NO301985B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav, plasmid samt mikroorganisme for anvendelse ved utförelse av fremgangsmåten - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav, plasmid samt mikroorganisme for anvendelse ved utförelse av fremgangsmåten Download PDFInfo
- Publication number
- NO301985B1 NO301985B1 NO890260A NO890260A NO301985B1 NO 301985 B1 NO301985 B1 NO 301985B1 NO 890260 A NO890260 A NO 890260A NO 890260 A NO890260 A NO 890260A NO 301985 B1 NO301985 B1 NO 301985B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cystatin
- des
- plasmid
- sequence
- hydroxy
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 24
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 abstract description 67
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 abstract description 66
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 108090001069 Chymopapain Proteins 0.000 description 22
- XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N Chymopapain Chemical compound OC1=CC(S(O)(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1O XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 229960002976 chymopapain Drugs 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 101000912205 Homo sapiens Cystatin-C Proteins 0.000 description 14
- 102000049632 human CST3 Human genes 0.000 description 14
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 11
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 5
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 208000008765 Sciatica Diseases 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 3
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 3
- 102000015833 Cystatin Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 108050004038 cystatin Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FJPHHBGPPJXISY-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 FJPHHBGPPJXISY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101100109397 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 101710193050 Papain inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000018282 ACys amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003902 Cathepsin C Human genes 0.000 description 1
- 108090000267 Cathepsin C Proteins 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100029921 Dipeptidyl peptidase 1 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007487 Familial Cerebral Amyloid Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000032849 Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 102100026038 Lens fiber membrane intrinsic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710115990 Lens fiber membrane intrinsic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003874 central nervous system depressant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C. Oppfinnelsen vedrører også et plasmid såvel som en mikroorganisme for anvendelse ved utførelse av fremgangsmåten.
Modent cystatin C er et kjent protein med 12 0 aminosyrer.
Aminosyresekvensen er som følger:
Naturlig humant cystatin C er en blanding av to typer som er forskjellige ved at type I har aminosyresekvensen Ser-Ser-OHPro-Gly...Ala, mens type II, som kalles 3-des-OH-cystatin C, har følgende sekvens: Ser-Ser-Pro-Gly...Ala (1). De to typene avviker således fra hverandre bare i den tredje aminosyreresten. Da det relative forholdet mellom de to typene kan variere noe, avhengig av opprinnelsen for preparatene og ekstraksjonsmetoden, kan den biologiske aktiviteten av preparatene også variere noe.
Det skal påpekes at det i Grubb et al's artikkel i Proe.
Nati. 1982 (1), er angitt molekylvekt og en fullstendig amino-syresekvens for "human y-trace". På side 3025 er det i en fotnote nevnt at 3-Pro-gruppen er en "partly hydroxylated residue". Altså er naturlig human y-human-trace, som senere er blitt kalt cystatin C, en blanding av 3-Proc-hydroksylert og 3-des-OH-forbindelsen. Det er tydelig at blandingen ikke har vært separert, og de biologiske egenskapene til 3-des-OH-derivatet ikke har vært undersøkt.
Følgelig kan den rene forbindelse 3-des-OH-cystatin C ikke anses å være kjent fra dette motholdet. Motholdet hverken beskriver eller antyder fremstilling av 3-des-OH-cystatin C ved rekombinante teknikker.
Heller ikke i Proe. Nati. 1986, Ghiso et al., ref. 16, omtales 3-des-hydroksy-cystatin C, men et protein med 110 aminosyrer som kalles HVHWA amyloid protein, og hvis sekvens er identisk med cystatin C fra pos. 11-12 0, bortsett fra amyloid pos. 58, hvor aminosyren er Gin, mens den i cystatin C pos. 58 er Leu. Det er postulert at det er en "punktmutasjon" som er ansvarlig for dette spesielle proteinet. 3-des-hydroksy cystatin C synes ikke å være omtalt, og det er heller ikke erkjent at dette er den aktive form.
Cystatin C fremstilt ifølge oppfinnelsen er av typen 3-des-OH-cystatin C, blir ansett for å ha bestemt aktivitet.
Som det er kjent fra litteraturen er cystatin C en effektiv inhibitor for cystein-proteinaser, for eksempel papain og cathepsin B.
Cystein-proteinaser deltar i den intracellulære katabolismen av proteiner og peptider, i den proteolytiske omdanningen av prohormoner, i den ekstracellulære nedbrytningen av kollagen og i gjennomtrengningen av normalt vev med maligne celler.
Da cystatin C inhiberer cystein-proteinaser som akselererer kreftveksten eller metastasedannelsen, er det et potensielt kreft-hemmende middel.
Dessuten har cystatin C anti-viral og muligens anti-bakteriell aktivitet.
Cystein-proteinaser, for eksempel chymopapain, kan anvendes til behandling av forskjøvet virvel. Dersom disse cysteinproteinasene diffunderer inn i den cerebrospinale væsken, vil cerebral blødning finne sted som en alvorlig sidevirkning ved den terapeutiske behandlingen av forskjøvet virvel. Da cystatin C inhiberer slike sidevirkninger, anvendes det terapeutisk i denne forbindelse.
Spesielt viktig er virkningen av cystatin C til å motvirke arvelig tilbøylighet til hjerneblødning med amyloidose. Det deponeres som amyloid i arterieveggene. Metabolismen av cystatin C i denne sykdommen som angriper unge mennesker blir forandret, og sekvensen for avsatt cystatin C avviker i en posisjon fra den som opprinnelig er beskrevet for cystatin C isolert fra mennesker uten denne sykdommen.
I visse typer av arvelig hjerneblødning blir cystatin C utfelt etter avspalting av de 10 aminoterminale aminosyrene i form av et amyloid i hjernens arterier, som brister. I tilfeller med disse typene av arvelig hjerneblødning foreligger det et cystatin C molekyl som i posisjon 68 har en glutaminrest istedenfor en leucin-rest.
