellige HV2-varianter ved mutagenese in vitro 5
For at udføre en styret mutagenese in vitro klones det Defragment, som skal modificeres, i den replikative form af en enkeltstrenget fag; genomet fra den rekombinante fag isoleres og underkastes hybridisering med et syntetisk oligonukleotid, som 10 bærer den muterede sekvens. Dette oligonukleotid tjener som primer for syntesen af den komplementære streng, og DNA'et, som derved er blevet dobbeltstrenget, anvendes til transformation af en modtagerbakterie, som skal producere den fag, der bærer den ønskede mutation (Zoller og Smith, 1983) .
15
Plasmidet pTG720, der er beskrevet i EP 158 564, er en ekspressionsvektor for hirudin i E. coli. Plasmidet pTG730 er afledt af pTG720 ved tilføjelse af et EcoRI-sted nedstrøms for den sekvens, der koder for hirudin. EcoRI-stedet gør det muligt at isolere den 20 sekvens, der koder for hirudin, ved spaltning med EcoRI og med Clal.
Clal-EcoRI-fragmentet dækker hele den region, der koder for hirudin, minus nogle 5'-terminale kodoner. Dette Clal-EcoRI-25 fragment blev klonet mellem Accl- og EcoRI-stederne i et derivat af fagen M13, betegnet M13TG131 (Kieny et al., 1983). Den fag, der er afledt fra M13TG131, og som omfatter hirudinsekvensen, betegnes M13TG1919. 1 2 3 4 5 6
Der blev syntetiseret 2 oligonukleotider, som hver især kan 2 sammenkobles med sekvensen 5'-GTACACCGAACCCTGAAAG-31 fra M13TG1919 3 med undtagelse af deres centrale region, som svarer til den 4 ønskede mutation. Sekvenserne af disse oligonukleotider er 5 følgende: 6 6 DK 173247 B1 TG436 5 1 -CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-3' TG437 51-CTTTCAGGGCGCGGTGTAC-3'
Disse oligonukleotider blev udformet for at muliggøre erstatning 5 af kodonen AAC (Asn) i M13TG1919 med AAA (Lys) eller CGC (Arg).
120 picomol af hvert oligonukleotid blev phosphoryleret i 100 μΐ reaktionsmedium, og ca. 20 picomol af det phosphorylerede oligonukleotid blev hybridiseret med 1 picomol enkeltstrenget DNA fra 10 fagen M13TG1919 i 25 μΐ hybridiseringspuffer.
Efter hybridisering blev DNA-blandingerne underkastet påvirkning fra Klenow-polymerase og ligase fra fagen T4. Hver således behandlet blanding blev anvendt til transfektion af E. coli-15 stammen 71/18 (mut L) på et tæppe af JM103-indikatorbakterier (Messing et al., 1981). De inficerede celler kan selekteres, da de er mere langsomme til at danne vækstzoner; kolonierne blev udpladet på komplet medium og derefter overført til Whatman 540-papir til screening for celler med dé muterede fager.
20
Denne screening udføres ved hybridisering in situ med det oligonukleotid, der tidligere blev anvendt som primer. Der vandtes således 2 nye fager, der havde den ønskede muterede sekvens: 1
Ml3TG1921 (Asn47 -» Arg) og M13TG1925 (Asn47 -► Lys).
7 DK 173247 B1 EKSEMPEL 2
Erstatning af Pstl-Hindlll-fragmentet (0,6 kb) i pTG1828 med det muterede fragment 5
Plasmidet pTG1828 (beskrevet i EP 87 401649.6) bærer den sekvens, der koder for hirudin, før hvilken der findes præ-pro-sekvenser fra genet for α-kønspheromonet fra gær; det hele anbringes under kontrol af PGK-promotoren. Ved denne fusion mellem præ-pro-10 sekvenserne fra MFa og hirudin følger det udtrykte protein den normale vej for sekretion og modning af gær, således at det bearbejdede og aktive hirudin findes i dyrkningsmediet. Dette plasmid blev anvendt til at udtrykke de muterede hirudinsekvenser i stedet for nativt hirudin.
