JPS61192289A - ブタエラスタ−ゼ２の生物工学的製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明のνＶ圓 比術分野 本発明、ブタゴーラスター１２１の生物］二学的製造に
関ηる。さらに具体的には、本発明は、（１）ブタエラ
スターＬ’ＴＩの生物１丁学的産生能を有する１）　Ｎ
　Ａ鎖、（２）このＤＮＡ鎖をその遺伝情報が発現可能
４Ｔ状態で含むプラスミドによって形質転換されたゾタ
エラスターピ■産生性微生物、す゛なわら上記１）　Ｎ
　Ａ鎖の１１１質を告ら利用りる物、おＪ：び（３）こ
の微生物の培養によるブタ］−ラスターゼＩＩの生産法
、”Ｊ’　＜’にわち」−記ＤＮＡ鎖を使用Ｊる方法、
に関Ｊ−る。 一般に、エラスターゼは、吐乳動物ｌｌｉＩｉｍ１１１
胞等にＪ：って産生される所謂レリンプロテアーぜの一
種であって、不溶性硬蛋白であるＩラスヂンを分解する
ぎわめで特異なブ１コアアーＵである。、１ラスターゼ
は経口投与で人の動脈硬化症等の治療に有効であること
が確認されており、従来ブタの膵臓から抽出された所謂
ブタエラスターゼが医薬品（血管代謝改善剤）として既
に実用化されている。 哺乳動物の膵臓細胞て゛は、２種類のエラスターゼが産
生され、それらは互いに物理化学的に、酵素学的にまた
抗原性の面から異なっていて、エラスターゼ■および■
ラスターゼ■どそれぞれ呼ばれている。なお、医薬品と
して実用化されているブタエラスターゼは、前者を有効
成分とするものであるが、後者についても同様の薬効が
期待されている。 エラスターゼは、■、■どもに、それぞれ、膵臓細胞内
でプレプロエラスターゼとして産生され、これが細胞外
に分泌されるときにプロエラスターゼ（不活性なエラス
ター１！前駆体）となり、さらに細ｎ（外でトリプシン
等の酵素作用を受Ｇ′：Ｉてエラスヂン分解活性を右す
るエラスターゼに変化するものと考えられている。 先行技術 ブタエラスターゼＩＴ　ニー）　イＴは、Ｄ、Ｈ，５１
１０ｔｔＯｎｅｔ　ａｔによりイのアミノ酸配列が報告
されている（Ｎａｔｕｒｅ、　２２５　Ｆｅｂ　２８．
８０２（’１９７０）　）。 また、ラットエラスターゼ■おＪ：び■についでは、Ｒ
ａｙｍｏｎｄ　Ｊ、　ＨａｃＤｏｎａｌｄ　ｅｔ　ａｌ
らが行った分子生物学的解析にＪ：す、関連づるｍＲＮ
△の塩基配列並びにアミノ酸配列が解明されている（　
Ｂ１０ＣｈＱＩｉＳｔｒＶ、　２１．１４５３−１４６
３（１９８２）　）。 ざらにヒトエラスターゼについてはｃ、　ｔａｒｇｍａ
ｎａｔ　ａｌににす、■と■がヒトの膵臓組織から精製
されて、それらの性質が調査報告されている（　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｌ：ｒｙ、　１５（１１）、２４９１（１
９７６））　。さらに、ヒトエラスターゼＩＩのプロ体
については、イのＮ末端のアミノ酸配列（１６ケ）も報
告され−Ｃいる（Ｃ，Ｌａｒｇｍａｎ　ｅｔ　ａｌ　　
：　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ａｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａＡｃｔａ　６２３（１９８０）２０８−２１２　＞。 発明の概要 要　　旨 本発明は、絹換えＤＮＡ技術による新規なブタ■ラスタ
ーゼＩＩの製造手段を提供Ｊ−るものである。 すなわち、本発明によるブタエラスターゼＩＩの生物工
学的産生能を有するＤＮＡ鎖は、下記の（１）〜（３）
から＜＞る群から選ばれるアミノ酸配列のポリペプチド
をコードする塩基配列を有すること、を特徴とするもの
である。 また、本発明によるブタ■ラスターゼ■産生能を有する
微生物は、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれ
るアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を
有するＤＮＡ鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含む
プラスミドによって形質転換されたものであること、を
特徴とするものである。 さらにまた、本発明によるブタエラスターゼＩＩの生物
工学的製造法は、下記の（１）〜（３〉からなる群から
選ばれるアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基
配列を有するＤＮＡ鎖を用意し、このＤＮＡ鎖を、これ
をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミドの作
成、このプラスミドによる微生物の形質転換おＪ：び得
られた形質転換体の培養からなる■程に付して、培養物
中にブタエラスターゼＩＩを産生さｔ！ることを特徴と