Ved nedbrytning av kollagen i vev deltar blant annet cystatin-proteinaser og cystatin C kan derfor sannsynligvis inhibere en slik nedbrytning av vev.
Aminosyresekvensen i cystatin C som er isolert fra human urin, er blittkarakterisert, og synes å være til en viss grad homolog med c-Ha-ras onkogene produkter.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er basert på bruken av nye DNA-sekvenser som inneholder kodoner som koder for 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav med i det vesentlige den samme biologiske aktivitet, og erkarakterisert vedat en vertsorganisme transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende en DNA-sekvens med strukturen:
eller en modifisert form derav i kombinasjon med transkripsjons-og translasjonregulerende sekvenser, og en seleksjonsmarkør dyrkes i et egnet vekstmedium, og at det dannede 3-des-hydroksy-cystatin C eller den forut definerte homolog derav deretter utvinnes fra kulturen.
En utførelse av oppfinnelsen anvender en DNA-kopi eller en cDNA-sekvens som er laget på basis av humane celler eller placenta. Oppfinnelsen anvender således også en slik DNA-sekvens, idet strukturen for denne er fremsatt i krav 2.
Oppfinnelsen vedrører dessuten fremstilling av modifisert 3-des-hydroksy-cystatin C, hvori en eller flere aminosyrer i posisjonene 5-17, 55-59 og/eller 68 er blitt erstattet med en annen aminosyre. Et eksempel på et slikt modifisert cystatin C er et derivat hvori Leu i posisjon 68 er forandret til Gin.
Oppfinnelsen vedrører også et plasmid for anvendelse i fremstilling av biosyntetisk 3-des-hydroksy-cystatin C eller et modifisert 3-des-hydroksy-cystatin C. I en slik fremgangsmåte anvendes en vertsorganisme, så som en bakterie, en gjærcelle eller en pattedyr cellelinje, hvori en vektor er inkludert, så som et plasmid med en struktur som er egnet til å uttrykke cystatin C eller et modifisert cystatin C.
Den aktuelle DNA-sekvensen innsettes i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser samt signalsekvens fra OmpA eller pre-cystatin, og seleksjonsmarkørsekvens som muliggjør ekspresjon i en egnet vertscelle som deretter blir dyrket på en måte som er kjent per se.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir en vertsorganisme
som inneholder en DNA-sekvens som koder for 3-des-hydroksy-cystatin C, dyrket i et substrat, og dannet cystatin C blir deretter ekstrahert fra kulturmediet. Mikroorganismer ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedat de inneholder et plasmid som angitt i krav 2. Den foretrukne vertsorganismen er E.coli, men i prinsippet kan en hvilken som helst mikroorganisme anvendes innbefattet gjærceller som SaccharomycesCerevisiae, eller dyrkingen kan foregå ved hjelp av pattedyrceller.
Det dannete cystatin C ekstraheres fra kulturmediet på en i og for seg kjent måte, for eksempel ved ekstraksjon ved hjelp av løsningsmidler og rensing ved kromatografi. Affinitetskromatografi med monoklonale eller polyklonale antistoffer har vist seg spesielt egnet for å isolere cystatin C i ren tilstand.
Isolering og analyse av cDNA-kloner er blitt utført ved å screene rekombinante fager. Det er således blitt anvendt Agtll cDNA bibliotek fra humanplacenta og mRNA fra lever. Screeningen foregikk ved en tetthet på50.000plakker pr. 13 0 mm petriskåler med affinitetsrenset antistoff, ved en fremgangsmåte ifølge Young og Davis. Bundet antistoff ble demonstrert ved alkalisk fosfatase-konjugert antistoff (Promega Bioteknik).
A-fager fremstilt ved platelysatmetoden ble isolert ved sentrifugering i enCsCl gradient. DNA ble ekstrahert ved standardmetoder. En blandet oligonukleotidprøve som var spesifikk for cystatin C, ble hybridisert til produktet fra fag DNA omsatt med EcoRI i et Southern blot eksperiment. Innsatt hybridisert cDNA ble ligert i EcoRI-lineæriserte pUC18 plasmidvektorer som deretter ble anvendt til å transformere E. coli JMB83 celler. Plasmider ble fremstilt ved alkalisk nedbrytningsmetode. DNA-sekvenseringen av innskuddene, subklonene i M13mp8, ble utført ved bruk av en modifisert dideoksykjede terminatorteknikk.
Oppfinnelsen beskrives i det følgende ved hjelp av figurene hvor: Fig. 1 illustrerer en sekvenseringsstrategi for human 3-des-OH-cystatin C cDNA-innsetninger.
Fig. 2 viser plasmidet pUC18/C6a.
Fig. 3 viser plasmidene pHD162 og pHD262.
Fig. 4 viser plasmidet pHD313.
I det følgende er oppfinnelsen beskrevet ved hjelp av eksempler.
EKSEMPEL 1
Konstruksjon av et cDNA som koder for 3- des- OH- cystatin C
cDNA bibliotek fra humane celler fra lever, prostata og placenta ble screenet for kloner som koder for cystatin C Om lag 1,2 x IO<6>rekombinanter av leverceller og 3 x IO<5>rekombinanter fra prostataceller ble screenet med antistoffer og en blandet oligo-nukleotidprobe. Resultatet av denne screeningen var negativ. På den annen side ga screening av 6 x IO<5>rekombinanter av placentaceller9kloner som reagerte med antistoffet.
Tre av disse klonene, betegnet henholdsvis C5, C6a og C12, ble anvendt i det følgende. Deres innskudd på henholdsvis 800, 800 og 700 basepar ble spesifikt hybridisert ved Southern blot ekseperi-menter til et blandet oligonukleotid, konstruert fra protein-sekvensdata.
