RO106890B1 - VARIANTE DE HIRUDINã ©I PROCEDEU DE PREPARARE A ACESTORA - Google Patents
VARIANTE DE HIRUDINã ©I PROCEDEU DE PREPARARE A ACESTORA Download PDFInfo
- Publication number
- RO106890B1 RO106890B1 RO130679A RO13067987A RO106890B1 RO 106890 B1 RO106890 B1 RO 106890B1 RO 130679 A RO130679 A RO 130679A RO 13067987 A RO13067987 A RO 13067987A RO 106890 B1 RO106890 B1 RO 106890B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- hirudin
- variants
- variant
- gly
- asn
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 62
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 56
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 55
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 48
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 18
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 15
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N Asp-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GWIJZUVQVDJHDI-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 2
- UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N Cys-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O UXUSHQYYQCZWET-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 2
- GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N Glu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N 0.000 claims description 2
- OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N Asn-Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- QGNXYDHVERJIAY-ACZMJKKPSA-N Asn-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QGNXYDHVERJIAY-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- OXFOKRAFNYSREH-BJDJZHNGSA-N Cys-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N OXFOKRAFNYSREH-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims 1
- HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N Glu-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N 0.000 claims 1
- ZAPFAWQHBOHWLL-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZAPFAWQHBOHWLL-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims 1
- IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N Ile-Thr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N 0.000 claims 1
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N Pro-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N 0.000 claims 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims 1
- TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 1
- NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N Thr-Asp-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NLJKZUGAIIRWJN-LKXGYXEUSA-N 0.000 claims 1
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 claims 1
- YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N Val-Thr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N 0.000 claims 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 claims 1
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 claims 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 20
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 11
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 11
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 3
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- NOQPTNXSGNPJNS-YUMQZZPRSA-N His-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O NOQPTNXSGNPJNS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N Lys-Pro-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CNGOEHJCLVCJHN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- REJRKTOJTCPDPO-IRIUXVKKSA-N Thr-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O REJRKTOJTCPDPO-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003056 antler Anatomy 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 108010010968 hirudin HV2 Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- OGGAIRCLBMGXCZ-UHFFFAOYSA-M monosodium PIPES Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 OGGAIRCLBMGXCZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000013037 reversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000006107 tyrosine sulfation Effects 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
Prezenta descriere de invenție se referă la noi variante de hirudină și la procedeul de preparare a acestor compuși.
Se cunosc în literatura de specialitate, cel puțin trei variante naturale de hirudină (Markwardt 1970; Petersen et al. 1976; Markwardt an Walsmann 1976; Chang 1983; Dodt el al., 1984, 1985, 1986; Hervey et al. 1986; French Patent 84.04.755). Secvențele comparate ale acestor trei variante sunt prezentate în fig. 1.
Prima variantă HV1, corespunde hirudinei care se izolează din corpul de lipitoare (Hirudo medicinalii); a doua variantă HV2 (Harvey et al. 1986) diferă de prima variantă printr-un număr de nouă aminoacizi; cea de a treia variantă (Dodt et. al. 1986) este identică cu HV2, până la poziția 32 serină, dar ,diferă printr-un număr de zece aminoacizi în partea Clerminală, care cuprinde, printre altele, un aminoacid suplimentar (alanina 63). Această a treia variantă va fi desemnată în continuare HV3.
Aceste secvențe comportă un număr de 65 sau 66 aminoacizi și pot fi considerate ca două domenii: o parte Nterminală globulară, care conține trei punți disulfurice și o parte C terminală acidă, care prezintă o omologie în legătură cu porțiunea de clivaj în cazul trombinei, în molecula de protrombină. Această omologie permite să se ajungă la ideea că, regiunea care înconjoară poziția 47 ar putea fi porțiunea de fixare a hirudinei pe trombină.
Pe de altă parte, hirudină naturală conține o tirozină sulfatată, în poziția 63, așa cum este menționat în Chang, 1983. Această tirozină sulfatată se regăsește în poziția 64, în varianta HV3. Ea va fi denumită, în continuare, ca poziția 63, pentru toate variantele, funcția acesteia fiind aceeași, oricare ar fi poziția sa.
Analiza comparată a secvențelor vâri antelor naturale ale hirudinei permite crearea de noi variante, în care apar combinații diferite.
Variantele HV1 și HV3 prezintă o lizină în poziția 47 situată între cele două molecule de prolină și care este probabil responsabilă de blocajul porțiunii active a trombinei, așa cum sc menționează în Dodt et al. 1984 and 1985.
Deoarece varianta HV2 nu prezintă reziduu bazic, în această poziție, dar conține o moleculă de asparagină, se pare că dacă se substituie cu o moleculă de lizină sau o moleculă de arginină se obține un produs corespunzător în ceea ce privește inhibiția trombinei, așa cum este menționat în Chang 1985 și, mai mult decât atât, conține și o moleculă de histidină, care însă nu este corespunzătoare unui substrat bun al trombinei, dar care ar putea crește puterea de inhibiție a hirudinei.
