CN102895658A - Cystatin C在治疗蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Cystatin C在制备用于治疗脑血管痉挛的药物组合物中的应用。通过动物实验证实Cystatin C能诱导自噬在基底动脉壁的高表达，对SD大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛有防治作用，并且这种作用与Cystatin C浓度存在正相关性。Cystatin C对SAH后脑血管痉挛具有显著抑制的效果，可以用来改善SAH后脑血管痉挛。

Description

Cystatin C在治疗蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛的应用

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及一种Cystatin C在治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的应用。 

背景技术

自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的年发病率约6～16/100000人，约占脑卒中总发病率的6～8%，颅内动脉瘤破裂是自发性SAH的主要原因。脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)是蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)后常见而危险的并发症，常可引起严重的脑组织缺血或迟发性缺血性脑损害，甚至导致脑梗死，是致死或致残的主要原因之一。有研究表明，动脉瘤性SAH发病后，约30%-70％的患者产生血管造影显示的血管痉挛，其中20％～30％的患者出现临床症状，虽经积极治疗，有症状的患者中仍有32％～67％出现脑梗死，最终15％～20％会因卒中致残或因缺血而死亡。近年来国内外学者在血管痉挛和SAH的治疗方面取得了一定的进展，使脑血管痉挛的病死率和致残率大为降低。但目前引起脑血管痉挛的确切发病机制仍未明确，各种治疗方法均不甚理想，因此如何防治CVS是降低SAH后致残率和致死率的关键。 

动脉瘤性SAH后CVS的确切病理机制目前仍不十分清楚，治疗上也因此缺乏针对性。临床上对于SAH后CVS的防治方法主要有手术清除血凝块、脑脊液持续外引流等预防措施和3H治疗、钙离子拮抗剂的应用等治疗措施，但效果均不理想。由于CVS是多因素、多种机制综合作用的结果，因而防治的关键在于能够同时针对不同的机制逆转其发生和发展的过程。现阶段亟需一种能够控制动脉瘤性SAH后CVS的治疗手段来减轻脑血管痉挛的影响。 

Cystatin C是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3KD，由120个氨基酸残基组成,等电位9.3，由CST3基因编码，为半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员，也称为胱抑素C，γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，可由机体所有有核细胞产生，无组织学特异性，产生率恒定。Cystatin C广泛存在于人类的体液中，在脑脊液中浓度最高，约占2～4％，是血液中的5.5倍。Cystatin C在生理条件下的重要功能是抑制内源性的半胱氨酸蛋白 酶（包括组织蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等）的活性。 

脑脊液中的Cystatin C主要来源于神经胶质细胞、神经元和脉络丛。Cystatin C因其分子量小，能自由通过肾小球滤过膜，几乎完全被肾小管重吸收且不被分泌，其血中浓度不受炎症、肌肉量、肾小管分泌因素的影响，因此，能替代肌酐成为一种新的反映GFR的理想标志物而在临床上得到了广泛的应用。除此之外，Cystatin C在生理条件下的重要功能是抑制内源性的半胱氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等）的活性。 

它在机体中有着广泛的生物学作用，可以阻止死亡细胞或恶性细胞漏出的细胞内酶对周围组织的破坏，并具有促生长活性、炎症下调、抗病毒、抗细菌等功能。它参与了众多各式各样的疾病的进程，如肿瘤、肾病、糖尿病、癫痫、神经变性疾病等。有研究证明它在一些神经系统疾病中具有神经保护功能：如遗传性大脑淀粉样血管病、短暂性前脑缺血、脑梗塞和癫痫症等。Tizon等实验证明，外源性Cystatin C通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路诱导自噬，从而对小鼠皮质神经元起到保护作用，而Cystatin C的神经保护作用可被3-MA（3-甲基腺嘌呤，一种自噬阻断剂）阻断，认为Cystatin C通过诱导自噬在脑保护中起重要作用。 

目前针对SAH后自噬的作用主要集中在早期脑损伤方面，但Cystatin C对颅内血管痉挛是否有防治作用，目前尚无相关文献报道。本发明因此而来。 

发明内容

本发明目的在于提供一种Cystatin C在治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的新用途，揭示了一种蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的新治疗途径。 