Ved å sekvensere innskudd fra klonene C6a og C12, subklonen i EcoRI-kuttet M13mp8, ble det oppdaget at innskuddene delte den samme 3<1->sekvensen, inneholdende polyadenyleringsignalet AATAAA.
Hele sekvensen i begge trådene i klon C6a cDNA innskuddet ble bestemt ved vilkårlig å sekvensere overlappende fragmenter, subklonen i M13mp8. Hvert nukleotid ble bestemt gjennomsnittlig 5,63 ganger. Data oppnådd ved å sekvensere cDNA innskudd av klonene C6a og C12 fra endene, åpenbarte at sekvensen av C12 innskudd starter ved posisjon 91 i C6a, se figur 1.
C6a innskuddet inneholder 777 basepar innbefattet 77 basepar med 5<1->ikke-kodende sekvens og 262 basepar med 3<1->ikke-kodende sekvens. Polyadenylsignalet AATAAA i posisjon 756-761 etterfølges av 15 nukleotider. En mulig translasjonsinitiering i samsvar med sekvensen oppdaget av Kozak, finnes 6bp nedstrøms fra et stopp-kodon. Initiering i denne posisjonen og translasjonsstopp ved
TAG-koden i posisjonene 516-518 vil til slutt resultere i et
120 aminosyre langt cystatin C med en signalsekvens på 26 amino-syrerester. Det aktuelle proteinet vil være identisk med cystatin C, isolert fra urin.
Figur 1 illustrerer en sekvenseringsstrategi for humant cystatin C cDNA-innskudd. Innskudd av klonene C12 og C6a ble, som det fremgår av fig. 1, sekvensert fra endene sine ved kjede-terminatormetoden. En "hagle"-sekvenseringsanalyseteknikk ble brukt for å sekvensere begge DNA-trådene i C6a-innskuddene. De horison-tale pilene indikerer retningen og utstrekningen av hver sekvens-analyse. Det proteinkodende området for innskutt C6a er omrammet, og den skraverte delen indikerer det området som koder for modent protein.
Den DNA-strukturen som koder for cystatin C omfatter nukleotider avledet fra aminosyresekvensen for klonen C6a cDNA som koder for humant precystatin C. Nummereringen av nukleotidsekvensen begynner ved det første nukleotidet og fortsetter i retningen fra 5' til 3'. Nummereringen av aminosyren begynner med den første aminosyren i det ferdige proteinet. Aminosyren som er substituert i cystatin C fragmentet som er avsatt som amyloid hos pasienter som lider av arvelig hjerneblødning med amyloidose, er innrammet. Kozak-inititieringen og polyadenylring-signalet er understreket.
EKSEMPEL 2
Cvto<p>lasmatisk ekspresjon av metioninforlenget cystatin C i E. coli
Plasmidet pUC18/C6a som inneholder cDNA-sekvensen for cystatin C ble kuttet med restriksjonsenzymene Ncol/Hindlll, hvorefter plasmidfragmentet ble renset. En syntetisk DNA-linker som inneholder kodesekvensen for aminosyren metionin og de første om lag 40 basene i ferdig cystatin C, ble deretter innført mellom Ncol og Hindlll setene (fig. 2). Istedenfor kodonene som opptrer i cDNA i cystatin C, ble det anvendt kodoner i linkeren som resulterte i høyt proteinutbytte i E.coli. Dette plasmidet ble kuttet med restriksjonsenzymene Clal/EcoRI, hvorefter et fragment og om lag 600 bp inneholdende kodesekvensen for metioninforlenget cystatin C, ble renset.
Plasmidet pHD162 som inneholder en syntetisk promotor og Shine og Dalgarno sekvens ble kuttet med restriksjonsenzymene Clal/EcoRI, hvorefter plasmidfragmentet ble renset. Dette plasmidfragmentet ble deretter kombinert med fragmentet ovenfor på 600 bp for å danne cystatin C ekspresjonsplasmidet pHD2 62 (som koder for metionin cystatin C) (fig. 3). E.coli MC1061 som inneholder ekspresjonsplasmidet ovenfor, ble dyrket som beskrevet nedenfor.
EKSEMPEL 3
Peri<p>lasmatisk ekspresjon av cystatin C i E. coli: Plasmidet pUC18/C6a nevnt i eksempel 2 ble kuttet med restriksjonsenzymene Ncol/Hindlll, hvorefter plasmidfragmentet ble renset. En syntetisk DNA-linker som inneholder kodesekvensen for ytre membranprotein A (OmpA) fra E.coli og de første om lag 40 basene i ferdig cystatin C ble deretter innsatt mellom Ncol og Hindlll setene. Optimale E.coli kodoner ble anvendt. Dette plasmidet ble deretter kuttet med restriksjonsenzymene Clal/EcoRI, hvorefter et fragment på om lag 700 bp inneholdende kodesekvensen for OmpA signalpeptidet og cystatin C ble renset. Fragmentet ovenfor ble deretter innført i et ekspresjonsplasmid inneholdende APR promotoren, en optimal Shine og Dalgarno sekvens, polylinker-regionen fra plasmidet pUC18 og det temperatursensitive CI repressorgenet fra X. Plasmidet pHD313 (fig. 4) som ble dannet herved, ble deretter innført i E.coli MC1061. Ekspresjonen av 3-des-OH-cystatin C og rensingen av polypeptidet ble utført som beskrevet heri.
EKSEMPEL 4
Periplasmatisk ekspresjon av 3- des- OH- cvstatin C i E. coli
Plasmidet pUC18 ble kuttet med Apal/EcoRI, og et fragment på om lag 680 basepar ble renset og ligert til en syntetisk Apal/Clal linker inneholdende kodesekvensen for om lag de første 3 aminosyrene i precystatin C. Fragmentet ble deretter innført i ekspresjonsplasmidet nevnt i eksempel 3, inneholdende den temperatur-induserende APR promotoren.