15
Spaltning af pTG1828 med PstI og Hindlll frigør 5 fragmenter med en størrelse på henholdsvis ca. 3,8, 1,9, 1,5, 1,1 og 0,6 kb. Det sidste fragment omfatter den fusionerede præ-pro-hirudinsekvens.
Dette fragment omfatter kun ét AccI-sted og ét EcoRI-sted. Den 20 region, der er afgrænset af disse to steder, omfatter hele hirudinsekvensen undtagen nogle 5’-terminale kodoner. Hindlll-Pstl-fragmentet på 0,6 kb blev indsat mellem Hindlll- og Pstl-stederne i en vektor, som hverken har EcoRI-sted eller AccI-sted. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Det således dannede plasmid (pTG1960) har således et unikt AccI- 2 sted og et unikt EcoRI-sted, der befinder sig henholdsvis i 3 starten af hirudinsekvensen og nedstrøms for denne. Spaltning af 4 pTG1960 med Accl og EcoRI frigør et fragment, som omfatter næsten 5 hele hirudinsekvensen og resten af plasmidet.
6 7
Det store DNA-fragment, der er deleteret fra hirudinsekvensen, 8 oprenses på en gel og blandes med AccI-EcoRI-spaltningsproduktet i 9 den replikative form af hver af de i eksempel 1 beskrevne muterede 10 fager for at danne præ-pro-hirudinfusionen med de nye HV2- 11 varianter, der er fremstillet ved styret mutagenese. 2 nye plasmider blev selekteret: pTG1963 (Asn41 -> Arg) og pTGl966 (Asn47 DK 173247 B1 ' 8 -» Lys), som kun er forskellige fra pTG1960 ved de muterede kodoner.
Disse sekvenser, der bærer de muterede kodoner, kan isoleres i 5 form af Pstl-Hindlll-fragmenter og genklones i vektoren pTG1828 i stedet for det oprindelige Pstl-HindlII-fragment.
Dette gav 2 nye plasmider: pTG1977 (Asn41 -* Arg) og pTG1980 (Asn47 -> Lys), som kun er forskellige fra det ovenfor beskrevne pTG1828 10 ved de mutationer, der er dannet in vitro.
EKSEMPEL 3
Transformation af TGYlsp4 med DNA fra pTG1977 og pTG1980 15 Celler fra S. cerevisiae TGYlsp4 (Mata ura3.251.373.382 his3.1-1.15) blev transformeret med DNA fra pTG1977 og pTGl980. Der blev i hvert tilfælde opnået ura*-transformanter.
Der fås således 2 stammer: TGYlsp4 pTGl977 og TGYlsp4 20 pTG1980. Disse 2 stammers produktion af hirudin blev sammenlignet med TGYlsp4 pTG1828.
20 ml kultur (YNBG + 0,5% casaminosyrer) ved OD66o 0,02 blev podet med hver stamme. Efter 48 timers agitation ved 30°C centrifugeres 25 kulturerne (5000 omdr./minut, 5 minutter), og supernatanterne blev analyseret. En kultur af TGYlsp4 pTG881 (dette plasmid bærer ikke nogen sekvens, der koder for HV2) anvendes som kontrol.
Aktiviteten af de rå supernatanter måles ved deres inhiberende 30 virkning på aktiviteten af thrombin (proteolytisk aktivitet på et syntetisk substrat, chromozym TH - Boehringer Mannheim). Den procentvise inhibering som funktion af supernatantvolumenerne er angivet i fig. 2.
9 DK 173247 B1
Det fremgår, at den inhiberende virkning, der frembringes af varianterne Arg47 og Lys47, er mindst lige så stor som nativt HV2' s virkning.
5 EKSEMPEL 4
Inhibering af aktiviteten af thrombin
For bedre at påvise betydningen af hirudinvarianterne ifølge 10 opfindelsen, især med henblik på deres farmaceutiske anvendelse, belyser følgende sammenligningseksempler de inhiberende egenskaber over for thrombin hos HV2-varianten og to andre varianter af HV2-formen, hvor aminosyren i stilling 47 er erstattet med Arg eller Lys, alle fremstillet ved hjælp af rekombinant DNA.