１６ものである。 （１）　第１図および第２図にわたって示されているア
ミノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２）　第１
図および第２図にわたって示されているアミノ酸配列の
うち、ＢからＤまでのもの、（３）　第１図および第２
図にわたって示されているアミノ酸配列のうち、△から
Ｄまでのもの。 なお、本発明は上記の（１）〜（３）からなる群から選
ばれるアミノ酸配列のポリペプチドからなる、微生物に
よって生産されたブタエラスターゼ■、に関Ｊるものと
もいえる。 効　　果 本発明にＪ：れば、ブタエラスターゼＩＩを、形質転換
させた微生物により産生させることができる。 従って、膵臓器から抽出する方法に比べ、より有効にブ
タエラスターゼＩＩを産生さ１Ｊ、単１１１１ノ得る可
能性がある。 また、本発明の好ましい一実施態様（詳細後記）によれ
ば、ＤＮＡの発現産物として直接活性を有するブタエラ
スターゼＩＩを産生させることができる（膵臓から１ラ
スターゼを抽出する場合には、不活性なプロエラスター
ゼとして存在するので、精製操作に加えて活性化処理を
行なうことが必要であった）。 なお、組換えＤＮＡ技術が今日非常な発展を遂げている
とはいえ、個々の蛋白に関して常にそれをコードする遺
伝子のクローニングとその発現（産生）成功を予測し得
るほどには到っていないのが現状なので、本発明により
ブタエラスターゼＩＩを産生させ（ｑたことは思いがす
なかったことというべきであろう。 定　　義 本発明によるブタエラスターゼＩＩの生物工学的産生能
を有するＤＮＡ鎖すなわちブタエラスターゼＨＭ伝子は
、アミノ酸配列が第１図および第２図にわたって示され
ているアミノ酸配列のうちＣから１〕までのもの、Ｂか
ら［〕までのもの、また（ま△からＶ）までのもの、で
あるポリペプチドをコードするものである。なお、第１
図はΔから始まるアミノ酸配列の１〜１８０番を、第２
図はそれに続く１８１〜２６９番を示づものであること
はいうまでもない（第２図には、２６９番目のアミノ酸
に対応Ｊるコードンに続り１）Ｎ八も示されている）。 ここで、ｒＤＮＡ鎖」とはある長さを有するボリデＡＶ
ニジリボ核酸の相補的二本鎖を意味するものである。そ
して、本発明ではこのｌ”　ＯＮΔ鎖」はそれがコード
Ｊるポリペプチドのアミノ酸配列にＪ：って特定されて
いるところ、このポリペプチドは上記にＪ：うに有限の
艮ざのｂのであるから、このＤ　Ｎ　Ａ鎖も有限の長さ
のｂのである。しかし、このＤＮＡ鎖はブタエラスター
ゼ１１の遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工
学的産イ［を行なわ１↓るものであるところ、この有限
の艮ざのＤＮＡ鎖のみにＪ：つてこのにうな生物Ｔ学的
産イ１−が行イ１えるのでＧＥＬなく、イの５′　−側
上流Ｊ３よび（または）３′　−側下流に適当良さのＤ
　Ｎ　Ａ鎖が結合した状態でこのポリペプチドの生物Ｔ
学的産生が可能どなる訳である。従って、本発明でｒＤ
ＮＡ鎖」というどきは、この特定の長さのもの（第１〜
２図の対応アミノ酸配列でいえばＣ−ＤｌＢ−Ｄまたは
Ａ−Ｄの長さ）の外に、この特定の良さのＤＮＡ鎖を構
成Ｕとする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態に在るものを
も包含するものとする（ただし、発明の性質からいって
、このＤＮＡ鎖はブタ膵緘中に存在する場合を含まない
ことはいうまでもない。本発明によるＤＮＡ鎖を「ブタ
エラスターゼＩＩの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖
」と呼ぶ所以である）。 本発明にＪ：るＤＮＡ鎖の存在状態のうち代表的なのは
、このＤＮＡ鎖を構成員の一部どするプラスミドの形態
ならびにプラスミドとして微生物、特に大胆菌および酵
母菌、中に存在する形態である。 本発明にＪ：るＤＮＡ鎖の一つのそして好ましい存在形
態としてのプラスミドは、パッセンジ

【？−ないし外来
遺伝子どしての本発明１）　Ｎ　Ａ鎖と微９物中で安定
に存在して複製司能なプラスミドベクターと本発明ＤＮ
Ａ鎖をｍＲＮＡへ転写さ口るプロモーターとを一体に結
合させたものである。プラスミドベクターおよびプロモ
ーターどしては公知のものを適宜組合わせて用いること
ができるが、次のものを例示することができる。 −１１記のように、本発明によるＤＮＡ鎖はこれがコー
ドするポリペプチドのアミノ酸配列によって特定されて
いる。 このポリペプチドは、アミノ酸配ＩＪ＋が第１〜２図に
わたって示されているアミノ酸配列のうちＣ−Ｄ、Ｂ−
ＤＪ：たはＡ−Ｄのものであるものである。ここで、ア
ミノ酸配列がＣ−Ｄ、Ｂ−ＤおよびＡ−Ｄのポリペプチ
ドは、それぞれブタエラスターゼ■、ブタプロエラスタ
ーゼ■おにびブタプレプロエラスターゼ■である。 ブタエラスターゼ■は、２４１個のアミノ酸からなるも
のである。 ブタプロエラスターゼ（Ｂ−Ｄ）は、上記のブタエラス
ターゼＩ（Ｃ−１））のＮ−末端に１２個のアミノ酸が
結合したものに相当する。 ブタプレプロエラスターゼＩＩ　（Ａ−Ｄ）は、このブ
タプロエラスターゼＩＩ（Ｂ−Ｄ）のＮ−末端にさらに
１６個のアミノ酸が結合したものである。 これらのエラスターゼ■化合物（上記３種を含めたもの
）は従来そのアミノ酸配列が知られていなかったもので
ある。 ＤＮＡ鎖の１′ｉ！１基配列 ブタエラスターゼ■化合物が３種存在することににって
、イれをコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖も基本的
には３種存在りる。 ブタエラスターゼＩＩをコードするＤＮＡ鎖は、第１〜
２図のＣ−Ｄの塩基配列を持つものまたはその縮重異性
体である。ここで「縮重寞竹体」とは、縮重二ｌ−トン
においてのみ巽なっていて同一のポリペプチドをコード
することのできるＤＮＡ鎖を意味するものどする。たど
えば、第１〜２図のＣ−ｒ）の塩基配列を持つＤＮＡ鎖
に対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコードンた
とえばＮ−末端のＶａｌに対応するコードン（Ｇ　Ｔ　
Ｔ　）がこれと縮重関係にあるたとえばＧＴＣに変った
ものを本発明では縮重異性体と呼ぶものどする。 好ましい具体例は、５′　−側上流に接しＣ開始］−ト
ンＡＴＧと３′　−側末端に接して停止コードンを少な
くとも１個（そのうらの一つは、たとえばＴＧＡ）を持
つものである。 ブタプロエラスターゼＩＩを：１−ドするＤＮＡ鎖は、
第１〜２図のＢ−Ｄの塩基配列を持つものまたはその縮
重異性体である。ブタプロエラスターゼＩＩをコードす
るＤＮＡ鎖も、その５′　−末端に開始コードンΔＴＧ
を、また３１−末端に停止コードンを少なくとも１ｌｌ
ｌｉｌ（そのうちの一つは、たとえばＴＧＡ）を有り−
ることが好ましい。 ブタプレブ［１エラスターゼＩＩをコードするＤＮＡ鎖
は、第１〜２図のＡ−ＤのＪｎＭ配列を持つものまたは
その縮重異性体である。このＤＮＡ鎖はその５′　−末
端に開始コードンＡＴＧを有するが、このＤＮＡ鎖もそ
の３′　−末端に停止コードンを少なくとも１個（その
うちの一つは、たとえばＴＧＡ）を有りることが好まし
い。 上記のいずれのブタエラスターゼ■化合物をコードづる
ＤＮＡ鎖においても、該ポリペプチドのＣ−末端のΔｓ
ｎに対応する］−トン（図示の例では△ＡＣ）の３′　
−側下流には、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖（その最初
の部分は、ＴＡＧのような停止コードンであることがふ
つうである）がある長さで続いていることができ、また
そのさらに３′　−側下流に真核生物遺伝子共通のポリ
（Ａ）鎖が付加していてもよい。ポリ（Ａ）鎖が付加し
ている場合には、それの５′　−側上流の上記非翻訳領
域にはＡＡＴＡＡＡというポリ（Ａ）付加シグナルが含
まれていることがふつうである。なお、第１〜２図に示
したＤＮＡ鎖（５′　−末端のＡＴＧから３′　−末端
のポリ（Ａ）鎖まで）の塩基配列は、ブタプレプロエラ
スターゼＩＩのｒｒ＋ＲＮＡから得たＧ　ｌ）　Ｎ　Ａ
について７４二４ツム・ギルバート法によって決定した
ものである。 ＤＮＡ皿μｌＩ 上記のブタエラスターゼ■化合物のアミノ酸配列を二ｒ
−ドする塩基配列を有するｌ）　Ｎ　Ａ鎖を取得する一
つの手段は、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少なく
とも一部を化学合成することである。 結合アミノ酸が少なくとも２４１個であるということを
考えれば、この化学合成法よりもブタ膵臓から得たｍＲ
ＮＡからの′Ｍ累的な方法による方が好ましいといえる
。 すなわｌう、ブタＪラスターゼ■遺伝子の製造のために
はブタエラスターゼｍＲＮＡを含む臓器よりｍＲＮＡを
取得し、これをテンプレートとして逆転写酵素を用いて
ｃＤＮＡバンクを作成し、ぞのＣＤＮＡバンクの中から
適当なプローブを用いて、ブタエラスターゼＩＩＩ伝子
を含むクローンを取得するのが一般的方法である。この
プローブとしては、ラットエラスターゼ■遺伝子の一部
を利用するのが便利である。一般に、生物界において同
一の機能を司るタンパク質はアミノ酸−泡構造レベルど
ともにＤＮＡ塩基配列レベルでも相同性があることが知
られており、その場合に系統発生的に近縁のものほど相
同性は高い。ブタとラットでは、本発明者らが遺伝子取
得後に比較した結果では、アミノ酸、ＤＮＡ配列とも８
０％程度の相同性が見られた。ラットエラスターゼ■遺
伝子についてはすでに報告があって（前掲文献）、ＤＮ
Ａ塩基配列が知られている。 そこで、本発明者らの行なった方法は、下記の通りであ
る。寸なわち、ラットエラスターゼＩＴＩ伝子のＤＮＡ
塩基配列の一部を化学合成し、それをプローブとして用
いて、ラット膵ｌ１ｍＲＮＡより逆転写酵素を用いて作
成したＣＤＮＡバンクよりスクリーニングを行なって、
クツ１〜エラスターゼ■遺伝子クローンを取得した。こ
の遺伝子がラッ］・エラスターゼ■遺伝子であることは
［’）ＮＡ塩基配列を調べることにＪ：り推定した。こ
の遺伝子を制限酵素で切断して約７７０ｂｐ（塩基対）
はどの断片を取得し、この断片にＪ２ｐラベルを入れて
プローブとして用いた。ブタ膵臓ｍＲＮ△より逆転写酵
素を用いて作成したＣＤＮＡバンクについて、−り記プ
ローブを用いてスクリーニングを行なった。得られたク
ローンのう１５一番ＣＤＮＡ部分の長いものについてｉ
ｌｌ配列をマキシムギルバート法ににり決定した。 このように、本発明ＤＮＡ鎖は上記のにうにブタ膵臓Ｃ
ＤＮＡバンクより大賜菌プラスミド上に組み込まれた形
で得られたが、もちろんこのＤＮＡ鎖を化学合成によっ
てすべてもしくは途中から作成して取得することも可能
であることは前記したところである。 形質転換体 上記のようにして取得される本発明ＤＮＡ鎖はブタエラ
スターゼ■蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるの
で、これを生物１−学的手法によって微生物に導入して
形質転換体をつくり、この形質転換微生物にブタエラス
ターゼ■蛋白をつくらゼることができる。 宿１−微生物 適当なプラスミドベクタ〜が存在する限り、各種の微生
物が本発明ＤＮＡ鎖を構成員として含むプラスミドによ
り形質転換の対象となりうる。 そのような微生物の一群はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉであり、仙の一群はｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。 形質転換 形質転換体の作成（おＪ、びそれによるブタエラスター
ゼＩＩの産生）のための手順ないし方法そのものは、分
子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣
用されているものでありうるので、本発明においても下
記したところ以外のものについで−はこれら慣用技術に
準じて実施すればよい。 微生物中で本発、明ＤＮＡ鎖の遺伝子を弁用させるだめ
には、まずその微生物中で安定に′０７Ｉするプラスミ
ドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。 この際用いられるプラスミドベクターは、大腸菌に対し
てはｐＢＲ３２２等、酵Ｂ１に対【ノてはＹＲｐ７等種
々知られているものすべてが用いられる。 一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を微生物で弁用させるた
めには、そのＤＮＡをｍ　ＲＮ　Ａへ転写さぼる必要が
ある。そのためには、転写のためのジグプル（゛あるプ
ロモーターの遺伝子を本発明ＤＮＡ鎖の５′　−側上流
に組込めばよい。このプロモーターについては１でにｔ
ｒｐ、Ｉａｃ。 ｏｍｐＦ　（以」−１大腸菌用）、八〇　＋−１１、Ｇ
　Ａ　ｌ−７、ＰＧＫ、ＴＲＰＩ（以干、酵母用）等種
々用られており、本発明でもこれらのいずれをも利用Ｊ
ることができる。 また、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳さＵる段階では蛋白合成の
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列（大腸菌ではＳＯ配列と呼ばれる）を蛋
白合成の開始イム号である△ＴＧの前につける必要があ
る。なお、ポリ（Ａ＞付加シグナルを含む３′非翻訳領
域については蛋白を合成させるために特に必要ではない
ど考えられているので、場合ににっでは削り取ることも
できる。ただし、宿主微生物が酵Ｃ］であるどきはこの
３′非翻訳領域の有無が蛋白合成量の大小に関与するど
いわれている場合もあるので、多ｉｉ１にブタエラスタ
ーゼ■蛋白を合成しようというときは注意を要する。 さて、一般的には、■ラスターゼ蛋白をつくろうとすれ
ば上記のにうな操作が必要であるが、本発明ＤＮＡ鎖の
うち塩基配列がＢ−ＤおよびＡ−Ｄのものは前駆体ペプ
チドをコードづ−る配列が含まれているので、ブタエラ
スターゼＩｒｆｆｔ白をつくる際に前駆体ペプチドを含
むブタエラスターＣ■蛋白（ブタエラスターゼ■前駆体
蛋白と呼ぶ）すなわちプロエラスターゼ■またはプレプ
ロエラスターゼＩＩをつくることができ、また塩基配列
Ｃ−Ｄのものからはこの前駆体ペプチドのない蛋白をつ
くることもできる。ただし、前駆体ペプチド−２０＝ （Δ−Ｃ）を含ま４Ｔい場合は蛋白合成開始のためのシ
グナルであるＡ　Ｔ　Ｇが必要なので、最低１個のメヂ
ＡニンをＮ−末端アミノ酸の前にイ・１加させておｈＳ
　＜ｒければならない。まＩ、：、ブタコーラスクーぜ
■蛋白をつくるばあにエラスターゼ活噌牛さえ保持され
れば、Ｎ−末端アミノ酸の前に１個または複数個のアミ
ノ酸を付加覆ることや、いくつかのアミノ酸をＮ−末９
２１側もしくはＣ−末端側で削ることもできる。また、
読粋の調整その他の目的で適当な良さのＤＮＡ鎖をリン
カ−として結合させることもできる。このようなりＮＡ
鎖の加工は、規右の遺伝子工学技術では、制限酵素およ
びＤＮＡ化学合成技術を利用で−れば容易に実施するこ
とができる。 このＪ：うにしてつくったプラスミドにＪ：る徴４−物
の形質転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用
されている白目目的な■意の方法によって行なうことが
できる。その一般的な事項については適当な成書または
総説たとえばＴ、Ｈａｎｉａｔ　ｉｓ。 Ｅ、ＦＪｒｉｔｓｃｈ、　、１．ＳａｍｂｒｏｏＫ：　
［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　　１ａｂ
ｏｒａｒｏｙ　１４ａｎｕａｌＪ　　、Ｃｏ１ｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　（１９８２）を参照すればよい。 形質転換体は、本発明１’）ＮＡ鎖によつ又導入された
遺伝情報ににる新しい形質〈Ｊ−なわちブタエラスター
ゼＩＩの産生能）および使用ベクター由来の形Ｍ　＜ｒ
らびに場合によっては生じているかも知れない遺伝了組
換時の使用ベクターからの一部の遺伝情報の欠落にＪ：
る対応形質の欠落を除Ｇプば、そのゼノタイブないしフ
ェノタイプあるいは菌学的＋４　￥ｉにおいて使用宿主
微生物と同じである。 遺伝情報の発現／蛋白の生産 Ｆ記のＪ：うにして４１１られる形質転換体のクローン
は、これを培養すれば培養物中にブタエラスターゼＴ［
、ブタプロ］ニラスターゼ■まｌこはブタブレプ［１エ
ラスターゼＩＩを産生ずる。ブレプロエラスクーゼＩＩ
は、膵臓外に分泌されるどぎにブ「１エラスターゼ■と
なり、これがさらに十二指腸でトリプシン等にＪ：り分
解されて成熟蛋白すなわちブタエラスターゼ■に変化す
るといわれているので、本発明によってこのようなブタ
エラスターゼ■前駆体蛋白が１ｑられたどきはこれを１
−リプシン等にＪ：つで処理ずればブタエラスターゼ■
と同一のものが冑られると代えられる。 また、キモシン還伝子を酵母で発現さ口るときにキ［シ
ンを面接つくらせるよりもブ［ｌキモシンをつくらｔ！
たどきに１０倍以上の生産効率があったどの報？、があ
るので（，１，１ｌｅｌｌｏｒ、　Ｈ，，１，Ｄｏｂｓ
ｏｎ。 Ｎ、八、Ｒｏｂａｒｔｓ、　　ＨＪ、Ｔｕｉｔｅ、　　
、１．Ｓ、ｒｍｔａｇｌ、　　Ｓ、Ｗｌｌｉｔｅ。 Ｐ、八、１．ｏｗｅ、　　Ｔ、Ｐａｔｃ、　　＾、、Ｊ
、ＫｉｎｇＳｍａｎ、　　Ｓ、Ｈ，にｉｎｇｓｍａｎＧ
ｅｎｅ、　２４．１−１４　（１９８３）　）　、本発
明でもこのプレプロ部分の配列を利用して入植生産を容
易１こづることム省えられる。 形質転換体の培養ない【ノ増殖条イ′１は、使用宿主微
生物にり・１１」るそれど本質的に【よ変らない。まＩ
こ、培養物すなわら菌体内おＪ、び（または）培養液か
らの産生蛋白の回収も常法に従って行イ１うことができ
る。 実　　験　　例 ■、ラットエラスターゼＩＴ　３１１伝子のり［１−ニ
ングウイスターラッ１〜（１」本チＶ−ルスリバー社よ
り入手）をニーデル麻酔後でただちに膵臓を取り出し、
グアニジンブＡシアネ−１・を変性剤として用い、かつ
塩化レシウム密度勾配遠心で精製する方法にＪ：っで、
ＲＮＡを取得したく詳１１１１　’、’に実験条件は、
十用和博、藤月義明：　ｒｉ胞■学」し、。 ２９８〜３０３　（１９８２）参照）。このＲＮＡより
ｍＲＮＡを得るため、これをオリゴｄ　Ｔ　ｔルロース
カラムクロマ１〜グラフィーにより精製し、オリゴｄＴ
に吸＠するポリ（△）をもったｍＲＮＡだりを取得した
。クツ１−１匹にり約１ｇの膵臓が得られ、ｍ　ＲＮ　
Ａ　ハ２００　ＩＩ　ｇ得らレタ。次ニ、このｍＲＮＡ
をデンプレートとしてオカヤマバーク法によりｃＤＮＡ
を作成した。実験手順は下記の通りである（詳細な実験
条１’ｌは、重定勝哉：［細胞■学Ｊ２，６１６〜６２
６　（１９８３）を参照）。 すなわち、ｍＲＮＡどオリゴｄＴを末端に５０個はど付
加されたベクタープライマーＤＮＡとをまぜ、逆転写酵
素を加えて、ベクタープライマーＤＮＡのｄＴ部分をプ
ライマーにしてｍＲＮＡに対する相補鎖ＤＮΔを合成さ
せる。次にこのＤＮＡ断片にｄ　ＣＴ　Ｐとターミナル
トランスノＪラーゼどを加えて両末端にｄＣを２０個は
ど＋Ｉ　ｈｎする。制限酵素１１ｉｎｄｌｌｌでこのベ
クタープライマーＤＮＡ部分の一部を切断して、ｄＣ伺
付加部をある長さにわたって取り除く。一方、一方の端
がｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　■と同じ切断末端をもちかつ他方
の末端にｄＧを２０ｕＡ程度付加したリン）Ｊ　−Ｄ　
ＮＡ断片を用意して、これを前記ｌ−１ｉｎｄｌｌｒ８
’Ｊ化物に加え、両Ｉ’）ＮＡを環状に結合させる。 次に、ＲＮ　ａ　ｓ　６１−１、ＤＮＡポリメラーゼＩ
Ｔ　Ｊ３よびＤＮＡリガーゼによりｍ　Ｒ’Ｎ　Ａ部分
をとりのぞいてＤＮＡに置きかえる。このようにして、
ラット膵＆ｆｔｍＲＮＡ２．５μ０どベクタープライマ
ーＤＮＡ１．５ｆｌｏどを使用し、リンカ−１）ＮＡ断
片０．０７μＣ】を加えてＣｒ）ＮＡを得た。 このｃＤＮＡで大腸菌ＲＲＩ株（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ、
　：Ｇｅｎｅ、２　、９５　（１９７７）　）を形質転
換さＶたどころ、形質転換体どして約５万個のクローン
が得られた。 この大腸菌の中からラットエラスターゼ■遺伝子を持つ
ものを探す−ため、既知のラツ１−Ｊラスタ−ゼ■遺伝
子（前記Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１．　１４５３
−１４６３（１９８２）　’）の一部を化学合成してプ
ローブとした。 さらに詳しくは、ラットエラスターゼＴｌ３１伝子のＣ
−末端部分に相当する の塩基配列である。上側がラットエラスターゼｍＲＮΔ
であり、下側が合成されたオリゴヌクレオヂドのプロー
ブであって、ｍＲＮＡに対する相補鎖となっている。合
成法は固相リン酸１〜リエステル法に依った（詳細は、
Ｅ、０ｈｔｓｕｋａ、　Ｈ，Ｉｋｅｈａｒａ。 Ｄ、５ｏｌｌ：　　Ｎｕｃｌｃｉｃ　　八ｃｉｄｓ　　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　　ｉｏｌ　６５５３〜６５７０　
（１９８２）参照）。この合成オリゴヌクレオチドにＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼをつかってγ〔３２Ｐ）Ａ
丁ＰよりリンＭ基を転移させて、これを標識した。これ
をプローブどして、ｃｌ）ＮΔの入った形質転換体をス
クリーニングした。スクリーニング法は］ロニーハイプ
リダイゼージョン法でおこなった。すなわち、ニトロセ
ルロースフィルター上で成育した菌体をアルカリ変性さ
せて、菌体内のＤＮＡをフィルター上に焼付【−Ｊる。 イのフィルターをプローブＤＮＡを含むハイブリダイゼ
−ション液中にＡ３＜と、Ｄ’ＮΔの１ｎ基配列に相同
性のあるものだけがある条件下で結合するく詳細は、高
木康敬［ｒ３ｕ伝子操作マニュアル」　（講談社）参照
）。これをオ′−トラジオグラフィーに付して、プラス
かマイブスかを判定する。相同の配列を含むクローンは
黒く着色される。実際には、約２０００個のり［１−ン
をスクリーニングして、１２個のポジティブクローンが
１ｑられた。ハイブリダイゼーションの条件は６ＸＳＳ
Ｃ１５ｘデンハルト溶液／３５℃／１６時間であり、６
×ＳＳＣ／３５℃／３０分で２回洗浄した。これらのク
ローンについて、プラスミドをアルカリ法（Ｔ、Ｈａｎ
ｉａｔｉｓ、　　Ｅ、ｌ−１Ｆｒｉｔｓｃｈ、　　Ｊ、
５ａｎｂｒｏｏｋ　　：　　　　　＋［Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ
　　Ｍａｎｕａｌ　　Ｊ　　参照）により取得し、制限
酵素切断地図を作成して文献報告のものと比較したとこ
ろ、完全に一致した。このようにして、クツ１〜エラス
ターゼ■遺伝子が得られた。 ■、ブタエラスターＬ’Ｉ遺伝子のクローニングッｌ−
１ラスターゼ■遺伝子の場合とまったく同じ方法でｍＲ
ＮＡを取得し、ざらにｃＤＮＡを作成した。ブタの膵臓
的５０　にすｍＲＮＡ２００μ０が得られた。さらに、
ｍＲＮＡ７．５μｑ１ベクターブライマーＤＮＡ／１．
．５／ｌＧおにびリンカ−ＤＮＡ０．２７１Ｏを使って
、ｃＤＮＡを含んだ形質転換体が約２０万個得られた。 この中からブタエラスターゼＴｌ３１仏子をスクリーニ
ングしたわ【ノであるが、プローブとしてラットエラス
ターゼ■遺伝子の一部を利用した。ラットエラスターゼ
ＴＩ遺伝子を制限酵素ＤｄｅＩで分解したのちアガロー
スゲル電気泳動で分離を行なって、約７７０ｂｐのフラ
グメントを得た。この断片にニック１−ランスレージョ
ン法によりα（３２Ｐ）ｄ　ＣＴ　Ｐを用いてアイソト
ープラベルを入れたにツクトランスレーション法の詳細
は前掲「Ｍ転子操作マニュアル」参照）これをプローブ
に用い、先にラットエラスターゼＩ’ｌｌ伝子のクロー
ニングの際に採用したコロニーハイプリダイゼーシコン
法でスクリーニングした。ハイブリダイげ−ジョンの条
件は６ＸＳＳＧ１５Ｘデンハルト溶液中／６０℃／１６
時間であり、洗いは６０℃／３０分７２回で行なった。 約１０，０００個にす１０個のクローンが得られ、その
中で最；ｂ艮いｃＤＮＡ部分を有するもの（Ｅ　Ｐ　Ｅ
　ｌ−２株と呼ぶ。 また、これに含まれるｃＤＮＡ含有プラスミドをＤ　Ｐ
　Ｅ　Ｌ　２と呼ぶ）についてベクターブライマー以外
のＩ）ＮＡ部分の塩基配列を決定した。塩基配列決定は
マキ（ノームギルバー１〜法を用い、両方向の鎖を読む
ようにして行なった（方法の詳細は、高浪満、大井龍夫
編ｒＤＮΔシーケンス解析マニュアル」　（講談社）参
照）。決定された配列は、第１〜２図に示した通りであ
る（なお、現実に得られたＪ！ｉＭ配列は、その５′　
−側士流にＡＣＡＴＡＴ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｃｌ−ＣＣ
Ａ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　ＣＡ　ＣＣなる配列を有
していた）。このｌ”）ＮＡ塩基配列より］−トン表に
従ってアミノ酸に翻訳したものも同時に示されている。 このアミノ酸配列をり、Ｈ，５ｈｏｔｔｏｎらの報告（
前掲）にあるブタエラスターゼＩＩのそれと比較したと
ころ、第３図に示Ｊように５８％の相同性が認められた
。 微生物の寄託 本発明に関係する下記の微生物は、■業技術院微生物工
業技術研究所から受託が拒否された。 （１）　ブタエラスターゼ■遺伝子含有プラスミドｐ　
Ｐ　Ｅ　Ｌ　２を含む大腸菌ＲＲＩ株（Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｉ
−２株）。

【図面の簡単な説明】

第１〜２図は、ブタエラスターゼＩＴＩ伝子おＪ：びそ
の前駆体遺伝子のＤＮＡ塩基配列とその塩基配列より１
（（定されるアミノ酸配列とを示すものであって、第１
図は１８０ＴＩ口のアミノ酸までを、第２図は１８１番
目以降のアミノ酸を示すものである。 第３図は、ブタ■ラスターゼ■遺伝子（」二段）とブタ
エラスターゼＩｆ　３１仏子（下段）の相同性を示ずｂ
のである。ニドしるしは、対応するアミノ酸が一致して
いることを示す。 出願人代理人　　猪　　股　　　　清 見 ［ｊｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。 １図 Ａｓｐ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　ＧｌｎらＩｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＶＱＩ第２図 ＧＴＧ　ＧＡＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧ　ＴＧＣＴＣＣＡＡ
Ｇ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＡ
Ａ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＧＧＣＣＡＧ　ＴＧＧ　
ＣＡＡ　ＧＴＧ　ＣＡＣＴＴＧ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＴＣ
Ａ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ
　ＣＭ　ＴＡＡＧＧＣＡＧＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　
ＡＣＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＣＣＧＧ
Ｔ　ＧＧＧ　ＣＣＴ　ＣＴＧＡＣＡ　ＣＧＧ　ＧＴＣＴ
ＣＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＡＧＴ　ＧＡＣＡＡＣＣ
ＡＣＡＴＧ 兜３ Ｉ　Ｉ　　ＷＧＧＴＥＡＱＲＮ　５ＷＰＳＯＩＳＬＱＹ
　Ｒ３Ｇ５５ＷＡＨＴＣ１＊★大大　　大　　宜　宵★
糞　＊　γ大大大　　大　　　寅　大宮★Ｉｌｌ　ＷＧ
ＧＥＤＡＲＰＮ　５ＷＰＷＩ）ＶＳＬＱＹ　ＤＳＳＧＱ
ＷＲＨＴＣＩＮＬＮＱＮＤＧＴＥＱＹｖＧＶＱＫＩｖｖ
ＨＰＹＷＮＴＤＤｖＡＡ（大　　女 ５ＬＳＴＮＥＰＧＳＬ　ＡＶＫＶＳＫＬＷＨＱＤＷＮＳ
ＮＱＬＳＫ　＋ＬＡＮＮ５ＰＣＹＩＴ　　ＧＷＧＬＴＲ
ＴＮＧＱ　　ＬＡＱＴＬＱＱＡＹＬ　　１＊　責★　　
＊大　★　★★實　　　＊−に＊　　　　　　★★★　
　大ＬＰＮＮＹＶＣＹＶＴ　　ＧＷＧＲＬＱＴＮＧＡ　
　５ＰＤＩＬＱＱＧＯＬ　　ＩＲＳＧＣＱＧＤＳＧＧ　
ＰＬＨＣＬ−ＶＮＧＱ　ＹＡＶＨＧＶＴＳＦＶ　’火責
★蚤大六★＊六★　六★青　★＊去　★ｋＩＳＳＣＮＧ
ＤＳＧＧ　ＰＬＮＣＱＧＡＮＧＱ　ＷＱＶＨＧＩＶＳＦ
Ｇ図 ３ＧＴＬＩＲＱＮ’ｉｌ／Ｖ　ＭＴＡＡＨＣＶＤＲＥ　
ＬＴＦＲＶＷＧＥＨヤ實１ｅ亥す大＊＊★うυ★゛大六
大゛★★火犬ｔＴＬＶＤＱｓＶ／Ｖ　ＬＴＡＡＨＣＩＳ
ＳＳ　ＲＴＹＲＷＬＧＲＨ；ＹＤＩＡＬＬＲＬＡ　　Ｑ
ＳＶＴＬＮＳＹＶＱ　　ＬＧＶＬＰＲＡＧＴＩ（★★★
★★責★　大−ｋ　　＊★★大＊六★に責；ＮＤＩＡＬ
ＬＫＬＡ　　５ＰＶＹＬＴＤＫＩＱ　　ＬＧＣＬＰＡＡ
ＧＴ１コＴＶＤＹＡＩＣＳＳ　　５ＳＹＷＧＳＴＶＫＮ
　ＳＭＶＣＡＧＧＮＧＶ＊＊喰＊　大★　　　　　す★
＊六≠＊　　　責　★大★＊　★ＶＶＤＹＡＴＣ３Ｋ　
ＰＧＷＷＧＳＴＶＫＴ　ＮＭＩＣＡＧＧＤＧＩ；ＲＬＧ
ＣＮＶＴＲＫ　ＰＴＶＦＴＲＶＳＡＹ　ｌ５ＷＩＮＮＶ
ＩＡＳ　Ｎ細　−ｋｋ＊ｋ　　　　女　六　★★＋大★
六　★　貴　六青ｋ　ｋｋ六　　大３ＳＬＧＣＮＹＹＨ
Ｋ　ＰＳＶＦＴＲＶＳＮＹ　ＴＤＷＩＮＳＶＩＡＮ、Ｎ
手続補正書 昭和６０年９　月／ρ　１」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれるアミ
   ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
   ことを特徴とする、ブタエラスターゼIIの生物工学的産
   生能を有するＤＮＡ鎖。 （１）第１図および第２図にわたって示されているアミ
   ノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２）第１図お
   よび第２図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
   、ＢからＤまでのもの、（３）第１図および第２図にわ
   たって示されているアミノ酸配列のうち、ＡからＤまで
   のもの。 ２、ポリペプチドをコードする塩基配列が第１図および
   第２図にわたって示されている塩基配列のうちＣからＤ
   までのもの、ＢからＤまでのもの、またはＡからＤまで
   のもの、である特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ鎖
   。 ３、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれるアミ
   ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
   ＤＮＡ鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラス
   ミドによって形質転換されたものであることを特徴とす
   る、ブタエラスターゼII産生能を有する微生物。 （１）第１図および第２図にわたって示されているアミ
   ノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２）第１図お
   よび第２図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
   、ＢからＤまでのもの、（３）第１図および第２図にわ
   たって示されているアミノ酸配列のうち、ＡからＤまで
   のもの。 ４、微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉであ
   る、特許請求の範囲第３項に記載の微生物。 ５、ＤＮＡ鎖が、その塩基が第１図および第２図にわた
   って示されている塩基配列のうちＣからＤまでのもの、
   ＢからＤまでのもの、またはＡからＤまでのもの、であ
   る特許請求の範囲第３〜４項のいずれか１項に記載の微
   生物。 ６、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれるアミ
   ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
   ＤＮＡ鎖を用意し、このＤＮＡ鎖を、これをその遺伝情
   報が発現可能な状態で含むプラスミドの作成、このプラ
   スミドによる微生物の形質転換および得られる形質転換
   体の培養からなる工程に付して、培養物中にブタエラス
   ターゼIIを産生させることを特徴とする、ブタエラスタ
   ーゼIIの生物工学的製造法。 （１）第１図および第２図にわたって示されているアミ
   ノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２）第１図お
   よび第２図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
   、ＢからＤまでのもの、（３）第１図および第２図にわ
   たって示されているアミノ酸配列のうち、ＡからＤまで
   のもの。 ７、微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉである
   、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、ＤＮＡ鎖が、その塩基が第１図および第２図にわた
   って示されている塩基配列のうちＣからＤまでのもの、
   ＢからＤまでのもの、またはＡからＤまでのもの、であ
   る特許請求の範囲第６〜７項のいずれか１項に記載の方
   法。