Pc de altă parte, sulfatarea tirozinei 63 constituie o diferență între hirudină naturală și hirudină obținută prin recombinări genetice, care ar putea avea însă consecințe privind activitatea acestui compus (Stone and Hofsteenge 1986). De asemenea, există tendința de mimare a proteinei native, înlocuind tirozină printr-un reziduu acid, cum ar fi, de exemplu, acidul glutamic sau acidul aspartic.
Spre deosebire de aceste variante, prezenta descriere de invenție se referă la variante de hirudină, caracterizate prin aceea că, acestea comportă un aminoacid diferit care există sub forma naturală în poziția 47 sau 63.
Prezenta descriere de invenție se referă la o variantă preferată de hirudină'HV1, HV2 sau HV3.
- Printre aceste variante, se pot enumera următoarele:
- variantele în care aminoacidul tirozină 63 a fost înlocuită cu un reziduu acid, în special cu acid glutamic sau acid aspartic;
- variante în care aminoacidul, în poziția
47, în forma sa naturală, este înlocuit cu arginină sau cu histidinâ;
- variante în care asparagina 47, în forma sa naturală, de variantă HV2, este înlocuită cu lizină.
Se pol cita, în special, următoarele variante:
Lizina 47 (Lys 47) ca variantăHV2, arginina 47 (Arg 47) ca variantăHV2, histidinâ 47 (His 47) ca variantăHV2;
acidul glutamic 63 (Glu 63) ca variantă HV2 și acidul aspartic 63 (Asp 63) ca variantă HV2.
Variantele referitoare la prezenta descriere de invenție, în special lizina 47 (Lys 47) ca variantă HV2 (sau rHV2 - Lys 47), răspund la formula următoare: ILE
| THR | TYR | GLU | SER | GLY | GLN | ASN |
| LEU | CYS | LEU | CYS | GLU | GLY | SER |
| ASN | VAL | CYS | GLY | LYS | GLY | ASN |
| LYS | CYS | ILE | LEU | GLY | SER | ASN |
| GLY | ASN | GLN | CYS | VAL | THR | GLY |
| GLU | GLY | THR | PRO | LYS | PRO | GLU |
| SER | HIS | ASN | GLY | ASP | PHE | GLU |
| GLU | ILE | PRO | GLU | GLU | TYR | LEU |
GLN.
Diferitele variante care au conservat TYR 63 pot fi utilizate ca atare sau sub formă de sulfat. Această sultaiare poate fi obținută fie pe calc chimică sau mai bine, pe cale biologică.
Prezenta descriere de invenție se referă la procedeele biologice care permit să se prepare variantele menționate mai sus. In sfârșit, se pot obține aceste variante prin sinteză, semisinteză și/sau prin tehnicile cunoscute de manipulare genetică.
Astfel, de exemplu, se menționează clonajul și exprimarea diferitelor secvențe codificate pentru HV1, HV2 sau HV3, în special HV2 și obținerea hirudinelor corespunzătoare, plecându-se de la culturile de levuri, așa cum este descris în Patent Application EP-A-200,655.
Variantele, conform prezentei invenții, pot fi obținute prin tehnici echivalente.
după ce au fost modificate secvențele codificate menționate mai înainte, de exemplu prin mutageneză dirijată.
în special, prin mutageneză dirijată - in vitro - se obțin variante în care asparagina 47 este înlocuită cu lizină, cu arginină sau cu histidinâ și în care tirozina 63 este înlocuită cu acidul glutamic.
în special, este posibil să se utilizeze blocuri de exprimare funcțională, așa cum s-a descris în Patent Application EP-A-200, 655 și în care secvența de hirudinâ este codificată pentru variantele precedente; aceste blocuri funcționale de ADN pot fi purtate de un vector plasmidic.
Pentru a dirija exprimarea și secreția de către levuri a genelor corespunzătoare diferitelor variante, aceste blocuri sunt integrate într-un vector care conține, de preferință, elementele următoare, Patent Application EP-A-200, 655:
- originea replicației plasmidei levurei 2μ;
- gena ura 3;
- o origine a replicației în Escherichia coli și un marcator a rezistenței la un antibiotic;
- un promotor de transcripție, secvența lider și secvența pre-pro a precursorului factorului alfa, fuzionat în amonte de secvența codificată a hirudinei;
- terminatorul de transcripție a genei PGK a levurei care va fi plasată în aval de gena hirudinei.
Prezenta descriere de invenție se mai referă la levurile transformate prin acești vectori sau prin acest bloc funcțional de ADN și la aplicarea acestora la prepararea variantelor de hirudină.
Invenția de față se referă, în special, la un procedeu de preparare a unei variante a hirudinei, prin fermentarea unei levuri și recuperarea hirudinei produse în mediul de cultură sub formă matură sau sub formă de precursor maturabil - in vitro.
Tehnicile puse în valoare sunt deja des crise, în detaliu, în Patent Applications EP-A200,655 and EP-87 401649.6.
Variantele de hirudină. astfel obținute, pot fi utilizate la fel ca cele descrise în Patent Application EP-A-200,655, atât ca inhibitori de trombină, cât și - in vivo sau in vitro
In special, aceste variante pot fi utilizate în compoziții farmaceutice singure sau sub formă de combinații cu alte principii active sau în cadrul testelor sau diagnosticelor efectuate - in vitro - sau in vivo. In acest ultim caz, poate fi interesant să se marcheze aceste variante, ca de exemplu prin marcare radioactivă, fluorescentă, enzimatică, sau alte forme.
Prezenta descriere de invenție este ilustrată prin următoarele exemple în legătură și cu fig. 1 și 2, care reprezintă:
- fig. 1, secvențele celor trei variante naturale ale hirudinei. numite HVL, HV2 și HV3;
- fig. 2, procentajul de inhibiție a activității proteolitice a trombinei pe cromozimă, în funcție de volumele de supernatanți ale culturilor de drojdie producătoare de hirudină rHV2 sau variantele ei.
Exemplul 1. Construirea diferitelor variante de HV2 prin mutageneză - in vitro
Pentru a efectua o mutageneză dirijată - in vitro -, fragmentul de ADN care trebuie modificat este donat în forma replicativă a unui simplu filament; filamentul genetic recombinat este izolat și adus la hibridizare cu o oligonucleotidă sintetică, care poartă secvența transferată. Această oligonucleotidă servește la amorsarea sintezei filamentului complementar și a ADN transformat astfel în filament dublu și utilizat pentru transformarea unei bacterii receptive, care urmează să producă fagul purtător al mutației dorite (Zoller and Smith, 1983).
Plasmida pTG720, descrisă în Patent EP-A-158,564 este un vector de exprima re a hidrudinei în Escherichia coli. Plasmida pTG 730 a fost derivată din pTG720 prin adiția unei părți din EcoRI, la secvența codificată a hirudinei. Acesctă parte de EcoRI permite recuperarea secvenței codificate a hirudinei prin digestia de către EcoRI pe de o parte și de către Clăi pe de altă parte.
Fragmentul Clal-EcoRI acoperă totalitatea regiunii codificate a hirudinei, mai puțin câțiva codoni 5’-terminali. Acest fragment Clal-EcoRI a fost clonat între părțile Acel și EcoRI a unui derivat din fagul M13, numit M13TG131, așa cum este menționat în Kieny et al., 1983. Fagul derivat din M13TG131 și care cuprinde această secvență a hirudinei este numit M13TG1919.
Au fost sintetizate trei oligonucleotide de care sunt capabile fiecare de a se apropia dc sevența 5’-GTACACCGAACCCTGAA AG-3’ a M13TG1919 în afară de regiunea centrală care corespunde la mutația dorită. Secvențele acestor oligonucleotide sunt următoarele:
- TG435 5'-CTTTCAGGGTGTAC-3’;
- TG436 5’-CTTTCAGGTTTCGGTGT AC-3’;
- TG437 5’-CTTTCAGCGCGGTGTAC-3’; aceste oligonucleotide au fost sintetizate pentru a permite substituția codonului AAC (Asn) a M13TG1919 prin CAC (His) sau AAA (Lys) sau respectiv CGC (Arg).
Se fosforilează 120 picomoli din fiecare oligonucleotidă, într-o sută de microlitri din mediul de reacție și aproximativ 20 de picomoli de oligonucleotide fosforilate care se hibridizează, în prealabil, cu 1 picomol dc ADN monocatenar ai fagului M13TG1919 în 25 dc microlitri soluție tampon de hibridizare.
După hibridizare, amestecul de acizi dezoxiribonucleici este supus la acțiunea polimerazei Klenow și a ligazei fagului T4. Fiecare amestec astfel tratat servește la transfectarea sușei de Escherichia coli
71/18 (mutare L) pe mediu de bacterii indicative JM1O3 (Messing et al., 1981). Celulele infectate sunt identificate, deoarece ele formează porțiuni de creștere mai lente; coloniile au fost însămânțate pe mediul complet și apoi au fost transferate pe hârtie Whatman 540, în vederea unei selecții a celulelor care prezintă fagii producători de mutații.
Această selecție a fost realizată prin hibridizare in situ, cu oligonucleotide care au servit mai înainte ca primer. Astfel, au fost obținute trei noi fagi care prezintă secvențele de mutații dorite: M13TG1921 (Asn 47 —. Arg), M13TG1924 (Asn 47 —.
- His) și M13TG1925 (Asn 47 Lys).
Pe de altă parte, aceiași tip de experiență a fost condus cu o oligonucleotidă TG434 cu secvența 5’-ATTGTAACTCT TCTTCTG-3’. Această oligonucleotidă se hibridizează cu secvența 5-CAGAAGAA TATTTACAAT localizată în regiunea 3’ a secvenței codificate pentru HV-2, cu un triplet care nu se potrivește sustituției codonului TAT (Tyr63) cu GAG (Glu). Sa obținut astfel fragmentul mutant corespunzător la M13TG1922 (Tyr63 — Glu).
Exemplul 2. Substituția fragmentului PsfI-HindIII (0,6 kb) al pTG1828 prin fragmentul mutant.
Plasmida pTG1828 (descrisă în Patent Aplication EP-87 401649.6) poartă secvența codificată a hirudinei, precedată de secvențele pre - pro a genei feromonului sexual alfa al levurei; ansamblul este plasat sub controlul promotorului PGK. După această fuziune între secvențele pre
- pro ale MF a și hirudinei, proteina se exprimă apoi prin calea normală de secreție și de maturizare, a levurei, astfel că hirudina activă în acest proces, se regăsește în mediul de cultură. Această plasmidă a fost reluată pentru a exprima secvențele de hirudină mutante, în locul hirudinei native.
Digestia prin PStl și Hindlll a pTG1828 s
eliberează cele cinci fragmente de talie aproximativă de 3,8, 1,9, 1,5, 1,1 și 0,6 kb respectiv. Ultimul fragment nu conține decât o singură porțiune de Acel și o singură parte de EcoRI. Regiunea delimitată pentru aceste două părți cuprinde integralitatea secvenței hirudinei mai puțin câțiva codoni 5’-lerminali. Fragmentul Hindlll-Pstl de 0,6 kb a fost înserai între porțiunile de Hindlll și Psll a unui vector care nu prezintă nici una din părțile de EcoRI sau Acel.
Plasmida astfel reconstituită (pTG1960), posedă, deci, o parte dc Acel unică și o parte EcoRI unică localizată, respectiv la capătul secvenței hirudinei și în aval de aceasta. Digestia pTG1960 de către Acel și EcoRI pune în libertate un fragment care cuprinde cvasitotalitatea secvenței hirudinei și restului plasmidei.
Fragmentul mare al ADN care conține secvențe de hirudină dăunătoare, este purificat pe gel și amestecat cu produsul de digestie AccI-EcoRI în formă replicați vă la fiecare din fagii mutanți descriși în exemplul 1, în vederea reconstituirii fuziunii prepro hirudinei cu noile variante HV-2 obținute prin mutageneză dirijată. Patru noi plasmide au fost selecționate: pTG1963 (Asn47 - Arg), pTG1964 (Tyr63 - Glu), pTG1965 (Asn47 His) și pTG1966 (Asn47—► Lys) care nu diferă de pTG1960, decât prin codonii mutanți. Aceste secvențe purtătoare ale codonilor mutanți pot fi recuperați sub formă de fragmente PstlHindlII pentru a fi reclonate în vectorul pTG1828 în locul fragmentului Pstl-Hindili original.
S-a obținut astfel un număr de patru plasmide noi: pTG1977 (Asn47 Arg), pTG 1978 (Tyr63 -♦ Glu), pTG1979 (Asn47 -» His) și pTG1980 (Asn47 -> Lys) care nu sunt diferite de pTG1828 descrise mai sus, decât prin mutanții creați - in vitro.
Exemplul 3. Transformarea TGYlsp4 prin acizii dezoxiribonucleici ai pTG1977, pTG1978, pTG1979 și pTG1980
Celulele de Sacharomices cerevisiae TGYlsp4 (Mat alfa ura 3 - 251.373.382 his 3.11.15) au fost transformate de către acizii dezoxiribonucleici ai pTG1977, 5 pTG1978, pTG1979 și pTG1980. Transformanții ura+ au fost obținuți în fiecare caz.
Există, deci, patru tipuri de sușe: TGYsp4 pTG1977, TGYsp4 pTG1978, 10
TGYlsp4 PTG1979 și TGYlsp4 pTG1980. S-a făcut comparație între producțiile de hirudină cu cele patru tipuri de sușe și cu TGYlsp4 pTG1828. S-au însămânțat 20 de mililitri de mediu de cultură 15 (YNBG + cas aminoacizi 0,5%) la DO 660 0,02 cu fiecare sușă. După un timp de patruzeci și opt de ore de agitație, la temperatura de treizeci de grade C, culturile sunt centrifugate la viteze de cinci mii 20 de rotații pe minut, timp de cinci minute, iar supematanții se dozează. O cultură de TGYlsp4 pTG881 (plasmida care nu poartă secvența codantă pentru HV-2) este utilizată la control. 25
Activitatea supematanților în stare brută este măsurată prin efectul inhibitor asupra activității trombinei (activitate proteolitică asupra unui substrat sintetic, cromozomul TH-Boehringer Mannheim). 30 Procentajul de inhibiție în funcție de volumele de supematant este dat în fig. 2.
Se contată că, efectul inhibitor produs de către variantele Arg4' și Lys47 este mai mic decât cel produs de HV2 nativ. Vâri- 35 antele Glu63 și His47 sunt mai puțin inhibitori decât HV2.
Exemplul 4. Inhibarea activității trotnbinei
Pentru a demonstra mai clar valoarea variantelor de hirudină, care formează subiectul invenției, în special în scopul aplicării lor farmaceutice, exemplele comparative care ilustrează proprietățile inhibitorii față de trombină a variantei HV2 și a altor două variante ale formei HV2, în care amino-acidul din poziția 47 este înlocuit cu o Arg say Lys, oricare fiind obținută prin intermediul ADN-ului recombinant.
Pentru a studia cinetica inhibării trombinei cu aceste variante, este utilizată teoria inhibitorilor de înaltă afinitate, așa cum este descrisă de J.W.Williams și J.F.Morrism, Methods in Engymology, 63, pag. 437-467, 1979, întrucât hirudină este un inhibitor reversibil al trombinei.
Variantele utilizate de hirudină sunt purificate până la 95% și trombină umană pură Sigma are un procent al activității, măsurat prin titrarea situsului activ, care este peste 92%. Concentrația trombinei umane este aceeași pentru toate măsurătorile, adică 5,5 x IO’9 M. Mediul este un tampon PIPES de sodiu 0,05 M, pH = 7,9 cu KCI 0,18 și 0,1% PEG la 37°C. Substratul pentru trombină este chromozyme PL Boehringer. Este respectat un timp de incubare de 2 min, pentru trombină și hirudină, și reacția este inițiată apoi cu substratul.
Tabelul care urmează sumarizează valorile determinate experimental, pentru cantitatea de hirudină necesară pentru o inhibare dc 95% a aceleiași cantități de trombină umană (5,5 x IO'9 M).
Cantitatea pentru atingerea unei inhibiții de 95% a trombinei (10'9M)
| HV2 Lys47 | 7,6 |
| HV2 Arg47 | 8,5 |
| HV2 | 32,2 |
Prin urmare, se vede că este necesară aproximativ de 4 ori mai puțină hirudină
HV2 Arg 47 și HV2 Lys47 decât hirudină HV2, pentru inhibarea aceleiași cantități de trombină umană.
Deci variantele propuse au proprietăți inhibitorii în mod marcant îmbunătățite față de trombină.
Exemplul 5. Studiu farmacologic preliminar a celor două variante recombinate de hirudină rHV2 și rHV2-Lys'7în comparație cu heparina standard
1. Scopul studiului: Evaluarea celor două variante de hirudină recombinată rHV2 (sau HV2) și rHV2-Lys47 (sau Lys47) HV2 și compararea eficacității antitrombotică a acestora cu heparina standard. Aceste două variante sunt lipsite de sulfatarea post-transcripțională a grupului Tyr 63.
2. Condițiile experimentale:
a) Activitatea antitrornbinică specifică (trombine umane și bovine) a celor două hirudine recombinate în serul fiziologic este determinată pe baza inhibiției activității proteolitice a trombinei pe cromozimă.
b) Activitatea antihoagulantă a celor două hirudine este comparată - in vitro în plasma de șobolan și de iepure, prin prelungirea timpului de protrombinâ și efectul anti-IIa este măsurat prin metoda cromogenică.
c) Cinetica de dispariție plasmatică a hirudinei după injectare, pe cale intravenoasă a bolusului, este urmărită prin măsurarea efectului anti-IIa cu ajutorul timpului de protrombină și prin metoda cromogenică cu ajutorul curbelor de calibrare.
d) Concentrațiile plasmatice obținute după treizeci de minute de perfuzie continuă, intravcnoasă, la iepure, sunt determinate prin aceleași tehnici.
e) Activitatea antitrombotică a celor două variante de hirudină și heparina standard este studiată în modelul Wessler la iepure și șobolan, cu tromboplastină ca agent trombogen și în modelul de stază la iepure (Fareed). Drogurile sunt administrate prin perfuzie continuă la iepuri și bolus intravenos la șobolan.
Metodele utilizate sunt următoarele:
Modelul Wessler la iepure. Se utilizează iepuri masculi de Noua Zeelandă, care cântăresc de la 2,5 până la trei kilograme. După anesteziere, prin injectare intravcnoasă, de pentobarbital sodic (treizeci de miligrame per kilogram), carotida stângă este canulată și cele două vene jugulare sunt izolate; două ligaturi slabe sunt puse fiecare din ele la o distanță de 2,5 cm una de alta. Iepurii primesc apoi, fie ser fiziologic, fie soluții de hirudină sau de heparina, sub formă de perfuzie continuă, timp de treizeci de minute, sub un debit de 2,5 mililitri per oră. Cu două minute înainte de terminarea perfuziei, se realizează prelevările arteriale, înainte de a se determina nivelele plasmatice ale anticoagulanților. Cu un minut înainte dc terminarea perfuziei tromboplastina umană (fabricată de firma Manchester Comparative Reagents Ltd), standardizată conform procedeului lui M. Buchanan, a fost injectată într-o doză de șase sute micrograme per kilogram timp exact de treizeci de secunde, în aortă, prin carotidă. Trei zeci de secunde mai târziu, perfuzia a fost oprită, realizându-se o stază sanguină, strângându-se ligatura cu două segmente venoase, timp de cincisprezece minute. Venele jugulare sunt apoi deschise și trombii sunt extrași, spălați cu ser fiziologic și cântăriți, după tamponare cu hârtie dc filtru.
Modelul Wessler la șobolani. Se utilizează șobolani de tip Sprague-Dawley (CDCOBS) masculi, care cântăresc aproximativ trei sute de grame. După anesteziere cu pentobarbital sodic, pe cale intra peritoneală (treizeci miligrame per kilogram) și laparotomic mediană, vena cavă inferioară a fost degajată, pe o porțiune de un centimetru, plecându-se de la caret’urul renal.
Două ligaturi suple au fost puse în acest loc la o distanță de 0,7 cm. Produșii de testat, diluați în ser fiziologic, au fost injectați prin bolus intravenos ia un milimetru per kilogram, timp de cinci minute, patruzeci secunde sau un minut (heparină), înainte de realizarea stazei venoase. Cu patruzeci secunde înainte dc această stază, un agent trombogen (tromboplastină de iepure E. Dade) a fost injectat în două de douăzeci și cinci miligrame per mililitru per kilogram în vena penisului, timp exact de treizeci de secunde. După zece secunde de la injectare, se stabilește o stază prin strângerea ligaturilor, mai întâi cea proximalâ, apoi cea distală. Staza a fost menținută timp de zece minute, apoi trombusul a fost prelevat, imersat în soluție de citrat la 0,38 procente, uscat pe hârtie de filtru care se cântărește a doua zi, după uscare, timp de o oră, la cincizeci grade C.
Modelul de tromboză prin stază sanguină la iepuri. Se utilizează în acest test, iepuri masculi de tip Noua Zeelandă, care cântăresc 2,5 până la trei kilograme. După anestezie pe cale intravenoasă cu pentobarbilal sodic (treizeci miligrame per kilogram), carotida stângă este canulată și au fost izolate două vene jugulare; se fac două ligaturi slabe pe fiecare din ele, la 5 distanțe de 2,5 cm una de alta. Iepurii primesc, fie ser fiziologic, fie soluție de hirudină sau heparină în perfuzie continuă timp de treizeci de minute, sub un debit de
2,5 mililitri la oră. Două minute înainte de 10 terminarea perfuziei, prelevările arteriale au fost realizate înainte de determinarea nivelelor plasmatice anticoagulante. în același timp, în care a fost oprită perfuzia, se stabilește o stază prin strângerea ligaturilor, 15 mai întâi cele proximale, apoi cele distale (cele patru ligaturi). Staza respectivă este menținută, timp de două ore, apoi jugularele au fost deschise și trombii extrași, spălați cu ser fiziologic și cântăriți, după 20 tamponare cu hârtie de filtru.
3) Rezultate
a) Pentru prepararea soluției mume în concentrație de un miligram per mililitru, activitatea antitrombinică specifică a celor 25 doi varianți de hirudină vis-ă-vis de trombinele umane și bovine este experimentată în tabelul 1.
Tabelul 1
| rHV2 | rHV2-lizină 47 | |
| Pentru trombină umană | 14800 | 19000 |
| Pentru trombină bovină | 15500 | 19200 |
| (rezultatele așteptate pentru | ||
| trombină umană) | (13300) | (16000) |
Activitatea antitrombinică specifică a hirudinei varianta rHV este +/- 15000 ATU per miligram și de +/- 19000 ATU 30 per miligram pentru varianta rHV2-lizină 47. Aceste activități specifice sunt superioare celei așteprate. Activitatea specifică este identică pentru trombinele umane și bovine. 35
b) Activitatea anticoagulantă în plasma de șobolani și de iepuri, determinată prin timpul de protrombină, este echivalentă pentru concentrații mici ale celor două hirudine. Varianta rHV2-lizină 47 este net superioară pentru concentrații mai ridicate. Cantitatea de trombină reziduală în plasma de șobolan și de iepure, determină prin substrat cromogen, este comparabilă, după adăugarea celor două hirudine, până la șaizeci ATU per mililitru. Pentru a neutraliza mai întâi urmele de trombină rezidua106890 (5 lă, varianta rHV2-lizinâ 47 este eficace. Aceasta reflectă diferența dc Ki.
c) Cinetica dispariției plasmatice a celor două hirudine, după injectarea bolusului pe cale intravenoasă, este com- 5 parabilă pentru determinarea prin metoda cromogenică, dar ușor diferită de determinarea timpului de trombină, conform tabelului 2. Hirudinele dispar potrivit celor două valori exponențiale. O primă 10 fază (de distribuție), cu un timp de înjumătâțire (t 1/2 alfa) de aproximativ trei minute, care reduce șaizeci de procente din prima cantitate inițială, in cinci minute pentru cele două hirudine; o a doua fază (de eliminare), cu un timp de înjumătățire (t 1/2 beta) de șaisprezece minute, pentru rHV2-lizină 47 și de douăzeci și opt de minute, respectiv pentru rHV2, dacă se consideră timpul de trombină și de două zeci și opt de minute respectiv și treizeci de minute, respectiv dacă se utilizează metoda cromogenică. Heparina standard dispare, conform unei singure valori exponențiale, timp de înjumătățire de nouă minute (t 1/2 = =9 minute).