EKSEMPEL 5 Ekspresjon av periplasmatisk
modifisert 3- des- OH- cvstatin C i E. coli
Et Hindlll/EcoRI fragment på om lag 700 bp ble isolert fra ekspresjonsplasmidet pHD313 (eksempel 3). Fragmentet ble innført i M13 MP18 og eksponert for in vitro mutagenese, slik at kodesekvensen for cystatin C ble forandret til å inneholde en eller flere av modifikasjonene som fremkommer i tabell 1 nedenfor. Etter in vitro mutagense ble flere kloner dyrket og sekvensbestemt. Kloner med korrekt sekvens ble deretter kuttet med Clal/EcoRI, hvorefter et fragment på om lag 7 00 bp ble isolert og innført i ekspresjonsplasmidet pHD313. Plasmidene som ble dannet herved, ble dyrket, og produktet renset som beskrevet ovenfor.
EKSEMPEL 6
Fremstilling av 3-des-OH-cystatin C i teknisk skala ved sats-vis fermentering.
E.coli MC1061 pHD 313-1-1, som uttrykker 3-des-OH-cystatin C med korrekt N-terminal, dyrkes i LB petriskål som inneholder ampicillin. En enkelt koloni overføres til en 100 ml rysteflaske som inneholder LB medium og 50 ml/l ampicillin. Denne inkuberes ved 30°C, 200 rpm i 20 timer.
Fermenteringen utføres i 10 liter laboratoriefermentor under følgende betingelser: pH = 7,2, lufttilførsel = 1 WM, omrøring = 1.000 rpm og temperaturen = 30°C i den første fasen. Det anvendte medium består av gjæreksktrakt, casaminosyrer og forskjellige salter.
Fermentoren inokuleres med 100 ml kultur fra rysteflasken, og doseringen av glukose starter når biomasse-konsentrasjonen er OD525nm=5. Matehastigheten må være 3,5 g glukose pr. liter pr. time, og den opprettholdes gjennom hele prossessen. Dannelsen eiv 3-des-OH-cystatin C settes i gang ved å heve temperaturen i fermentoren til 40°C i vekstfasen (OD525nm= 50) . Cystatin C dannes raskt - 2 timer etter at temperaturen ble hevet, avsluttes fermenteringen ved å senke temperaturen til 20°C og heve pH til 9,0. Hele fermenteringsprossessen varer omlag 12 timer.
Ved denne prossessen oppnås sluttkonsentrasjoner på 3-des-OH-cystatin C på omlag 1000 mg/l (cystatin C utgjør omlag 10% av det totale proteinet i cellen).
Ekstraksjon av cystatin C
Ekstraksjon I av 3-des-OH-cystatin C fra E.coli
Cellesuspensjonen fra fermenteringen blir sentrifugert. Cellene resuspenderes i 20-25% w/w sukrose, 0,1 molar EDTA, 0,2 molar Tris pH 9,0, og omrøres i 2 0 minutter. Cellene fjernes ved sentrifugering, og pelleten resuspenderes raskt i 0°C lOmM Tris pH 9 under kraftig omrysting i 10 minutter.
Supernatanten herifra inneholder cystatin C fra den periplas-matiske fasen (70% av total ekstraksjon ved mekanisk homogenisering).
Ekstraksjon II av 3-des-OH-cystatin C fra E.coli
Cellesuspensjon fra fermenteringen justeres til pH lik 10,5 med 5 molar NaOH. Etter omrøring i 20 minutter sentrifugeres suspensjonen. Supernatanten herifra inneholder cystatin C.
Ekstraksjon III av 3-des-OH-cystatin C fra E.coli
Cellesuspensjon fra fermenteringen sentrifugeres og resuspenderes i 0,5 molar Tris pH = 10,5. Etter omrøring i 20 minutter sentrifugeres suspensjonen. Supernatanten herifra inneholder 3-des-OH-cystatin C.
Ekstraktet dialyseres mot 20 millimolar etanolamin pH = 10,0 med en dialysemembran av typen Spectropor<®>(mw kutt 3500) og underkastes deretter en Q-Sepharose kolonne ekvilibrert i 20 millimolar etanolamin, pH = 10,0. Fraksjoner inneholdende cystatin C (3-des-OH cystatin C) slåes sammen, og konsentreres på et filter av typen Diaflo<®>YM2. Deretter underkastes materialet en kolonne av typen Bio-Gel<®>P60, ekvilibrert i 0,05 molar ammoniumhydrogenkarbonat. Fraksjoner inneholdende 3-des-OH-cystatin C blir oppsamlet. Ved denne isolasjonsprosedyren er utbyttet typisk 50-60%.
EKSEMPEL 7
Konstruksjon av et syntetisk gen som koder for 3- des- OH- cvstatin C ved bruk av optimale E. coli kodoner: Det er kjent fra litteraturen at høyt uttrykte E.coli proteiner gjør bruk av visse kodoner for de individuelle aminosyrene. Samtidig med fremstilling av cDNA for 3-des-OH-cystatin C, ble det syntetisert et cystatin C gen på basis av den publiserte aminosyresekvensen. Genet inneholdt de kodonene som foretrekkes i høyt uttrykte E.coli proteiner. Genet ble også modifisert på en slik måte at det ville tillate en fusjon med signalsekvensen fra enten det ytre membranproteinet A fra E.coli eller signalsekvensen fra fibriaproteinet K88/99 fra E.coli. Etter syntesen ble genet ovenfor trinnvis klonet i plasmidet pUC18. Genet ble deretter isolert og innført i ekspresjonsplasmidet nevnt i eksempel 3 i kombinasjon med en av signalsekvensene ovenfor. Plasmidet ble innført i E.coli MC 1061 og dyrket som beskrevet ovenfor.