15
Til undersøgelse af thrombininhiberingskinetikken ved hjælp af disse varianter anvendes teorien med inhibitorer med stærk affinitet, som er beskrevet af J.W. Williams og J.F. Morrison,
Methods in Enzymology 63, s. 437-467, 1979, idet hirudin er en 20 reversibel thrombininhibitor.
De anvendte hirudinvarianter oprenses til 95%, og rent humant thrombin fra Sigma har en aktivitetsprocent på over 92%, målt ved titrering af det aktive sted. Koncentrationen af humant thrombin 25 er den samme for alle målingerne, dvs. 5,5 x ΙΟ"9 M. Mediet er en 0,05 M PIPES-natriumpuffer, pH 7,9, 0,18 M KC1 og 0,1% PEG ved 37°C. Thrombinsubstratet er chromozym PL fra Boehringer. Der udføres præinkubation i 2 minutter for thrombin og hirudin, hvorefter reaktionen udløses ved hjælp af substratet.
30 I følgende tabel er angivet de eksperimentelt bestemte værdier for den mængde hirudin, der er nødvendig for at inhibere 95% af den samme mængde humant thrombin (5,5 x 10'9 M) .
10 DK 173247 B1 Mængde for at nå 95% inhibering af thrombin (10"9 M) HV2 Lys47 7,6 5 HV2 Arg47 8,5 HV2 32,2
Det fremgår således, at der kræves ca. 4 gange mindre hirudin (HV2 10 Arg47 og HV2 Lys47) for at inhibere samme mængde humant thrombin end af HV2-hirudin.
De omhandlede varianter har derfor inhiberende egenskaber over for thrombin, som er klart forbedrede.
15 EKSEMPEL 5
Præliminær farmakologisk undersøgelse af de to varianter af rekom-20 binant hirudin, rHV2 og rHV2-Lys47 sammenlignet med standardheparin 1. Formål med undersøgelsen
Formålet var at bedømme to varianter af rekombinant hirudin, rHV2 25 (eller HV2) og rHV2-Lys47 (eller (Lys47)HV2) og sammenligne deres antithrombotiske virkning med standardheparin. Disse to varianter mangler posttranskriptionel sulfatering af gruppen Tyr63.
Forsøgsbetingelser 30 a) Den specifikke antithrombinaktivitet (humant og bovint thrombin) af de to rekombinante hirudinvarianter i fysiologisk serum bestemmes ved inhiberingen af thrombinets proteolytiske aktivitet på chromozymet.
35 11 DK 173247 B1 b) Den antikoagulerende aktivitet af de to hirudinvarianter sammenlignes in vitro i rotte- og kaninplasma ved forlængelse af - thrombintiden, og anti-IIa-virkningen måles ved en chromogen metode.
5 c) Kinetikken for hirudinets forsvinden fra plasmaet efter bolusinjektion ad intravenøs vej følges ved måling af anti-IIa-virkningen ved hjælp af thrombintiden og ved en chromogen metode ved hjælp af kalibreringskurver.
10 d) De plasmakoncentrationer, der opnås efter 30 minutters kontinuerlig intravenøs perfusion i kaniner, bestemmes ved samme teknikker.
15 e) Antithrombinaktiviteten af de to hirudinvarianter og af stan-dardheparin undersøges i Wesslers kanin- og rottemodel med thromboplastin som thrombogent middel og i stasis-modellen i kaniner (Fareed). Lægemidlerne administreres ved kontinuerlig perfusion til kaninerne og som en intravenøs bolus til rotterne.
20 De anvendte modeller er følgende:
Wesslers kaninmodel
New Zealand-hankaniner med en vægt på 2,5-3 kg blev anvendt i 25 denne undersøgelse. Efter anæstesi ved intravenøs injektion af natriumpentobarbital (30 mg/kg) blev der indsat en kanyle i venstre halspulsåre, og de to halsvener blev isoleret; to løse ligaturer blev anbragt på hver af disse 2,5 cm fra hinanden.