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是： 

一种Cystatin C在制备用于治疗脑血管痉挛的药物组合物中的应用。 

优选的，所述脑血管痉挛为蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛。 

优选的，所述药物组合物包含药学上有效量的Cystatin C和药学上可接受的载体。 

优选的，所述脑血管痉挛为动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛。 

本发明技术方案通过枕大池注药法来研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C）能否对SD大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑血管痉挛有防治作用，并测定LC3和Beclin-1等自噬指标来研究这种作用与自噬的相关性，以期为探讨蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的作用机制及治疗提供更多的理论依据。 

本发明通过SD大鼠蛛网膜下腔出血后自噬在基底动脉壁的表达情况，研究经枕大池注入半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C，CysC）对SD大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑血管痉挛的干预作用，并分析其与自噬的相关性。 

本发明采用五十只SD大鼠随机分为对照组（A组）、蛛网膜下腔出血组（B组）、安慰剂组（C组）、Cystatin C低浓度治疗组(DL组)和CystatinC高浓度治疗组（DH组），每组10只。各组动物均在全麻下行常规手术操作，SAH组、安慰剂组和Cystatin C治疗组的动物取自体非抗凝股动脉血0．3ml注入枕大池即一次注血法制作SAH动物模型，而对照组经枕大池注入0．3ml生理盐水，安慰剂和治疗组在枕大池注血前30分钟分别注入生理盐水0.1ml和Cystatin C水溶剂0.1ml（其中低浓度和高浓度组剂量分别为2μg/0.1ml和10μg/0.1ml）。各组于术后48小时处死动物取脑基底动脉及周围脑干组织行病理检查，测定基底动脉血管内径周长和血管壁厚度，应用自噬标记抗体LC3和Beclin-1对各组基底动脉组织进行免疫组化和Western blot检测。采用单因素方差分析对各组数据进行统计分析。 

结果表明，SAH组和安慰剂组中大鼠基底动脉内径周长较对照组明显缩短（P＜0.01），血管壁厚度明显增加（P＜0.01），管腔狭窄，内膜皱褶，平滑肌细胞肥大；CysC治疗组中基底动脉内径周长增大，管壁增厚程度减轻，与SAH组对比有显著性差异（P＜0.01），在高浓度治疗组更明显，与低浓度组相比有统计学意义（P＜0.05）。免疫组化显示，在对照组中基底动脉的内膜、中膜只可观察到极少数的LC3和Beclin-1阳性表达，在SAH和安慰剂组中LC3和Beclin-1阳性的表达增加，在低浓度和高浓度治疗组内膜和中膜可观察到大量LC3和Beclin-1阳性表达，外膜也可见到散在的染色信号。Western blot结果显示LC3和Beclin-1在对照组是低表达的，而在SAH组及安慰剂组表达明显增高，其LC3/GAPDH、Beclin-1/GAPDH值与 对照组比较，P＜0.05。而在CysC治疗组，LC3和Beclin-1的表达进一步增高，以CysC高浓度组更明显，与SAH组比较，P＜0.01，与CysC低浓度组相比，P＜0.05。 

本发明中，可将本发明中的Cystatin C采用本领域常规的方法制备成适用于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将Cystatin C制备成适用于胃肠道给药的药物制剂，其制剂形式可以为常规片剂或胶囊剂或控释、缓释制剂。在本发明中Cystatin C药物组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式或制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1%~99%，优选为10%~90%；本发明所述的药学上可接受的载体为组合物中制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明活性成分发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提，所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。 

本发明中，组合物的制备方法没有限制，Cystatin C直接做成制剂，或者分别或/和辅料混合后做成制剂，然后安装本领域常规的方式进行包装，与其他辅料混合制成制剂。本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。 

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是： 

本发明通过构建大鼠枕大池一次注血模型，能够观察到基底动脉发生明显的细胞形态改变、管壁的增厚以及管腔的狭窄，提示SAH后存在CVS。由于自噬在正常大鼠基底动脉壁的表达是低水平的。而SAH后自噬在基底动脉壁的表达上调，提示自噬可能参与了CVS的病理过程。经枕大池注入Cystatin C能诱导自噬在基底动脉壁的高表达，对SD大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛有防治作用，并且这种作用与Cystatin C浓度存在正相关性。Cystatin C对SAH后脑血管痉挛具有显著抑制的效果，可以用来改善SAH后脑血管痉挛。 