Tabelul 2
| Metoda | t 1/2 alfa | t 1/2 beta | ||
| TT | SC | TT | SC | |
| rHV2 | 2,5 | 3,0 | 28 | 28 |
| rHV2-lizină 47 | 1,8 | 3,0 | 16 | 30 |
în care TT reprezintă timp de trombină ți SC? substrat cromogen
d) Concentrațiile plasmatice ale celor două variante de hirudinâ, obținute după 15 treizeci de minute de perfuzie continuă intravenoasă la iepuri, sunt în relație lineară cu dozele perfuzate.
e) Efecte antitrombotice
Tabelul 3
| Produsele | Iepuri i.v. perfuzie micrograme/kilogram/oră | Șobolan bolus i.v. micrograme/kilogram | ||
| Wessler | Stază | Wessler -5 minute 40 s | -1 min | |
| rHV2 | 375 | - | 240 | |
| rHV2-lizină 47 | 20 | 47 | 160 | - |
| heparină standard | 110 | 110 | 160 | 110 |
Pe baza acestor rezultate farmacologice preliminare, se pare că în perfuzie continuă la iepuri, varianta de hirudinâ recombinată rHV2-lizinâ 47 are o activitate 20 antitrombotică superioară celei pe care o are varianta rHv2 și heparina. Farmacocinetica celor două variante de hirudină este identică.
Exemplul 6. Compararea raportului 25 activității antitrombotice/risc hemoragie al hirudinei rHV2-lizină 47 și heparină standard
Studiile realizate arată că riscul hemoragie la iepuri sau prelungirea timpului de sângerare la șobolani tratați cu rHV2-lizinâ 47, sunt inferioare celor tratați cu heparină standard, referitor, pentru fiecare specie, la doze echiactive în modelul trombozei.
Depunerea de suge reprezentative conform prezentei invenții. Următoarele sușe au fost depozitate la Colecția Națională a Culturilor de Microorganisme de la Institutul Pasteur, Paris, str. Dr. Roux (15) 6 XI 1986:
TGYlsp4 pTG1977 (HV2-Argininâ 47) sub numărul 1-621 și TGYlsp4 pTG1980 (HV2-lizinâ 47) sub numărul 1-622
Sușa de referință a fost depusă la 6 iunie 1986:
TGYlsp4 pTG1828 sub numărul 1-569.
Revendicări
Claims (10)
1. Variante de hirudină, caracterizate prin aceea câ fața de formele naturale conțin un aminoacid diferit în poziția 47 sau 63.
2. Variante de hirudină, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că formele naturale de la care acestea sunt derivate, sunt alese dintre HV1, HV2 și HV3.
3. Variantă de hirudină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aminoacidul tirozină în poziția 63 din forma naturală este înlocuit printr-un rest de acid glutamic sau aspartic.
4. Variantă de hirudină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, inoacidul asparagină în poziția 47 din forma naturală este substituit cu argimină, histidina sau lizină.
5. Variantă de hirudină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este aleasă dintre:
(Lys47)HV2 (Arg47)HV2 (His47)HV2 (GIu63)HV2 (Asp63)HV2
6. Variantă de hirudină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că răspunde la secvența: ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN
7. Variantă de hirudină, conform revendicării l, caracterizată prin aceea că este sau nu sulfatată.
8. Procedeu de preparare a unor variante de hirudină, caracterizat prin aceea că o tulpină de drojdie transformată printr-un vector sau un bloc de expresie funcțională a unei secvențe de ADN, care codifică o variantă de hirudină, se cultivă pe un mediu adecvat, de care se recuperează ca produse de excreție, variantele de hirudină sub formă matură sau sub formă de precursor maturabil in vitro.
9. Procedeu, conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că tulpina de drojdie folosită este Saccharomyces ce re vis te.
