JPH029390A - ヒルジン変異体とその用途及び製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒルジン変異体、その用途及びその製造方法
に関する。

天然のヒルジンは、治療用ヒルの唾液腺から非常に歩合
分泌される、６５個及び６６個のアミノ酸からなるペプ
チドの混合物である（マルクワル）　（Ｍａｒｋｖａｒ
ｄｔ　）　１９７０　；ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏ
ｎ）ら１９７６、チャンク（Ｃｈａｎｇ　）１９６３；
　ドツト（Ｄｏｄ　ｔ　）ら１９８４，１９８５゜１９
８６；ハーベイ（ｌｌａｒｖｅｙ）ら１９８６）、最初
に記載された変異体ＨＶ１は、ヒルの体から単離された
ヒルジンに相当する。２番目のＨＶ２（ハーベイら１９
８６）はＨｖｌと９個のアミノ酸が異なり、３番目（ド
ツトら１９８６）はセリン３２までＨＶ２と同一で、Ｃ
末端側でアミノ酸（Ａｌａ”３）の添加を含む、１０個
のアミノ酸が異なる。この３番口の変異体をＨＶ３と称
する。

これら３変種の構造を第１図に記す。

これらの天然変異体は６５個又は６６個のアミノ酸を含
み、２つのドメインを認め得る＝３つのジスルフィド結
合を含む球状Ｎ末端部分と、プロトロンビン分子中のト
ロンビンによる切断部位と相同性を示す酸性Ｃ末端部分
である。この相同性は、４７位周囲の領域がヒルジンの
トロンビンに対する結合部位である可能性を示唆する。

この理由から、本出願人はヨーロッパ特許出願Ｎｏ、８
７．４０２８９８．８に、天然型とは４７位のアミノ酸
が異なるヒルジン変異体を既に記載している。

特に、変異体ＨＶ２　（Ｌｙｓ”　）は非修飾分子と比
べて、トロンビン阻害キネティクスの改善と、大きな抗
トロンビン活性を示すと記されている。

本発明の目的は、改善された生物学的性質を示す新しい
ヒルジン変異体を提供することにある。

まずはじめに、インビボでの活性を延長し、それによっ
て必要な治療用爪を減らすために、ヒルジン分子の薬物
動体学的プロフィールを改善する目的で、共有結合性の
翻訳後修飾を導入することが可能である。特に、炭化水
素側鎖はこの分子が循環から消失する原因となるポリペ
プチドの部位を覆うことができる。

この理由から、１又は２以上の、炭化水素鎖の添加を促
進することができるグリコジル化反応部位を分子上に創
造する。グリコジル化反応はしばしば、特異的な認識部
位であるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒの
Ａｓｎ残基上でおこり、ヒルジンでは、アミノ酸Ｌｙｓ
３５をアミノ酸Ｔｈｒ３５で置き換えてＡｓｎ３３−Ｇ
ｌｙ”−Ｔｈｒ３５という配列を導く修飾が、可能であ
る。

更に、天然のヒルジンは血球表面受容体が認識する特異
的部位を持たない。ヒルジンの生体内での作用様式を修
飾するためには、ヒルジン分子中にＡ　ｒ　ｇ−Ｇ　１
　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ−８ｅ　ｒ　（ＲＧＤＳ）という配列
を導入して細胞表面受容体との相互作用を良くすること
が有利である様に考えられた。

このＲＧＤＳ配列はフィブリノーゲンの血小板受容体Ｇ
　ｐＩＩ　ｂ　／　−ｍ　ａに対する結合に関係する部
位に存在する。最近の研究（ラッゲリ（Ｒｕｇｇｅｒｉ
　）ら１９８６）から、フィブリノーゲンとＧｐＩＩｂ
／　ｍ　ａの相互作用が血小板凝集に必要であり、ＲＧ
ＤＳ配列を含むペプチドは血小板凝集を阻害することが
示された。

最後に、ヒルジンが遺伝子工学的技術、特にサツカロミ
セス　セレビシェ（５ａｃｃｈａｒｏｎｙｃｅｓｃｃｒ
ｅｖ　ｉｓ　ｆａｅ）酵母を用いた発現と分泌によって
製造される場合、ヒルジンは産生の間にカルボキシペプ
チダーゼの影響によってＣ末端で好ましくない分解を受
けるかもしれないことがわかった。この分解を減じるた
めに、本発明は、この分子のＣ末端に１又は２以上のア
ミノ酸、例えばプロリン等を加えて修飾することを提案
する。

従って本発明の目的は、親ＨＶ変異体との比較において
、そのペプチド構造に以下の修飾の一つを含む、ヒルジ
ン変異体を提供することにある：（１）ＨＶにＡｓｎ−
Ｘ−Ｙという部位を少くととも１つ持つ。但しＸは任意
のアミノ酸、ＹはＳｅｒ又はＴｈｒである； （２）　Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓ　ｐ−８ｅ　ｔ
という配列が、あるアミノ酸配列と置きかわっである；
（３）少くとも１つのアミノ酸がＣ末端に添加されてい
る； また、親ＨＶ変異体は、ＨＶＩ、ＨＶ２、ＨＶ３、ＨＶ
２　（Ｖａ　１’　、Ｖａ　１２）、ＨＶＩ　（ＡＡ６
３’）　、ＨＶ２　（ＡＡ６３）、ＨＶ３　（ＡＡ”　
）　、ＨＶ２　（Ｖａ　１’Ｖａｔ２、ＡＡ６３）、Ｈ
Ｖ２　（Ｌｙｓ４７）、ＨＶ２　（Ｖａ　１’　、、Ｖ
ａ　１２、Ｌｙｓ”　）、ＨＶ２　（Ｌｙ　ｓ”　、Ａ
Ａ”　３）　、ＨＶ２（Ｖａｌ１、Ｖａ１２、ＬｙｓＬ
７、ＡＡ６３）から選ぶ。但しＡＡはＧｌｕ又はＡｓｐ
である。

親変異体はヨーロッパ特許出願８７．４０２６９６．６
に本出願人により記載された方法に従って得ることがで
きる。

本発明は特に、親ＨＶがＨＶ２　（Ｌｙｓ”　）で、上
記修飾の少くとも１つに加えて、或いは唯一の修飾とし
てＩ　ｌｅ’−Ｔｈｒ２の代わりにＶａ　１’　−Ｖａ
　１２のアミノ酸を含むハイブリッド分子の一群に関す
る。

問題の変異体は特に、ＨＶ２　（Ｌｙｓ”　）、ＨＶ２
　（Ｌｙｓ”　、ＡＡ６３）、ＨＶ２（Ｖａ　１’　、
Ｖａ　１２、Ｌｙｓ”　）　、ＨＶ２（Ｖａｌ’　、Ｖ
ａｌ２、Ｌｙｓ４７、ＡＡｅ３）である。

（１）の修飾に特に適する部位の１つは、ＨＶ２のアミ
ノ酸３３から３５に位置し、（Ｌｙｓ３５）を（Ｔｈｙ
”　）又は （Ｓｅｒ３５）で置き換えることである。

（２）の修飾に特に適する部位の１つは、アミノ酸３３
から３６に位置し、変異体（Ａｒｇ３３ＡＳＴ）３５．
５ｅｒ３８）で、特に親変異体がＨＶ２　（Ｌｙｓ”　
）であるものが最も優れている。

Ｃ末端には任意のアミノ酸を加えることができるが、プ
ロリンを使用すること（例えばＨＶ２（Ｌｙｓ”　、Ｐ
ｒｏ８ｅ））が望ましい。

最後に、本出願人によってヨーロッパ特許出願Ｎ　ｏ、
８７．４０２８９６．６に記載されている変異体ＨＶ２
（ＬｙｓＬ７）と比較して、より強いトロンビン阻害活
性、薬物動態学的性質の改善、より大きい安定性、及び
抗トロンビン作用の改善を得るために、以下の変異体が
非常に興味深い： Ａ　　Ｂ　　ＴＹＲ’ｒ）ｔＲＡＳＰ　ＣＹＳ　ＴＨＲ
ＧＬＵ　ＳＥＲＧＬＹ　ＧＬＮ　ＡＳＷ　ＬＥＤ　ＣＹ
Ｓ　ＬＥＵＣＹＳ　ＧＬＵ　Ｇ１１．、Ｙ　ＳＥＲＡＳ
Ｗ　ＶＡＩＩＣＹＳ　ＧＬＹ　ＬＹＳ　　ＧＬＹ　ＪＬ
５！ｆ　ＬＹＳ　　ＣＹＳ　　ＸＬＥＬＥＵ　ＧＬＹ　
ＳＥＲＡＳＷ　ＧＬＹ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＡＳＷ　ＧＬ
Ｎ　ＣＹＳ　　ＶＭ、ＴＨＲＧＬＹ　ＧＬＵＧＬＹ　Ｔ
ＨＲＰＲＯＩ、ＹＳ　　ＰＲＯＧＬＵ　ＳＥＲＨＸＦｉ
　ＡＳＷ　ＡＳＷ　ＧＩ、Ｙ　ＡＳＰ　ＰＨＩ　ＧＩ、
ＵＧＩ、Ｕ　ＸＬＥ　　ＰＲＯＧＬＵ　ＧＩ、Ｕ　　Ｃ
ＬＥＴＪ　ＧＬＮ但し、Ａ−Ｂはｌ１ｅ−Ｔｈｒ又はＶ
ａｌ−Ｖａｌを表し、ＣはＧｌｕ又はＡｓｐを表す。

実際上、チロシンｅ３の硫酸化は恐らく、天然のヒルジ
ンと遺伝子組換によって得られるヒルジンとの間に、ス
トーン（Ｓｔｏｎｅ　）とホフスティーング（ｌｌｏｆ
ｓｔｅｅｎｇｅ）　　（１９８６）のキネティ”／りの
研究で示唆された様に、重要な差異を作るものと思われ
る。

この理由により、上記変異体において、（Ｔｙ　ｒ６３
）はＧｌｕ又はＡｓｐで置き換えた。

上記修飾は同時に起き得る。

上記の変異体のうち、下記のものが好ましいものとして
挙げられる。

ＨＶ２　（Ｌｙｓ”　、Ａｓｐｅ３） ＨＶ２　（ＬｙｓＬ７、Ａｓｎ３３−Ｇｌｙ”−Ｔｈｒ
３５） ＨＶ２（ＬｙｓＬ７、Ａｒｇ３３、Ａｓｐ３５Ｓｅｒ３
８） ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”　、Ｐｒｏｅ８）以下の変異体も
同様である： （Ｖａ　１’　−Ｖａ　１２）ＨＶ２　（Ｌｙｓ”　）
（Ｖａ　　１　　’　　−Ｖａ　　１２　）　　ＨＶ２
　　（Ｌｙ　　ｓ”Ａｓｐ＋３３） （Ｖａ　１’　−Ｖａ　１２）ＨＶ２　（Ｌｙｓ”Ｔｈ
ｒ３５） （Ｖａ　Ｉ’　−Ｖａ　ｌ２）ＨＶ２　（Ｌｙｓ”Ａｒ
ｇ３３、Ａｓｐ３５．５ｅｒ３ｅ）（Ｖａ　Ｉ’　−Ｖ
ａ　ｌ２）ＨＶ２　（Ｌｙｓ”Ｐｒｏθθ） Ｔｙｒ［１３を保持する異なる変異体が硫酸化体又は非
硫酸化体で使用できる。この硫酸化は化学的又は生物学
的に得ることができる。

本発明は上記変異体を製造できる生物学的及び／又は化
学的方法を包含する。

これらの変異体は実際上、合成又は部分的合成及び／又
は公知の工学技術によって得ることができる。

このようにして、例えば、ＨＶ２をコードする配列のク
ローニングと発現、及び対応するヒルジンの、酵母から
の産生はヨーロッパ特許ＥＰ−Ａ−２００，６５５公報
に記載されている。

本発明による変異体は、ＨＶ２をコードする配列を、例
えば特異的変異誘起によって修飾した後、上記と同様の
技術で得ることができる。

特に、インビトロでの定方向変異誘起によって、ＨＶ２
変異体は、Ａｓｎ”がＬｙｓによって置きかえられ、か
つ、、Ｌｙｓ３５がＴｈｒによって置きかえられるか、
Ａｓｎ３３がＡｒｇにより置きかえられるか、、Ｌｙｓ
３５がＡｓｐによりかつＧ１　ｙ　３　ｅがＳｅｒによ
り置きかえられるか、Ｔｙ　ｒ　Ｅｌ　３がＡｓｐによ
り置きかえられるか、又はその代りにＩ　１　ｅ’　−
Ｔｈ　ｒ２配列がＶａｌ’−Ｖａ　１２により置きかえ
られている。

特に、特許出願ＥＰ−Ａ−２００，６５５に記載されて
いる様に、機能的発現ブロックを使用することも可能で
ある。このブロックでは、ヒルジン配列は上記変異体を
コードする。これらの機能的ＤＮＡブロックをプラスミ
ドベクターによって持ち込むことが可能である。

異なる変異体に対応する遺伝子を酵母において発現し分
泌させるために、酵母のためのベクターが遺伝子に組込
まれる。このベクターは、特許ＥＰ−Ａ−２００，６５
５に記載されている、以下の要素を含むことが好ましい
： （１）酵母の２μプラスミドの複製起点（２）ｕｒａ３
遺伝子 （３）イー、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の複製起点と抗生
物質抵抗性のマーカー （４）ヒルジン変異体をコードした配列から上流に相融
合した、転写プロモーター、先導配列、及びα−因子の
前駆体のプレプロ配列 （５）ヒルジン変異体の遺伝子から下流に位置されるで
あろう酵母ＰＧＫ遺伝子の転写ターミネータ− 本発明はこれらのベクター又はこの機能的ＤＮＡブロッ
クによって形質転換された酵母にも関する。

特に、本発明は、本発明の酵母の醗酵、及び培養基中に
成熟型又はインビトロで成熟可能な前駆体型で産生じた
ヒルジンの回収による、ヒルジン変異体を製造する方法
に関する。

使用した技術は特許出願Ｅ　Ｐ　−Ａ　−２００，６５
５及びＥ　Ｐ　−８７，４０１８４９，８に既に詳細に
記載されている。

このようにして得たヒルジン変異体は、特許出願ＥＰ−
Ａ−２００，６５５に記載されている様に、インビボ及
びインビトロの双方におけるトロンビン阻害剤として使
用できる。

特に、これらの変異体は、単独もしくは他の活性成分と
共に、医薬組成物として、又はインビトロやインビボで
の試験や診断に使用できる。後者の場合、変異体を例え
ば放射能、蛍光、酵素、又は他のラベル手段で標識する
ことが望ましい。

以下に本発明の実施例を、第１図及び第２図を用いて示
す。

実施例コ インビトロでの定方向突然変異を行なうために、修飾し
たいＤＮＡ断片を一本鎖ファージＭ１３の複製型中にク
ローンする。組換えファージのゲノムを単離し、突然変
異した配列を持つ合成オリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズする。このオリコヌクレオチドは（■補的ＤＮＡ鎖
を複製するブライマーとなる。そして、このように二本
鎖にしたＤＮＡで受容体細菌を形質転換すると、この細
菌は必要な変異を持つファージを産生ずるようになる（
シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）　％スミス（Ｓｍｉｔｈ　）、
（１９６３））。

ヒルジンＨＶ２をコードする配列を処理して酵母中の機
能的「発現カセット」内にいれ、合成されたタンパク質
を分泌させた。このために、酵母のα−フェロモンのプ
レプロ配列をコードするＤＮＡセグメントを遺伝子の上
流に置いた。この構造はｐＴＧ１６３３と呼ぶ。

ヒルジンの発現カセットをＰｓｔＩ−ＢｇｌｌＩ断片の
形で回収し、ファージＭ１３１導体であるＭ１３７Ｇ１
３１に導入しくキーニー（Ｋｌｅｎｙ　）ら（１９６３
））　、そこで引続き変異誘起を行った。

プレプロ配列に変異誘起を行なってＨｉｎｄｍ認識配列
を創造し、それによって、ヒルジンをコードする配列の
融合と、後者と様々な変異配列との迅速な交換を、リー
ディングフレームを保持して合成タンパク質の正しい変
異をおこす一方で、可能にした。

変異された配列を以下に示す： ・・・ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＴ
　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＡＣＧＨｉｎｄＩ［［ 変異をＨＶ２をコードする配列に導入し、Ａｓｎ”をＬ
ｙｓ”により置きかえた。この変異誘起には以下のオリ
ゴヌクレオチドを用いた：５°ＣＴＴＴＣＡＧＧ工ＣＧ
ＧＴＧＴＡＣ３゜これら２つの変異した発現カセットを
持つファージＭ１３誘導体をＭ１３ＴＧ１９４５と呼び
、これは、以下の全ての変異のブライマーとなる。

ＨＶ２をコードする配列に、更に変異を起こすために、
以下のオリゴヌクレオチドを用いた：ＴＧ１１５２：５
°ＣＴＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＣＡ３′ＴＧ１
１５３　：　５　’　ＴＧＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧ
ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧ３　’ＴＧ１１５４　：　
５　’ＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＡＣＡＡＴＧ３　’
ＴＧ１１５５：５°にＡＴＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ
ＡＴＡＣＡＧＡＣＴ３゜ＴＧｌ１５６：５°ＴＡＴＴＴ
ＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡ３゜これらの
変異配列は各々以下の変異体に対応する： ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”　、Ｔｙ　ｒ３５）ＨＶ２　（Ｌ
ｙｓ”　、Ａｒｇ３３、Ａｓｐ３５Ｓｅｒ３８） ＨＶ２　（Ｌｙｓ”、Ａｓｐθ３） ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”　、Ｖａ　１’　、Ｖａ　１２）
ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”、ＰｒｏθＢ） この変異は以下の条件下で行った： 各オリゴヌクレオチド１２０ｐｍｏｌを１００μＱの反
応液中でリン酸化し、リン酸化されたオリゴヌクレオチ
ド約２０　ｐ　ｌｌ１ｏｌをファージＭ１３ＴＧ１９１
９の一本鎖ＤＮＡ１ｐｍｏｌ　と、ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液２５μＱ中でハイブリダイズした。

ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡ５混合液にクレノ
ー　ポリメラーゼとファージＴ４リガーゼを作用させた
。このように処理した各々の混合液を用いて、インデイ
ケータ−細菌ＪＭ１０３菌叢上のイー、コリ（Ｅ、　Ｃ
ｏ１１）菌株７１／１８（ｍｕｔＬ）を形質転換した（
メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）ら（１９８１））、感
染細胞はプラーク形成が遅いことで同定できる；コロニ
ーは完全培地に継代培養し、ファツトマン５４０（Ｗｈ
ａｔａ＋ａｎ　５４０　）紙上に移して、変異ファージ
を持つ細胞をスクリーニングした。

変異誘起に使用したオリゴヌクレオチドとインシラでハ
イブリダイズして、変異配列を持つファージを同定する
。変異配列を持つ以下のファージが得られた； Ｍ１３ＴＧ１９４６→ ＨＶ２　（Ｌｙｓ’　７、Ｔｈ　ｒ３５）Ｍ１３ＴＧ１
９４７→ ＨＶ２　（ＬｙｓＬ７、Ａｒｇ３３ Ａｓｐ３５、Ｓｅｔ”） Ｍ１３ＴＧ１９４８→ ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”、Ａｓｐ”３） Ｍ１３ＴＧ１９４９→ ＨＶ２　　（Ｌｙ　ｓ”　、Ｖａ　１’Ｖａ　１２） Ｍ１３ＴＧ１９５０→ ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”　、Ｐｒｏ６６）実施例２ 発現／分泌ベクターｐＴＧ２６３５は以下の成分からな
る： （１）イー、コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）内でのプラスミド
の増殖と選択を可能にする、プラスミドｐＢＲ３２２の
複製起点とアンピシリン抵抗遺伝子（２）酵母の２μプ
ラスミドの複製起点と、ｕｒａ３−酵母株の選択マーカ
ーである酵母ｕｒａＢ逍伝子 （３）他の選択マーカー、宿主株の欠損１ｅｕ２遺伝子
を補足する酵母１ｅｕ２遺伝子 （４）酵母のα−フェロモン遺伝子の転写プロモーター
と、酵母ＰＧＫ遺伝子の転写ターミネータ（５）ヒルジ
ン遺伝子の融合と、合成タンパク質の正しい成熟が可能
となるＨｉｎｄｌＩｒ認識配列を創造する操作をした、
酵母のα−フェロモン遺伝子のプレプロ配列。

選択的変異を持ち、ファージＭ１３ＴＧ１９４６．１９
４７．１９４８．１９４９、及び１９５０に担われた、
ヒルジンをコードする配列を、Ｈｉｎｄｍ断片の形で回
収し、ベクターｐＴＧ２６３５に再導入１．て、次のプ
ラスミドを得た： ｐＴＧ２９８２→ ＨＶ２　（Ｌｙｓ”　、Ｔｈｒ３５） ｐＴＧ２９６３→ ＨＶ２　　（Ｌｙｓ’　７、Ａｓｐ”　）ｐＴＧ２９８
８→ ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”　、Ａｒｇ３３ ＡＳｐ３５．５ｅｒ３Ｂ） ｐＴＧ２９８９→ ＨＶ２　　（Ｌｙ　ｓ”　、Ｖａ　１’Ｖａ１２） ｐＴＧ２９９０→ ＨＶ２　　（Ｌｙｓ”　、Ｐｒｏ６６）ニス、セレビシ
ェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ　）酵母株ＴＧＹｌｓ
ｐ４　　（ｍａｔα　　ｕｒａ３．　２５１゜３７３．
３８　　ｈｉｓ０３．１１．１５）をこれらの異なるプ
ラスミドで形質転換した。

これらの株によって産生じた種々のヒルジン変異体の抗
トロンビン活性を比較した（第２図）。

各菌株をはやしたＯＤｓ　ｓ　ｏ　＝０．０２の培養物
２０ｍ（！　（ＹＮＢＧ＋０．５９６７４７ザミ／酸）
　を、３０℃で４８時間攪拌した後、遠心しく５００Ｏ
ｒ　ｐｍ、５ｍ　ｉ　ｎ）　、上清をアッセイした。

ＴＧＹＩ　ｓｐ４　　ｐＴＧ８８１　（ＨＶ２をコード
する配列を持たないプラスミド）培養物をコントロール
として使用した。粗製上清でトロンビン活性（合成基質
クロモザイムＴＨ，ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）に対するタンパク
質加水分解活性）に対する阻害効果を測定した。上清量
当り阻害パーセントを第２図に示す。

この結果から明らかに、ヒルジン配列の修飾は抗トロン
ビン活性の減少をおこさず、又は酵母の産生力を減じな
い。

これらの新しい分子をインビボで抗トロンビン剤として
使用することが考えられる。

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（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ、　Ｍ、）　、）ルストシエフ、ピ
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エンス　ニーニス−Ｌ　−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
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（１９７０）０メツシング、ジエイ、　　（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ　、　Ｊ、）　、フレア、アール、　　（Ｃｒｅａ
、　Ｒ，）　、シーブルグ、ピーエッチ、（Ｓｅｅｂｕ
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ド　リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）９
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Ｅ、）、ロバーツ、エッチ、アール、　　（Ｒｏｂｅｒ
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ル。

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ッソン、ニス。

（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　ＳＳ、）　、プロタイド、バイ
オロジ、フルイド、プロシーデインゲス　オブ　コロキ
ウム（Ｐｒｏｔｉｄｅｓ％Ｂｉｏ１．　、Ｆｌｕｉｄｓ
、　Ｐｒｏｃ。

Ｃｏ１１ｏｑ、　）　２３．１４５−１４９　（１９７
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　、Ｚ、Ｍ、）、ホートン、アール、　−Ｌ−、（Ｉｌ
ｏｕｇｈｔｅｎ、　Ｒ，Ａ、）、ラッセル、ニス、アー
ル、　　（Ｒｕｓｓｅｌｌ　、Ｓ、Ｒ，）、シマーマン
、ティー、ニス、　　（Ｚｌｍｍｅｒｍａｎ　ＳＴ。

Ｓ、）、プロシーデインゲス　オブ　ザ　ナショナル　
アカデミ−オブ　ザ　サイエンス　ニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１、ＵＳＡ）６
３．５７０８−５７１２　（１９８６）０ストーン、ニ
ス、アール、　　（Ｓｔｏｎｅ　、　Ｓ、Ｒ，）、ホフ
スティーン、ジエイ、　　（Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ、　
Ｊ、）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、）　
２５．Ｏシラー、エム、ジエイ、　　（Ｚｏｌｌｅｒ、
　Ｍ、Ｊ、）　、スミス、エム、エフ、　　（Ｓｍｉｔ
ｈ　ＳＭ、Ｎ、）　、メソッド　イン　エンザイモロジ
−１００，４６９

【図面の簡単な説明】

第１図はヒルジンの天然変異体３種の配列を示す。第２
図はクロモザイムに対するトロンビンのタンパク質加水
分解活性に対する、阻害パーセントを、ヒルジン変異体
ＨＶ２　（Ｌｙｓ”　）（ＨＶ２Ｌと呼ぶ） を産生する酵母培養物の上清 量として示す。 （以 上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］親ＨＶ変異体と比較して、以下の修飾の１つをペ
   プチド構造に含む、ヒルジン変異体であり：（１）Ａｓ
   ｎ−Ｘ−Ｙという部位を少くとも１つ持つ。但しＸは任
   意のアミノ酸、ＹはＳｅｒ又はＴｈｒである； （２）あるアミノ酸配列に置きかわって、 Ａｒｇ−Ｇ１ｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒという配列がある； （３）Ｃ末端に少くとも１つのアミノ酸が加わっている
   ； 且つ親ＨＶ変異体は以下から選ばれる； ＨＶ１、ＨＶ２、ＨＶ３、ＨＶ２（Ｖａｌ＾１、Ｖａ１
   ＾２）、ＨＶ１（ＡＡ＾６＾３）、ＨＶ２（ＡＡ＾６＾
   ３）、ＨＶ３（ＡＡ＾６＾４）、ＨＶ２（Ｖａｌ＾１、
   Ｖａ１＾２、ＡＡ＾６＾３）、ＨＶ２（Ｌｙｓ＾４＾７
   ）、ＨＶ２（Ｖａｌ＾１、Ｖａｌ＾２、Ｌｙｓ＾４＾７
   ）、ＨＶ２（Ｌｙｓ＾４＾７、ＡＡ＾６＾３）、ＨＶ２
   （Ｖａｌ＾１、Ｖａ１＾２、Ｌｙｓ＾４＾７、ＡＡ＾６
   ＾３）、但しＡＡはＧｌｕ又はＡｓｐである。 ［２］特許請求の範囲第１項記載の変異体のうち、以下
   から選ばれたもの： ＨＶ２（Ｌｙｓ＾４＾７）、ＨＶ２（Ｌｙｓ＾４＾７、
   ＡＡ＾６＾３）、ＨＶ２（Ｖａｌ＾１、Ｖａ１＾２、Ｌ
   ｙｓ＾４＾７）及びＨＶ２（Ｖａｌ＾１、Ｖａ１＾２、
   Ｌｙｓ＾４＾７、ＡＡ＾６＾３）。 ［３］特許請求の範囲第２項記載の変異体のうち以下か
   ら選ばれたもの： ＨＶ（Ｔｈｒ＾３＾５）及びＨＶ（Ｓｅｒ＾３＾５）。 ［４］特許請求の範囲第３項記載の変異体のうち以下か
   ら選ばれたもの： ＨＶ２（Ｌｙｓ＾４＾７、Ｔｈｒ＾３＾５）、ＨＶ２（
   Ｓｅｒ＾３＾５、Ｌｙｓ＾４＾７）、ＨＶ２（Ｖａｌ＾
   １、Ｖａｌ＾２、Ｔｈｒ＾３＾５、Ｌｙｓ＾４＾７）、
   ＨＶ２（Ｖａｌ＾１、Ｖａｌ＾２、Ｓｅｒ＾３＾５、Ｌ
   ｙｓ＾４＾７）。 ［５］特許請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記
   載の変異体のうち、（Ａｒｇ＾３＾３、Ａｓｐ＾３＾５
   、Ｓｅｒ＾３＾８）という部分構造を持つもの。 ［６］特許請求の範囲第１項に記載の変異体のうち、当
   該変異体が、ＨＶ２（Ｌｙｓ＾４＾７、 Ａｒｇ＾３＾３、Ａｓｐ＾３＾５、Ｓｅｒ＾３＾６）で
   あるもの。 ［７］特許請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記
   載の変異体のうち、Ｃ末端に１つのアミノ酸が加わって
   いるもの。 ［８］特許請求の範囲第７項に記載の変異体のうち、Ｃ
   末端のアミノ酸がＰｒｏであるもの。 ［９］特許請求の範囲第１項に記載の変異体のうち、当
   該変異体が、ＨＶ２（Ｌｙｓ＾４＾７、 Ｐｒｏ＾６＾６）であるもの。 ［１０］特許請求の範囲第１項に記載の変異体のうち、
   ＨＶ２（ＡＡ＾６＾３、Ｌｙｓ＾４＾７）及びＨＶ２（
   Ｖａｌ＾１、Ｖａ１＾２、ＡＡ＾６＾３、Ｌｙｓ＾４＾
   ７）から選ばれるもの。但しＡＡはＧｌｕ又はＡｓｐ。 ［１１］特許請求の範囲第１項から第１０項のいずれか
   に記載の変異体のうち、硫酸化されたもの。 ［１２］特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれか
   に記載の変異体のうち、ペプチド鎖がグリコシル化され
   たもの。 ［１３］特許請求の範囲第１項から第１２項のいずれか
   に記載の変異体からなるトロンビン阻害剤。 ［１４］特許請求の範囲第１項から第１２項のいずれか
   に記載の変異体の少くとも１つを活性成分として含む抗
   凝固剤。 ［１５］特許請求の範囲第１項から第１２項のいずれか
   に記載の変異体を含む医薬品。 ［１６］特許請求の範囲第１項から第１２項のいずれか
   に記載の変異体を製造する方法であつて、合成、部分合
   成、及び／又は遺伝子操作の段階からなる方法。 ［１７］以下のものを含むプラスミドにより又はヒルジ
   ン変異体をコードする機能的ＤＮＡブロックにより予め
   形質転換された酵母の醗酵からなる、特許請求の範囲第
   １６項に記載の方法： （１）酵母の２μプラスミドの複製起点； （２）ｕｒａ３遺伝子； （３）イー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点と、抗生
   物質抵抗性のマーカー； （４）ヒルジン変異体をコードする配列の上流に相融合
   した、転写プロモーター、先導配列、及びα−因子前駆
   体のプレプロ配列； （５）ヒルジン変異体遺伝子の下流に位置するであろう
   酵母ＰＧＫ遺伝子の転写ターミネーター。