JPH0246289A - ４ｇ１２モノクローナル抗体をコードするｄｎａ塩基配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は新規なりＮＡ塩基配列に関する。更に詳しくは
、ヒト肺癌および食道癌に特異性高く反応する４Ｇ１２
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ塩基配列に関す
る。

〔従来の技術〕

現在、悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫
瘍抗原の解析などの基礎研究への利用の他に、血清診断
、標識化抗体による腫瘍の画像診断および抗ｉｔ瘍効果
を有する抗体の生体への投与など臨床応用も徐々にでは
あるが試みられている。

このような状況の中で本発明者らは、特開昭６３−１２
２９４号公報により、ヒト肺癌に高い反応性を有するヒ
ト肺癌モノクローナル抗体（４Ｇ１２）産生細胞株を樹
立した。この４Ｇ１２モノクローナル抗体は、抗体クラ
スがＩｇＭ、サブクラスがλ型であり、免疫組織化学的
に肺扁平上皮癌および食道癌に特異性高く反応するとい
う興味ある知見が得られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、該４Ｇ１２モノクローナル抗体を構成す
るＬＨとＨ鎖、さらには抗原と特異的に結合する機能を
有する■領域の遺伝子構造については全く知られていな
い。

また、モノクローナル抗体産生細胞株は、一般に継代と
ともにその抗体産生能の低下することが知られており、
この問題を解決するために抗体産生細胞の細胞クローニ
ングや抗体遺伝子をクローニングした後、遺伝子導入す
ることによって大量発現させることなどが行なわれてい
る。このように、遺伝子工学的手法により生産するため
にはその遺伝子の分離さらに構造の解明が重要である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の点に鑑み鋭意研究した結果、４Ｇ
１２モノクローナル抗体のＬｆＡおよびＨ鎖をコードす
るｃＤＮＡを分離し、Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列を解明し
本発明を完成した。

すなわち、本発明は下記（１）の塩基配列を有する４Ｇ
１２モノクローナル抗体のＬ鎖■領域をコードするＤＮ
Ａ塩基配列と下記（２）の塩基配列を有する４Ｇ１２モ
ノクローナル抗体Ｈ鎖■領域をコードするＤＮＡ塩基配
列に関する。

ＧＣＧ、ＧＣＣ，ＣＣＡ、ＧＧＡ、ＣＡＧ、＾ＡＧ、Ｇ
ＴＣ，ＡＣＣ，八ＴＣ，ＴＣＣ。

ＴＧＣへＴＣＴ、ＧＧＡ、ＡＧＣ，ＡＧＣ，ＴＣＧ、Ａ
ＭＣ，ＡＴＴ、ＧＧＧ、ＡＡＴ。

八＾Ｔ、ＴＡＴ、ＧＴＡ、ＴＣＣ，ＴＧＧ、ＴＡＣ，Ｃ
ＡＧ、ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＣＣＡ。

ＣＧＡ、＾ＣＡ、ＧＣＣ，ＣＣＣ，ＡＡＡ、ＣＴＣ，Ｃ
ＴＣ，ＡＴＴ、ＴＡＴ、ＧＡＣ。

＾Ａ？、＾ＡＴ、ＡＡＧ、ＣＧＡ、ＣＣＣ，ＴＣＡ、Ｇ
ＧＧ、ＡＴＴ、ＣＣＴ、ＧＡ（：。

ＣＧＡ、ＴＴＣ，ＴＣＴ、ＧＧＣ，ＴＣＣ，ＡＡＧ、Ｔ
ＣＴ、ＧＧＣ，ＡＣＧ、ＴＣＡ。

ＧＣＣ，＾ＣＣ，ＣＴＧ、ＧＧＣ，八ＴＣ，ＡＣＣ，Ｇ
ＧＡへＣＴＣ，ＣＡＧ、ＡＧＴ。

ＧＧＧ、　ＧＡＣ，ＧＡＧ、　ＧＣＣ，ＧＡＴ、　ＴＡ
Ｔ、　ＴＡＣ，ＴＧＣ，ＧＧＡ、　ＡＣＡ。

ＴＧＧ、ＧＡＴ、ＡＧＣ，八ＧＣ，ＣＴＧ、＾ＧＴ、Ｇ
ＣＴ、ＧＧＧ、ＧＴＡ、ＴＴＣ。

ＧＧＣ，ＧＧＡ、ＧＧＧ、ＡＣＣ，＾＾Ｇ、ＣＴＧ、Ａ
ＣＣ，ＧＴＣ，ＣＴＡ、ＧＧＴ。

・　・　・　・　・（１） ＧＡＧ、ＧＴＧ、ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＴＴＧ、ＧＡＧ、Ｔ
ＣＴ、ＧＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＣ。