Kaninerne fik derefter enten fysiologisk serum eller opløsninger 30 af hirudin eller heparin ved kontinuerlig perfusion i 30 minutter i en mængde på 2,5 ml/time. 2 minutter før afslutningen af perfusionen blev der udtaget arterieprøver for at bestemme plasmamængden af antikoagulanser. 1 minut før afslutningen af perfusionen blev der injiceret humant thromboplastin (Manchester 35 Comparative Reagents LTD), standardiseret ved metoden ifølge M. Buchanan, i en dosis på 600 pg/kg i nøjagtig 30 sekunder i aorta 12 DK 173247 B1 der blev udført en blodstasis ved at stramme ligaturerne på de to venesegmenter i 15 minutter. Halsvenerne blev åbnet og thromber ekstraheret, skyllet i fysiologisk serum og vejet efter at være blevet duppet på filterpapir.
5
Wesslers rottemodel
Der blev anvendt Sprague-Dawley-hanrotter (CD-COBS) med en vægt på ca. 300 g. Efter anæstesi med natriumpentobarbital ad intra-10 peritoneal vej (30 mg/kg) og median-laparotomi blev vena cava inferior isoleret i en længde på 1 cm fra nyre-knudepunktet (carrefour rénal). Der blev anbragt to løse ligaturer med en afstand på 0,7 cm.
15 De produkter, der skulle testes, og som var fortyndet i fysiologisk serum, blev injiceret som en intravenøs bolus med 1 ml/kg 5 minutter, 40 sekunder eller 1 minut (heparin) før udførelse af venestasis. 40 sekunder før denne stasis blev der injiceret et thrombogent middel (thromboplastin fra E. Dade-kanin) i en dosis 20 på 25 mg/ml/kg i penisvenen i løbet af nøjagtig 30 sekunder. 10 sekunder efter afslutningen af injektionen blev der etableret en stasis ved at stramme de to ligaturer, først den proximale, dernæst den distale. Stasen blev opretholdt i 10 minutter, hvorefter thromben blev fjernet, nedsænket i en 0,38% 25 citratopløsning, tørret på køkkenrulle og vejet næste dag efter 1 times tørring ved 50°C.
Thrombose-model vist ved blodstasis hos kaniner 30 New Zealand-hankaniner med en vægt på 2,5-3 kg blev anvendt i denne undersøgelse. Efter intravenøs anæstesi med natriumpentobarbital (30 mg/kg) blev der indsat en kanyle i venstre halspulsåre, og de to halsvener blev isoleret; to løse ligaturer blev anbragt på hver af disse 2,5 cm fra hinanden. Kaninerne fik 35 derefter enten fysiologisk serum eller opløsninger af hirudin eller heparin ved kontinuerlig perfusion i 30 minutter i en mængde 13 DK 173247 B1 på 2,5 ml/time. 2 minutter før afslutningen af perfusionen blev der taget arterieprøver for at bestemme plasmamængden af antikoagulanser. Samtidig med, at perfusionen blev standset, blev der etableret en stasis ved at stramme de fire ligaturer (først 5 den proximale, dernæst den distale). Stasen blev opretholdt i 2 timer, hvorefter halsvenerne blev åbnet og thromberne ekstraheret, skyllet i fysiologisk serum og vejet efter at være duppet på filterpapir.