10. Procedeu, conform revendicării 8, caracterizat prin aceea că vectorul sau blocul de expresie funcțional al unei secvențe de ADN care codifică o variantă de hirudină conține:
- originea de replicare a plasmidei drojdiei 2 μ;
- gena ura 3;
- o origine de replicare Γη E. coli și un marcator de rezistență la un antibiotic;
- un promotor de transcripție, secvența leader și secvența pre-pro a precursorului factorului alfa, fuzionată în amonte de secvența care codifică carianta hirudinei;
- terminatorul transcripției genei PGK a drojdiei, care va fi plasat în aval de gena variantei de hirudină.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR868616723A FR2607517B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO106890B1 true RO106890B1 (ro) | 1993-07-30 |
Family
ID=9341393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO130679A RO106890B1 (ro) | 1986-12-01 | 1987-11-30 | VARIANTE DE HIRUDINã ©I PROCEDEU DE PREPARARE A ACESTORA |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5650301A (ro) |
| EP (1) | EP0273800B1 (ro) |
| JP (1) | JP2567263B2 (ro) |
| KR (1) | KR960011918B1 (ro) |
| AT (1) | ATE73462T1 (ro) |
| AU (1) | AU617989B2 (ro) |
| BG (1) | BG49719A3 (ro) |
| CA (1) | CA1341416C (ro) |
| CS (1) | CS276245B6 (ro) |
| DE (1) | DE3777367D1 (ro) |
| DK (1) | DK173247B1 (ro) |
| ES (1) | ES2032465T3 (ro) |
| FI (1) | FI99211C (ro) |
| FR (1) | FR2607517B2 (ro) |
| GR (1) | GR3004556T3 (ro) |
| HU (1) | HU213871B (ro) |
| IE (1) | IE60544B1 (ro) |
| MC (1) | MC1884A1 (ro) |
| NO (1) | NO177500C (ro) |
| PL (1) | PL157254B1 (ro) |
| PT (1) | PT86233B (ro) |
| RO (1) | RO106890B1 (ro) |
| SU (1) | SU1687032A3 (ro) |
| ZA (1) | ZA879011B (ro) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2628429B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1990-12-28 | Transgene Sa | Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir |
| GB8817161D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Modified proteins |
| GB8817160D0 (en) * | 1988-07-19 | 1988-08-24 | Ciba Geigy Ag | Novel proteins |
| US5284768A (en) * | 1988-08-24 | 1994-02-08 | Sanofi | Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| FR2656531B1 (fr) * | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
| US5118790A (en) * | 1990-07-24 | 1992-06-02 | Sri International | Analogs of hirudin |
| ATE140929T1 (de) * | 1990-11-08 | 1996-08-15 | Japan Energy Corp | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| US5407822A (en) * | 1991-10-02 | 1995-04-18 | Sanofi | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast |
| JP7375012B2 (ja) * | 2019-04-16 | 2023-11-07 | サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッド | ヒルジン突然変異体の抽出・精製方法およびその使用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
-
1986
- 1986-12-01 FR FR868616723A patent/FR2607517B2/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-11-25 NO NO874905A patent/NO177500C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-27 PT PT86233A patent/PT86233B/pt unknown
- 1987-11-27 AU AU81880/87A patent/AU617989B2/en not_active Expired
- 1987-11-27 IE IE323987A patent/IE60544B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 CA CA000553153A patent/CA1341416C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-30 DK DK198706276A patent/DK173247B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 EP EP87402696A patent/EP0273800B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 AT AT87402696T patent/ATE73462T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-30 ES ES198787402696T patent/ES2032465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-30 SU SU874203831A patent/SU1687032A3/ru active
- 1987-11-30 RO RO130679A patent/RO106890B1/ro unknown
- 1987-11-30 DE DE8787402696T patent/DE3777367D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-01 PL PL1987269164A patent/PL157254B1/pl unknown
- 1987-12-01 HU HU875394A patent/HU213871B/hu unknown
- 1987-12-01 MC MC871932A patent/MC1884A1/xx unknown
- 1987-12-01 FI FI875295A patent/FI99211C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 CS CS878732A patent/CS276245B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 BG BG82035A patent/BG49719A3/xx unknown
- 1987-12-01 KR KR1019870013708A patent/KR960011918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-12-01 ZA ZA879011A patent/ZA879011B/xx unknown
- 1987-12-01 JP JP62305504A patent/JP2567263B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-12 GR GR920400903T patent/GR3004556T3/el unknown
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,511 patent/US5650301A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5312736A (en) | Anticoagulant analogues of the tissue factor extrinsic pathway inhibitor (EPI) with reduced affinity for heparin | |
| JP3156082B2 (ja) | マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤ペプチド | |
| FI102183B (fi) | Menetelmä uusien trombiini-inhibiittoreiden valmistamiseksi | |
| KR920007666B1 (ko) | 변형된 섬유소 용해제의 제조방법 | |
| RO106890B1 (ro) | VARIANTE DE HIRUDINã ©I PROCEDEU DE PREPARARE A ACESTORA | |
| EP0511393B1 (en) | Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism | |
| US5239058A (en) | Proteins having anticoagulant properties | |
| EP0419099B1 (en) | Proteins having anticoagulant properties | |
| CA2002924C (en) | Anti-thrombins | |
| WO1989000192A1 (en) | Production of kallikrein | |
| FI104724B (fi) | Menetelmä aprotiniinivarianttien valmistamiseksi | |
| US5432264A (en) | Recombinant 3-des-OH-cystatin C produced by expression in a procaryotic host cell | |
| IE913601A1 (en) | Megakaryocyte maturation factors | |
| US5876971A (en) | Thrombin inhibitor from the saliva of protostomia | |
| EP0189784A1 (en) | Human natural inhibitor of collagenases | |
| CA1339875C (en) | Modified human psti | |
| CA2004764C (en) | Ancrod proteins, their preparation and use | |
| JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
| JPH0235084A (ja) | トロンビン阻害物質の製造法 | |
| GB2257974A (en) | Hirudin analogues and process for their preparation | |
| JPH08333400A (ja) | 抗血栓活性を有する融合蛋白質及びその製法 | |
| WO1994012204A1 (en) | Anticoagulant proteins | |
| HUT52559A (en) | Process for production of proteins with trombolitic effect | |
| GB2242681A (en) | Hirudin fragments |