OmpA-cystatin C gen med optimale E.coli kodoner.
EKSEMPEL 8
Fremstilling og isolering av 3- des- OH- cystatin C
Bakterimedia- inneholdende 3-des-OH-cystatin C ble sentrifugert, og bakteriefrie media konsentrert på et Diaflo™ YM 2 filter. Det konsentrerte materialet ble dialysert mot 20 millimolar etanolamid, pH 10,0 gjennom Spectrapor™ dialysemembran (mw kutte-grense 3.500) og derefter overført til en Q-Sepharose™ kolonne ekvilibrert i 20 millimolar etanolamin, pH 10,0. Fraksjoner inneholdende 3-des-OH-cystatin C ble slått sammen og konsentrert på et Diaflo™ YM 2 filter. Materialet ble deretter overført til en Bio-Gel™ kolonne ekvilibrert i 0,05 molar ammoniumbikarbonat. Fraksjoner som inneholdt 3-des-cystatin C ble slått sammen. Ved denne isoleringsprosedyren er utbyttet av 3-des-OH-cystatin C typisk 50-60%.
EKSEMPEL 9
Karakterisering av 3- des- OH- cystatin C: 3-des-OH-cystatin C isolert som beskrevet ovenfor fra kultur av pHD 313 transformert E.coli, blekarakterisertfysikalsk-kjemisk med hensyn på biologisk aktivitet. Resultatene fra karakterise-ringen ble sammenlignet med resultater fra tilsvarende analyse av human cystatin C.
Analyse med Ouchterlony's doble immune diffusjonsteknikk viste at alle cystatin C epitopene anerkjent av et polyklonalt antiserum dyrket mot humant cystatin C, også er til stede i 3-dés-OH-cystatin C. Agarosegel elektroforese ved pDH 8,6 og SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser, viste at 3-des-OH-cystatin C og humant cystatin C er identiske med hensyn til ladning og molekylvekt. Aminosyreanalyse viste at aminosyresamménsetningen i 3-des-OH-cystatin C er nesten identisk med aminosyresamménsetningen i humant cystatin C. Automatisert sekvensbestemmelse viste at 3-des-OH-cystatin C har N-terminalsekvensen.
SSPGKPPRLVGGPMDASVEEEGV--ALDFAVGEYNKASNDMY i hver posisjon identisk med den som ble funnet i humant cystatin C (konferer referanse 1) og i tillegg at 100% av prolinresten i posisjon 3 i 3-des-OH-cystatin C manglet en hydroksygruppe. Aminosyreanalyse av disulfidbundne peptider viste at 3-des-OH-cystatin C har disulfid-broer mellom Cys<73->Cys83 og Cys<73->Cys<83>, det vil si det samme som er tilfelle i humant cystatin C (konferer referanse 15).
Biologisk aktivitet i 3-des-OH-cystatin C bestemmes ved titrering mot konsentrasjonsbestemt papain. 3-des-OH-cystatin C var 83% aktiv, som er høyere enn de tilsvarende tall for humant cystatin C (55%). Styrken av bindingen 3-des-OH-cystatin C på cysteinproteinasene papain (EC 3.4.22.2), cathepsin B (EC 3.4.22.1) og dipeptidyl peptidase I (EC 3.4.14.1) ble bestemt. Likevektskonstanten for dissosiasjon av 3-des-OH-cystatin C enzymkomplekset (< 0,005 nanomol, 0,50 nanomol og 3,5 nanomol) var innenfor den eksperimentelle feilgrensen identisk med likevektskonstanten for humant cystatin C enzymkomplekset (< 0,005 nanomol, 0,27 nanomol og 3,5 nanomol).
Fysikalsk-kjemisk karakterisering og analyse utført av den gjensidige påvirkningen mellom 3-des-OH-cystatin og cystein-proteinaser, viser at 3-des-OH-cystatin C har full biologisk aktivitet, og er identisk med humant cystatin C med det unntak at det fullstendig mangler hydroksylgruppen på rest 3.
EKSEMPEL 10
Terapeutisk anvendelse av 3- des- OH- cystatin C som CNS- beskyttelsesmiddel ved chymopapain- behandlinq av isjias
Straks før chymopapainbehandling av pasienter med isjias injiseres i den cerebrospinale væsken en molar mengde av 3-des-OH-cystatin C som er tre ganger høyere enn den molare mengden av chymopapain som skal anvendes. For eksempel, dersom 8 mg chymopapain (den aktive komponenten i de nå tilgjengelige medikamentene: Discase<®>; Travenol Laboratories Ltd., Thetford, UK og Chymodiactin<®>; Smith Laboratories, Inc., Rosemont, IL, USA) skal anvendes for intradiskal injeksjon, injiseres 12 mg av 3-des-OH-cystatin C i den cerebrospinale væsken. 3-des-OH-cystatin C kan være sammensatt av 5 mg 3-des-OH-cystatin C pr. ml steril fysiologisk saltløsning. Dette vil beskytte mot eventuelle sidevirkninger på grunn av proteolytisk nedbrytning av nervevev forårsaket av ukorrekt injeksjon av chymopapain i den cerebrospinale væsken.
Alternativt, dersom kliniske eller radiografiske sicjnaler på ukorrekt chymopapaininjeksjon i den cerebrospinale væsken blir observert ved, eller etter, utførelsen av den tilsiktede intra-diskale chymopapaininjeksjonen, blir en molar mengde av 3-des-OH-cystatin C som er tre ganger høyere enn den molare mengden av chymopapain som anvendes, umiddelbart injisert i den cerebrospinale væsken for å hemme den vevsødeleggende virkningen av chymopapain. Direkte etter injeksonen av 3-des-OH-cystatin C blir pasienten forsiktig beveget på en måte som fører til en rask fordeling av den injiserte løsningen av 3-des-OH-cystatin C i den cerebrospinale væsken hos pasienten.