ＴＴＧ、ＧＴＡ、ＣＡＧ、ＣＣＴ、ＧＧＧ、ＧＧＧ、Ｔ
ＣＣ，ＣＴＧ、ＡＧ＾、ＣＴＣ。

ＴＣＣ，ＴＧＴ、ＧＣＡ、ＧＣＣ，ＴＣＴ、ＣＧＡ、Ｔ
ＴＣ，ＡＣＣ，ＴＴＴ、ＡＣＣ。

ＡＣＣ，ＴＡＴ、ＧＣＣ，ＡＴＧ、＾ＧＣ，ＴＧＧ、Ｇ
ＴＣ，ＣＧＣ，ＣＡＧ、ＧＣＴ。

ＣＣＡ、ＧＧＧ、ＡＡＧ、ＧＧＧ、ＣＴＧ、ＧＡＧ、Ｔ
ＧＧ、ＧＴＣ，ＴＣＡ、ＧＣＴ。

ＡＴＴ、ＡＧＴ、ＧＧＴ、＾ＧＴ、ＧＧＴ、ＧＧＴ、Ａ
ＧＣ，ＡＣ＾、ＴＡＣ，ＴＡＣ。

ＧＣＡ、ＧＡＣ，丁ＣＣ，ＧＴＧ、ＡＡＧ、ＧＧＣ，Ｃ
ＧＧ、ＴＴＣ，ＡＣＣ，ＡＴＣ。

ＴＣＣ，ＡＧＡ、ＧＡＣ，ＡＡＴ、ＴＣＣ，＾＾Ｇ、＾
ＡＣ，＾ＣＧ、ＣＴＧ、ＴＡＴ。

ＣＴＧ、ＣＡＡ、＾ＴＧ、ＡＡＣ，ＡＧＣ，ＣＴＧ、＾
Ｇ＾、ＧＣＣ，ＧＡＧ、ＧＡＣ。

ＡＣＧ、ＧＣＣ，ＧＴＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ，ＴＧＴ、Ｇ
ＣＧ、＾Ａ八へＧＣＣ，，ＧＴＧ。

ＧＴＴ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＴＴ、＾ＴＣ，ＴＣＣ，Ｔ
ＡＣ，ＴＡＣ，ＴＡＣ，ＴＡＣ。

ＧＧＴ、ＡＴＧ、ＧＡＣ，ＧＴＣ，ＴＧＧ、ＧＧＣ，Ｃ
Ａ＾、ＧＧＧ、ＡＣＣ，ＡＣＣ。

ＧＴＣ，ＡＣＣ，ＧＴＣ，ＴＣＣ，ＴＣＡ、　　・・・
・・（２）従って上記のＤＮＡ塩基配列により、本発明
の４０１２モノクローナル抗体り鎖ｙ　％ｌ域はサブク
ラスλ１であり、４Ｇ１２モノクローナル抗体Ｈ鎖■領
域はサブクラスＶＨＷであることが判明した。

〔作　用〕

本発明によれば、４Ｇ１２モノクローナル抗体Ｌ　ｕｉ
Ｖ領域およびＨ鎖ｖｔＩＩ域のＤＮＡ塩基配列は、ヒト
抗体ＬＳＩおよびＨａのＣ領域の合成りＮＡあるいはＲ
ＮＡをプローブとして４Ｇ１２モノクローナル抗体り鎖
およびＨｕｉのｃＤＮＡをクローニングし、そのＤＮＡ
塩基配列を解析することによって決定した。

以下、これらの工程についてさらに詳細に説明する。

（１）ＲＮＡおよびＤＮＡの単離精製 本発明において使用される細胞株はヒト肺癌患者リンパ
球細胞とマウス骨ＩＩＩａ！ｌａｉ細胞を融合させたハ
イブリドーマであり、具体的には特開昭６３−１２２９
４号公報に記載され、ヒト肺癌および食道癌に特異的に
反応するヒト型モノクローナル抗体を産生ずる４Ｇ１２
ハイプリドーマである。この４Ｇ１２ハイプリドーマは
ＩＦＯ５００９０として財団法人発酵研究所に寄託され
ている。

これら所望の抗体を産生ずる細胞を適当な条件下、たと
えば３７°Ｃ炭酸ガス濃度５％で培養増殖させ、得られ
た細胞を遠心分離によって集めた後、細胞から常法、た
とえばＦａｖａｌｏｒｏらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５巻、７１８頁（１９
８０））により全ＲＮＡを抽出し、次いでこれを常法、
たとえばオリゴｄＴセルロースまたはポリＵセファロー
スなどを用いる吸着カラムクロマトグラフィーまたはバ
ッチ法によりポリ（Ａ）”ｍＲＮＡ画分を分離すること
ができる。

また、同様にして得られた細胞を、たとえばドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性剤存在下で、
たとえばプロテアーゼにのような蛋白質分解酵素を用い
て溶解させ、さらにフェノールによる抽出によって除蛋
白を行なって染色体ＤＮＡを得ることができる。

これらによって得られたＲＮＡおよびＤＮＡは共に以下
のｃ　ＤＮＡライブラリーまたは遺伝子ライブラリーの
作製に供することができる。

本発明においては４Ｇ１２ハイブリドーマ細胞から全Ｒ
ＮＡを抽出し、この抽出物をオリゴｄＴセルロースカラ
ムで処理することによりポリ（Ａ）４ｍＲＮＡを作製し
以下のｃＤＮＡライブラリーの作製に供した。

（ＩＩ）ｃＤＮＡライブラリーまたは遺伝子ライブラリ
ーの作製 （＋）の工程で得られたＲＮＡを用いる場合にはポリ（
Ａ）”ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴまたは抗体Ｃ９
Ｉ域の塩基配列に対応すると考えられる塩基配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドをブライマーとして、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ。

ｄＣＴＰの存在下で逆転写酵素により、ｍＲＮＡと相補
的な単鎖ｃＤＮＡを合成する０次いでこの単鎖ｃＤＮＡ
を鋳型として、逆転写酵素あるいは大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼｌを用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成する。こうして
得られたｃＤＮＡを、たとえばＥｃｏＲＴメチレース処
理した後Ｅｃ。

［１リンカ−を接続し、さらにＥＣ０ＲＴ消化すること
によって粘着末端を導入することができる。

得られた断片を適当なファージベクター、たとえばλｇ
Ｌ１０ベクター、λｇｔｌｌベクター（Ｔ。

Ｉｔ　ｕ　ｙ　ｎ　ｈ　らＩｎ　ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（
１９８５）　）などに連結した後、イン・ビトロ・パッ
ケージング（Ｓ、　Ｍ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｇｅ
ｎｅ、　３９巻、３１３頁（１９８５））を行ない、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作製することができる。

また、（＋）の工程で得られたＤＮＡを用いる場合には
、例えばＥｃｏＲＩのような制限酵素で切断し、適当な
ファージ・ベクター、たとえばシャロン４Ａベクター（
Ｆ、ＲｏＢｌａｔｔｎｅｒら、　５ｃｉｅｎｃｅ＋１９
６巻、１６１頁（１９７７）　）と連結した後、イン・
ビトロ・パッケージングを行ない、遺伝子ライブラリー
を得ることができる。ＥｃｏＲＩ以外の制限酵素を用い
る場合や、クローニングサイトとしてＥｃｏＲＩをもた
ないような他のファージ・ベクターを使用する場合には
、適当なリンカ−ＤＮＡを用いれば遺伝子ライブラリー
の作製が可能になる。

本発明においては（１）の工程で得られたポリ（Ａ）”
ｍＲＮＡを用いｃＤＮＡを合成し、このＣＤＮＡをλｇ
ｔｌｏベクターと連結し、イン・ビトロ・パッケージン
グを行ない４Ｇ１２ｃＤＮＡライブラリーＩ　Ｘ　１０
’　ｐｆｕ／ｐｇＤＮＡを作製した。

