HU213871B - Process for producing variants of hirudine - Google Patents

Process for producing variants of hirudine Download PDF

Info

Publication number
HU213871B
HU213871B HU875394A HU539487A HU213871B HU 213871 B HU213871 B HU 213871B HU 875394 A HU875394 A HU 875394A HU 539487 A HU539487 A HU 539487A HU 213871 B HU213871 B HU 213871B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hirudin
glu
asn
gly
lys
Prior art date
Application number
HU875394A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT45564A (en
Inventor
Michael Courtney
Eric Degryse
Yves Lemoine
Gerard Loison
Original Assignee
Transgene Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene Sa filed Critical Transgene Sa
Publication of HUT45564A publication Critical patent/HUT45564A/hu
Publication of HU213871B publication Critical patent/HU213871B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

(57) KIVONAT A találmány tárgya eljárás őlyan trőmbingátlóaktivitással rendelkező hirűdinvariánsők előállítására, amelyek atermészetes főrmában a 47. vagy 63. helyeknél levő aminősavaktól eltrő aminősavakat tartalmaznak. Ilyen variáns előnyösen a HV1, HV2 vagyHV3 hirűdin valamely váltőzata. A váltőzatők közül elsősőrban azők aváltőzatők jelentősek, – amelyben a Tyr63 aminősav valamely savasjellegű gyökkel, elsősőrban Glű-val vagy Asp-pal van helyettesítve; –amelyben a természetes hirűdin 47. helyzetében levő aminősav Arg-galvagy His-sel van helyettesítve; és – amelyben a HV2 természetesfőrmájának Asn47-e Lys-sel van helyettesítve. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás olyan hirudinvariánsok előállítására, amelyek a természetes formában található aminosavaktól eltérő aminosavakat tartalmaznak a 47. vagy 63. helynél.
A hirudinnak legalább három természetes változatát írták le az irodalomban [Markwardt F.: Methods Enzymol. 19, 924-932 (1970); Petersen T. E., Roberts H. R., SottrupJensen L. és Magnusson S.: Protides, Bioi. Fluids, Proc. Colloq. 23, 145-149 (1976); Markwardt és Walsmann 1976; Chang J. Y.: FEBS Letters 164, 307-313 (1983); Dodt J., Mueller Η. P., Seemüller U. és Chang J. Y.: FEBS Letters 165, 180-184 (1984); Dodt J., Seemüller U., Maschler R. és Fritz M.: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985); Dodt J., Machleidt W., Seemüller U., Maschler R. és Fritz H.: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986); Harvey R. P., Degryse E., Stefani L., Schamber F., Cazenave J. P., Courtney M., Tolstoshev P. és Lecocq J. P.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1084-1088 (1986); 84/04,755 bejelentési számú francia szabadalmi bejelentés].
A 3 változat szekvenciájának összehasonlítását az
1. ábrán mutatjuk be.
Az első változat, a HV1, annak a hirudinnak felel meg, amelyet piócák testéből izolálhatunk; a második, a HV2 (Harvey és munkatársai, 1986., fentebb idézett munka) az elsőtől 9 aminosavban különbözik; a harmadik (Dodt és munkatársai 1986, fentebb idézett munka) azonos a HV2-vel a 32. szerint illetően, de 10 aminosavban különbözik a C-terminális részen, amely ezen kívül még egy többlet-aminosavat is tartalmaz (Ala63). Ezt a harmadik változatot ezután HV3-nak nevezzük.
Ezek a szekvenciák 65 vagy 66 aminosavat tartalmaznak és 2 tartománynak tekinthetők: egy globulárisN-terminális résznek, amely 3 diszulfíd-hidat tartalmaz, és egy savas C-terminális résznek, amely homológiával rendelkezik a trombin hasítási helyével a protrombinmolekulában. Ez a homológia azt sugallja, hogy az a terület, amely a 47. helyet körülveszi, lehet a hirudin kötőhelye a trombinhoz.
Ezenkívül a természetes hirudin tartalmaz egy szulfáttal ellátott tirozint a 63. helyen (Chang 1983, fentebb idézett munka). Ez a szulfáttal ellátott tirozin a HV3 változatban a 64. helyen bukkan fel. Ezt a helyet ezután „63. hely”-nek nevezzük az összes változatnál, mivel működésűk azonos tekintet nélkül tényleges helyükre.
A hirudin természetes variánsai szekvenciáinak összehasonlító elemzése lehetővé teszi elvileg, hogy új változatok létrehozását tűzzük ki célul, amelyekben a természetes molekulák jellemzői különböző módokon kombinálódnak.
A HV1 és HV3 lizint tartalmaz a 47. helyzetben két prolin közt, amely valószínűleg felelős a trombin aktív helyének gátlásáért (Dodt és munkatársai, 1984 és 1985, fentebb idézett munkák).
Mivel a HV2 nem ezt a gyököt tartalmazza a nevezett helyen, hanem aszparagint, kívánatosnak tűnik lizint vagy argimint helyettesíteni ennél a pontnál abból a célból, hogy a molekula tulajdonságai jobban hasonlítanak trombin inhibitortól elvárhatóakhoz (Chang 1985, fentebb idézett munka), vagy egy másik elgondolás szerint hisztidint helyettesíteni be, amely ugyan nem felel meg annak az elgondolásnak, hogy a trombinnak jó szubsztrátuma legyen, de amely mégis növelheti a hirudin gátlási erősségét.
Ezenkívül a 63. tirozin szulfáttal ellátottsága jelent különbséget a természetes hirudin és a genetikai rekombinációval nyert hirudin között, amely káros következménnyel járhat az aktivitásra, amint ezt Stone és Hofsteenge kinetikai tanulmányai sugallják [Stone S. R. ésHofsteenge: J. Biochem, 25,4622^4628 (1986)]. Meg lehet kísérelni a természetes fehérje utánzását olyan módon, hogy a tirozint valamely savas jellegű gyökkel, pl. Glu-val vagy Asp-pal helyettesítjük.
A jelen találmány olyan hirudin változatokkal foglalkozik, amelyek a természetes formában a 47. vagy 63. helyeknél levő aminosavaktól eltérő aminosavakat tartalmaznak.
Ilyen változat előnyösen a HV1, HV2 vagy HV3 hirudin valamely változata.
A szóban forgó változatok közül a következőket kell megemlítenünk.
- azt a változatot, amelyben a Tyr63 aminosav valamely savas jellegű gyökkel, elsősorban Glu-val vagy Asp-pal van helyettesítve;
- azt a változatot, amelyben a természetes hirudin 47. helyzetében levő aminosav Arg-gal vagy His-sel van helyettesítve;
- azt a változatot, amelyben a HV2 természetes formájának Asn47-e Lys-sel van helyettesítve.
Főleg az alábbi előnyös változatokat kell megemlítenünk:
[Lys47] HV2 [Arg47] HV2 [His47] HV2 [Glu63] HV2 [Asp47] HV2
A jelen találmány szerinti fentebb megadott változat, nevezetesen a (Lys47) HV2 [vagy „rHV2-Lys47”] a következő képletnek felel meg.
ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU
CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU
GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR
PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO
GLU GLU TYR LEU GLN
Azok a különböző változatok, amelyek megőrizték a Tyr63-at, lehetnek szulfáttal ellátott formában vagy másképpen.
A szulfátképzést lehet kémiailag vagy biológiailag létrehozni.
A találmány tartalmazza azokat a biológiai és/vagy kémiai módszereket, amelyek segítségével a fentebb említett változatokat elő lehet állítani.
Ezeket a változatokat hatásosan elő lehet állítani szintetikusan, félszintetikusan, és/vagy a genetikai manipuláció ismert technikáival.
így pl. a HVl-et, HV2-t és HV3-at, elsősorban a HV2-t, kódoló különböző szekvenciák klónozását és
HU 213 871 Β kifejezését, valamint a megfelelő hirudinok előállítását élesztőtenyészetekből az EP-A-200 655 számon közzétett szabadalmi bejelentés írja le.
A találmány szerinti változatokat a fentebb említett módszerekkel azonos módon, pl. irányított mutagenezissel a fentebb említett kódoló szekvenciák módosítása után nyerhetjük.
Az in vitro irányított mutagenezissel főleg olyan változatokat állítunk elő, amelyekben a 47. aszparagin lizinnel, argininnel vagy hisztidinnel van helyettesítve, és amelyben a 63. tirozin glutaminsawal van helyettesítve.
Főleg funkcionális kifejező blokkokat lehet alkalmazni, amint ez az EP-A-200 655 számon közzétett szabadalmi bejelentésben olvasható, amely blokkokban a hirudin szekvencia a fenti változatokat kódolja; ezeket a funkcionális DNS blokkokat valamely vektor plazmid hordozhatja.
Abból a célból, hogy a különböző változatoknak megfelelő gének élesztők általi kifejezését és kiválasztását irányítsuk, a géneket olyan élesztőben működő vektorba integráljuk, amely előnyösen a következő elemeket tartalmazza, amelyek az EP-A-200 655 számon közzétett szabadalmi bejelentésben le vannak írva:
- az élesztő 2 μ plazmidjának replikációs origóját,
- az ura3 gént,
- E.coli-hoz illő replikációs origót és egy antibiotikum rezisztencia markert,
- valamilyen átírási promotort, az alfa faktor prekurzorának vezető szekvenciáját és prepro szekvenciáját, ez a szekvencia fázisban fuzionálva van a hirudin változat kódoló szekvenciájától fölfelé,
- az élesztő PGK génjének átírási terminátorát, amely az említett változat génjétől lefelé helyezkedik el.
A találmány az ezekkel a vektorokkal vagy ezzel a funkcionális DNS blokkal transzformált élesztők, valamint ezek alkalmazásával hirudinvariánsok előállítására is vonatkozik.
A találmány különösen hirudinvariánsok oly módon történő előállítására vonatkozik, amelynek során valamely találmány szerinti élesztőt fermentálunk és a tenyészközegekben termelődött hirudint érett formában vagy valamilyen prekurzor formájában kinyerjük, amely utóbbit azután in vitro lehet beérlelni.
Az alkalmazott technikákat már nagy részletességgel leírták az EP-A-200 655 és EP-A-252 854 számon közzétett szabadalmi bejelentésekben.
Az ilyen módon kapott hirudinváltozatokat olyan módon lehet alkalmazni, amint ezt az EP-A-200 655 számon közzétett szabadalmi bejelentésben leírták, trombin inhibitorként mind in vivő, mind in vitro.
Ezeket a változatokat főleg gyógyászati kompozíciókban lehet alkalmazni egyedül vagy más aktív anyagokkal kombinálva vagy vizsgálatokkal vagy diagnózissal összefüggésben lehet alkalmazni in vitro vagy in vivő. Az utóbbi esetben előnyös lehet, ha a változatokat pl. radioaktív, fluoreszcens, enzimes vagy egyéb jelzéssel látjuk el.
A találmányt az itt következő példákkal és ábrákkal illusztráljuk. Az 1. ábra a hirudin 3 természetes változatát, nevezetesen a HVl-et, HV2-t és HV3-at mutatja be, és a 2. ábra, amely a trombin proteolitikus aktivitásának százalékos gátlását mutatja be kromozimon a HV2 hirudint vagy változatait termelő élesztőtenyészetek felülúszói térfogatainak függvényében. A példákban alkalmazott módszerek részletesebb leírását lásd: „Molecular Cloning” (J. Gambrook, E. F. Fritsch és I. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.)
1. példa
HV2 különböző változatainak megalkotása in vitro mutagenezissel
Hogy in vitro irányított mutagenezist hajtsunk végre, a módosítani kívánt fragmentumot egy egyszálas fág replikatív formájába klónozzuk; a rekombináns fág genomját izoláljuk és egy olyan szintetikus oligonukleotiddal hibridizáljuk, amely a mutált szekvenciát hordozza. Ez az oligonukleotid szolgál primerként a komplementer szál szintéziséhez, és azt a DNS-t amelyet ilyen módon kétszálúvá tettünk, használjuk egy receptor baktérium transzformálására, amely azután a kívánt mutációt hordozó fágot termeli [Zoller M. J. és Smith Μ. N.: Methods in Enzymol. 100, 469 (1983)].
Az EP-A-158 564 számon közzétett szabadalmi bejelentésben leírt pTG720 plazmid a hirudin kifejezésére szolgáló vektor E.coliban. A pTG730 plazmid a pTG720-ból származik egy EcoRI hely hozzáadásával a hirudint kódoló szekvenciától lefelé. Az EcoRI hely lehetővé teszi, hogy a hirudint kódoló szekvencia egyrészt EcoRI-gyel végzett emésztés, másrészt Clal-gyel végzett emésztés segítségével kinyerhető legyen.
A Clal-EcoRI fragmentum magában foglalja a hirudin teljes kódoló területét néhány 5'-terminális kodon kivételével.
Ezt a Clal-EcoRI fragmentumot az Ml3 fág egyik származékának, az M13TG131-nek nevezett származéknak [Kieny Μ. P., Lathe R. és Lecocq J. P.: Gene 26, 91-99 (1983)] Acél és EcoRI helyei közé klónozzuk. AzM13TG131-ből származó fágot, amely ezt a hirudin szekvenciát tartalmazza, M13TG1919nek nevezzük.
Három oligonukleotidot szintetizálunk, amelyek mindegyike képes párt képezni az M13TG1919 5'-GTACACCGA4CCCTGAAAG szekvenciájával, kivéve a központi területüket, amely a kívánt mutációnak felel meg. Ezeknek az oligonukleotidoknak a szekvenciái az alábbiak.
TG435 5'-CTTTCAGGG7Y7CGGTGTAC-3'
TG436 S'-CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-S'
TG437 5'-CTTTCAGGGCGCGGTGTAC-3'
Ezek az oligonukleotidok arra vannak szánva, hogy lehetséges legyen az M13TG1919 AAC(Asn) kodonjának helyettesítése CAC-vel (His), illetve AAA-val (Lys), illetve CGC-vel (Arg).
Az egyes oligonukleotidokból 120 pikomólt foszforilezünk 100 μΐ reakcközegben, és mintegy 20 pikomól foszforilezett oligonukleotidot hibridizálunk 1 pikomól M13TG1919 fág egyszálú DNSsel 25 mikroliter hibridizáló pufferban.
HU 213 871 Β
A hibridizálás után a DNS-ek keverékét Klenow polimeráz és T4 fág ligáz hatásának tesszük ki. Az egyes így kezelt keverékeket alkalmazzuk E.coli 71/18 törzs (műt L) átfertőzéséhez JM103 (ATCC39403) indikátor baktériummezőn [Messing J., Crea R., Seeburg P. H.: Nuc. Ac. Rés. 9, 309 (1981)]. A fertőzött sejtek azonosíthatók, mivel ezek olyan tarfoltokat képeznek, amelyek lassabban nőnek; a telepeket altenyésztésnek vetjük alá komplett tápközegen, majd Whatman 540 papírra visszük át a mutált fágokkal rendelkező sejtek kiszűrése céljából.
Ezt a kiszűrést in situ hibridizálással hajtjuk végre a fentebb primerként alkalmazott oligonukleotiddal. Három új fágot kapunk ilyen módon, amelyek a kívánt mutált szekvenciával rendelkeznek.
H1 3TG1921 ( Asn47 -> Arg) , M1 3TG1 924(Asn47 —> His) és M13TB1925 (Asn47 —* Lys) .
Ezenkívül azonos típusú kísérleteket végzünk a TG434 oligonukleotiddal, amely az 5'-ATTGTAACTCTTCTTCTG-3’ szekvenciával rendelkezik. Ez az oligonukleotid hibridizál egy HV2-t kódoló szekvencia 3’ területén lokalizált 5’-C AGAAGAA714 7TTACAAT szekvenciával, ahol a nevezett terület párnélküli triplettel rendelkezik, amely úgy van tervezve, hogy a TAT(Tyr63) kodon helyettesítve legyen GAG(Gln) kodonnal. Ilyen módon a megfelelő M13TG1922 (Tyr2 * * * 6HGln) mutált fágot kapjuk meg.
2. példa
A pTG1828 (0,6-kb)PstI-Hindinfragmentumának helyettesítése a mutált fragmentummal A pTG1828 plazmid (amelyet az EP-A-252 854 számon közzétett szabadalmi bejelentés ír le) hordozza a hirudin 2 variáns (HV2) kódoló szekvenciáját, amelyet az élesztő alfa szex feromonja génjének prepo-szekvenciája előz meg; a konstrukció a PGK promotor szabályozása alatt áll. Az MFa prepro szekvenciája és a hirudin közti fúzió segítségével a kifejezett fehérje a kiválasztás és az érés normál élesztő útját követi, úgy, hogy feldolgozott és aktív hirudin jelenik meg a tenyészközegben.
Ezt a plazmidot a mutált hirudin szekvenciáinak kifejezésére alkalmazzuk a natív hirudin helyett.
A pTG1828 emésztése Pstl-gyel és HindlII-mal 5 fragmentumot hoz létre, amelyek hozzávetőleges mérete 3,6; 1,9; 1,5,1,1, illetve 0,6 kb. Az utolsó fragmentum tartalmazza a preprohirudin fuzionált szekvenciát. Ez a fragmentum csak egyetlen Acél helyet és egyetlen EcoRI helyet tartalmaz. Az ezzel a két hellyel kapcsolt terület tartalmazza a teljes hirudin szekvenciát néhány 5’-terminális kodon kivételével. A 0,6 kb-s HindlII-PstI fragmentumot beiktatjuk egy olyan vektor HindlII és PstI helyei közé, amely sem EcoRI, sem Acél hellyel nem rendelkezik.
Az ilyen módon helyreállított plazmid (pTG1960) ennélfogva egy egyedi Acél hellyel illetve egy egyedi EcoRI hellyel rendelkezik a hirudin szekvencia kezdeténél és az utóbbitól lefelé. A pTG1960 emésztése
Accl-gyel és EcoRI-gyel olyan fragmentumot eredményez, amely gyakorlatilag a teljes hirudin gént, valamint a plazmid többi részét tartalmazza.
A nagy DNS fragmentumot, amelyből a hirudin szekvenciát kitöröltük, gélen tisztítjuk és összekeverjük az 1. példában leírt mutált fágok replikatív formája AccI/EcoRI emésztésének termékével abból a célból, hogy helyreállítsuk az irányított mutagenezissel kapott új HV2 változatokhoz tartozó preprohirudint. Négy új plazmidot választunk ki: pTG1963 (Asn47—»Arg), pTG1964 (TyfrHGlu), pTG1965 (Asn47->His) és pTG1966 (Asn47—>Lys), amelyek a pTG 1960-tól csak a mutált kodon tekintetében térnek el.
Ezeket a mutált kodonokat tartalmazó szekvenciákat Pstl-HindlII fragmentumok formájában ki lehet nyerni, és újra lehet klónozni a pTG1828 vektorba az eredeti Pstl-HindlII fragmentum helyébe.
Ilyen módon négy új plazmidot kapunk: a pTG1977-et (Asn47—> Arg), a pTgl978-at (Tyr63—>Gln), a pTG1979-et (Asn47—>His), és a pTG1980-at (Asn47—>Lys), amelyek a fentebb leírt pTG 1828-tól csak az in vitro megalkotott mutációk tekintetében különböznek.
3. példa
TGYsp4 transzformálásapTG1977, pTG1978, pTG1979 és pTG1980 DNS-eivel
S.cerevisiae TGYlsp4 (Mata ura3.251.373.382 his—3.11.15) sejteket (lásd 202 919 lajstromszámú magyar szabadalmi leírást) transzformálunk pTG1977, pTG1978, pTG1979 és pTG1980 DNS-eivel. Minden esetben ura+ transzformánsokat kapunk.
Ezen a módon négy törzset kapunk, a TGYsp4/pTG1977-et, a TGYlsp4/pTG1978-at, a TGYlsp4/pTG1979-et és a TGYlsp4/pTG1980-at. Ennek a négy törzsnek és a TGYlsp4/pTGl828-nak a hirudin termelését hasonlítjuk össze.
ml tenyészközeget (tápközeg: YNBG+0,5% savval hidrolizált kazein) 0,02 OD66o értékű törzsekkel inokulálunk. 48 órán át 30 °C hőmérsékleten végzett rázatás után a tenyészeteket centrifugáljuk (5000 fordult/perc), és a felülúszókat vizsgáljuk. Kontrollként a TGYlsp4 pTG881 (HV2-t kódoló szekvenciát nem hordozó plazmid) tenyészetét alkalmazzuk.
A nyers felülúszó aktivitását a trombin aktivitásra vonatkozó gátló hatásuk függvényében mérjük [proteolitikus aktivitás a kromozim TH (chromozyme TH - Boehringer Mannheim) szintetikus szubsztrátumra], A százalékos gátlást a felülúszó térfogatainak függvényében a 2. ábrában adjuk meg.
Megfigyelhető, hogy az Arg47 és Lys47 változatok által kialakított gátló hatás legalább azonos, a natív HV2-ével. A Glu63 és His47 változatok valamivel kisebb gátló hatásúak, mint a HV2.
4. példa
A trombin aktivitás gátlása
Abból a célból, hogy világosabban bemutassuk a találmány szerinti hirudin változatoknak az értékét különösen gyógyászati alkalmazás céljából, az alábbiakban
HU 213 871 Β összehasonlítjuk a HV2 változat és további két HV2 formájú változat trombinra vonatkozó gátló tulajdonságait, az említett két további változatban a 47. helynél levő aminosav Arg-gal vagy Lys-sel van helyettesítve, és mindkét változatot rekombináns DNS segítségével kapjuk.
Hogy ezen változatok trombin-gátlásának kinetikáját tanulmányozzuk, a nagy affinitású inhibitorok elméletét alkalmazzuk, amelyet Williams J. W. és Morrison J. F. írtak le [Methods in Enzymology 63, 437—467 (1979)], mivel a hirudin a trombinnak reverzibilis inhibitora.
Az alkalmazott hirudin-változatokat 95%-osra tisztítjuk, míg a Sigma tiszta trombinja, az aktív hely titrálásával mérve, 92%-nál nagyobb aktivitású. A humán trombin koncentrációja mindegyik mérésnél azonos, nevezetesen 5,5.10~9 mól/1. A közeg 0,05 mól/1 nátrium-PIPES puffer (pH 7,9), 0,18 mól/1 Kel és 0,1% polietilénglikol (PEG), és 37 °C hőmérsékletet alkalmazunk. A trombin szubsztrátum Boehringer kromozim PL. 2 perc előinkubációs időt tartunk a trombinhoz és a hirudinhoz, majd ezután indítjuk be a reakciót a szubsztrátummal.
A következő táblázatban megadjuk a kísérletileg meghatározott értékeket a humán trombin azonos mennyiségének (5,5.10 9 mól/liter 95%-os gátlásához szükséges mennyiségére.
10-9 mól/1 trombin 95%-os gátlásának eléréséhez szükséges mennyiség
HV2 Lys47 7,6
HV2 Arg47 8,5
HV2 32,2
Ezáltal látható, hogy mintegy négyszer kevesebb HV2 Arg47 és HV2 Lys47 szükséges azonos mennyiségű humán trombin gátlásához, mint HV2 hirudin.
A javasolt változatok tehát erőteljesen megjavított gátló hatással rendelkeznek trombinra vonatkoztatva.
5. példa
Rekombináns hirudin két változatára, az rHV2-re és rHV2-Lys47-re vonatkozó előzetes farmakológiai tanulmány, heparin strandarddal összehasonlítva
- A TANULMÁNY TÁRGYA
- a rekombináns hirudin két változatának, az rHV2nek (vagy HV2-nek) és rHV2-Lys 47-nek [vagy (Lys47) HV2-nek] a meghatározása és antitrombotikus hatékonyságuk összehasonlítása standard heparinnal. Ezen két változat mindegyikéből hiányzik a Tyr 63 csoport átírás utáni szulfát-csoporttal ellátása.
- KÍSÉRLETI KÖRÜLMÉNYEK
a) A két rekombináns hirudin fajlagos antitrombin aktivitását (humán és szarvasmarha trombinra) fiziológiás sóoldatban határozzuk meg a trombin kromozimra gyakorolt proteolitikus aktivitásának gátlása alapján.
b) A két hirudin antikoaguláns aktivitását in vitro összehasonlítjuk patkány és nyúl plazmában a trombinidő meghosszabbodásának függvényében, és az anti-IIa hatást kromogénesen mérjük.
c) A hirudin plazmából való eltűnésének kinetikáját
i.v. kapszulás injekció beadása után követjük az anti Ha hatás mérésével, a trombin idő alapján és kromogénesen kalibrációs görbék segítségével.
d) A 30 perces folyamatos i.v. perfúzió után nyulakban kapott plazmakoncentrációt azonos technikával határozzuk meg.
e) A hirudin két változatának és a standard heparinnak az antitrombotikus aktivitását Wessler-féle nyúl és patkány modellen tanulmányozzuk tromboplasztinnal, mint trombogénszerrel, és vérpangás (sztázis) modellen nyulakban (Fareed). A vegyületeket folyamatos perfúzióval adjuk be nyulakba, és i.v. kapszulákkal patkányokba.
Az alkalmazott modellek az alábbiak:
Wessler-féle nyúlmodell
2,5-3 kg tömegű hím New Zealand nyulakat használunk ebben a tanulmányban. Nátrium-pentobarbitol (30 mg/kg) intravénás injekcióval végzett érzéstelenítés után a bal nyaki verőérbe kanült vezetünk be, és a két nyaki vénát izoláljuk; két laza lekötő fonalat helyezünk mindegyikre egymástól 2,5 cm távolságra. A nyulak azután vagy fiziológiás sóoldatot kapnak, vagy hirudin vagy heparin oldatokat kapnak folyamatos perfúzióval 30 percen át 2,5 ml/óra áramlási sebességgel. Két perccel a perfúzió vége előtt, artériás vérmintákat veszünk abból a célból, hogy meghatározzuk az antikoagulánsok plazmaszintjeit. Egy perccel a perfúzió vége előtt Buchanan M. eljárása szerint standardizált humán tromboplasztint (Manchester Comparative Reagents Ltd.) injektálunk 600 μ/kg adagban pontosan 30 másodperc alatt az aortába a nyaki verőéren keresztül. 30 másodperccel később a perfúziót leállítjuk és vérpangást idézünk elő a lekötő fonalak megszorításával a két vénás szegmensen 15 percen át. A nyaki vénákat ezután felnyitjuk és a vérrögöket kiszedjük, fiziológiás sóoldatban öblítjük, és szűrőpapírral végzett szárítás után tömegüket lemérjük.
Wessler-féle patkány-modell
Hím (CD-COBS) Sprague-Dawley patkányokat alkalmazunk, amelyek mintegy 300 g tömegűek. A nátrium-pentobarbitollal (30 mg/kg) i.p. végzett érzéstelenítés és középső hasfelmetszés után az alsó véna cava-t feltárjuk 1 cm-rel a vese csatlakozás fölött. Két rugalmas lekötő fonalat helyezünk el 0,7 cm távolságra egymástól.
A vizsgálandó termékeket, fiziológiás sóoldatban hígítva, i.v. kapszulából injektáljuk 1 ml/kg-mal 5 perc 40 másodpercen át, vagy 1 percen át (heparinnál) a vénás pangás előidézése előtt. 40 másodperccel a vérpangás előtt trombogén szert (nyúl tromboplasztin, Dade E.) injektálunk 25 mg/kg dózisban a hímvessző vénájába nagyon pontosan mért 30 másodperc alatt. Az injekció vége előtt 10 másodperccel pangást hozunk létre a két lekötő fonal megszorításával, először a testközponthoz közelebb eső (proximális), majd a távolabb eső (disztális) fonal megszorításával. A pangást 10 percen át tartjuk fenn, és a vérrögöket ezután eltávolítjuk, bemerítjük 0,38% erősségű citrát-oldatba, szárítjuk általános célú abszorbens papírral, és a következő napon megmérjük egy órán át 50 °C hőmérsékleten végzett szárítás után.
HU 213 871 Β
A vérpangással kapott trombózis modellje nyulakban
2,5-3 kg testtömegü hím New Zealand nyulakat alkalmazunk ebben a tanulmányban. A nátrium-pentobarbitollal (30 mg/kg) végzett intravénás érzéstelenítés után a bal nyaki verőérbe kanült vezetünk be és a két nyaki vénát izoláljuk; két laza lekötő fonalat helyezünk mindegyikre egymástól 2,5 cm távolságra. A nyulak azután vagy fiziológiás sóoldatot kapnak, vagy hirudin vagy heparin oldatokat kapnak folyamatos perfúzióval 30 percen át 2,5 ml/óra áramlási sebességgel. Két perccel a perfüzió vége előtt artériás vérmintákat veszünk abból a célból, hogy meghatározzuk az antikoagulánsok plazmaszintjeit. Ugyanabban az időben, amikor a perfúziót leállítjuk, pangást idézünk elő a négy lekötő fonal megszorításával (először a proximális, majd a dísztális fonalak meghúzásával). A pangást 2 órán át tartjuk fenn, ezután a nyaki vénákat felnyitjuk és a vérrögöket kiszedjük, fiziológiás sóoldatban öblítjük és szűrőpapírral végzett szárítás után tömegüket lemérjük.
- EREDMÉNYEK mg/ml-es koncentrációjú törzsoldat készítéséhez a hirudin két változatának fajlagos antitrombin aktivitását az emberi és szarvasmarha trombinra vonatkoztatva az
1. táblázatban mutatjuk be.
I. TÁBLÁZAT
rHV2 rHV2-Lys47
humán trombinra 14800 19000
szarvasmarha trombinra 15500 19200
(a humán trombinra várt eredmények) (13300) (16000)
A hirudin rHV2 változatának fajlagos antitrombin aktivitása +/- 15000 ATU (antitrombin egység)/mg, és az rHV2-Lys 47 változaté +/- 19000 ATU/mg. Ezek a fajlagos aktivitások nagyobbak, mint az elvárt aktivitások. A fajlagos aktivitások azonosak a humán és a szarvasmarha trombinoknál.
b) Az antikoaguláns aktivitás patkány- és nyúlplazmában a trombin-idő függvényében meghatározva azonos a két hirudin kis koncentrációinál. Az rHV2-Lys 47 változat határozottan jobb a nagyobb koncentrációknál. A maradék trombin a patkány- és nyúlplazmában, kromogén szubsztrátum segítségével meghatározva, hasonló a két hirudinnál 60 ATU/ml-ig. A maradék trombin nyomainak további semlegesítésénél az rHV2Lys 47 hatásosabb. Ez a Ki értékek különbségében tükröződik.
c) A két hirudin plazmából való eltűnésének kinetikája hasonló i.v. kapszulás injekció után kromogénes meghatározással, de enyhén különböző a trombin-idő függvényében meghatározva (2. táblázat). A hirudinok két hatványkitevő szerint tűnnek el. Egy első fázis (eloszlás) mintegy 3 perces t 1/2 a értékkel, amely csökkenti az első kiindulási értéket 60%-kal 5 perces időtartam alatt mindkét hirudinnál; és egy második fázis (eltávolítás) 16 perces 11/2 β értékkel rHV2-Lys 47-re és 28 perces értékkel rHV2-re, ha a trombin-időt vesszük figyelembe, és 28, illetve 30 perces 11/2 β értékekkel, ha a kromogénes módszert alkalmazzuk. A standard heparin egyetlen exponenciális fázis szerint tűnik el (t 1/2 = 9 perc).
2. TÁBLÁZAT
A hirudinekfél-élettartama i.v. kapszulás injekció után nyulakban
Módszer TT t l/2a CS TT 11/2β CS
rHV2 2,5 3,0 28 28
rHV2-Lys 47 1,8 3,0 16 30
TT: trombin-idő
CS: kromogénes szubsztrátum
d) A két hirudinváltozat 30 perces, folyamatos i.v. perfüzió utáni plazmakoncentrációja nyulakban egyenes összefüggésben van a perfüzióval beadott dózisokkal
e) Antitrombotikus hatások
TERMÉKEK NYÚL i.v. PATKÁNY i.v.
perfüzió kapszulás adag pg/kg/bra pg/kg
WESSLER PANGÁS WESSLER
-5 perc 40 mp. - 1 perc
rHV2 375 240
rHV2-Lys 47 20 47 160
Standard heparin 110 110 160 110
Ezeknek az előzetes farmakológiai adatoknak az alapján úgy tűnik, hogy nyulakban, folyamatos perfúzióval, az rHV2-Lys 47 rekombináns hirudinváltozat olyan antitrombotikus aktivitással bír, amely nagyobb az rHV2 és a heparin antitrombotikus aktivitásánál. A két hirudin változat farmakokinetikája azonos.
6. példa
Az antitrombotikus aktivitás/vérzési kockázatarány összehasonlítása rHV2-Lys 47 hirudinnál és standard heparinnál
A végrehajtott tanulmányok azt mutatják, hogy a vérzés kockázata rHV2-Lys 47-tel kezelt nyulakban és a vérzési idő meghosszabbodása ugyanúgy kezelt patkányokban kisebb, mint azokban az állatokban, amelyeket standard heparinnal kezelünk, az egyes fajoknál olyan adagokra alapozva, amelyek egy trombózis-modellen azonos aktivitással bírnak.
A találmányt képviselő törzsek letétbe helyezése
A következő törzseket helyeztük letétbe a Pasteur Intézetben [28 Rue du Docteur Roux, Paris (15)] működő Nationale de Cultures de Microorganismes-nél (Nemzeti Mikroorganizmus Gyűjtemény) 1986. december 6-án:
TGYl-sp4/pTG1977(HV2-Arg47), 1-621 letéti számon; és
TGYsp4/pTG1980(HV2-Lys47), 1-622 letéti számon.
A referencia törzset 1986. június 6-án helyeztük letétbe: TGYlsp4/pTG1828,1-569 letéti számon.

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás a 47. vagy 63. helyzetben a természetestől eltérő aminosavat tartalmazó trombingátló aktivitással rendelkező hirudinvariáns előállítására, azzal jellemezve, hogy a természetes hirudinban az említett aminosavakat szintetikus, félszintetikus vagy genetikai manipuláció útján kicseréljük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genetikai manipuláció során élesztőt egy, az említett hirudinvariánst kódoló funkcionális DNS blokkal vagy egy olyan plazmiddal transzformálunk, amely a következő elemeket tartalmazza:
    - az élesztő 2 μ plazmidjának replikációs origója,
    - ura3 gén,
    - egy E.coliban működő replikációs origó és egy antibiotikum-rezisztencia marker,
    - egy átírási promotor, a „vezető” szekvencia és az alfa faktor prekurzoránakprepro szekvenciája, ez utóbbi fázisban fuzionálva a hirudinváltozatot kódoló szekvenciától fölfelé, és
    - az élesztő PGK génjének átírási terminátora, a hirudinváltozat génjétől lefelé.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 63. helyzetben a természetes formában előforduló Tyr aminosavat Glu vagy Asp aminosavra cseréljük ki.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HV1, HV2 vagy HV3 változatból indulunk ki.
  5. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 47. helyzetben a természetes formában előforduló aminosavat Arg vagy His aminosavra cseréljük ki.
  6. 6. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HV2 47. helyzetében a természetes formában előforduló Asn aminosavat Lys aminosavra cseréljük ki.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás (Lys47) HV2, (Arg47) HV2, (His47) HV2, (Glu63) HV2 vagy (Asp63) HV2 előállítására, azzaljellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás
    Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin
    szekvenciával rendelkező hirudinváltozat előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a hirudinvariáns szulfátéit formájának előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  10. 10. Eljárás trombingátló tulajdonságú gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hirudinvariánst hordozó, hígító- és/vagy a gyógyszerkészítésben szokásos más segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
HU875394A 1986-12-01 1987-12-01 Process for producing variants of hirudine HU213871B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR868616723A FR2607517B2 (fr) 1986-12-01 1986-12-01 Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT45564A HUT45564A (en) 1988-07-28
HU213871B true HU213871B (en) 1997-11-28

Family

ID=9341393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU875394A HU213871B (en) 1986-12-01 1987-12-01 Process for producing variants of hirudine

Country Status (24)

Country Link
US (1) US5650301A (hu)
EP (1) EP0273800B1 (hu)
JP (1) JP2567263B2 (hu)
KR (1) KR960011918B1 (hu)
AT (1) ATE73462T1 (hu)
AU (1) AU617989B2 (hu)
BG (1) BG49719A3 (hu)
CA (1) CA1341416C (hu)
CS (1) CS276245B6 (hu)
DE (1) DE3777367D1 (hu)
DK (1) DK173247B1 (hu)
ES (1) ES2032465T3 (hu)
FI (1) FI99211C (hu)
FR (1) FR2607517B2 (hu)
GR (1) GR3004556T3 (hu)
HU (1) HU213871B (hu)
IE (1) IE60544B1 (hu)
MC (1) MC1884A1 (hu)
NO (1) NO177500C (hu)
PL (1) PL157254B1 (hu)
PT (1) PT86233B (hu)
RO (1) RO106890B1 (hu)
SU (1) SU1687032A3 (hu)
ZA (1) ZA879011B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2628429B1 (fr) * 1988-03-08 1990-12-28 Transgene Sa Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir
GB8817160D0 (en) * 1988-07-19 1988-08-24 Ciba Geigy Ag Novel proteins
GB8817161D0 (en) * 1988-07-19 1988-08-24 Ciba Geigy Ag Modified proteins
US5284768A (en) * 1988-08-24 1994-02-08 Sanofi Signal peptide, DNA sequences coding for the latter, expression vectors carrying one of these sequences, gram-negative bacteria transformed by these vectors, and process for the periplasmic production of a polypeptide
FR2645174B1 (fr) * 1989-03-31 1994-01-07 Transgene Sa Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant
US5879926A (en) * 1989-03-31 1999-03-09 Transgene S.A. Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin
FR2645175B1 (fr) * 1989-03-31 1994-02-18 Transgene Sa Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
FR2656531B1 (fr) * 1989-12-29 1992-04-24 Sanofi Sa Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure.
US5118790A (en) * 1990-07-24 1992-06-02 Sri International Analogs of hirudin
ATE176500T1 (de) * 1990-11-08 1999-02-15 Japan Energy Corp Sekretionsvektor, diesen enthaltene transformierte mikroorganismen und herstellung von produkten durch obigen mikroorganismus
US5837808A (en) * 1991-08-20 1998-11-17 Baxter International Inc. Analogs of hirudin
US5407822A (en) * 1991-10-02 1995-04-18 Sanofi Artificial promoter for the expression of proteins in yeast
WO2020210965A1 (zh) * 2019-04-16 2020-10-22 广东双骏生物科技有限公司 水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341414C (fr) * 1984-03-27 2002-12-31 Paul Tolstoshev Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
EP0168342B1 (de) * 1984-06-14 1991-07-03 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
DE3445517C2 (de) * 1984-12-13 1993-11-18 Ciba Geigy Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
DE3689525D1 (de) * 1985-07-17 1994-02-24 Hoechst Ag Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel.

Also Published As

Publication number Publication date
FI99211B (fi) 1997-07-15
DK627687A (da) 1988-06-02
FI875295A (fi) 1988-06-02
FR2607517A2 (fr) 1988-06-03
DK627687D0 (da) 1987-11-30
GR3004556T3 (hu) 1993-04-28
MC1884A1 (fr) 1989-01-24
PT86233A (fr) 1987-12-01
NO177500C (no) 1995-09-27
EP0273800B1 (fr) 1992-03-11
CS276245B6 (en) 1992-05-13
EP0273800A2 (fr) 1988-07-06
CS8708732A2 (en) 1991-07-16
JP2567263B2 (ja) 1996-12-25
IE873239L (en) 1988-06-01
DE3777367D1 (de) 1992-04-16
PT86233B (pt) 1990-11-07
FI875295A0 (fi) 1987-12-01
EP0273800A3 (en) 1988-07-20
HUT45564A (en) 1988-07-28
PL157254B1 (pl) 1992-05-29
DK173247B1 (da) 2000-05-22
RO106890B1 (ro) 1993-07-30
AU8188087A (en) 1988-06-02
PL269164A1 (en) 1988-08-18
ATE73462T1 (de) 1992-03-15
ZA879011B (en) 1988-05-27
NO177500B (no) 1995-06-19
FI99211C (fi) 1997-10-27
ES2032465T3 (es) 1993-02-16
NO874905L (no) 1988-06-02
US5650301A (en) 1997-07-22
CA1341416C (fr) 2003-01-21
FR2607517B2 (fr) 1989-12-22
AU617989B2 (en) 1991-12-12
NO874905D0 (no) 1987-11-25
KR880007729A (ko) 1988-08-29
JPS63152987A (ja) 1988-06-25
KR960011918B1 (ko) 1996-09-04
IE60544B1 (en) 1994-07-27
SU1687032A3 (ru) 1991-10-23
BG49719A3 (en) 1992-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2515468B2 (ja) ヒト抗トロンビンｉｉｉ
CA1336493C (en) Pharmaceutically active combination of plasminogen activator and thrombin inhibitor
US5087613A (en) Hirudin variants
CA2065409C (en) Anticoagulant polypeptides
HU218104B (hu) Humán, Kunitz-típusú proteázgátló változatai
HU213871B (en) Process for producing variants of hirudine
Zitnik et al. The cloning and characterization of a murine secretory leukocyte protease inhibitor cDNA
WO1991012270A2 (en) Novel platelet aggregation inhibitors from the leech
US5516656A (en) Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same
US5239058A (en) Proteins having anticoagulant properties
US5824641A (en) Method of treating of preventing influenza
EP0568833B1 (en) Human antithrombin III mutants
US5876971A (en) Thrombin inhibitor from the saliva of protostomia
Courtney et al. Production and evaluation of recombinant hirudin
EP0696198B1 (en) Novel polypeptide having factor xa inhibitory activity
CA2004764C (en) Ancrod proteins, their preparation and use
HUT72926A (en) High molecular weight desulphatohirudin
JP2696316B2 (ja) ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法
JPH07119237B2 (ja) ヒルジン変異体，その製造法及び抗凝血剤

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT, DE