EKSEMPEL 11
Sammenligning av den biologiske aktivitet
av 3- des- OH- cystatin C med cystatin C av human opprinnelse.
Den papain-inhiberende kapasitet av rekombinant 3-des-OH-cystatin C fremstilt ifølge oppfinnelsen ble sammenlignet med den tilsvarende aktivitet til humant cystatin C.
Humant cystatin C ble isolert fra urin fra pasienter med blandet glomerulær-tubulær proteinuri ved ultrafiltrering, ione-bytterkromatografi og gelfiltrering som beskrevet i litteraturen (ref. 2,3) og lyofilisert. Ialt 10 forskjellige preparater av dels humant cystatin C, dels 3-des-OH-cystatin C, ble testet for sin cystein-proteinase-inhiberende kapasitet. Cystatin C og 3-des-OH-cystatin C preparatene utvunnet henholdsvis av human urin og fremstilt ved rekombinant teknikk, ble hver for seg oppløst i 0,15 mol/l ammoniumbikarbonat. Cystatin C konsentrasjoner av de resulterende løsninger ble bestemt fysikalsk kjemisk og ved immun-diffusjon og kvantifisering av aminosyrer frigitt ved hydrolyse i 6 mol/l HC1. Cystein-proteinase-inhiberingskapasiteten til disse løsninger ble bestemt ved tilsetning av en løsning av isolert papain (ref. 4), som er en plantecystein-proteinase, som generelt anvendes som en modell for cystein-proteinase, og deretter ble den resterende proteolytiske aktivitet av de dannede blandinger bestemt.
Cystein-proteinase-aktivitetene til papainløsningen og cystatin C-papainblandingene ble bestemt ved anvendelse av substratet Z-Phe-Arg-NHMec (ref. 5). Den molare konsentrasjon av aktivt enzym i papain-løsningene ble bestemt ved hjelp av den irreversible papain-inhibitor E-64 (ref. 6).
De molare inhibitor-kapasiteter til de forskjellige preparater av cystatin C ble beregnet som forholdet mellom papain-inhibitor-kapasiteten til cystatin C-løsningene, idet 1 mol cystatin C antas å inhibere 1 mol papain, hvorved den molare konsentrasjon av cystatin C i løsningene er målt ved fysikalsk-kjemiske eller immunokjemiske metoder under forutsetning av en molekylvekt på 13343 for cystatin C. Målt på denne måten oppnådde man molar inhiberende kapasitet til cystatin C isolert fra human urin på 5-55%, mens den inhi-bitoriske kapasitet til flere prøver av rekombinant 3-des-OH-cystatin C lå i området 83-98%. Det fremgår herav at den biologiske potens til alle undersøkte preparater av rekombinant 3-des-OH-cystatin C vesentlig overstiger den biologiske potens til alle cystatin C preprater som er isolert fra humane biologiske væsker.
EKSEMPEL 12
Terapeutisk anvendelse av rekombinant 3- des- OH- cystatin C som et CNS- beskvttende middel ved chymopapain- behandling av sciatica
Umiddelbart før chymopapainbehandling av pasienter med sciatica ble en molar mengde 3-des-OH-cystatin C, 3 ganger høyere enn den anvendte molare mengde chymopapain, injisert i den cerebrospinale væske. Hvis f.eks. 8 mg chymopapain (den aktive komponent i de for tiden tilgjengelige legemidler: Discase<®>; Travenol Laboratories Ltd., Thetford, UK and Chymodiactine<®>; Smith Laboratories, Inc., Rosemont, IL, USA) skal anvendes til intradiscal injeksjon, injiseres 12 mg 3-des-OH-cystatin C i den cerebrospinale væske. Injeksjonspreparatet kan være sammensatt av 5 mg 3-des-OH cystatin C pr. ml steril fysiologisk saltoppløsning. Dette vil beskytte mot enhver bivirkning som skyldes proteolytisk nedbrytning av nervevev forårsaket av feilaktig injeksjon av chymopapain i den cerebrospinale væske.
Hvis kliniske eller radiografiske tegn på feilaktig chymopapaininjeksjon i den cerebrospinale væske i stedet iakttas ved eller etter utførelse av den tilsiktede intradiscale chymopapaininjeksjon, anvendes en molar mengde 3-des-OH-cystatin C, som er tre ganger høyere enn den molare mengde av det anvendte chymopapain, og det injiseres straks i den cerebrospinale for å inhibere den vevs-skadende virkning av chymopapain. Umiddelbart etter injeksjon av 3-des-OH-cystatin C blir pasienten utsatt for en viss bevegelse for å sikre en hurtig fordeling av den injiserte oppløsning av 3-des-OH-cystatin C med den cerebrospinale væske hos pasienten.
EKSEMPEL 13
I overensstemmelse med eksempel 5 ble de følgende fem mutanter av 3-des-OH-cystatin C med mutasjoner innenfor området aminosyre 8 til aminosyre 11 "RLVG" fremstilt ved:
1. Val 10 ble endret til Gly : RLGG
2. Leu 9 ble endret til Gly : RGVG
3. Arg 8 ble endret til Gly : GLVG
4. Val 10 og Leu 9 ble endret til Gly : RGGG
5. Val 10, Leu 9 og Arg 8 ble endret til
Gly : GGGG
De fem mutanter ble sammen med ikke-mutert 3-des-OH-cystatin C undersøkt med hensyn til deres inhiberende virkning overfor fire forskjellige enzymer: Cathepsinerne B,L,S og H. Ved undersøkelsen ble "Equilibrium constants" (Ki) uttrykt i nanomol/liter, bestemt i det enkelte tilfelle. Metoden er angitt i "A. Hall et al., Biochem J (1993) 291, 123-129".