（Ｉ［Ｉ）プローブの作製 プローブとしては、たとえばニックトランスレーション
法（Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｒｉｇｂｙら＋　Ｊ、　Ｍｏ１
−　Ｂｉｏｌ、＋１１３巻、２３７頁（１９７７））に
よりｘｚｐ標識を行なったヒト免疫グロブリンＬｔ１ま
たはＨｌＸのＣｗｉ域の遺伝子やあるいはその部分のア
ミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを化学合成し、３！ｐｉｌｌｌｌｌを行なったもの
や合成オリゴヌクレオチドを組合わせて定常領域あるい
はその一部に相当する遺伝子の合成を行ない、これをＲ
ＮＡポリメラーゼプロモーターの下流に再クローン化し
た後、ＲＮＡポリメラーゼを用いて作製した”　Ｐ　ｔ
Ｊｉ高比活性ＲＮＡなどを用いることができる。

本発明においては４Ｇ１２ＬｔｊｔＣＤＮＡクローニン
グ用プローブとしてヒトλ鎖定常領域の一部に相当する
相補的塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを組み
合わせて遺伝子断片を樽築し、５Ｐ６ＲＮＡポリメラー
ゼプロモーターの下流に再クローン化した後Ｓ　Ｐ　６
　ＲＮＡポリメラーゼを用いてコｚＰ標識化したＲＮＡ
プローブを作製した。

また、４Ｇ１２Ｈ１ｊ［ｃＤＮＡクローニング用プロー
ブとしては、ヒトＨ１ｍ定常領域の一部に相当する合成
オリゴヌクレオチド、ＨＯ２およびＨＯ４を常法により
５°−末端ラベルしたプローブを作製して用いた。

（ＩＶ）ＣＤＮＡまたは遺伝子のクローニング（ＩＩ）
の工程で得られたｃＤＮＡライブラリーまたは遺伝子ラ
イブラリーに（ＩＩＩ）の工程で得られたプローブを用
いることによって目的とするクローンの選択を行なう、
たとえば、（ＩＩ）の工程で得られたｃＤＮＡライブラ
リーまたは遺伝子う、イブラリ−のファージを大腸菌株
（Ｃ６００Ｈｆ　ｆｆ１−）に感染させプラーク形成さ
せて、プラークハイブリダイゼーション（Ｗ、　Ｄ、　
Ｂｅｎｔｏｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ＋１９６巻、１８０
頁（１９７７））によってポジティブクローンを選択す
る。

さらに、このクローン化ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で
切り出し、″ｔＰ標識したものをプローブとして用い前
述のｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングすること
によって、より大きなサイズのＤＮＡを選択することも
できる。

本発明においては４Ｇ１２モノクローナル抗体り鎖ｃ　
ＤＮＡクローンとしてファージφ４Ｇ１２Ｌ６を有する
クローン６が、また、４Ｇ１２モノクローナル抗体Ｈ鎖
ｃＤＮＡクローンとしてファージφ４Ｇ１２Ｈ３１を有
するクローン３１が選択され次の塩基配列決定に用いら
れた。

（Ｖ）塩基配列の決定 （ＩＶ）の工程で得られたｃＤＮＡまたは遺伝子クロー
ンから得られるクローン化ＤＮＡ断片はたとえば、ｐＢ
Ｒ３２２のようなプラスミドベクターやＭ１３ファージ
などのファージベクターに再クローン化し、得られたサ
ブクローンの挿入部分のＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギ
ルバート法（＾。

Ｍ、　Ｍａｘａｍと−、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

［ＩＳＡ、　７４巻、５６０頁（１９７７）　’Ｐ４＋
７カー法（Ｆ。

Ｓａｎｇｅｒら＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾、７４巻。

５４６３頁（１９７７）　）を用いて塩基配列決定する
ことができる。

本発明においては（ｒＶ）の工程で得られたファージφ
４Ｇ１２Ｌ６のＥｃｏＲＩ断片を４０１２モノクローナ
ル抗体Ｌｔｊ［ｃＤＮＡとしてＭ１３ファージベクター
ｍｐｌｏおよびｍｐＨに再クローン化後、−末鎖ＤＮＡ
を調製し、またファージφ４Ｇ１２Ｈ３１のＥｃｏＲＩ
断片は４Ｇ１２モノクローナル抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡとして
同様に処理してそれぞれサンガー法により塩基配列を決
定した（第１表および第２表）。

〔以下余白〕

こうして得られた目的の抗体をコードしたＤＮＡが特に
ヒト染色体のものである場合、実際にアミノ酸をコード
しないイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）を含んでおり、この
ままでは微生物中で発現させることはできない。そこで
この遺伝子を適当な制限酵素で切断し、イントロンの部
分を完全に除去する。

この制限酵素切断の際に、実際にアミノ酸をコードする
エクソン（ｅｘｏｎ）の部分も削られてしまうことがあ
りうるが、その場合には化学合成したオリゴヌクレオチ
ドを用いて削られた部分を修復させると共に、隣り合っ
たエクソン同志を連結させ発現可能な形に変更すること
ができる。

これらの方法によって得られた４Ｇ１２モノクローナル
抗体をコードするＤＮＡ塩基配列は、位置指定突然変異
導入法により変異を導入させることができる（岸本ら　
続生化学実験講座１．遺伝子研究法■（東京化学同人”
）　３３５．　（１９８５））。

このようにして得られた４Ｇ１２モノクローナル抗体を
コードするＤＮＡあるいはその変異体ＤＮＡは遺伝子工
学的な手法により発現可能な配列、たとえばプロモータ
ー、ＳＤ配列、翻訳開始コドン、翻訳終止コドンなどと
連結させプラスミドベクター、ファージベクターなどの
適当なベクターに組み込み、さらに適当な宿主、たとえ
ば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、酵母などの微生物や動
物細胞に導入し、該宿主細胞中で発現させることもでき
る。

また、本発明の４０１２モノクローナル抗体ＣＤＮＡを
プローブとして遺伝子ライブラリーから新たに抗体遺伝
子をクローニングすることに用いることもできる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらにより何ら限定されるものではない。

実施例１：４Ｇ１２ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡ
分画の単離精製 特開昭６３−１２２９４号公報により開示された方法に
よって得られた抗肺癌ヒト型モソクローナル抗体産生株
４Ｇ１２ハイプリドーマ細胞４×１０７個を、０．１４
　Ｍ塩化ナトリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０
．５％ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（シグマ社製）および
１０ｍＭバナジル−リボヌクレオチド複合体（シａｎａ
ｄｙｌ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｃｏｍｐｌｅ
ｘ　：ＢＲＬ社製）を含む１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液
（ｐｌ＋８．６）に懸濁後、２４％ショ糖を含有した上
記緩衝液に重層し、遠心分離後上層を回収した。

これに等量の２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．３
Ｍ塩化ナトリウムおよび２％ドデシル硫酸リチウム（Ｌ
ＤＳ）を含む０．２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝？ＦＬｉ　
（ｐＨ７、５）を加えプロテアーゼＫ（ペーリンガー社
製）２００ｐｇ／ｌ１１７で３７°Ｃ１３０分間処理し
た。その後、フェノール−クロロホルム処理、エタノー
ル沈澱により全ＲＮＡ１．２ｍｇを回収した。

この全ＲＮＡを１−の水に溶解し、６５゛ｃで５分間加
熱し、次いで塩化リチウム溶液を０．５　Ｍとなるよう
に加えた。この溶液を、あらかじめ０．５　Ｍ塩化リチ
ウムおよび１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）で平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラム（ファルマシア社製）に付し、
吸着したポリ（Ａ）”ｍＲＮＡを１ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸を含む１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液で溶出させ
ることによりポリ（Ａ）”ｍ　ＲＮ　Ａ　３０　ｐｇを
得た。

実施例２ニブロープの作製法 （１）　　４　Ｇ、１２　Ｌｌｃ　ＤＮＡクローニング
用の高比活性ＲＮＡプローブは以下の方法で調製した。

ヒトλ鎖定常領域の一部に相当する相補的塩基配列を有
する下記合成りＮＡＩおよび２をアニール後、ｐＧＥＭ
３ベクター（プロメガ社製）のＥｃｏＲＩ　オヨヒＨｉ
　ｎ　ｄ　ＤＩ認識部位の間にカセット変異法（岸本、
実験医学（羊上社）５巻、１０００頁（１９８７））を
用いて組込んだ。

合成りＮＡＩ　（８３１ｔ体） ５″−＾＾ＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧ
ＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡ
ＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧ
ＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧ＾−３′合成りＮＡ２　（８３量
体） ５’　−ＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＴ
ＴＣＡＴＧＣＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣ
ＴＴＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧ
ＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧ　−３”次に、このプローブ
作製用組換え体ＤＮＡをＰｖｕＩｌ消化後、５Ｐ６ＲＮ
Ａポリメラーゼ（東洋紡社製）と（α−”Ｐ）　ＧＴＰ
　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、第一化学社製）を用い、
プロメガ社のプロトコールに従い、高比活性のＲＮＡプ
ローブを作製した。

（２）　　４　Ｇ　１２　Ｈｌｆｉｃ　ＤＮＡクローニ
ング用のプローブとしては、ヒ）μ鎖定常領域の一部に
相当する２本の合成りＮＡ　　ＨＣ３およびＨＣ４（ア
ブライドバイオシステムズジャパン社製）を、常法によ
り５°−末端ラベルしたものを用いた。

合成りＮＡ　　ＨＣ３（１８量体） ５’−ＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＴＧＣ−３合成
りＮＡ　　ＨＣ４（１Ｂ量体） ５’　−ＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＧＣＧＧＧ−３実
施例３：ノーザンプロット解析 （１）実施例１により得られた全ＲＮＡおよびポリ（Ａ
）’ｍＲＮＡを４Ｇ１２ＬｌｌｃＤＮＡクローニング用
ＲＮＡプローブを用いてノーザンプロット解析した。そ
の結果を第１図に示す。図中、約１．５ｋｂのバンドが
検出され、４Ｇ１２Ｌ鎖のｍＲＮＡの全長は約１．５　
ｋ　ｂと結論された。

（２）同様にして４Ｇ１２Ｈ鎖ｃＤＮＡクローニング用
プローブＨＣ３およびＨＣ４を用いてノーザンプロット
解析した。その結果を第２図に示す。

図中に示されるようにＨＣ３およびＨＣ４プローブ共に
約２．３　ｋ　ｂにバンドが検出され、４Ｇ１２Ｈ鎖の
ｍＲＮＡの全長は約２．３　ｋ　ｂと結論された。

実施例４：４Ｇ１２ｃＤＮＡライブラリーの作製実施例
１で得られたポリ（Ａ）”ｍ　ＲＮ　Ａ　５　ｐｇを用
いアマジャム社のｃＤＮＡＤＮＡ合成キン口トコールに
従いｃＤＮＡを合成し１．７Ｐｇを回収した。

このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩメチラーゼ処理後、３！ｐ
ｌ識ＥｃｏＲ１リンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し
た。ＥｃｏＲＩ消化後、Ｇ５０カラムに付しＥｃｏＲＩ
末端を有するｃＤＮＡ分画を回収した。このｃＤＮＡ７
５ｎｇをλｇｔｌｏベクター（ストラータジーン社製）
１イと連結後、イン・ビトロ・パッケージングを行ない
４Ｇ１２ｃＤＮＡライブラリーＩ　Ｘ　１０”　ｐｆｕ
／ＰＩｒＤＮＡを作製した。

実施例５　：　ｃＤＮＡのクローニング（１１４Ｇ１２
Ｌ鎖ｃＤＮＡのクローニング前記実施例４で得られた４
Ｇ１２ｃＤＮＡライブラリ′−に対して実施例２０）で
作製されたＲＮＡプローブを用いてプラークハイブリダ
イゼーションを行ない２３個のポジティブクローンを得
た。

この中のクローン６のＥｃｏＲＩ断片は約９００塩基対
でありコード領域全長を含むこのファージをφ４Ｃ１２
Ｌ６と命名した。

（２）４Ｇ１２Ｈ鎖ｃＤＮＡのクローニング前記実施例
４で得られた４Ｇ１２ｃＤＮＡライブラリーに対して、
実施例２（２）のプローブＨＣ３およびＨＣ４を用いて
プラークハイブリダイゼーションを行ない両プローブに
ハイブリダイズする１０個のポジティブクローンを得た
。この中のクローン３はＥｃｏＲＩ断片として８３０塩
基対および６１０塩基対の挿入ＤＮＡを有しており塩基
配列の決定により抗体のμ鎖定常領域に相当することが
明らかとなった。

次に、上記ＥｃｏＲＩ断片のうち８３０塩基対をｐＧ已
Ｍ３に再クローン化後、前述のようにＲＮＡプローブを
作製しこれを用いて新たに４Ｇ１２ｃＤＮＡライブラリ
ーをプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニ
ングした。その結果クローン３１はＥｅｏＲＩ断片とし
て８３０塩基対、６１０塩基対および５１０塩基対から
なる最も長い挿入ＤＮＡを有しており、このファージは
φ４Ｇ１２Ｈ３１と命名された。

実施例６：塩基配列の決定 （１）４Ｇ１２Ｌ鎖ｃＤＮＡの塩基配列の決定実施例５
（１）によりクローン化したφ４Ｃ；１２Ｌ６のＥｃ　
ｏＲＩ断片をＭ１３ファージベクターｍｐｌｏおよびｍ
ｐＨに再クローン化した。

そして、この再クローン化により得られる挿入部位をＭ
１３シークエンスキット（宝酒造社製）を用いてサンガ
ー法により塩基配列の決定を行なった。この時、プライ
マーとしてはユニバーサルプライマーあるいは解読した
塩基配列をもとにして作製した合成オリゴヌクレオチド
を用いた。その結果得られた４　Ｇ　１２　Ｌｌ（ｃ　
ＤＮＡの塩基配列を第１表に示す。

この４Ｇ１２Ｌ鎖ｃＤＮＡクローンは、８８５塩基長で
あり、その推定されるアミノ酸配列を下欄に示した。ト
リブレットコドンの一２０番目のＡＴＣ（Ｍｅ　ｔ）か
ら翻訳開始され、＋１のＴＣＴ（Ｓｅｔ）が成熟型蛋白
の最初のアミノ酸になると予測される。−２０から−１
までは、膜蛋白に共通な疎水性のシグナルペプチド領域
であり、＋１から＋９７までは変異領域、＋９８から＋
１１０まではＪ断片、＋１１１から＋２１５まではλ鎖
定常領域であると考えられる。二重線を引いた塩基配列
ＡＡＴＡＡＡは、ポリＡ付加シグナルの共通配列である
。また、プローブとして用いた領域の塩基配列の位置を
下線で示した。

以上のように、このＬＩｉｃＤＮＡクローンは、遺伝子
発現に必要な情報をもっていることから、活性型のλ鎖
ｃＤＮＡであると考えられる。

（２）４０１２Ｈ鎖ｃＤＮＡの塩基配列の決定実施例５
（２）によりクローン化したファージφ４Ｇｌ　２Ｈ３
１のＥｃ　ｏＲＴ断片を前述と同様の処理を行なうこと
により塩基配列の決定を行なった。

その結果を第２表に示し、Ｈ鎖変異領域の塩基配列およ
びそれから予測されるアミノ酸配列をその下欄に示した
。トリプレットコドンの一１９番目のＡＴＧ（Ｍｅｔ）
から翻訳開始し、＋１のＧＡＧ（Ｇｌｕ）が成熟型蛋白
の１番目のアミノ酸になると推測される。−１９から−
１までは、膜蛋白に共通な疎水性のシグナルペプチド領
域であり、＋１から＋９８までは変異領域（Ｖ）、＋９
９から＋１２５まではＤおよびＪｉＪ域であると考えら
れる。

また、本発明の４Ｇ１２Ｌｔ３ＭおよびＨ鎖変異領域の
サブタイプを決定するためコンピュータ検索を行ない相
同性の高い遺伝子を調べた結果、４Ｇ１２Ｌ鎖変異領域
はサブタイプλ１であることが判明し、４Ｇ１２Ｈ鎖変
異領域はサブタイプＶＭｌｉであることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は４Ｇ１２ハイブリドーマ由来ＲＮＡの４Ｇ１２
Ｌ鎖ｃＤＮＡクローニング用ＲＮＡプローブによるノー
ザンプロット解析図（図中、１；全ＲＮＡ４．５Ｐｇ、
　２　：ポリ（Ａ）”ｍ　ＲＮ　Ａ　１．５　ｐｇ。 ３：ポリ（Ａ）”ｍ　ＲＮ　Ａ　４．５　ｐｇ）を示す
。 第２図は４Ｇ１２ハイブリドーマポリ（Ａ）’ｍＲＮＡ
の４Ｇ１２Ｈ鎖ｃ　ＤＮＡクローニング用プローブＨＣ
３およびＨＣ４によるノーザンプロ。 ト解析図（ポリ（Ａ）”ｍＲＮＡ４．５ｐｇ）を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の塩基配列を有する４Ｇ１２モノクローナル
   抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ塩基配列。 【遺伝子配列があります】
2. （２）下記の塩基配列を有する４Ｇ１２モノクローナル
   抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ塩基配列。 【遺伝子配列があります】