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 

图1为A组的大鼠基底动脉血管的HE染色检查； 

图2为B组的大鼠基底动脉血管的HE染色检查； 

图3为C组的大鼠基底动脉血管的HE染色检查； 

图4为DL组的大鼠基底动脉血管的HE染色检查； 

图5为DH组的大鼠基底动脉血管的HE染色检查； 

图6为各组SD大鼠基底动脉内径周长直方图（单位：μm）； 

图7为各组SD大鼠基底动脉管壁厚度直方图（单位：μm）； 

图8为各组SD大鼠基底动脉Western blot检查结果； 

图9为各组SD大鼠基底动脉LC3和Beclin-1表达的变化（/GAPDH）。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 

实施例Cystatin C对SAH后脑血管痉挛的影响 

一、试验 

1.1实验对象 

健康SD大鼠（Sprague-Dawley rat）50只，雄性，体重300~350g，清洁级，由苏州大学实验动物中心提供。喂养条件如下：五只一笼，室温20℃左右，湿度50-60%，通风良好，自由摄食摄水，术前禁食12小时但不禁水。 

1.2主要试剂和仪器 

1.2.1常规试剂 

Cystatin C（100μg，人尿提纯，Enzo Life Sciences，瑞士）、4%多聚甲醛、PBS液，安尔碘，DAB显色剂、生理盐水、蒸馏水、10%水合氯醛、无水酒精。 

1.2.2HE及免疫组化试剂 

苏木素伊红(HE)染色试剂盒(武汉博士德公司)，内有苏木素染色液和伊红染色液。 

二步法兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒（上海拜力生物科技有限公司），主要成分为：A液（ChemMate^TMEnVision＋/HRP），B液（DAB缓冲稀释液），C液（DAB原液）。 

抗Beclin-1和抗LC3抗体-一抗（北京博奥森生物技术有限公司）。 

1.2.3实验设备 

石蜡切片机（Leica 3215，德国）、自动脱水机（Leica 1020，德国）、石蜡包埋机（BMJ-III，中国，常州）、Olympus BX40型光学显微镜、图像摄影软件（LOGENE-I Path PRT诊断报告工作站）、液氮罐（成都金凤液氮容器有限公司）、大鼠实验操作台（苏州大学附属第一医院脑神经研究室提供）、医用冰箱(青岛海尔公司)、手术器械一套等。 

1.3实验分组及动物模型的制作 

1.3.1实验分组： 

选择健康雄性SD大鼠50只，随机分为A、B、C、DL、DH 5组，每组10只。 

A组：（对照组）暴露环枕筋膜及股动脉，穿刺枕大池释放脑脊液0.3ml，取0.3ml生理盐水缓慢注入枕大池，头低30°俯卧位30min，然后缝合伤口。 

B组：（SAH组）暴露环枕筋膜及股动脉，穿刺枕大池释放脑脊液0.3ml，取自体非抗凝股动脉血0.3ml缓慢注入枕大池，头低30°俯卧位30min，然后缝合伤口。 

C组：（SAH+安慰剂组）暴露环枕筋膜及股动脉，穿刺枕大池释放脑脊液0.3ml，经枕大池注入生理盐水0.1ml，30分钟后取自体非抗凝股动脉血0.3ml缓慢注入枕大池，头低30°俯卧位30min，然后缝合伤口。 

DL组：（SAH+低浓度药物组）暴露环枕筋膜及股动脉，穿刺枕大池释放脑脊液0.3ml，经枕大池注入Cystatin C水溶液0.1ml（浓度为2μg/0.1ml），30分钟后取自体非抗凝股动脉血0.3ml缓慢注入枕大池，头低30°俯卧位30min，然后缝合伤口。 

DH组：（SAH+高浓度药物组）暴露环枕筋膜及股动脉，穿刺枕大池释放脑脊液0.3ml，经枕大池注入Cystatin C水溶液0.1ml（浓度为10μg/0.1ml），30分钟后取自体非抗凝股动脉血0.3ml缓慢注入枕大池，头低30°俯卧位30min，然后缝合伤口。 

1.3.2术前准备： 

SD大鼠，电子称重仪，安尔碘，手术刀、剪、镊和拉钩，1ml、5ml注射器，24G静脉留置套管针，10%水合氯醛，500ml容器+输液管，托盘， 4%中性多聚甲醛，生理盐水。 

1.3.3手术步骤： 

根据Gules法[Gules I,Satoh M,Clower B R,et al.Comparison of three rat models of cerebral vasospasm[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,283(6):H2551-H2559]经枕大池一次注血制备大鼠SAH模型： 

手术前12小时对SD大鼠禁食不禁饮，术前4小时禁饮，10％水合氯醛按0.4ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，颈枕交界区和腹股沟区备皮、消毒。大鼠俯卧位，于枕外隆突以下约0.5cm正中直切口，钝性分离，逐步暴露枕骨、环椎及环枕膜，大鼠改仰卧位，于腹股沟区剪开长约lcm大小切口，暴露、分离出股动脉，并置人24G留置针。大鼠改为俯卧位，用1ml注射器针头刺破环枕膜并稍稍向前推进至枕大池，回抽并释放清凉脑脊液约0.3m，用1ml注射器采集0.3ml未抗凝股动脉血后即缓慢注入枕大池。注射完毕后用明胶海绵封堵穿刺孔，用庆大霉素冲洗伤口并逐层缝合。然后，大鼠头低位30°约30min，以利于血液广泛分布于颅底蛛网膜下隙中。模型制作完毕。 

各组除枕大池注射内容物不同外，其它步骤都一致。将实验动物保温复苏后给予喂水喂食。并进行一般情况与行为学观察。 

1.4标本采集 

各组实验动物均于术后48h，腹腔注射10％水合氯醛过量麻醉大鼠，仰卧位固定于鼠台上，开胸暴露心脏，经心尖向升主动脉插管灌注，后剪开右心耳，先用生理盐水250ml加压冲洗约20分钟至冲洗液变为无色，再用250ml 4％中性多聚甲醛溶液灌注，至动物四肢抽搐，变硬。断头取脑。每组10只标本中随机选择5只取基底动脉部位存放于液氮罐中用于Westernblot检测，另5只取脑干标本在4％多聚甲醛溶液中固定24小时，固定后冠状切取包括基底动脉中上段脑组织3mm，石蜡包埋后，作HE染色及免疫组化分析。 

1.5HE染色 

主要试剂是苏木素伊红(HE)染色试剂盒(武汉博士德公司)，内有苏木素染色液和伊红染色液。 

HE染色步骤： 

(1)将石蜡切片在二甲苯脱蜡10分钟，2次。 

(2)切片脱蜡后，依次过100％，100％，95％，90％，85％的酒精至水，每缸各10分钟。 

(3)流水冲洗切片3分钟后，在苏木素燃料中染色3分钟，再用流水冲洗2分钟。 

(4)1％盐酸酒精分化20秒，再流水冲洗3分钟。 

(5)10％的稀氨水溶液中反蓝30秒，蒸馏水冲洗1分钟。 

(6)在伊红溶液中染色3分钟，流水冲洗1分钟。 

(7)依次过85％，90％，95％，100％，100％的酒精脱水。 

(8)在二甲苯溶液中透明2分钟，3次，后用流水冲洗1分钟。 

(9)用封片胶封片。 

1.6免疫组化染色检测LC3和Beclin-1 

ChemMate^TMEnVision＋/HRP/DAB，兔/鼠二步法染色步骤： 

(1)常规脱蜡水化：将已在烤箱中干燥过的石蜡切片浸于二甲苯中10分钟，三次。取出切片置于100％无水乙醇中10分钟两次；依次置入90％－70％各级酒精各3分钟。取出置于蒸馏水中。 

(2)抗原修复：切片置于10mmol/L的柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波炉加热（温度95℃）30min，自然冷却至室温，PBS液冲洗3次，每次3分钟。 

(3)取出蒸馏水中的切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加3％过氧化氢，避光孵育15分钟。蒸馏水冲洗，再将切片置入PBS缓冲液中，浸泡5分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体，平放于湿盒中。 

(4)滴加100微升抗Beclin-1和抗LC3亲和纯化兔抗体（一抗）于组织上，室温孵育30分钟。用PBS冲洗切片3次，每次3分钟，取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体，平放于湿盒中。 

(5)滴加100微升A液（ChemMateTMEnVision＋/HRP）（二抗）于组织上，室温孵育30分钟。用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体，平放于湿盒中。 

(6)滴加预备好的显色剂DAB工作液100微升。室温孵育30分钟。显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。 

(7)各级酒精（70%-100％）脱水，每级3分钟。取出切片置入二甲苯5分钟，三次。 

(8)用封片胶封片。 

1.7Western blot检测LC3和Beclin-1 

1.7.1主要仪器： 

玻璃匀浆器(宁波新芝DY89-1)、高速离心机（湖南湘仪H1650-W）、分光光度仪（上海欣茂UV-7504）、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置（上海天能生物）、电泳仪（北京君意JY300C）、多用脱色摇床（苏州捷美SYC-2101）。 

1.7.2主要试剂： 

单去污剂裂解液（北京普利莱生物）、一抗LC3，BECN1（北京博奥森）、预染蛋白(Fermentas)、HRP二抗（GenScript）、内参一抗（GenScript）、0.01mol/L PBS(pH7.3)、12％分离胶、6％浓缩校、0.15mol/LNaCl溶液、5XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、TBST、TBS、TEMED、显影液、定影液、化学发光试剂。 

1.7.3Western blot检测步骤： 

①灌胶与上样 

先玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。将12％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。将6％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 

用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。取出上样样品与5XSDS上样缓冲液上样缓冲液按4：1比例混合，混匀后沸水中煮5min使蛋白变性。加足够的电泳液后按等量蛋白上样。电泳，80V跑过浓缩胶后转换电压至120V，待溴酚兰跑到胶板底部刚好没有跑出即可。将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面依次垫海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜(经甲醇活化)、滤纸、海绵垫；同时将电泳液换成转移液。 

将电流调整到恒流200mA，转移约1.0小时。取出膜，并做好正反面标 记，在TBST中清洗1分钟，然后用封闭液封闭过夜。用封闭液将对应的一抗稀释成一定的浓度（1：300），内参一抗的稀释终浓度为1：3000,然后温育1.5小时。用TBST清洗3次，每次5分钟。用封闭液将二抗稀释成一定的浓度(1:5000)，然后温育1.5小时。用TBST清洗4次，每次5分钟。 

②化学发光，显影，定影 

先将A和B两种试剂在试管内等体积混合，然后加在PVDF膜的正面，温育大概2分钟；然后进入暗室，PVDF膜上盖一层保鲜膜，擦去多余的发光剂。将胶片压在保鲜膜上，依照发光的强度选择不同的曝光时间；将胶片放入显影液中，出现条带后，立即放入定影液中,流水冲洗胶片后晾干；对胶片进行扫描，然后用UVP凝胶图象处理系统Labworks4.6软件分析目的条带的灰度值。 

1.8检验观察 

1.8.1HE染色观察： 

大鼠基底动脉血管内径周长及血管壁厚度：基底动脉在40倍光学显微镜下照相，采用Image-pro Plus显微镜图像分析系统计算出血管内径周长及血管壁厚度。通过基底动脉内径周长的比较，判断血管有无痉挛及痉挛程度。CVS值参照Liszczak法[Liszczak T M,Varsos V G，Black P M,et al.Cerebral arterial constriction after experimental subarachnoid hemorrhage is associated with blood components within the arterial wall[J].J Neurosurg,1983,58(1):18-26]，计算如下： 

CVS值=(注血前BA直径-注血后BA直径)/注血前BA直径×100%； 

CVS的评价方法，参照Handa方法[Handa Y,Kabuto M,Kobayashi H,et al.The correlation between immunological reaction in the arterial wall and the time course of the development of cerebral vasospasm in a primate model[J].Neurosurgery,1991,28(4):542-549]：无CVS，CVS值≤10%；轻度CVS，CVS值11-30%；中度CVS，CVS值31-50%；重度CVS，CVS值≥50%。 

1.8.2免疫组化观察： 

显微镜下观察并摄像，每张切片在高倍镜（10×20）视野下观察基底动脉管壁内膜、中膜及外膜的染色情况。结果判断标准：棕色或棕黄色为阳性 染色。以无染色为阴性（-），轻度或局部染色为（+），全层重度或强烈染色为（+++），介于两者之间为（++）。 

1.8.3Western blot结果观察： 

用GAPDH为内对照，以阳性条带与内对照光密度比值作为阳性条带的相对表达。 

1.9统计分析 

数据用均数±标准差（X±S）表示，使用SPSS18.0软件进行统计学分析。多组比较用单因素方差分析（one way ANOVA），两两比较在总体方差齐的条件下，选用LSD及Dunnett-t法进行分析。P<0.05为有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。 

二、结果 

2.1动物存活情况： 

对照组动物全部成活，SAH组、安慰剂组及高浓度药物组中分别有2、2、1只大鼠在注血过程中心跳、呼吸停止，经心肺按压无效死亡，死亡原因考虑为注血过程过快或针头穿刺过深损伤脑干所致。死亡后动物随机补充至各组。 

2.2动物状态及行为学观察： 

术后第一天各组实验动物精神状态比较差，术后第二天对照组动物精神状态及食欲恢复正常。而SAH组、安慰剂组、药物处理组动物仍有不同程度的萎靡，毛发蓬松，头低位蜷缩状，活动及饮食减少，小部分大鼠可出现一侧或两侧球结膜下出血。 

2.3标本病理学检查： 

2.3.1大体观察： 

对照组大鼠脑表面及血管周围均未见到积血，未见手术损伤；SAH组、安慰剂组、Cystaitin C处理组均可见在脑干腹侧、基底池、颅底脑表面大量积血，其中以SAH组、安慰剂组明显。 

2.3.2基底动脉HE染色结果，如图1~图5所示： 

①形态学：光镜下，对照组基底动脉结构正常，管腔呈圆形或椭圆形，管壁较薄，血管内膜光整，未见管壁皱褶，管腔面积大，内径长，内皮细胞 排列整齐，结构层次清楚，无肿胀、坏死、脱落，内弹力层平整，血管平滑肌呈扁平状；SAH组和安慰剂组基底动脉管壁皱褶，管腔不规则，收缩明显，管壁增厚，管腔面积小，直径短，内皮细胞肿胀、变形，部分坏死、脱落，内弹力膜迂曲，厚薄不均，部分中膜变厚，平滑肌细胞排列紊乱；Cystatin C处理组基底动脉管壁有皱褶，但收缩较轻，管腔圆滑，内弹力膜结构完整，可见少量内皮细胞肿胀、变形，多数平滑肌细胞排列尚整齐。 

②血管内径周长的变化：与对照组相比，SAH组、安慰剂组基底动脉管腔明显狭窄，P＜0.01，内径周长分别为：633.43±47.53μm，630.35±31.01μm，表现为中度CVS。CysC低浓度和高浓度治疗组基底动脉内径周长分别为724.06±26.78μm,814.16±24.58μm，表现为轻度CVS。与SAH组及安慰剂组相比，治疗组管腔狭窄程度明显减轻，其中CysC低浓度治疗组与SAH组相比，P＜0.05；CysC高浓度治疗组与SAH组相比，P＜0.01。CysC高浓度治疗组与低浓度治疗组相比，管腔狭窄程度进一步减轻，P＜0.05，但仍较对照组狭窄，P＜0.01。见表2-1，图6。 

③动脉壁厚度变化：SAH组、安慰剂组血管壁明显增厚，与对照组相比，P＜0.01。而CysC治疗组使血管增厚程度明显减轻，与SAH组相比，P＜0.01。CysC高浓度治疗组与低浓度治疗组相比，血管增厚程度进一步减轻，两者比较，P＜0.05，但管壁仍厚于对照组，P＜0.01。见表1，图7。 

表1各组大鼠基底动脉内径周长、动脉壁厚度（X±S，μm）以及CVS程度的比较 

注：与对照组相比，★P＜0.01。与SAH组相比，▲P＜0.01，△P＜0.05。与CysC低浓度组相比，☆P＜0.05。 

2.4Western blot检查结果： 

Western blot结果显示LC3和Beclin-1在对照组是低表达的，而在SAH组及安慰剂组表达明显增高，其LC3/GAPDH、Beclin-1/GAPDH值分别与 对照组比较，结果分别为P＜0.05、P＜0.01。而在CysC治疗组，LC3和Beclin-1的表达进一步增高，以CysC高浓度组更明显，与SAH组比较，P＜0.01。其中CysC高浓度组与低浓度相比，LC3/GAPDH、Beclin-1/GAPDH值统计结果分别为P＜0.01，P＜0.05。见表2，图8、9。 

表2各组SD大鼠基底动脉LC3和Beclin-1表达的变（/GAPDH） 

注：与对照组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01。与SAH组相比，ns P＞0.05，☆P＜0.05，★P＜0.01。与CysC低浓度组相比，○P＜0.05，●P＜0.01。 

Beclin-1是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因6（Autophagy related gene，Atg6）的同源体，表达于反面高尔基网状结构,与Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)和Atgl4L结合形成复合体，调控自噬前体产生和自噬体形成。通过检测Beclin-1的表达水平，可对细胞的自噬活性进行动态监测和判断。微管相关蛋白l轻链3(Microtubule-associated protein 1light chain 3，LC3)是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8（Atg8）的同源体，调控微管蛋白的组装和去组装，参与自噬体的形成。它包括LC3-I和LC3-Ⅱ两种存在形式，LC3在C端与Atg4结合形成LC3-I，在自噬过程中，LC3-I与脑磷酯结合形成LC3-Ⅱ即LC3酯化,随后LC3-Ⅱ组装入自噬前体膜。在自噬溶酶体内，与溶酶体膜融合的自噬体外膜上的LC3-Ⅱ在Atg4作用下与脑磷酯分离即去酯化，LC3循环入细胞质,而自噬体内膜上的LC3-Ⅱ被降解，因此LC3-Ⅱ在自噬前体和自噬体的内外膜特异表达。LC3-Ⅱ含量的多少与自噬泡数量的多少成正比，可通过检测细胞内LC3-Ⅱ的含量变化，可以判断其自噬是被诱导还是被抑制。 

本实验研究发现，在大鼠SAH模型中，经枕大池注入Cystatin C后48小时，自噬相关指标如LC3、Beclin1在基底动脉及周围的表达明显增高，与对照组、SAH组和安慰剂相比，差异有统计学意义。另外，在高浓度、低浓度治疗组中，Cystatin C高浓度组自噬的表达较低浓度组更强，两者比较 有统计学意义，说明Cystatin C能诱导自噬，并且自噬的水平与该部位的Cystatin C的浓度存在正相关。 

本实验研究也发现，正常对照组大鼠基底动脉自噬标记物LC3、Beclin-1的表达水平较低，而在枕大池注血模拟SAH后48小时，LC3、Beclin-1的表达水平明显增高，Western bolt检测结果与对照组相比有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）。以上研究表明，SAH后早期自噬被激活，除了对早期脑损伤有保护作用外，LC3、Beclin-1在基底动脉壁的高表达可能预示着自噬参与了SAH后CVS的过程。 

至于自噬如何参与防治CVS的病理过程，目前尚无详细报道，结合文献和本实验，推测可能通过以下途径：1、通过清除和降解SAH后释放的毒性产物，减少对血管内皮细胞的毒性刺激，维持内皮细胞的结构和功能，抑制内皮素的释放，稳定细胞钙离子通道，从而缓解血管痉挛；2、清除胶原纤维，抑制细胞凋亡和平滑肌增生，从而维护血管壁细胞结构和功能，改善血管的顺应性；3、下调OxyHb与血管壁细胞的炎症反应。 

本实施例通过构建大鼠枕大池一次注血模型，能够观察到基底动脉发生明显的细胞形态改变、管壁的增厚以及管腔的狭窄，提示SAH后存在CVS。而自噬在正常大鼠基底动脉壁的表达是低水平的，SAH后自噬在基底动脉壁的表达上调，提示自噬可能参与了CVS的病理过程。经枕大池注入Cystatin C能诱导自噬在基底动脉壁的高表达，对CVS有一定的防治作用，并且这种作用与Cystatin C浓度存在正相关性。 

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 

Claims (3)

1.一种Cystatin C在制备用于治疗脑血管痉挛的药物组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述脑血管痉挛为蛛网膜下腔出血后发生的脑血管痉挛。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物组合物包含药学上有效量的Cystatin C和药学上可接受的载体。

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