10 Resultater a) For et præparat af stamopløsningen i en koncentration på 1 mg/ml er den specifikke antithrombinaktivitet af de to hirudin-varianter over for humant og bovint thrombin angivet i tabel 1 15 nedenfor: TABEL 1 rHV2 rHV2-Lys47 20 - for humant thrombin 14.800 19.000 for bovint thrombin 15.500 19.200 (forventet resultat for humant thrombin) (13.300) (16.000) 25 -
Den specifikke antithrombinaktivitet af hirudinvarianten rHV2 er ± 15.000 ATU/mg og ± 19.000 ATU/mg for varianten rHV2-Lys47. Disse specfikke aktiviteter er større end de forventede. Den specifikke 30 aktivitet er identisk for humant og bovint thrombin.
b) Den antikoagulerende aktivitet i rotte- og kaninplasma, bestemt ved thrombintiden, er ens ved svage koncentrationer af de to hirudinvarianter. Varianten rHV2-Lys47 er klart bedre i højere 35 koncentrationer. Mængden af resterende thrombin i rotte- og kaninplasmaet, bestemt ved hjælp af chromogent substrat, er 14 DK 173247 B1 sammenlignelige efter tilsætning af de to hirudinvarianter op til 60 ATU/ml. Til yderligere neutralisering af sporene af resterende thrombin er varianten rHV2-Lys47 mere effektiv. Dette afspejler forskellen i Ki.
5 c) Kinetikken for de to hirudinvarianters forsvinden i plasmaet efter intravenøs bolusinjektion er sammenlignelig ved bestemmelse ved chromogenmetoden, men en smule forskellig ved bestemmelse ved hjælp af thrombintiden (tabel 2). Hirudinvarianterne forsvinder i 10 henhold til to eksponenter. En første fase (fordeling) med en halveringstid a på ca. 3 minutter, som reducerer den første initiale mængde med 60% på 5 minutter for de to hirudinvarianter; en anden fase (eliminering) med en halveringstid β på 16 minutter for rHV2-Lys47 og på 28 minutter for rHV2, hvis man ser på 15 thrombintiden, og på henholdsvis 28 og 30 minutter, hvis man anvender chromogenmetoden. Standardheparin forsvinder i henhold til en enkelt eksponentiel fase (halveringstid = 9 minutter).
TABEL 2 20
Halveringstid i minutter for hirudinvarianterne efter intravenøs bolusinjektion hos kaniner halveringstid α halveringstid β
25 Metode TT SC TT SC
rHV2 2,5 3,0 28 28 rHV2-Lys47 1,8 3,0 16 30 30 TT: thrombintid SC: chromogent substrat d) Plasmakoncentrationerne af de to hirudinvarianter opnået efter 30 minutters kontinuerlig intravenøs perfusion hos kaniner står i 35 lineært forhold til de perfunderede doser.
15 DK 173247 B1 e) Antithrombinvirkninger
Produkter Intravenøs perfusion i Intravenøs bolus i rot te 5 kanin, pg/kg/time pg/kg
Wessler Stasis Wessler -5 min 40 s -1 min rHV2 375 — 240 10 rHV2-Lys47 20 47 160
Standard- heparin 110 110 160 110 15 På grundlag af disse præliminære farmakologiske resultater fremgår det, at ved kontinuerlig perfusion hos kaniner har den rekombinante hirudinvariant rHV2-Lys47 en antithrombinaktivitet, der er større end rHV2's og heparins. Farmakokinetikken hos de to hirudinvarianter er identisk.
20 EKSEMPEL 6
Sammenligning af forholdet antithrombotisk aktivitet/hamorrhagisk 25 risiko for hirudin rHV2-Lys47 og standardheparin
De udførte undersøgelser viser, at den hæmorrhagiske risiko hos kaniner eller forlængelse af blødningstiden hos rotter, der er behandlet med rHV2-Lys47, er mindre end hos de dyr, der er be-30 handlet med standardheparin, idet der for hver art henvises til ækviaktive doser i en thrombose-model.
Deponering af repræsentative stammer ifølge opfindelsen 16 DK 173247 B1 Følgende stammer er den 6. november 1986 deponeret i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de 1'Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux, Paris (15): 5 TGYlsp4 pTG1977 (HV2-Arg47) med nummeret 1-621.
TGYlsp4 pTG1980 (HV2-Lys47) med nummeret 1-622.
Sammenligningsstammen blev deponeret den 6. juni 1986: 10 TGYlsp4 pTG1828 med nummeret 1-569.
REFERENCER
Chang, J.Y., FEBS Letters 164, 307-313 (1983).
15 - Chang, J.Y., Eur. J. Biochem. 151, 217-224 (1985).
Dodt, J. , Mueller, H.P., Seemiiller, U. & Chang, J.Y., FEBS Letters 165, 180-184 (1984).
Dodt, J., Seemiiller, U., Maschler, R. & Fritz, H., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985).
20 - Dodt, J., Machleidt, W., Seemiiller, U., Maschler, R. &
Fritz, H., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986).
Harvey, R.P., Degryse, E., Stefani, L., Schamber, F., Caze-nave, J.P., Courtney, M., Tolstoshev, P. & Lecocq, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. OSA 83, 1084-1088 (1986).
25 - Kieny, M.P., Lathe, R. & Lecocq, J.P., Gene 26, 91-99 (1983). Krajewski, T. & Blomback, B., Acta Chemica Scandinavica 22, 1339-1346 (1968).
Markwardt, F., Methods Enzymol. 19, 924-932 (1970).
Messing, J., Crea, R., Seeburg, P.H., Nucl. Ac. Res. 9, 309 30 (1981).
Petersen, T.E., Roberts, H.R., Sottrup-Jensen, L. & Magnusson, S., Protides, Biol., Fluids, Proc. Colloq. 23, 145-149 (1976). Stone, S.R. & Hofsteenge, J. Biochem. 25, 4622-4628 (1986).
Zoller, M.J. & Smith, M.N., Methods in Enzymol. 100, 469 35 (1983).
Claims (9)
1. Variant af hirudin HV2, kendetegnet ved, at Asn i stilling 47 er udskiftet med 5 Lys eller Arg.
2. Variant ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aminosyren i stilling 47 i den naturlige form af HV2, Asn, er erstattet med Arg. 10
3. Variant ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aminosyren i stilling 47 i den naturlige form af HV2, Asn, er erstattet med Lys.
4. Variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den enten er sulfateret eller ikke er sulfateret.
5. Variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 til an-20 vendelse som thrombininhibitor.
6. Præparat til anvendelse som antikoagulationsmiddel, kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder i det mindste én variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1- 25 4.
7. Variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 til anvendelse som lægemiddel.
8. Fremgangsmåde til fremstilling af en variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at den omfatter trin med syntese, hemisyntese og/eller genetisk manipulation. 18 DK 173247 B1
9. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den omfatter fermentering af en i forvejen transformeret gærstamme enten med et plasmid, der omfatter 5 replikationsinitieringsstedet fra gærplasmidet 2μ, ura3-genet, et replikationsinitieringssted fra E. coli og en markør for antibiotikaresistens, 10. en transkriptionspromotor, "leder"-sekvensen og præ-pro- sekvensen fra precursoren for α-faktoren fusioneret i fase opstrøms for den sekvens, der koder for hirudinvarianten, og transkriptionsterminatoren fra PGK-gærgenet, som anbringes nedstrøms for genet for den pågældende variant, 15 eller med en funktionel DNA-blok, der koder for hirudinvarianten.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8616723 | 1986-12-01 | ||
| FR868616723A FR2607517B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK627687D0 DK627687D0 (da) | 1987-11-30 |
| DK627687A DK627687A (da) | 1988-06-02 |
| DK173247B1 true DK173247B1 (da) | 2000-05-22 |
Family
ID=9341393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198706276A DK173247B1 (da) | 1986-12-01 | 1987-11-30 | Varianter af hirudin HV2, disse varianter til anvendelse som lægemiddel, specielt som thrombinihibitorer, et præparat til a |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650301A (da) |
| EP (1) | EP0273800B1 (da) |
| JP (1) | JP2567263B2 (da) |
| KR (1) | KR960011918B1 (da) |
| AT (1) | ATE73462T1 (da) |
| AU (1) | AU617989B2 (da) |
| BG (1) | BG49719A3 (da) |
| CA (1) | CA1341416C (da) |
| CS (1) | CS276245B6 (da) |
| DE (1) | DE3777367D1 (da) |
| DK (1) | DK173247B1 (da) |
| ES (1) | ES2032465T3 (da) |
| FI (1) | FI99211C (da) |
| FR (1) | FR2607517B2 (da) |
| GR (1) | GR3004556T3 (da) |
| HU (1) | HU213871B (da) |
| IE (1) | IE60544B1 (da) |
| MC (1) | MC1884A1 (da) |
| NO (1) | NO177500C (da) |
| PL (1) | PL157254B1 (da) |
| PT (1) | PT86233B (da) |
| RO (1) | RO106890B1 (da) |
| SU (1) | SU1687032A3 (da) |
| ZA (1) | ZA879011B (da) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2628429B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1990-12-28 | Transgene Sa | Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir |
| GB8817161D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Modified proteins |
| GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
| US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| FR2656531B1 (fr) * | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
| US5118790A (en) * | 1990-07-24 | 1992-06-02 | Sri International | Analogs of hirudin |
| ATE140929T1 (de) * | 1990-11-08 | 1996-08-15 | Japan Energy Corp | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| US5407822A (en) * | 1991-10-02 | 1995-04-18 | Sanofi | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast |
| JP7375012B2 (ja) * | 2019-04-16 | 2023-11-07 | サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッド | ヒルジン突然変異体の抽出・精製方法およびその使用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
-
1986
- 1986-12-01 FR FR868616723A patent/FR2607517B2/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-11-25 NO NO874905A patent/NO177500C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-27 PT PT86233A patent/PT86233B/pt unknown
- 1987-11-27 AU AU81880/87A patent/AU617989B2/en not_active Expired
- 1987-11-27 IE IE323987A patent/IE60544B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 CA CA000553153A patent/CA1341416C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-30 DK DK198706276A patent/DK173247B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 EP EP87402696A patent/EP0273800B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 AT AT87402696T patent/ATE73462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 ES ES198787402696T patent/ES2032465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 SU SU874203831A patent/SU1687032A3/ru active
- 1987-11-30 RO RO130679A patent/RO106890B1/ro unknown
- 1987-11-30 DE DE8787402696T patent/DE3777367D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-01 PL PL1987269164A patent/PL157254B1/pl unknown
- 1987-12-01 HU HU875394A patent/HU213871B/hu unknown
- 1987-12-01 MC MC871932A patent/MC1884A1/xx unknown
- 1987-12-01 FI FI875295A patent/FI99211C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 CS CS878732A patent/CS276245B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 BG BG82035A patent/BG49719A3/xx unknown
- 1987-12-01 KR KR1019870013708A patent/KR960011918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 ZA ZA879011A patent/ZA879011B/xx unknown
- 1987-12-01 JP JP62305504A patent/JP2567263B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-12 GR GR920400903T patent/GR3004556T3/el unknown
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,511 patent/US5650301A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173247B1 (da) | Varianter af hirudin HV2, disse varianter til anvendelse som lægemiddel, specielt som thrombinihibitorer, et præparat til a | |
| DK174837B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af hirudin samt transformeret gær som kan anvendes ved fremgangsmåden | |
| US5256559A (en) | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation | |
| US5087613A (en) | Hirudin variants | |
| AU623882B2 (en) | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation | |
| US5516656A (en) | Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same | |
| WO1991012270A2 (en) | Novel platelet aggregation inhibitors from the leech | |
| US5616476A (en) | Synthetic isohirudins with improved stability | |
| EP0352228A2 (en) | Novel proteins | |
| Courtney et al. | Production and evaluation of recombinant hirudin | |
| AU685835B2 (en) | High molecular weight desulphatohirudin | |
| WO1994013807A1 (de) | Thrombininhibitor aus speichel von protostomiern | |
| EP0352227A2 (en) | Modified proteins | |
| KR0147294B1 (ko) | 혈액 응고 억제제에 대한 해독제로서의 인자 viii의 용도 | |
| JP2696316B2 (ja) | ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法 | |
| AU6070590A (en) | Hirudin peptide derivatives | |
| WO1993004082A1 (en) | Analogs of hirudin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |