JP2961118B2 - ヒルジン変異体とその用途及び製造方法 - Google Patents
ヒルジン変異体とその用途及び製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒルジン変異体、その用途及びその製造方
法に関する。
法に関する。
天然のヒルジンは、治療用ヒルの唾液腺から非常に少
量分泌される、65個及び66個のアミノ酸からなるペプチ
ドの混合物である（マルクワルト（Markwardt）1970;ピ
ーターソン（Peterson）ら1976;チャング（Chang）198
3;ドット（Dodt）ら1984,1985,1986;ハーベイ（Harve
y）ら1986）。最初に記載された変異体HV1は、ヒルの体
から単離されたヒルジンに相当する。２番目のHV2（ハ
ーベイら1986）はHV1と９個のアミノ酸が異なり、３番
目（ドットら1986）はセリン32までHV2と同一で、Ｃ末
端側でアミノ酸（Ala63）の添加を含む、10個のアミノ
酸が異なる。この３番目の変異体をHV3と称する。これ
ら３変種の構造を第１図に記す。
量分泌される、65個及び66個のアミノ酸からなるペプチ
ドの混合物である（マルクワルト（Markwardt）1970;ピ
ーターソン（Peterson）ら1976;チャング（Chang）198
3;ドット（Dodt）ら1984,1985,1986;ハーベイ（Harve
y）ら1986）。最初に記載された変異体HV1は、ヒルの体
から単離されたヒルジンに相当する。２番目のHV2（ハ
ーベイら1986）はHV1と９個のアミノ酸が異なり、３番
目（ドットら1986）はセリン32までHV2と同一で、Ｃ末
端側でアミノ酸（Ala63）の添加を含む、10個のアミノ
酸が異なる。この３番目の変異体をHV3と称する。これ
ら３変種の構造を第１図に記す。
これらの天然変異体は65個又は66個のアミノ酸を含
み、２つのドメインを認め得る:3つのジスルフィド結合
を含む球状Ｎ末端部分と、プロトロンビン分子中のトロ
ンビンによる切断部位と相同性を示す酸性Ｃ末端部分で
ある。この相同性は、47位周囲の領域がヒルジンのトロ
ンビンに対する結合部位である可能性を示唆する。この
理由から、本出願人はヨーロッパ特許出願No.87.40269
6.6に、天然型とは47位のアミノ酸が異なるヒルジン変
異体を既に記載している。特に、変異体HV2（Lys47）は
非修飾分子と比べて、トロンビン阻害キネティクスの改
善と、大きな抗トロンビン活性を示すと記されている。
み、２つのドメインを認め得る:3つのジスルフィド結合
を含む球状Ｎ末端部分と、プロトロンビン分子中のトロ
ンビンによる切断部位と相同性を示す酸性Ｃ末端部分で
ある。この相同性は、47位周囲の領域がヒルジンのトロ
ンビンに対する結合部位である可能性を示唆する。この
理由から、本出願人はヨーロッパ特許出願No.87.40269
6.6に、天然型とは47位のアミノ酸が異なるヒルジン変
異体を既に記載している。特に、変異体HV2（Lys47）は
非修飾分子と比べて、トロンビン阻害キネティクスの改
善と、大きな抗トロンビン活性を示すと記されている。
本発明の目的は、改善された生物学的性質を示す新し
いヒルジン変異体を提供することにある。
いヒルジン変異体を提供することにある。
まずはじめに、インビボでの活性を延長し、それによ
って必要な治療用量を減らすために、ヒルジン分子の薬
物動体学的プロフィールを改善する目的で、共有結合性
の翻訳後修飾を導入することが可能である。特に、炭化
水素側鎖はこの分子が循環から消失する原因となるポリ
ペプチドの部位を覆うことができる。
って必要な治療用量を減らすために、ヒルジン分子の薬
物動体学的プロフィールを改善する目的で、共有結合性
の翻訳後修飾を導入することが可能である。特に、炭化
水素側鎖はこの分子が循環から消失する原因となるポリ
ペプチドの部位を覆うことができる。
この理由から、１又は２以上の、炭化水素鎖の添加を
促進することができるグルコシル化反応部位を分子上に
創造する。グルコシル化反応はしばしば、特異的な認識
部位であるAsn−Ｘ−Thr又はAsn−Ｘ−SerのAsn残基上
でおこり、ヒルジンでは、アミノ酸Lys35をアミノ酸Thr
35で置き換えてAsn33−Gly34−Thr35という配列を導く
修飾が、可能である。
促進することができるグルコシル化反応部位を分子上に
創造する。グルコシル化反応はしばしば、特異的な認識
部位であるAsn−Ｘ−Thr又はAsn−Ｘ−SerのAsn残基上
でおこり、ヒルジンでは、アミノ酸Lys35をアミノ酸Thr
35で置き換えてAsn33−Gly34−Thr35という配列を導く
修飾が、可能である。
更に、天然のヒルジンは血球表面受容体が認識する特
異的部位を持たない。ヒルジンの生体内での作用様式を
修飾するためには、ヒルジン分子中にArg−Gly−Asp−S
er（RGDS）という配列を導入して細胞表面受容体との相
互作用を良くすることが有利である様に考えられた。こ
のRGDS配列はフィブリノーゲンの血小板受容体Gp II b/
−III aに対する結合に関係する部位に存在する。最近
の研究（ラッゲリ（Ruggeri）ら1986）から、フィブリ
ノーゲンとGp II b/−III aの相互作用が血小板凝集に
必要であり、RGDS配列を含むペプチドは血小板凝集を阻
害することが示された。
異的部位を持たない。ヒルジンの生体内での作用様式を
修飾するためには、ヒルジン分子中にArg−Gly−Asp−S
er（RGDS）という配列を導入して細胞表面受容体との相
互作用を良くすることが有利である様に考えられた。こ
のRGDS配列はフィブリノーゲンの血小板受容体Gp II b/
−III aに対する結合に関係する部位に存在する。最近
の研究（ラッゲリ（Ruggeri）ら1986）から、フィブリ
ノーゲンとGp II b/−III aの相互作用が血小板凝集に
必要であり、RGDS配列を含むペプチドは血小板凝集を阻
害することが示された。
最後に、ヒルジンが遺伝子工学的技術、特にサッカロ
ミセス セレビシエ（Saccharonyces cerevisiae）酵母
を用いた発現と分泌によって製造される場合、ヒルジン
は産生の間にカルボキシペプチダーゼの影響によってＣ
末端で好ましくない分解を受けるかもしれないことがわ
かった。この分解を減じるために、本発明は、この分子
のＣ末端に１又は２以上のアミノ酸、例えばプロリン等
を加えて修飾することを提案する。
ミセス セレビシエ（Saccharonyces cerevisiae）酵母
を用いた発現と分泌によって製造される場合、ヒルジン
は産生の間にカルボキシペプチダーゼの影響によってＣ
末端で好ましくない分解を受けるかもしれないことがわ
かった。この分解を減じるために、本発明は、この分子
のＣ末端に１又は２以上のアミノ酸、例えばプロリン等
を加えて修飾することを提案する。
従って本発明の目的の一つは、HV2又はHV2（Lys47）
といった親HV変異体との比較において、そのペプチド構
造に以下の修飾の一つを含む、ヒルジン変異体を提供す
ることにある： （１）HVにAsn−Ｘ−Ｙという部位を少くとも１つ持
つ。但しＸは任意のアミノ酸、ＹはSer又はThrである； （２）Arg−Gly−Asp−Serという配列が、あるアミノ酸
配列と置きかわってある； （３）少くとも１つのアミノ酸がＣ末端に添加されてい
る； 親変異体はヨーロッパ特許出願87.402606.6に本出願
人により記載された方法に従って得ることができる。
といった親HV変異体との比較において、そのペプチド構
造に以下の修飾の一つを含む、ヒルジン変異体を提供す
ることにある： （１）HVにAsn−Ｘ−Ｙという部位を少くとも１つ持
つ。但しＸは任意のアミノ酸、ＹはSer又はThrである； （２）Arg−Gly−Asp−Serという配列が、あるアミノ酸
配列と置きかわってある； （３）少くとも１つのアミノ酸がＣ末端に添加されてい
る； 親変異体はヨーロッパ特許出願87.402606.6に本出願
人により記載された方法に従って得ることができる。
本発明はまた、親HVがHV2（Lys47）で、上記修飾の少
くとも１つに加えて、或いは唯一の修飾としてIle1−Th
r2の代わりにVal1−Val2のアミノ酸を含むハイブリッド
分子の一群に関する。
くとも１つに加えて、或いは唯一の修飾としてIle1−Th
r2の代わりにVal1−Val2のアミノ酸を含むハイブリッド
分子の一群に関する。
問題の変異体は特に、HV2（Val1、Val2、Lys47）、HV
2（Val1、Val2、Lys47,AA63）である。
2（Val1、Val2、Lys47,AA63）である。
（１）の修飾に特に適する部位の１つは、HV2のアミ
ノ酸33から35に位置し、（Lys35）を（Thr35）又は（Se
r35）で置き換えることである。
ノ酸33から35に位置し、（Lys35）を（Thr35）又は（Se
r35）で置き換えることである。
（２）の修飾に特に適する部位の１つは、アミノ酸33か
ら36に位置し、変異体（Arg33、Asp35、Ser36）で特に
親、変異体がHV2（Lys47）であるものが最も優れてい
る。
ら36に位置し、変異体（Arg33、Asp35、Ser36）で特に
親、変異体がHV2（Lys47）であるものが最も優れてい
る。
Ｃ末端には任意のアミノ酸を加えることができるが、
プロリンを使用すること（例えばHV2（Lys47、Pr
o66））が望ましい。
プロリンを使用すること（例えばHV2（Lys47、Pr
o66））が望ましい。
最後に、本出願人によってヨーロッパ特許出願No.87.
402696.6に記載されている変異体HV2（Lys47）と比較し
て、より強いトロンビン阻害活性、薬物動態学的性質の
改善、より大きい安定性、及び抗トロンビン作用の改善
を得るために、以下の変異体が非常に興味深い： 但し、Ａ−ＢはIle−Thr又はVal−Valを表し、ＣはGlu
又はAspを表す。
402696.6に記載されている変異体HV2（Lys47）と比較し
て、より強いトロンビン阻害活性、薬物動態学的性質の
改善、より大きい安定性、及び抗トロンビン作用の改善
を得るために、以下の変異体が非常に興味深い： 但し、Ａ−ＢはIle−Thr又はVal−Valを表し、ＣはGlu
又はAspを表す。
実際上、チロシン63の硫酸化は恐らく、天然のヒルジ
ンと遺伝子組換によって得られるヒルジンとの間に、ス
トーン（Stone）とホフスティーング（Hofsteenge）（1
986）のキネティックの研究で示唆された様に、重要な
差異を作るものと思われる。
ンと遺伝子組換によって得られるヒルジンとの間に、ス
トーン（Stone）とホフスティーング（Hofsteenge）（1
986）のキネティックの研究で示唆された様に、重要な
差異を作るものと思われる。
この理由により、上記変異体において、（Tyr63）はG
lu又はAspで置き換えた。
lu又はAspで置き換えた。
上記修飾は同時に起き得る。
上記の変異体のうち、下記のものが好ましいものとし
て挙げられる。
て挙げられる。
HV2（Lys47、Asp63） HV2（Lys47、Asn33−Gly34−Thr35） HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） HV2（Lys47、Pro66） 以下の変異体も同様である： （Val1−Val2）HV2（Lys47） （Val1−Val2）HV2（Lys47、Asp63） （Val1−Val2）HV2（Lys47、Thr35） （Val1−Val2）HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） （Val1−Val2）HV2（Lys47、Pro66） Tyr63を保持する異なる変異体が硫酸化体又は非硫酸
化体で使用できる。この硫酸化は化学的又は生物学的に
得ることができる。
化体で使用できる。この硫酸化は化学的又は生物学的に
得ることができる。
本発明は上記変異体を製造できる生物学的及び／又は
化学的方法を包含する。
化学的方法を包含する。
これらの変異体は実際上、合成又は部分的合成及び／
又は公知の工学技術によって得ることができる。
又は公知の工学技術によって得ることができる。
このようにして、例えば、HV2をコードする配列のク
ローニングと発現、及び対応するヒルジンの、酵母から
の産生はヨーロッパ特許EP−Ａ−200,655公報に記載さ
れている。
ローニングと発現、及び対応するヒルジンの、酵母から
の産生はヨーロッパ特許EP−Ａ−200,655公報に記載さ
れている。
本発明による変異体は、HV2をコードする配列を、例
えば特異的変異誘起によって修飾した後、上記と同様の
技術で得ることができる。
えば特異的変異誘起によって修飾した後、上記と同様の
技術で得ることができる。
特に、インビトロでの定方向変異誘起によって、HV2
変異体は、Asn47がLysによって置きかえられ、かつ、Ly
s35がThrによって置きかえられるか、Asn33がArgにより
置きかえられるか、Lys35がAspによりかつGly36がSerに
より置きかえられるか、Tyr63がAspにより置きかえられ
るか、又はその代りにIle1−Thr2配列がVal1−Val2によ
り置きかえられている。
変異体は、Asn47がLysによって置きかえられ、かつ、Ly
s35がThrによって置きかえられるか、Asn33がArgにより
置きかえられるか、Lys35がAspによりかつGly36がSerに
より置きかえられるか、Tyr63がAspにより置きかえられ
るか、又はその代りにIle1−Thr2配列がVal1−Val2によ
り置きかえられている。
特に、特許出願EP−Ａ−200,655に記載されている様
に、機能的発現ブロックを使用することも可能である。
このブロックでは、ヒルジン配列は上記変異体をコード
する。これらの機能的DNAブロックをプラスミドベクタ
ーによって持ち込むことが可能である。
に、機能的発現ブロックを使用することも可能である。
このブロックでは、ヒルジン配列は上記変異体をコード
する。これらの機能的DNAブロックをプラスミドベクタ
ーによって持ち込むことが可能である。
異なる変異体に対応する遺伝子を酵母において発現し
分泌させるために、酵母のためのベクターが遺伝子に組
込まれる。このベクターは、特許EP−Ａ−200,655に記
載されている、以下の要素を含むことが好ましい： （１）酵母の２μプラスミドの複製起点 （２）ura3遺伝子 （３）イー．コリ（E.coli）の複製起点と抗生物質抵抗
性のマーカー （４）ヒルジン変異体をコードした配列から上流に相融
合した、転写プロモーター、先導配列、及びα−因子の
前駆体のプレプロ配列 （５）ヒルジン変異体の遺伝子から下流に位置されるで
あろう酵母PGK遺伝子の転写ターミネーター。
分泌させるために、酵母のためのベクターが遺伝子に組
込まれる。このベクターは、特許EP−Ａ−200,655に記
載されている、以下の要素を含むことが好ましい： （１）酵母の２μプラスミドの複製起点 （２）ura3遺伝子 （３）イー．コリ（E.coli）の複製起点と抗生物質抵抗
性のマーカー （４）ヒルジン変異体をコードした配列から上流に相融
合した、転写プロモーター、先導配列、及びα−因子の
前駆体のプレプロ配列 （５）ヒルジン変異体の遺伝子から下流に位置されるで
あろう酵母PGK遺伝子の転写ターミネーター。
本発明はこれらのベクター又はこの機能的DNAブロッ
クによって形質転換された酵母にも関する。
クによって形質転換された酵母にも関する。
特に、本発明は、本発明の酵母の醗酵、及び培養基中
に成熟型又はインビトロで成熟可能な前駆体型で産生し
たヒルジンの回収による、ヒルジン変異体を製造する方
法に関する。
に成熟型又はインビトロで成熟可能な前駆体型で産生し
たヒルジンの回収による、ヒルジン変異体を製造する方
法に関する。
使用した技術は特許出願EP−Ａ−200,655及びEP−87.
401649.6に既に詳細に記載されている。
401649.6に既に詳細に記載されている。
このようにして得たヒルジン変異体は、特許出願EP−
Ａ−200,655に記載されている様に、インビボ及びイン
ビトロの双方におけるトロンビン阻害剤として使用でき
る。
Ａ−200,655に記載されている様に、インビボ及びイン
ビトロの双方におけるトロンビン阻害剤として使用でき
る。
特に、これらの変異体は、単独もしくは他の活性成分
と共に、医薬組成物として、又はインビトロやインビボ
での試験や診断に使用できる。後者の場合、変異体を例
えば放射能、蛍光、酵素、又は他のラベル手段で標識す
ることが望ましい。
と共に、医薬組成物として、又はインビトロやインビボ
での試験や診断に使用できる。後者の場合、変異体を例
えば放射能、蛍光、酵素、又は他のラベル手段で標識す
ることが望ましい。
以下に本発明の実施例を、第１図及び第２図を用いて
示す。
示す。
実施例１ ヒルジン変異体HV2（Lys47）をコードする突然変異遺伝
子の、インビトロでの定方向突然変異誘起による産生 インビトロでの定方向突然変異を行なうために、修飾
したいDNA断片を一本鎖ファージM13の複製型中にクロー
ンする。組換えファージのゲノムを単離し、突然変異し
た配列を持つ合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
する。このオリゴヌクレオチドは相補的DNA鎖を複製す
るプライマーとなる。そして、このように二本鎖にした
DANで受容体細菌を形質転換すると、この細菌は必要な
変異を持つファージを産生するようになる（ゾラー（Zo
ller）、スミス（Smith）、（1983））。
子の、インビトロでの定方向突然変異誘起による産生 インビトロでの定方向突然変異を行なうために、修飾
したいDNA断片を一本鎖ファージM13の複製型中にクロー
ンする。組換えファージのゲノムを単離し、突然変異し
た配列を持つ合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
する。このオリゴヌクレオチドは相補的DNA鎖を複製す
るプライマーとなる。そして、このように二本鎖にした
DANで受容体細菌を形質転換すると、この細菌は必要な
変異を持つファージを産生するようになる（ゾラー（Zo
ller）、スミス（Smith）、（1983））。
ヒルジンHV2をコードする配列を処理して酵母中の機
能的「発現カセット」内にいれ、合成されたタンパク質
を分泌させた。このために、酵母のα−フェロモンのプ
レプロ配列をコードするDNAセグメントを遺伝子の上流
に置いた。この構造はpTG1833と呼ぶ。
能的「発現カセット」内にいれ、合成されたタンパク質
を分泌させた。このために、酵母のα−フェロモンのプ
レプロ配列をコードするDNAセグメントを遺伝子の上流
に置いた。この構造はpTG1833と呼ぶ。
ヒルジンの発現カセットをPst I−Bgl II断片の形で
回収し、ファージM13誘導体であるM13TG131に導入し
（キーニー（Kieny）ら（1983））、そこで引続き変異
誘起を行った。
回収し、ファージM13誘導体であるM13TG131に導入し
（キーニー（Kieny）ら（1983））、そこで引続き変異
誘起を行った。
プレプロ配列に変異誘起を行なってHind III認識配列
を創造し、それによって、ヒルジンをコードする配列の
融合と、後者と様々な変異配列との迅速な交換を、リー
ディングフレームを保持して合成タンパク質の正しい変
異をおこす一方で、可能にした。
を創造し、それによって、ヒルジンをコードする配列の
融合と、後者と様々な変異配列との迅速な交換を、リー
ディングフレームを保持して合成タンパク質の正しい変
異をおこす一方で、可能にした。
変異された配列を以下に示す： 変異をHV2をコードする配列に導入し、Asn47をLys47
により置きかえた。この変異誘起には以下のオリゴヌク
レオチドを用いた： ５′CTTTCAGGTTTCGGTGTAC3′ これら２つの変異した発現カセットを持つファージM1
3誘導体をM13TG1945と呼び、これは、以下の全ての変異
のプライマーとなる。
により置きかえた。この変異誘起には以下のオリゴヌク
レオチドを用いた： ５′CTTTCAGGTTTCGGTGTAC3′ これら２つの変異した発現カセットを持つファージM1
3誘導体をM13TG1945と呼び、これは、以下の全ての変異
のプライマーとなる。
HV2をコードする配列に、更に変異を起こすために、
以下のオリゴヌクレオチドを用いた： これらの変異配列は各々以下の変異体に対応する： HV2（Lys47、Thr35） HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） HV2（Lys47、Asp63） HV2（Lys47、Val1−Val2） HV2（Lys47、Pro66） この変異は以下の条件下で行った： 各オリゴヌクレオチド120p molを100μの反応液中
でリン酸化し、リン酸化されたオリゴヌクレオチド約20
p molをファージM13TG1919の一本鎖DNA1p molと、ハイ
ブリダイゼーション緩衝液25μ中でハイブリダイズし
た。
以下のオリゴヌクレオチドを用いた： これらの変異配列は各々以下の変異体に対応する： HV2（Lys47、Thr35） HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） HV2（Lys47、Asp63） HV2（Lys47、Val1−Val2） HV2（Lys47、Pro66） この変異は以下の条件下で行った： 各オリゴヌクレオチド120p molを100μの反応液中
でリン酸化し、リン酸化されたオリゴヌクレオチド約20
p molをファージM13TG1919の一本鎖DNA1p molと、ハイ
ブリダイゼーション緩衝液25μ中でハイブリダイズし
た。
ハイブリダイゼーションの後、DNAs混合液にクレノー
ポリメラーゼとファージT4リガーゼを作用させた。こ
のように処理した各々の混合液を用いて、インディケー
ター細菌JM103菌叢上のイー．コリ（E.coli）菌株71/18
（mutL）を形質転換した（メッシング（Messing）ら（1
981））。感染細胞はプラーク形成が遅いことで同定で
きる；コロニーは完全培地に継代培養し、ファットマン
540（Whatman）540）紙上に移して、変異ファージを持
つ細胞をスクリーニングした。
ポリメラーゼとファージT4リガーゼを作用させた。こ
のように処理した各々の混合液を用いて、インディケー
ター細菌JM103菌叢上のイー．コリ（E.coli）菌株71/18
（mutL）を形質転換した（メッシング（Messing）ら（1
981））。感染細胞はプラーク形成が遅いことで同定で
きる；コロニーは完全培地に継代培養し、ファットマン
540（Whatman）540）紙上に移して、変異ファージを持
つ細胞をスクリーニングした。
変異誘起に使用したオリゴヌクレオチドとインシツで
ハイブリダイズして、変異配列を持つファージを同定す
る。変異配列を持つ以下のファージが得られた： M13TG1946→ HV2（Lys47、Thr35） M13TG1947→ HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） M13TG1948→ HV2（Lys47、Asp63） M13TG1949→ HV2（Lys47、Val1、Val2） M13TG1950→ HV2（Lys47、Pro66） 実施例２ 変異遺伝子の発現／分泌ベクター中への伝達と、宿主酵
母の形質転換 発現／分泌ベクターpTG2835は以下の成分からなる： （１）イー．コリ（E.coli）内でのプラスミドの増殖と
選択を可能にする、プラスミドpBR322の複製起点とアン
ピシリン抵抗遺伝子 （２）酵母の２μプラスミドの複製起点と、ura3-酵母
株の選択マーカーである酵母ura3遺伝子 （３）他の選択マーカー、宿主株の欠損leu2遺伝子を補
足する酵母leu2遺伝子 （４）酵母のα−フェロモン遺伝子の転写プロモーター
と、酵母PGK遺伝子の転写ターミネーター （５）ヒルジン遺伝子の融合と、合成タンパク質の正し
い成熟が可能となるHind III認識配列を創造する操作を
した、酵母のα−フェロモン遺伝子のプレプロ配列。
ハイブリダイズして、変異配列を持つファージを同定す
る。変異配列を持つ以下のファージが得られた： M13TG1946→ HV2（Lys47、Thr35） M13TG1947→ HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） M13TG1948→ HV2（Lys47、Asp63） M13TG1949→ HV2（Lys47、Val1、Val2） M13TG1950→ HV2（Lys47、Pro66） 実施例２ 変異遺伝子の発現／分泌ベクター中への伝達と、宿主酵
母の形質転換 発現／分泌ベクターpTG2835は以下の成分からなる： （１）イー．コリ（E.coli）内でのプラスミドの増殖と
選択を可能にする、プラスミドpBR322の複製起点とアン
ピシリン抵抗遺伝子 （２）酵母の２μプラスミドの複製起点と、ura3-酵母
株の選択マーカーである酵母ura3遺伝子 （３）他の選択マーカー、宿主株の欠損leu2遺伝子を補
足する酵母leu2遺伝子 （４）酵母のα−フェロモン遺伝子の転写プロモーター
と、酵母PGK遺伝子の転写ターミネーター （５）ヒルジン遺伝子の融合と、合成タンパク質の正し
い成熟が可能となるHind III認識配列を創造する操作を
した、酵母のα−フェロモン遺伝子のプレプロ配列。
選択的変異を持ち、ファージM13TG1946、1947、194
8、1949、及び1950に担われた、ヒルジンをコードする
配列を、Hind III断片の形で回収し、ベクターpTG2835
に再導入して、次のプラスミドを得た： pTG2982→ HV2（Lys47、Thr35） pTG2983→ HV2（Lys47、Asp63） pTG2988→ HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） pTG2989→ HV2（Lys47、Val1、Val2） pTG2990→ HV2（Lys47、Pro66） エス．セレビシエ（S.cerevisiae）酵母株TGY1sp4（m
atα ura3.251.373.38 his03.11.15）をこれらの異な
るプラスミドで形質転換した。
8、1949、及び1950に担われた、ヒルジンをコードする
配列を、Hind III断片の形で回収し、ベクターpTG2835
に再導入して、次のプラスミドを得た： pTG2982→ HV2（Lys47、Thr35） pTG2983→ HV2（Lys47、Asp63） pTG2988→ HV2（Lys47、Arg33、Asp35、Ser36） pTG2989→ HV2（Lys47、Val1、Val2） pTG2990→ HV2（Lys47、Pro66） エス．セレビシエ（S.cerevisiae）酵母株TGY1sp4（m
atα ura3.251.373.38 his03.11.15）をこれらの異な
るプラスミドで形質転換した。
これらの株によって産生した種々のヒルジン変異体の
抗トロンビン活性を比較した（第２図）。
抗トロンビン活性を比較した（第２図）。
各菌株をはやしたOD660＝0.02の培養物20ml（YNBG＋
0.5％カザミノ酸）を、30℃で48時間撹拌した後、遠心
し（5000rpm、5min）、上清をアッセイした。
0.5％カザミノ酸）を、30℃で48時間撹拌した後、遠心
し（5000rpm、5min）、上清をアッセイした。
TGY1sp4 pTG881（HV2をコードする配列を持たないプ
ラスミド）培養物をコントロールとして使用した。粗製
上清でトロンビン活性（合成基質クロモザイムTH;ベー
リンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）に対する
タンパク質加水分解活性）に対する阻害効果を測定し
た。上清量当り阻害パーセントを第２図に示す。
ラスミド）培養物をコントロールとして使用した。粗製
上清でトロンビン活性（合成基質クロモザイムTH;ベー
リンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）に対する
タンパク質加水分解活性）に対する阻害効果を測定し
た。上清量当り阻害パーセントを第２図に示す。
この結果から明らかに、ヒルジン配列の修飾は抗トロ
ンビン活性の減少をおこさず、又は酵母の産生力を減じ
ない。
ンビン活性の減少をおこさず、又は酵母の産生力を減じ
ない。
これらの新しい分子をインビボで抗トロンビン剤とし
て使用することが考えられる。
て使用することが考えられる。
参考資料 チャン、ジェイ．ワイ．（Chang、J.Y.）、エフイー
ビーエス レターズ（FEBS Letters）164、307−313
（1983） ドット、ジェイ．（Dodt、J.）、メラー、エッチ．ピ
ー．（Mueller、H.P.）、シーミュラー、ユー．（Seemu
ller、U.）、チャン、ジェイ．ワイ．（Chang、J.
Y.）、エフイービーエス レターズFEBS Letters）16
5、180−184（1984） ドット、ジェイ．（Dodt、J.）、シーミュラー、ユ
ー．（Seemuller、U.）、マシェラー、アール．（Masch
eler、R.）、フリッツ、エッチ．（Fritz、H.）、バイ
オロジカル ケミストリー ホッペ−ザイラー（Biol.C
hem.Hoppe−Seyler）366、379−385（1985） ドット、ジェイ．（Dodt、J.）、マクライト、ダブリ
ュー．（Machleidt W.）、シーミュラー、ユー．（Seem
uller、U.）、マシェラー、アール．（Mascheler、
R.）、フリッツ、エッチ．（Fritz、H.）、バイオロジ
カル ケミストリー ホッペ−ザイラー（Biol.Chem.Ho
ppe−Seyler）367、803−811（1986） ハーベイ、アール．ピー．（Harvey、R.P.）、デグラ
イス、イー．（Degryse、E.）、ステファニ、エル．（S
tefani、L.）シャンバー、エフ．（Schamber、F.）、カ
ゼナブ、ジェイ．ピー．（Cazeneve、J.P.）、カートニ
ー、エム．（Courtney、M.）、トルストシェフ、ピー．
（Tolstoshev、P.）、レコック、ジェー．ピー．（Leco
cq、J.P.）、プロシーディングス オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA）83、1084−1088（1986） キーニー、エム．ピー．（Kieny、M.P.）、ラーゼ、
アール．（Lathe、R.）、レコック、ジェー．ピー．（L
ecocq、J.P.）、ジーン（Gene）26、91−99（1983） マルクワルト、エフ．（Markwardt、F.）、メソッド
イン エンザイモロジー（Methods Enzymol.）19、92
4−932（1970） メッシング、ジェイ．（Messing、J.）、クレア、ア
ール．（Crea、R.）、シーブルグ、ピー．エッチ、（Se
eburg、P.H.）、ニュークレイック アシッド リサー
チ（Nucl.Acids Res.）９、309（1981） ピーターソン、ティー．イー．（Peterson、T.E.）、
ロバーツ、エッチ．アール．（Roberts、H.R.）、ソッ
トラップ−ジェンセン、エル．（Sottrup−Jensen、
L.）、マグヌッソン、エス．（Magnusson、S.）、プロ
タイド、バイオロジー、フルイド、プロシーディングス
オブ コロキウム（Protides、Biol.、Fluids、Proc.
Colloq.）23、145−149（1976） ラッゲリ、ゼット．エム．（Ruggeri、Z.M.）、ホー
トン、アール．エー．（Houghten、R.A.）、ラッセル、
エス．アール．（Russell、S.R.）、ジマーマン、ティ
ー．エス．（Zimmerman、T.S.）、プロシーディングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ ザ サイ
エンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）83、
5708−5712（1986） ストーン、エス．アール．（Stone、S.R.）、ホフス
ティーン、ジェイ．（Hofsteenge、J.）、バイオケミス
トリー（Biochem.）25、4622−4628（1986） ゾラー、エム．ジェイ．（Zoller、M.J.）、スミス、
エム．エヌ．（Smith、M.N.）、メソッド イン エン
ザイモロジー 100、469（1983）
ビーエス レターズ（FEBS Letters）164、307−313
（1983） ドット、ジェイ．（Dodt、J.）、メラー、エッチ．ピ
ー．（Mueller、H.P.）、シーミュラー、ユー．（Seemu
ller、U.）、チャン、ジェイ．ワイ．（Chang、J.
Y.）、エフイービーエス レターズFEBS Letters）16
5、180−184（1984） ドット、ジェイ．（Dodt、J.）、シーミュラー、ユ
ー．（Seemuller、U.）、マシェラー、アール．（Masch
eler、R.）、フリッツ、エッチ．（Fritz、H.）、バイ
オロジカル ケミストリー ホッペ−ザイラー（Biol.C
hem.Hoppe−Seyler）366、379−385（1985） ドット、ジェイ．（Dodt、J.）、マクライト、ダブリ
ュー．（Machleidt W.）、シーミュラー、ユー．（Seem
uller、U.）、マシェラー、アール．（Mascheler、
R.）、フリッツ、エッチ．（Fritz、H.）、バイオロジ
カル ケミストリー ホッペ−ザイラー（Biol.Chem.Ho
ppe−Seyler）367、803−811（1986） ハーベイ、アール．ピー．（Harvey、R.P.）、デグラ
イス、イー．（Degryse、E.）、ステファニ、エル．（S
tefani、L.）シャンバー、エフ．（Schamber、F.）、カ
ゼナブ、ジェイ．ピー．（Cazeneve、J.P.）、カートニ
ー、エム．（Courtney、M.）、トルストシェフ、ピー．
（Tolstoshev、P.）、レコック、ジェー．ピー．（Leco
cq、J.P.）、プロシーディングス オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA）83、1084−1088（1986） キーニー、エム．ピー．（Kieny、M.P.）、ラーゼ、
アール．（Lathe、R.）、レコック、ジェー．ピー．（L
ecocq、J.P.）、ジーン（Gene）26、91−99（1983） マルクワルト、エフ．（Markwardt、F.）、メソッド
イン エンザイモロジー（Methods Enzymol.）19、92
4−932（1970） メッシング、ジェイ．（Messing、J.）、クレア、ア
ール．（Crea、R.）、シーブルグ、ピー．エッチ、（Se
eburg、P.H.）、ニュークレイック アシッド リサー
チ（Nucl.Acids Res.）９、309（1981） ピーターソン、ティー．イー．（Peterson、T.E.）、
ロバーツ、エッチ．アール．（Roberts、H.R.）、ソッ
トラップ−ジェンセン、エル．（Sottrup−Jensen、
L.）、マグヌッソン、エス．（Magnusson、S.）、プロ
タイド、バイオロジー、フルイド、プロシーディングス
オブ コロキウム（Protides、Biol.、Fluids、Proc.
Colloq.）23、145−149（1976） ラッゲリ、ゼット．エム．（Ruggeri、Z.M.）、ホー
トン、アール．エー．（Houghten、R.A.）、ラッセル、
エス．アール．（Russell、S.R.）、ジマーマン、ティ
ー．エス．（Zimmerman、T.S.）、プロシーディングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ ザ サイ
エンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）83、
5708−5712（1986） ストーン、エス．アール．（Stone、S.R.）、ホフス
ティーン、ジェイ．（Hofsteenge、J.）、バイオケミス
トリー（Biochem.）25、4622−4628（1986） ゾラー、エム．ジェイ．（Zoller、M.J.）、スミス、
エム．エヌ．（Smith、M.N.）、メソッド イン エン
ザイモロジー 100、469（1983）
第１図はヒルジンの天然変異体３種の配列を示す。第２
図はクロモザイムに対するトロンビンのタンパク質加水
分解活性に対する、阻害パーセントを、ヒルジン変異体
HV2（Lys47）（HV2Lと呼ぶ）を産生する酵母培養物の上
清量として示す。
図はクロモザイムに対するトロンビンのタンパク質加水
分解活性に対する、阻害パーセントを、ヒルジン変異体
HV2（Lys47）（HV2Lと呼ぶ）を産生する酵母培養物の上
清量として示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特許2567263（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/12 C07K 14/435 A61K 38/58 C12P 21/02 C12N 1/19
Claims (7)
- 【請求項１】親HV2変異体から誘導されるヒルジン変異
体であって、そのペプチド構造がHV2（Lys47,Thr35）、
HV2（Lys47,Arg33,Asp35,Ser36）及びHV2（Lys47,Pr
o66）からなる群から選択されるいずれかであるヒルジ
ン変異体。 - 【請求項２】硫酸化されたものである請求項１記載のヒ
ルジン変異体。 - 【請求項３】ペプチド鎖がグルコシル化されたものであ
る請求項１又は２記載のヒルジン変異体。 - 【請求項４】請求項１乃至３のいずれかに記載のヒルジ
ン変異体を含むトロンビン阻害剤。 - 【請求項５】請求項１乃至３のいずれかに記載のヒルジ
ン変異体の少なくとも一つを活性成分として含む抗凝固
剤。 - 【請求項６】請求項１乃至３のいずれかに記載のヒルジ
ン変異体を製造する方法であって、合成、部分合成、及
び／又は遺伝子操作の段階からなる方法。 - 【請求項７】以下のものを含むプラスミドにより又はヒ
ルジン変異体をコードする機能的DNAブロックにより予
め形質転換された酵母の醗酵からなる、請求項６記載の
方法： （１）酵母の２μプラスミドの複製起点； （２）ura3遺伝子； （３）イー．コリ（E.coli）の複製起点と、抗生物質抵
抗性のマーカー； （４）ヒルジン変異体をコードする配列の上流に相融合
した、転写プロモーター、先導配列、及びα−因子前躯
体のプレプロ配列； （５）ヒルジン変異体遺伝子の下流に位置するであろう
酵母PGK遺伝子の転写ターミネーター。
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