Følgende resultater ble oppnådd:
Av resultatene ovenfor fremgår det at de undersøkte mutanter har biologisk aktivitet.
Litteratur
1. Grubb, A & Lofberg, Lt: Proe. Nati. Acad. Sei. 79, 3024-3027, 1982
2. Abrahamson M, Barrett A J, Salvesen G, Grubb A,
J. Biol. Chem. 1986; 261 (24): 1182-9. 3. Abrahamson M, Ritonja A, Brown M A, Grubb A, Machleidt W,
Barrett A J, Biol. Chem. 1987; 262 (20): 9688-94.
4. Barrett A J, Biochem. Sei. 1987; 12 (5): 193-6.
5. Barrett A J, Fritz H, Grubb A, Isemura S, Jarvinen M, Katunuma N, Machleidt W, Muller Esterl W, Sasaki M, Turk V,
Biochem. J. 1986; 236 (1): 312.
6. Buttle D J, Abrahamson M, Barrett A J,
Spine 1986; 11 (7): 688-94
7. Delaissé J M, Eeckhout Y, Vaes G,
Biochem Biophys Res. Commun 1984; 125 (2): 441-7.
8. Ford L T, Clin Orthop 1969; 67: 68-71.
9. Garvin P J, Jennings R B, Smith L, Gesler R M,
Chymopapain, Clin Orthop 1965; 41: 204-23.
10. Grubb A, Jensson O, Gudmundsson G, Arnason A, Lofberg H,
Malm J, N Engl J Med 1984; 311 (24); 1547-9.
11. Grubb A, Grimsberg V, Grubb A,
Acta Neurol Scand 1986; 73: 309-310.
12. Jensson 0, Gudmundsson G, Arnason A, Blondal H, Petrusdottir I, Thorsteinsson L, Grubb A, Lofberg H, Cohen D,
Frangione B, Acta Neurol Scand 1987; 76: 102-14.
13. Nachemson A L, Rydevik B,
Acta Orthop Scand 1988; 59 (1): 56-62.
14. Grubb A, Acta Orthop Scand 1988; 59 (1): 63-65.
15. Grubb A, Lofberg H & Barrett A,
J FEBS Lett. 170: 370-374, 1984.
16. Ghiso J, et al.,
Proe. Nati. Acad. Sei. (1986), vol. 83: 2974-2978.
Claims (5)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav med i det vesentlige den samme biologiske aktivitet,karakterisert vedat en vertsorganisme transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende en DNA-sekvens med strukturen:
eller en modifisert form derav i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonregulerende sekvenser, og en seleksjonsmarkør dyrkes i et egnet vekstmedium, og at det dannede 3-des-hydroksy-cystatin C eller den forut definerte homolog derav deretter utvinnes fra kulturen.
2. Plasmid for innføring i en vertsorganisme som anvendes til biosyntetisk fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav med i det vesentlige de samme biologiske egenskaper,karakterisert vedat det inneholder DNA-strukturen:
eller en modifisert form derav i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser samt signalsekvens fra OmpA eller preCystatin, og seleksjonsmarkørsekvens som muliggjør ekspresjon i en egnet vertscelle.
3. Mikroorganisme,karakterisert vedat den inneholder et plasmid som angitt i krav 2.
4. Mikroorganisme ifølge krav 3,
karakterisert vedat den er en bakterie.
5. Mikroorganisme ifølge krav 4,
karakterisert vedat bakterien er E. coli.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK260987A DK260987D0 (da) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Fremgangsmaade til fremstilling af et humant protein samt dna-sekvens til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden |
| PCT/DK1988/000082 WO1988009384A1 (en) | 1987-05-22 | 1988-05-20 | Method of producing cystatin c or modifications hereof and dna-sequence for use when carrying out the method |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO890260L NO890260L (no) | 1989-01-20 |
| NO890260D0 NO890260D0 (no) | 1989-01-20 |
| NO301985B1 true NO301985B1 (no) | 1998-01-05 |
Family
ID=8113675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO890260A NO301985B1 (no) | 1987-05-22 | 1989-01-20 | Fremgangsmåte for fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav, plasmid samt mikroorganisme for anvendelse ved utförelse av fremgangsmåten |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0362259B1 (no) |
| JP (1) | JP3011274B2 (no) |
| AT (1) | ATE135049T1 (no) |
| AU (1) | AU619750B2 (no) |
| CA (1) | CA1340862C (no) |
| DE (1) | DE3855078T2 (no) |
| DK (1) | DK260987D0 (no) |
| ES (1) | ES2013337A6 (no) |
| FI (1) | FI102191B1 (no) |
| IL (1) | IL86476A (no) |
| NO (1) | NO301985B1 (no) |
| WO (1) | WO1988009384A1 (no) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2002820A1 (en) * | 1988-11-18 | 1990-05-18 | Kazunori Hanada | Pharmaceutical use for cystatins |
| GB9122051D0 (en) * | 1991-10-17 | 1991-11-27 | Univ Nottingham | Medicines |
| GB9403819D0 (en) * | 1994-02-28 | 1994-04-20 | Univ Leeds | Control of parasites |
| RU2182598C2 (ru) * | 1994-11-21 | 2002-05-20 | Новартис Аг | Модифицированные ингибиторы протеиназы |
| AU738766B2 (en) * | 1994-11-21 | 2001-09-27 | University Of Leeds, The | Modified proteinase inhibitors |
| EP0842187A4 (en) * | 1995-06-05 | 2000-04-12 | Human Genome Sciences Inc | HUMANCYSTANIN E |
| US6011012A (en) | 1995-06-05 | 2000-01-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Human cystatin E |
| EP1123399A2 (en) * | 1998-08-05 | 2001-08-16 | The University Of British Columbia | Production and use of modified cystatins |
| US6436389B1 (en) * | 1998-12-11 | 2002-08-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Stimulation of cell proliferation by glycosylated cystatin C |
| EP1176200A3 (de) | 2000-06-20 | 2005-01-12 | Switch Biotech Aktiengesellschaft | Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen |
| EP2880994B1 (en) * | 2012-07-31 | 2017-06-28 | Megmilk Snow Brand Co. Ltd. | Novel protein material |
| CN102895658A (zh) * | 2012-08-23 | 2013-01-30 | 苏州大学附属第一医院 | Cystatin C在治疗蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛的应用 |
| CN106119286A (zh) * | 2016-08-10 | 2016-11-16 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 表达载体及其高效表达和制备人胱抑素c蛋白的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
-
1987
- 1987-05-22 DK DK260987A patent/DK260987D0/da not_active Application Discontinuation
-
1988
- 1988-05-20 JP JP63504682A patent/JP3011274B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-20 EP EP88904935A patent/EP0362259B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-20 DE DE3855078T patent/DE3855078T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-20 ES ES8801999A patent/ES2013337A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-20 AT AT88904935T patent/ATE135049T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-05-20 AU AU19399/88A patent/AU619750B2/en not_active Expired
- 1988-05-20 WO PCT/DK1988/000082 patent/WO1988009384A1/en active IP Right Grant
- 1988-05-23 IL IL8647688A patent/IL86476A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-05-24 CA CA000567916A patent/CA1340862C/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-01-20 NO NO890260A patent/NO301985B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-11-21 FI FI895553A patent/FI102191B1/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3855078T2 (de) | 1996-07-18 |
| JP3011274B2 (ja) | 2000-02-21 |
| WO1988009384A1 (en) | 1988-12-01 |
| IL86476A0 (en) | 1988-11-15 |
| AU619750B2 (en) | 1992-02-06 |
| FI895553A0 (fi) | 1989-11-21 |
| IL86476A (en) | 1994-01-25 |
| ES2013337A6 (es) | 1990-05-01 |
| JPH03501201A (ja) | 1991-03-22 |
| EP0362259B1 (en) | 1996-03-06 |
| ATE135049T1 (de) | 1996-03-15 |
| NO890260L (no) | 1989-01-20 |
| EP0362259A1 (en) | 1990-04-11 |
| DK260987D0 (da) | 1987-05-22 |
| AU1939988A (en) | 1988-12-21 |
| NO890260D0 (no) | 1989-01-20 |
| FI102191B (fi) | 1998-10-30 |
| DE3855078D1 (de) | 1996-04-11 |
| CA1340862C (en) | 1999-12-28 |
| FI102191B1 (fi) | 1998-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6962801B2 (en) | Protein for blocking platelet adhesion | |
| JPH0687778B2 (ja) | ヒト抗トロンビン▲ｉｉｉ▼ | |
| NO301985B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av 3-des-hydroksy-cystatin C eller en homolog derav, plasmid samt mikroorganisme for anvendelse ved utförelse av fremgangsmåten | |
| NO301480B1 (no) | Fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av basisk fibroblastfaktor | |
| US5332804A (en) | High molecular weight human angiogenic basic fibroblast growth factors | |
| Nilsson et al. | A signal peptide with a proline next to the cleavage site inhibits leader peptidase when present in a sec‐independent protein | |
| EP0687731B1 (en) | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism | |
| JPH01104178A (ja) | エンケファリナーゼの製造方法、アッセイ法およびそれを含有する医薬組成物 | |
| JP2000074922A (ja) | シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質ｆ | |
| US5432264A (en) | Recombinant 3-des-OH-cystatin C produced by expression in a procaryotic host cell | |
| JPH05506646A (ja) | ヒト・フォンビルブラント因子のクローニング及び製造、並びにその使用方法 | |
| McILHINNEY et al. | Characterization of a polyhistidine‐tagged form of human myristoyl‐CoA: protein N‐myristoyltransferase produced in Escherichia coli | |
| AU645055B2 (en) | Covalent angiogenin/RNase hybrids | |
| CA1339875C (en) | Modified human psti | |
| CN101173003A (zh) | 尖吻蝮蛇毒凝血酶原激活剂、其编码序列及用途 | |
| US7993893B2 (en) | Haemocoagulase | |
| US5188943A (en) | Method of producing high molecular weight human fibroblast growth factors | |
| WO1994029448A1 (fr) | Adn et proteine codee par celui-ci | |
| Isono et al. | Mutation leading to gene fusion in the histidine operon of Salmonella typhimurium | |
| TW200906433A (en) | Therapeutic agent for acute hepatitis or prophylactic and/or therapeutic agent for fulminant hepatitis | |
| EP0322084A2 (en) | Tumor cell inhibition factor | |
| NO864442L (no) | Mutantkodende sekvens. | |
| RU2130071C1 (ru) | Вектор секреции для получения гирудина hv1 (варианты), рекомбинантный штамм escherichia coli - продуцент гирудина hv1 и способ его получения | |
| DK164283B (da) | Polypeptid med cystatin c aktivitet, dna-sekvens til udtrykkelse af 3-des-oh-cystatin c eller en modifikation deraf, fremgangsmaade til fremstilling af 3-des-hydroxy-cystatin c eller en modifikation deraf, plasmid og mikroorganisme til udoevelse af fremgangsmaaden og anvendelse af 3-des-oh-cystatin c eller en modifikation deraf til fremstilling af et terapeutisk praeparat | |
| RU2106408C1 (ru) | Аналог гирудина, днк, вектор, способ получения аналога гирудина |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |