JPH06141884A - 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列及びそれをコードするｄｎａ塩基配列 - Google Patents
抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列及びそれをコードするｄｎａ塩基配列Info
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- JPH06141884A JPH06141884A JP32141892A JP32141892A JPH06141884A JP H06141884 A JPH06141884 A JP H06141884A JP 32141892 A JP32141892 A JP 32141892A JP 32141892 A JP32141892 A JP 32141892A JP H06141884 A JPH06141884 A JP H06141884A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト子宮癌患者のＢ細胞とヒトリンパ芽球細
胞株とのヒト／ヒト融合細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１
が産生する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンＣＬＮ
−lgＧの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列及びその
遺伝子の塩基配列。 【効果】 上記アミノ酸配列及び塩基配列は、ヒトの疾
患の予防、治療、診断などの医学及び薬学分野や、生化
学的試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化学
分野などにおいて有用である。
胞株とのヒト／ヒト融合細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１
が産生する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンＣＬＮ
−lgＧの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列及びその
遺伝子の塩基配列。 【効果】 上記アミノ酸配列及び塩基配列は、ヒトの疾
患の予防、治療、診断などの医学及び薬学分野や、生化
学的試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化学
分野などにおいて有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、たとえば、ヒトの疾患
の予防、治療、診断などの医学及び薬学分野や、生化学
的試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化学分
野などの広い分野において有用な抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンの可変領域の構造に関する。さらに詳しくは、
本発明は、ヒト子宮癌患者のＢ細胞とヒトリンパ芽球細
胞株とのヒト／ヒト融合細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１
が産生する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンの重鎖
及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列ならびにその遺伝子の
塩基配列に関する。
の予防、治療、診断などの医学及び薬学分野や、生化学
的試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化学分
野などの広い分野において有用な抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンの可変領域の構造に関する。さらに詳しくは、
本発明は、ヒト子宮癌患者のＢ細胞とヒトリンパ芽球細
胞株とのヒト／ヒト融合細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１
が産生する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンの重鎖
及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列ならびにその遺伝子の
塩基配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞融合あるいは細胞の不死化によるモ
ノクローナル抗体作成の技術の開発以来、多くの有用な
抗体が主にマウスなどを使って得られてきた。そのなか
でも悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫瘍
抗原の解析等の基礎研究への利用のほかに、血清診断、
標識化抗体による腫瘍の画像診断などに利用されはじ
め、その利用価値はきわめて高い。しかし、マウス等の
異種抗体はヒトにとって異物であり、ヒトに頻回投与す
ることは投与抗体に対する免疫反応を惹起し、その結
果、副作用並びに抗体の治療または予防効果の低下を引
き起こす。以上の点から、ヒトの癌の予防、治療、体内
診断など、実際に抗体をヒトに投与する臨床分野を考え
ると、ヒト型の抗体を用いることが望ましい。しかし、
ヒト型のモノクローナル抗体は、その作成が困難である
ことから、現在のところほとんど実用に供されていな
い。
ノクローナル抗体作成の技術の開発以来、多くの有用な
抗体が主にマウスなどを使って得られてきた。そのなか
でも悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫瘍
抗原の解析等の基礎研究への利用のほかに、血清診断、
標識化抗体による腫瘍の画像診断などに利用されはじ
め、その利用価値はきわめて高い。しかし、マウス等の
異種抗体はヒトにとって異物であり、ヒトに頻回投与す
ることは投与抗体に対する免疫反応を惹起し、その結
果、副作用並びに抗体の治療または予防効果の低下を引
き起こす。以上の点から、ヒトの癌の予防、治療、体内
診断など、実際に抗体をヒトに投与する臨床分野を考え
ると、ヒト型の抗体を用いることが望ましい。しかし、
ヒト型のモノクローナル抗体は、その作成が困難である
ことから、現在のところほとんど実用に供されていな
い。
【０００３】このような状況の中で本発明者の一人は、
特開昭５８−２０１９９４号公報（特公平０１−５９８
７８号公報）、特開昭５９−１３５８９８号公報および
特開昭５９−１３７４９７号公報に詳しく開示されてい
るごとく、ヒト癌細胞に高い反応性を有するヒトモノク
ローナル抗体を産生する細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１
（ＡＴＣＣ Ｎo.ＨＢ８３０７）を樹立した。この細胞
株が産生する抗体（ＣＬＮ−lgＧと命名）は、抗体クラ
スがlgＧ、アイソタイプがγ１型およびκ型であり、免
疫組織学的に癌細胞の表面に存在する癌抗原に結合し、
なおかつ癌細胞の増殖を抑制する効果をもつという興味
ある知見が得られている。
特開昭５８−２０１９９４号公報（特公平０１−５９８
７８号公報）、特開昭５９−１３５８９８号公報および
特開昭５９−１３７４９７号公報に詳しく開示されてい
るごとく、ヒト癌細胞に高い反応性を有するヒトモノク
ローナル抗体を産生する細胞株ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１
（ＡＴＣＣ Ｎo.ＨＢ８３０７）を樹立した。この細胞
株が産生する抗体（ＣＬＮ−lgＧと命名）は、抗体クラ
スがlgＧ、アイソタイプがγ１型およびκ型であり、免
疫組織学的に癌細胞の表面に存在する癌抗原に結合し、
なおかつ癌細胞の増殖を抑制する効果をもつという興味
ある知見が得られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このような技術背景の
中で、以下に述べる如き解決すべき課題がある。
中で、以下に述べる如き解決すべき課題がある。
【０００５】１）モノクローナル抗体産生細胞株は、一
般に継代と共にその抗体産性能の低下することが知られ
ている。また一般的に言って、ヒトハイブリドーマはマ
ウスのそれと比較して抗体の産生量が低い。ヒトモノク
ローナル抗体を癌治療や診断に用いる場合、大量の抗体
が必要であり、この問題の解決は必須である。
般に継代と共にその抗体産性能の低下することが知られ
ている。また一般的に言って、ヒトハイブリドーマはマ
ウスのそれと比較して抗体の産生量が低い。ヒトモノク
ローナル抗体を癌治療や診断に用いる場合、大量の抗体
が必要であり、この問題の解決は必須である。
【０００６】２）現在の免疫学の知見によれば、モノク
ローナル抗体がヒト癌細胞に結合し、抗体それ自体の作
用で癌細胞の増殖を抑制し、あるいは癌細胞を死滅させ
る機構が知られている。更にはまた、補体もしくはＫ−
細胞やマクロフアージなどの助けを借りて癌細胞の増殖
を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こすことが知られてい
る。しかし、これらの効果は実際のところ期待されるほ
ど強力ではなく、それゆえ更に抗体の抗癌活性を上昇さ
せる試みが必要である。
ローナル抗体がヒト癌細胞に結合し、抗体それ自体の作
用で癌細胞の増殖を抑制し、あるいは癌細胞を死滅させ
る機構が知られている。更にはまた、補体もしくはＫ−
細胞やマクロフアージなどの助けを借りて癌細胞の増殖
を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こすことが知られてい
る。しかし、これらの効果は実際のところ期待されるほ
ど強力ではなく、それゆえ更に抗体の抗癌活性を上昇さ
せる試みが必要である。
【０００７】以上のような課題の解決手段、すなわち抗
体産生量の改善と抗体の抗癌活性の上昇を具体化するひ
とつの手段として遺伝子操作による方法がある。例えば
１）の問題の場合、抗体遺伝子をクローニングした後、
動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に遺伝子を導入し、抗
体遺伝子を発現させ、抗体を多量に得る方法によって解
決することが考えられ、また２）の問題の場合、抗体遺
伝子を人為的に換えることによって、抗体の種々の機
能、たとえば抗原との結合親和性や、免疫担当細胞を介
した抗癌活性あるいは組織浸潤性を上昇させるように改
変したり、さらには本来抗体が持たない機能、たとえば
細胞毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体分子にも
しくはその断片に付加することで、より抗癌活性の高い
分子をデザインすることが考えられる。
体産生量の改善と抗体の抗癌活性の上昇を具体化するひ
とつの手段として遺伝子操作による方法がある。例えば
１）の問題の場合、抗体遺伝子をクローニングした後、
動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に遺伝子を導入し、抗
体遺伝子を発現させ、抗体を多量に得る方法によって解
決することが考えられ、また２）の問題の場合、抗体遺
伝子を人為的に換えることによって、抗体の種々の機
能、たとえば抗原との結合親和性や、免疫担当細胞を介
した抗癌活性あるいは組織浸潤性を上昇させるように改
変したり、さらには本来抗体が持たない機能、たとえば
細胞毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体分子にも
しくはその断片に付加することで、より抗癌活性の高い
分子をデザインすることが考えられる。
【０００８】これらの目的を達成するためには、抗体遺
伝子の分離さらに構造の解明が重要である。しかしなが
ら、該ＣＬＮ−lgＧモノクローナル抗体を構成する軽鎖
と重鎖の構造、さらには抗原と特異的に結合する機能を
有する可変領域の遺伝子構造についてはこれまで全く知
られていない。
伝子の分離さらに構造の解明が重要である。しかしなが
ら、該ＣＬＮ−lgＧモノクローナル抗体を構成する軽鎖
と重鎖の構造、さらには抗原と特異的に結合する機能を
有する可変領域の遺伝子構造についてはこれまで全く知
られていない。
【０００９】そこで本発明の主たる目的は、該ＣＬＮ−
lgＧモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の遺伝子構造を解
明することにある。
lgＧモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の遺伝子構造を解
明することにある。
【００１０】
【課題点を解決するための手段】本発明者らは、該ＣＬ
Ｎ−lgＧモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖をコードす
るcＤＮＡを分離し、該ＤＮＡ塩基配列を解明し、また
その配列より該抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸
配列を決定し本発明を完成するに至った。
Ｎ−lgＧモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖をコードす
るcＤＮＡを分離し、該ＤＮＡ塩基配列を解明し、また
その配列より該抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸
配列を決定し本発明を完成するに至った。
【００１１】具体的には、ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１より
mＲＮＡを調製し、そこから作成したcＤＮＡラムダフア
ージ・ライブラリーを、プラークハイブリダイゼーシヨ
ン法によりスクリーニングし、単離したフアージクロー
ンの挿入ＤＮＡの塩基配列を決定することにより達成さ
れた。以下本発明について更に詳細に説明する。
mＲＮＡを調製し、そこから作成したcＤＮＡラムダフア
ージ・ライブラリーを、プラークハイブリダイゼーシヨ
ン法によりスクリーニングし、単離したフアージクロー
ンの挿入ＤＮＡの塩基配列を決定することにより達成さ
れた。以下本発明について更に詳細に説明する。
【００１２】本発明によれば、ＣＬＮ−lgＧモノクロー
ナル抗体軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＤＮＡ塩基
配列は、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ鎖反応法）により増幅
したヒト抗体遺伝子断片をプローブとして、ＣＬＮ−lg
Ｇモノクローナル抗体軽鎖および重鎖のcＤＮＡをクロ
ーニングし、該ＤＮＡ塩基配列を解析することにより決
定された。以下、これらの工程について更に詳細に説明
する。
ナル抗体軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＤＮＡ塩基
配列は、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ鎖反応法）により増幅
したヒト抗体遺伝子断片をプローブとして、ＣＬＮ−lg
Ｇモノクローナル抗体軽鎖および重鎖のcＤＮＡをクロ
ーニングし、該ＤＮＡ塩基配列を解析することにより決
定された。以下、これらの工程について更に詳細に説明
する。
【００１３】［１］mＲＮＡ単離精製 本発明において使用される細胞株は、ヒト子宮癌患者リ
ンパ球とヒトリンパ芽球を融合させたヒト／ヒトハイブ
リドーマであり、具体的には特開昭５８−２０１９９４
号公報（特公平０１−５９８７８号公報）に詳しく開示
され、ヒト脳腫瘍、肺ガン、胃ガン、悪性黒色腫などの
ごとき癌細胞の細胞表面抗原に特異的に反応するヒト型
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＣＬＮ−
ＳＵＺＨ１１である。このハイブリドーマはＡＴＣＣ
（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection）に登録番号
ＨＢ８３０７として登録されている。
ンパ球とヒトリンパ芽球を融合させたヒト／ヒトハイブ
リドーマであり、具体的には特開昭５８−２０１９９４
号公報（特公平０１−５９８７８号公報）に詳しく開示
され、ヒト脳腫瘍、肺ガン、胃ガン、悪性黒色腫などの
ごとき癌細胞の細胞表面抗原に特異的に反応するヒト型
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＣＬＮ−
ＳＵＺＨ１１である。このハイブリドーマはＡＴＣＣ
（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection）に登録番号
ＨＢ８３０７として登録されている。
【００１４】この細胞を適当な条件下、例えば３７℃炭
酸ガス濃度５％の条件下、５％牛胎児血清を含む培養
液、たとえばＲＤＦ培地中で培養増殖させ、得られる細
胞を遠心分離によって集めた後、細胞から常法、例えば
Ｈanらのグアニジウムチオシアネート法［Ｈan，Ｊ．
Ｈ., Ｓtratowa，Ｃ., ＆ Ｒutter, Ｗ．Ｊ．（１９８
７）Ｂiochemistry, ２６，１６１７−１６２５］によ
り全ＲＮＡを抽出し、ついでこれを常法、例えばオリゴ
dTセルロースを用いる吸着カラムクロマトグラフイまた
はバッチ法によりポリ（Ａ）+ＲＮＡ画分を分離精製す
る。
酸ガス濃度５％の条件下、５％牛胎児血清を含む培養
液、たとえばＲＤＦ培地中で培養増殖させ、得られる細
胞を遠心分離によって集めた後、細胞から常法、例えば
Ｈanらのグアニジウムチオシアネート法［Ｈan，Ｊ．
Ｈ., Ｓtratowa，Ｃ., ＆ Ｒutter, Ｗ．Ｊ．（１９８
７）Ｂiochemistry, ２６，１６１７−１６２５］によ
り全ＲＮＡを抽出し、ついでこれを常法、例えばオリゴ
dTセルロースを用いる吸着カラムクロマトグラフイまた
はバッチ法によりポリ（Ａ）+ＲＮＡ画分を分離精製す
る。
【００１５】得られるポリ（Ａ）+ＲＮＡはさらにcＤＮ
Ａライブラリーの作製に利用することができる。本発明
においては、具体的にはＣＬＮ−ＳＵＺ Ｈ１１ハイブ
リドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、この抽出物からオ
リゴdTセルロースカラムを用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡを
精製し、以下のcＤＮＡライブラリーの作製に供した。 ［２］cＤＮＡライブラリーの作製 ［１］の工程で得られるポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型と
し、ポリＡに対応するオリゴdT、あるいは抗体の定常領
域に対応すると考えられる塩基配列を有する合成ヌクレ
オチドをプライマーとして、dＡＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴ
Ｐ、dＣＴＰの存在下で逆転写酵素によりmＲＮＡと相補
的な一本鎖ＤＮＡを合成する。次いで大腸菌ＲＮＡ分解
酵素ＨでＲＮＡを断片化した後、この一本鎖ＤＮＡを鋳
型として、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖
cＤＮＡを合成する。こうして得られるcＤＮＡに、たと
えばＥcoＲＩリンカーを連結後、ＥcoＲＩ消化すること
によって粘着末端を導入することができる。得られる断
片を適当なフアージベクター、たとえばλgt１０ベクタ
ー、λgt１１ベクターなどのＥcoＲＩ部位に連結した
後、インビトロパッケージングを行い、cＤＮＡライブ
ラリーを作製することができる。
Ａライブラリーの作製に利用することができる。本発明
においては、具体的にはＣＬＮ−ＳＵＺ Ｈ１１ハイブ
リドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、この抽出物からオ
リゴdTセルロースカラムを用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡを
精製し、以下のcＤＮＡライブラリーの作製に供した。 ［２］cＤＮＡライブラリーの作製 ［１］の工程で得られるポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型と
し、ポリＡに対応するオリゴdT、あるいは抗体の定常領
域に対応すると考えられる塩基配列を有する合成ヌクレ
オチドをプライマーとして、dＡＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴ
Ｐ、dＣＴＰの存在下で逆転写酵素によりmＲＮＡと相補
的な一本鎖ＤＮＡを合成する。次いで大腸菌ＲＮＡ分解
酵素ＨでＲＮＡを断片化した後、この一本鎖ＤＮＡを鋳
型として、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖
cＤＮＡを合成する。こうして得られるcＤＮＡに、たと
えばＥcoＲＩリンカーを連結後、ＥcoＲＩ消化すること
によって粘着末端を導入することができる。得られる断
片を適当なフアージベクター、たとえばλgt１０ベクタ
ー、λgt１１ベクターなどのＥcoＲＩ部位に連結した
後、インビトロパッケージングを行い、cＤＮＡライブ
ラリーを作製することができる。
【００１６】本発明の具体的操作においては、［１］の
工程で得られるポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型としcＤＮＡを
合成し、このcＤＮＡをλgt１０ベクターに連結しcＤＮ
Ａライブラリーを作製した。
工程で得られるポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型としcＤＮＡを
合成し、このcＤＮＡをλgt１０ベクターに連結しcＤＮ
Ａライブラリーを作製した。
【００１７】［３］プローブの作製 プローブとしては、ヒト免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の
定常領域あるいは可変領域の遺伝子もしくはその断片、
あるいはその部分のアミノ酸配列に対応する塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを化学合成したものをたとえ
ばニックトランスレーション法により32Ｐ、ビオチンな
どで標識を行ったものを用いることができる。
定常領域あるいは可変領域の遺伝子もしくはその断片、
あるいはその部分のアミノ酸配列に対応する塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを化学合成したものをたとえ
ばニックトランスレーション法により32Ｐ、ビオチンな
どで標識を行ったものを用いることができる。
【００１８】本発明において好適には、cＤＮＡを鋳型
に、抗体の軽鎖および重鎖の一部に相当する配列をプラ
イマーにして行ったＰＣＲにより増幅された断片を、ニ
ックトランスレーション法によりビオチン化したものを
プローブとすることができる。
に、抗体の軽鎖および重鎖の一部に相当する配列をプラ
イマーにして行ったＰＣＲにより増幅された断片を、ニ
ックトランスレーション法によりビオチン化したものを
プローブとすることができる。
【００１９】［４］cＤＮＡのクローニング ［２］の工程で得られるcＤＮＡライブラリーを、
［３］の工程で得られるプローブを用いることにより目
的とするクローンの選択を行う。例えば［２］の工程で
得られるcＤＮＡライブラリーのλgt１０フアージを大
腸菌株（Ｃ６００Ｈfl-）に感染させることでプラーク
を形成させ、さらにプラークハイブリダイゼーシヨン法
によって陽性クローンを選別する。これにより、ＣＬＮ
−lgＧ重鎖cＤＮＡクローンとしてλＣＬＮ−Ｇ１１１
が、ＣＬＮ−lgＧ軽鎖cＤＮＡクローンとしてλＣＬＮ
−Ｋ４１１が選択され塩基配列決定に供された。
［３］の工程で得られるプローブを用いることにより目
的とするクローンの選択を行う。例えば［２］の工程で
得られるcＤＮＡライブラリーのλgt１０フアージを大
腸菌株（Ｃ６００Ｈfl-）に感染させることでプラーク
を形成させ、さらにプラークハイブリダイゼーシヨン法
によって陽性クローンを選別する。これにより、ＣＬＮ
−lgＧ重鎖cＤＮＡクローンとしてλＣＬＮ−Ｇ１１１
が、ＣＬＮ−lgＧ軽鎖cＤＮＡクローンとしてλＣＬＮ
−Ｋ４１１が選択され塩基配列決定に供された。
【００２０】［５］塩基配列の決定 ［４］の工程で得られるcＤＮＡクローンは、たとえばp
ＵＣ１８のようなプラスミッドベクターやＭ１３フアー
ジなどのフアージベクターあるいはpＵＣ１１８、pＢlu
escript ＳＫ+などのフアージミッドベクターに再クロ
ーン化し、得られるサブクローンの挿入部分のＤＮＡ塩
基配列をマキサム、ギルバート法やサンガー法を用いて
塩基配列を決定することができる。
ＵＣ１８のようなプラスミッドベクターやＭ１３フアー
ジなどのフアージベクターあるいはpＵＣ１１８、pＢlu
escript ＳＫ+などのフアージミッドベクターに再クロ
ーン化し、得られるサブクローンの挿入部分のＤＮＡ塩
基配列をマキサム、ギルバート法やサンガー法を用いて
塩基配列を決定することができる。
【００２１】本発明の具体的操作においては、［４］の
工程で得られるλＣＬＮ−Ｇ１１１およびλＣＬＮ−Ｋ
４１１のＥcoＲＩ断片を、pＢluescript ＳＫ+に再クロ
ーン化後、ヘルパーフアージＲ４０８感染により一本鎖
ＤＮＡを調製し、サンガー法によりその塩基配列を決定
した。
工程で得られるλＣＬＮ−Ｇ１１１およびλＣＬＮ−Ｋ
４１１のＥcoＲＩ断片を、pＢluescript ＳＫ+に再クロ
ーン化後、ヘルパーフアージＲ４０８感染により一本鎖
ＤＮＡを調製し、サンガー法によりその塩基配列を決定
した。
【００２２】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００２３】
実施例１：ハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１から
のmＲＮＡ（ポリ（Ａ）+ＲＮＡ）の単離精製 ヒト／ヒトハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１から
mＲＮＡ分画を得た方法は以下のとおりである。
のmＲＮＡ（ポリ（Ａ）+ＲＮＡ）の単離精製 ヒト／ヒトハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１から
mＲＮＡ分画を得た方法は以下のとおりである。
【００２４】ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１細胞から、グアニ
ジウムチオシアネート法［Ｈan, Ｊ．Ｈ.，Ｓtratowa,
Ｃ., ＆ Ｒutter, Ｗ．Ｊ．（１９８７）．Ｂiochemis
try,２６，１６１７−１６２５］により、全ＲＮＡを調
整した。培養細胞１０9個を遠心分離で集め生理食塩水
で洗浄する。８００rpmで遠心し集めた細胞の沈殿に、
あらかじめ氷冷しておいた８％２−メルカプトエタノー
ルを含む５Ｍグアニジウムチオシアネートを２０ｍｌ加
え、すみやかにホモジェナイズする。その細胞破砕液
を、あらかじめ７.５ｍｌのエタノールをいれ−２０℃
で冷やしておいたポリプロピレン遠心チューブに入れて
混合し、即座に１０,０００rpmで５分間遠心する。得ら
れた沈殿にあらかじめ氷冷しておいた８％２−メルカプ
トエタノールを含む５Ｍグアニジウムチオシアネートを
１０ｍｌ加えホモジェナイズした後、そこへ１Ｍ酢酸
０.２５ｍｌと７.５ｍｌの冷エタノールを加え、−２０
℃で一晩放置する。１０,０００rpmで１０分間遠心分離
し得られた沈殿を１０mＭ２−メルカプトエタノールを
含む６Ｍ塩酸グアニジン１０ｍｌに溶解し、さらに１Ｍ
酢酸０.２５ｍｌと５ｍｌの冷エタノールを加え−２０
℃で３時間放置する。１０,０００rpmで１０分間遠心分
離し得られた沈殿を６Ｍ塩酸グアニジン５ｍｌに溶解し
１Ｍ酢酸０.１２５ｍｌと２.５ｍｌの冷エタノールを加
え−２０℃でさらに３時間放置する。１０,０００rpmで
１０分間遠心分離し得られた沈殿を滅菌純水５ｍｌに溶
解し、２１Ｍ酢酸ナトリウム０.５ｍｌおよび冷エタノ
ール１２.５ｍｌ加え−２０℃で全ＲＮＡ分画として保
存する。
ジウムチオシアネート法［Ｈan, Ｊ．Ｈ.，Ｓtratowa,
Ｃ., ＆ Ｒutter, Ｗ．Ｊ．（１９８７）．Ｂiochemis
try,２６，１６１７−１６２５］により、全ＲＮＡを調
整した。培養細胞１０9個を遠心分離で集め生理食塩水
で洗浄する。８００rpmで遠心し集めた細胞の沈殿に、
あらかじめ氷冷しておいた８％２−メルカプトエタノー
ルを含む５Ｍグアニジウムチオシアネートを２０ｍｌ加
え、すみやかにホモジェナイズする。その細胞破砕液
を、あらかじめ７.５ｍｌのエタノールをいれ−２０℃
で冷やしておいたポリプロピレン遠心チューブに入れて
混合し、即座に１０,０００rpmで５分間遠心する。得ら
れた沈殿にあらかじめ氷冷しておいた８％２−メルカプ
トエタノールを含む５Ｍグアニジウムチオシアネートを
１０ｍｌ加えホモジェナイズした後、そこへ１Ｍ酢酸
０.２５ｍｌと７.５ｍｌの冷エタノールを加え、−２０
℃で一晩放置する。１０,０００rpmで１０分間遠心分離
し得られた沈殿を１０mＭ２−メルカプトエタノールを
含む６Ｍ塩酸グアニジン１０ｍｌに溶解し、さらに１Ｍ
酢酸０.２５ｍｌと５ｍｌの冷エタノールを加え−２０
℃で３時間放置する。１０,０００rpmで１０分間遠心分
離し得られた沈殿を６Ｍ塩酸グアニジン５ｍｌに溶解し
１Ｍ酢酸０.１２５ｍｌと２.５ｍｌの冷エタノールを加
え−２０℃でさらに３時間放置する。１０,０００rpmで
１０分間遠心分離し得られた沈殿を滅菌純水５ｍｌに溶
解し、２１Ｍ酢酸ナトリウム０.５ｍｌおよび冷エタノ
ール１２.５ｍｌ加え−２０℃で全ＲＮＡ分画として保
存する。
【００２５】ポリ（Ａ）+ＲＮＡは、上述の方法で得ら
れた全ＲＮＡ分画からＣhirgwinの方法［Ｃhirgwin，
Ｊ．Ｍ.，Ｐrzybyla, Ａ．Ｅ.，ＭacＤonald，Ｒ．
Ｊ.，＆ Ｒutter, Ｗ．Ｊ．（１９７９）Ｂiochemistr
y，１８，５２９４−５２９９］を用いて調製した。ま
ずＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１細胞の全ＲＮＡ９ｍｇを純水
に解かし２.５ｍｇ／ｍｌとする。１００℃で５分間熱
処理し、氷上で急冷した後、５Ｍ塩化リチウム、１０％
ＳＤＳ、１Ｍトリエタノールアミン塩酸pＨ７.４をそ
れぞれ最終濃度０.５Ｍ、０.２％、１０mＭになるよう
に加える。その溶液を、あらかじめ結合緩衝液（０.５
Ｍ塩化リチウム、０.２％ＳＤＳ、１０ｍＭトリエタノ
ールアミン塩酸pＨ７.４）で平衡化しておいたオリゴ
（dT)セルロースカラムにかける。さらにカラム体積の
１０倍の結合緩衝液で洗浄する。カラムに結合したポリ
（Ａ）+ＲＮＡを溶出緩衝液（１０mＭトリエタノールア
ミン塩酸pＨ７.４）で溶出し、ＲＮＡ分画を集める。得
られたポリ（Ａ）+ＲＮＡ溶液は１００℃で５分間熱処
理した後、上述のオリゴ（dT)セルロースカラムを用い
たクロマトグラフイーを新しいカラムをつかってもう一
度繰り返す。ＲＮＡは、溶出液に２.５倍量のエタノー
ルと1/10量の２Ｍ酢酸ナトリウムを加え、１０,０００
ｘｇの遠心分離した後の沈殿として回収する。精製ポリ
（Ａ）+ＲＮＡ沈殿を滅菌純水に溶解し２μg／μlの濃
度で−７０℃で保存する。
れた全ＲＮＡ分画からＣhirgwinの方法［Ｃhirgwin，
Ｊ．Ｍ.，Ｐrzybyla, Ａ．Ｅ.，ＭacＤonald，Ｒ．
Ｊ.，＆ Ｒutter, Ｗ．Ｊ．（１９７９）Ｂiochemistr
y，１８，５２９４−５２９９］を用いて調製した。ま
ずＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１細胞の全ＲＮＡ９ｍｇを純水
に解かし２.５ｍｇ／ｍｌとする。１００℃で５分間熱
処理し、氷上で急冷した後、５Ｍ塩化リチウム、１０％
ＳＤＳ、１Ｍトリエタノールアミン塩酸pＨ７.４をそ
れぞれ最終濃度０.５Ｍ、０.２％、１０mＭになるよう
に加える。その溶液を、あらかじめ結合緩衝液（０.５
Ｍ塩化リチウム、０.２％ＳＤＳ、１０ｍＭトリエタノ
ールアミン塩酸pＨ７.４）で平衡化しておいたオリゴ
（dT)セルロースカラムにかける。さらにカラム体積の
１０倍の結合緩衝液で洗浄する。カラムに結合したポリ
（Ａ）+ＲＮＡを溶出緩衝液（１０mＭトリエタノールア
ミン塩酸pＨ７.４）で溶出し、ＲＮＡ分画を集める。得
られたポリ（Ａ）+ＲＮＡ溶液は１００℃で５分間熱処
理した後、上述のオリゴ（dT)セルロースカラムを用い
たクロマトグラフイーを新しいカラムをつかってもう一
度繰り返す。ＲＮＡは、溶出液に２.５倍量のエタノー
ルと1/10量の２Ｍ酢酸ナトリウムを加え、１０,０００
ｘｇの遠心分離した後の沈殿として回収する。精製ポリ
（Ａ）+ＲＮＡ沈殿を滅菌純水に溶解し２μg／μlの濃
度で−７０℃で保存する。
【００２６】実施例２：ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１ライブ
ラリーの作成 実施例１で得られたポリ（Ａ）+ＲＮＡ４μgを用い、ア
マシャム社のcＤＮＡ合成キットのプロトコールに従
い、cＤＮＡを合成した３.２μg回収した。このcＤＮＡ
断片をＥcoＲＩメチラーゼ処理後、ＥcoＲＩリンカーを
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。ＥcoＲＩ消化
後、アマシャム社製カラムによりＥcoＲＩ末端を有する
cＤＮＡ分画を回収した。このcＤＮＡ１００ngをλgt１
０ベクター（ストラタジーン社製）１μgに連結後、in
vitroパッケージングをパッケージングキット（ＧＩＧ
ＡＰＡＣＫ ＧＯＬＤ；ストラタジーン社製）を用いて
行いＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮＡライブラリー７.８
×１０6pfu／μg ＤＮＡを作成した。
ラリーの作成 実施例１で得られたポリ（Ａ）+ＲＮＡ４μgを用い、ア
マシャム社のcＤＮＡ合成キットのプロトコールに従
い、cＤＮＡを合成した３.２μg回収した。このcＤＮＡ
断片をＥcoＲＩメチラーゼ処理後、ＥcoＲＩリンカーを
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。ＥcoＲＩ消化
後、アマシャム社製カラムによりＥcoＲＩ末端を有する
cＤＮＡ分画を回収した。このcＤＮＡ１００ngをλgt１
０ベクター（ストラタジーン社製）１μgに連結後、in
vitroパッケージングをパッケージングキット（ＧＩＧ
ＡＰＡＣＫ ＧＯＬＤ；ストラタジーン社製）を用いて
行いＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮＡライブラリー７.８
×１０6pfu／μg ＤＮＡを作成した。
【００２７】実施例３：プロテインシーケンサーによる
ＣＬＮ−lgＧのアミノ酸配列の決定 精製ＣＬＮ−lgＧを還元後、ゲルろ過により精製した重
鎖および軽鎖のそれぞれ３０μgをプロテインシーケン
サー４７７Ａ（アプライトバイオシステムズ社製）にか
け、Ｎ末端からのアミノ酸配列を約３０残基決定した。
また重鎖を臭化シアンによりメチオニン特異的に切断し
断片を逆相液体クロマトグラフイで分離精製後、同様に
一部のアミノ酸配列を決定した。
ＣＬＮ−lgＧのアミノ酸配列の決定 精製ＣＬＮ−lgＧを還元後、ゲルろ過により精製した重
鎖および軽鎖のそれぞれ３０μgをプロテインシーケン
サー４７７Ａ（アプライトバイオシステムズ社製）にか
け、Ｎ末端からのアミノ酸配列を約３０残基決定した。
また重鎖を臭化シアンによりメチオニン特異的に切断し
断片を逆相液体クロマトグラフイで分離精製後、同様に
一部のアミノ酸配列を決定した。
【００２８】実施例４：プローブの作成法 （１）重鎖のプローブ 実施例３で決定したＣＬＮ−lgＧ重鎖の部分アミノ酸配
列とホモロジーをもつ配列をＮＢＲＦ蛋白質データベー
ス（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ；Ｎational Ｂiomedical Ｒesea
rch Ｆoundation Ｐrotein Ｄata Ｂase）から検索した
結果、ヒト免疫グロブリンgerm line ＶＨ２６（エント
リー名Ｈ３ＨＵ２６、Ａccession number A02047）が最
も高いホモロジーを持つことがあきらかとなった。そこ
でＥＭＢＬ ＤＮＡデータベース（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ；
Ｅuropean Ｍolecular ＢiologyＬaboratory Ｇene det
a Ｂase）にあるＶＨ２６のＤＮＡ配列（ＩＤ名ＨＳＩ
ＧＨＡＵ，Ａccession number M17747）のうちからＮ末
端アミノ酸１０残基に相当する３０ヌクレオチド（プラ
イマーＮo.１）を合成した。また重鎖γ１ＣＨ１ドメイ
ンのＤＮＡ配列（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ；ＩＤ名ＨＳＩＧＣ
Ｃ４，Ａccession number J00228）のＣ末端側アミノ酸
１０残基に相当する３０ヌクレオチド（プライマーＮo.
２）を合成した。
列とホモロジーをもつ配列をＮＢＲＦ蛋白質データベー
ス（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ；Ｎational Ｂiomedical Ｒesea
rch Ｆoundation Ｐrotein Ｄata Ｂase）から検索した
結果、ヒト免疫グロブリンgerm line ＶＨ２６（エント
リー名Ｈ３ＨＵ２６、Ａccession number A02047）が最
も高いホモロジーを持つことがあきらかとなった。そこ
でＥＭＢＬ ＤＮＡデータベース（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ；
Ｅuropean Ｍolecular ＢiologyＬaboratory Ｇene det
a Ｂase）にあるＶＨ２６のＤＮＡ配列（ＩＤ名ＨＳＩ
ＧＨＡＵ，Ａccession number M17747）のうちからＮ末
端アミノ酸１０残基に相当する３０ヌクレオチド（プラ
イマーＮo.１）を合成した。また重鎖γ１ＣＨ１ドメイ
ンのＤＮＡ配列（ＥＭＢＬ−ＧＤＢ；ＩＤ名ＨＳＩＧＣ
Ｃ４，Ａccession number J00228）のＣ末端側アミノ酸
１０残基に相当する３０ヌクレオチド（プライマーＮo.
２）を合成した。
【００２９】
【化９】
【００３０】この２種類のプライマーを用いて実施例２
で調製したＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮＡ４ngをテン
プレートにＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）を行った。そ
の結果、約６６０塩基対の断片（ＰＣＲγＣ３）が増幅
され、塩基配列決定により抗体重鎖γ１ ＣＨ１ドメイ
ンおよび可変領域に相当することがあきらかとなった。
このγＣ３をニックトランスレーションの方法でビオチ
ン化しプローブ（ビオチン化ＰＣＲγＣ３）を得た。
で調製したＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮＡ４ngをテン
プレートにＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）を行った。そ
の結果、約６６０塩基対の断片（ＰＣＲγＣ３）が増幅
され、塩基配列決定により抗体重鎖γ１ ＣＨ１ドメイ
ンおよび可変領域に相当することがあきらかとなった。
このγＣ３をニックトランスレーションの方法でビオチ
ン化しプローブ（ビオチン化ＰＣＲγＣ３）を得た。
【００３１】（２）軽鎖のプローブ 実施例３で決定したＣＬＮ−lgＧ軽鎖の部分アミノ酸配
列とホモロジーをもつ配列をＮＢＲＦ蛋白質データベー
スから検索した結果、Ｄaudi細胞由来のヒト免疫グロブ
リン（エントリー名Ｋ１ＨＵＤＩ、Ａccession number
A01884）の配列と最も高いホモロジーがあった。そこで
ＥＭＢＬ ＤＮＡデータベースにあるＤaudi抗体軽鎖の
ＤＮＡ配列（ＩＤ名ＨＳＶＫ０２，Ａccession number
X00966）のうちからＮ末端アミノ酸１０残基に相当する
３０ヌクレオチド（プライマーＮo.３）を合成した。ま
た軽鎖（κ鎖）ＣドメインのＤＮＡ配列（ＥＭＢＬ−Ｇ
ＤＢ；ＩＤ名ＨＳＩＧＫ１，Ａccession number V0055
7）のＣ末端側アミノ酸１０残基に相当する３０ヌクレ
オチド（プライマーＮo.４）を合成した。
列とホモロジーをもつ配列をＮＢＲＦ蛋白質データベー
スから検索した結果、Ｄaudi細胞由来のヒト免疫グロブ
リン（エントリー名Ｋ１ＨＵＤＩ、Ａccession number
A01884）の配列と最も高いホモロジーがあった。そこで
ＥＭＢＬ ＤＮＡデータベースにあるＤaudi抗体軽鎖の
ＤＮＡ配列（ＩＤ名ＨＳＶＫ０２，Ａccession number
X00966）のうちからＮ末端アミノ酸１０残基に相当する
３０ヌクレオチド（プライマーＮo.３）を合成した。ま
た軽鎖（κ鎖）ＣドメインのＤＮＡ配列（ＥＭＢＬ−Ｇ
ＤＢ；ＩＤ名ＨＳＩＧＫ１，Ａccession number V0055
7）のＣ末端側アミノ酸１０残基に相当する３０ヌクレ
オチド（プライマーＮo.４）を合成した。
【００３２】
【化１０】
【００３３】この２種類のプライマーを用いて実施例２
で調製したＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮＡ４ngをテン
プレートにＰＣＲを行った。その結果、約６６０塩基対
の断片（ＰＣＲκＡ４）が増幅され、塩基配列決定によ
り抗体軽鎖（κ鎖）Ｃドメインおよび可変領域に相当す
ることがあきらかとなった。このＰＣＲκ４をニックト
ランスレーションの方法でビオチン化しプローブ（ビオ
チン化ＰＣＲκＡ４）を得た。
で調製したＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮＡ４ngをテン
プレートにＰＣＲを行った。その結果、約６６０塩基対
の断片（ＰＣＲκＡ４）が増幅され、塩基配列決定によ
り抗体軽鎖（κ鎖）Ｃドメインおよび可変領域に相当す
ることがあきらかとなった。このＰＣＲκ４をニックト
ランスレーションの方法でビオチン化しプローブ（ビオ
チン化ＰＣＲκＡ４）を得た。
【００３４】実施例５：cＤＮＡのクローニング （１）重鎖cＤＮＡのクローニング 前記実施例２で得られたＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮ
Ａライブラリーに対して実施例４で得られたビオチン化
プローブを用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを行
い１３個の陽性クローンを得た。この中のクローンのひ
とつは約１.６Ｋ塩基対の挿入ＤＮＡを持っており、こ
のフアージをλＣＬＮ−Ｇ１１１と命名した。
Ａライブラリーに対して実施例４で得られたビオチン化
プローブを用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを行
い１３個の陽性クローンを得た。この中のクローンのひ
とつは約１.６Ｋ塩基対の挿入ＤＮＡを持っており、こ
のフアージをλＣＬＮ−Ｇ１１１と命名した。
【００３５】（２）軽鎖cＤＮＡのクローニング 前記実施例２で得られたＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１cＤＮ
Ａライブラリーに対して実施例４で得られたビオチン化
プローブを用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを行
い２７個の陽性クローンを得た。この中のクローン４１
１は約１.０Ｋ塩基対の挿入ＤＮＡを持っており、この
フアージをλＣＬＮ−Ｋ４１１と命名した。
Ａライブラリーに対して実施例４で得られたビオチン化
プローブを用いてプラークハイブリダイゼーシヨンを行
い２７個の陽性クローンを得た。この中のクローン４１
１は約１.０Ｋ塩基対の挿入ＤＮＡを持っており、この
フアージをλＣＬＮ−Ｋ４１１と命名した。
【００３６】実施例６：塩基配列の決定 実施例５においてクローン化したλＣＬＮ−Ｇ１１１お
よびλＣＬＮ−Ｋ４１１のＥcoＲＩ断片をフアージミッ
ドＢluescript ＳＫ+に再クローン化した。このフアー
ジミッドで形質転換した大腸菌ＫＬ１−Ｂlueにヘルパ
ーフアージＲ４０８を感染させ、一本鎖ＤＮＡを調整
し、サンガー法（Ｓanger, Ｆ．et al. Ｐroc. Ｎatl.
Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ．７４；５４６３（１９７７））
により塩基配列を決定した。その結果得られたＣＬＮ−
lgＧ軽鎖cＤＮＡクローンの可変領域の塩基配列および
それから予測されるアミノ酸配列を以下に示す。
よびλＣＬＮ−Ｋ４１１のＥcoＲＩ断片をフアージミッ
ドＢluescript ＳＫ+に再クローン化した。このフアー
ジミッドで形質転換した大腸菌ＫＬ１−Ｂlueにヘルパ
ーフアージＲ４０８を感染させ、一本鎖ＤＮＡを調整
し、サンガー法（Ｓanger, Ｆ．et al. Ｐroc. Ｎatl.
Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ．７４；５４６３（１９７７））
により塩基配列を決定した。その結果得られたＣＬＮ−
lgＧ軽鎖cＤＮＡクローンの可変領域の塩基配列および
それから予測されるアミノ酸配列を以下に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】またＣＬＮ−lgＧ重鎖および軽鎖のサブグ
ループを決定するためコンピューター検索を行い相同性
の高い遺伝子を調べた結果、ＣＬＮ−lgＧ重鎖可変領域
はサブグループ３に、まだ軽鎖（κ鎖）可変領域はサブ
グループ１に属することが明かとなった。
ループを決定するためコンピューター検索を行い相同性
の高い遺伝子を調べた結果、ＣＬＮ−lgＧ重鎖可変領域
はサブグループ３に、まだ軽鎖（κ鎖）可変領域はサブ
グループ１に属することが明かとなった。
【００４０】実施例７：超可変領域の決定 種々の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を各々比較す
ると、配列が一定の領域（定常領域）と異なっている領
域（可変領域）が存在することがわかる。可変領域の中
でも特に変異性に富んでいるところを超可変領域（hype
r-variable region, Ｈv領域）と呼び、重鎖及び軽鎖そ
れぞれ３箇所ずつ存在する。アミノ末端から、それぞれ
Ｈｖ１、Ｈｖ２、Ｈｖ３と呼ぶ。これらの超可変領域は
抗原との結合部位を形づくり、抗原決定基と直接接触す
るアミノ酸残基を含んでいると考えられている。そのた
め超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ；Ｃomplemen
tarity determining region）とも呼ばれ、抗体の抗原
特異性を支配している領域である。
ると、配列が一定の領域（定常領域）と異なっている領
域（可変領域）が存在することがわかる。可変領域の中
でも特に変異性に富んでいるところを超可変領域（hype
r-variable region, Ｈv領域）と呼び、重鎖及び軽鎖そ
れぞれ３箇所ずつ存在する。アミノ末端から、それぞれ
Ｈｖ１、Ｈｖ２、Ｈｖ３と呼ぶ。これらの超可変領域は
抗原との結合部位を形づくり、抗原決定基と直接接触す
るアミノ酸残基を含んでいると考えられている。そのた
め超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ；Ｃomplemen
tarity determining region）とも呼ばれ、抗体の抗原
特異性を支配している領域である。
【００４１】ＣＬＮ−lgＧの超可変領域を決定するため
にＫabat ＆ Ｗuプロットを用いた。［Ｋabat，Ｅ．
Ａ., Ｗu，Ｔ．Ｔ.，Ｂilofsky，Ｈ．Ｖariable Ｒegio
ns ofＩmmunoglobulin Ｃhains（Ｍedical Ｃomput. Ｓ
ystems, Ｂolt, Ｂeranek ＆Ｎewman, Ｃambridge，１
９７６）］これは種々の抗体の配列を並べて、各位置ご
とに変異度を計算してプロットするものである。ここで
いう変異度とは、「任意の位置における出現アミノ酸の
種類数」と「その位置で最も頻繁に出現するアミノ酸の
頻度」の比であり、理論的に１から４００の値をとる。
変異度の値が大きい領域が超可変領域である。
にＫabat ＆ Ｗuプロットを用いた。［Ｋabat，Ｅ．
Ａ., Ｗu，Ｔ．Ｔ.，Ｂilofsky，Ｈ．Ｖariable Ｒegio
ns ofＩmmunoglobulin Ｃhains（Ｍedical Ｃomput. Ｓ
ystems, Ｂolt, Ｂeranek ＆Ｎewman, Ｃambridge，１
９７６）］これは種々の抗体の配列を並べて、各位置ご
とに変異度を計算してプロットするものである。ここで
いう変異度とは、「任意の位置における出現アミノ酸の
種類数」と「その位置で最も頻繁に出現するアミノ酸の
頻度」の比であり、理論的に１から４００の値をとる。
変異度の値が大きい領域が超可変領域である。
【００４２】（１）ＣＬＮ−lgＧ軽鎖の超可変領域の決
定 ＣＬＮ−lgＧ軽鎖のアミノ酸配列から、カッパ鎖サブグ
ループ１に属することが明かとなった。そこでＮＢＲＦ
−ＰＤＢ（rel.26）に含まれているサブグループ１に属
する２４の配列をＣＬＮ−lgＧ軽鎖と共に並べ、各位置
で変異度を計算しＫabat ＆ Ｗuプロットを作製した
（図１）。その結果から、Ｈｖ１、Ｈｖ２、Ｈｖ３をそ
れぞれ残基番号２８から３４、５０から５６、９１から
９６と決定した。
定 ＣＬＮ−lgＧ軽鎖のアミノ酸配列から、カッパ鎖サブグ
ループ１に属することが明かとなった。そこでＮＢＲＦ
−ＰＤＢ（rel.26）に含まれているサブグループ１に属
する２４の配列をＣＬＮ−lgＧ軽鎖と共に並べ、各位置
で変異度を計算しＫabat ＆ Ｗuプロットを作製した
（図１）。その結果から、Ｈｖ１、Ｈｖ２、Ｈｖ３をそ
れぞれ残基番号２８から３４、５０から５６、９１から
９６と決定した。
【００４３】（２）ＣＬＮ−lgＧ重鎖の超可変領域の決
定 ＣＬＮ−lgＧ重鎖のアミノ酸配列から、Ｈｖサブグルー
プ３に属することが明かとなった。そこでＮＢＲＦ−Ｐ
ＤＢ（rel.26）に含まれているサブグループ３に属する
２１の配列をＣＬＮ−lgＧ重鎖と共に並べ、各位置で変
異度を計算しＫabat ＆ Ｗuプロットを作製した（図
２、残基番号９６まで表示）。その結果、Ｈｖ１、Ｈｖ
２をそれぞれ残基番号３１から３５、４９から５９と決
定した。Ｈｖ３に関しては、重鎖の場合、以下に示すご
とく、各配列間で顕著に鎖長が異なるため位置を正確に
あわせることが困難である。ギャップを考慮せずに変異
度を計算すると、残基番号９６システインが１．０、９
７グリシンが２.１、９８アルギニンが３.９、９９バリ
ンが２９.３、１０９チロシンが１８.４、１１０トリプ
トフアンが３.５、１１１グリシンが１.０となる。明か
に残基番号９９から１０９までの位置で変異度が高く、
この領域がＨｖ３に相当する。
定 ＣＬＮ−lgＧ重鎖のアミノ酸配列から、Ｈｖサブグルー
プ３に属することが明かとなった。そこでＮＢＲＦ−Ｐ
ＤＢ（rel.26）に含まれているサブグループ３に属する
２１の配列をＣＬＮ−lgＧ重鎖と共に並べ、各位置で変
異度を計算しＫabat ＆ Ｗuプロットを作製した（図
２、残基番号９６まで表示）。その結果、Ｈｖ１、Ｈｖ
２をそれぞれ残基番号３１から３５、４９から５９と決
定した。Ｈｖ３に関しては、重鎖の場合、以下に示すご
とく、各配列間で顕著に鎖長が異なるため位置を正確に
あわせることが困難である。ギャップを考慮せずに変異
度を計算すると、残基番号９６システインが１．０、９
７グリシンが２.１、９８アルギニンが３.９、９９バリ
ンが２９.３、１０９チロシンが１８.４、１１０トリプ
トフアンが３.５、１１１グリシンが１.０となる。明か
に残基番号９９から１０９までの位置で変異度が高く、
この領域がＨｖ３に相当する。
【００４４】
【表３】
【００４５】
【発明の効果】ＣＬＮ−lgＧ抗体及びその遺伝子構造が
明かになったことによって、この遺伝子を動物細胞や大
腸菌などの宿主細胞に導入し発現させ、抗体を多量に得
ることが可能となる。更には完全抗体のみならず、ある
種の抗体断片、たとえば重鎖のみ、軽鎖のみ、Ｆab断
片、Ｆ(ab)'2断片、Ｆv断片、ドメイン断片（dＡb）、
ＣＤＲ断片などの各種抗体由来断片を得ることが可能と
なる。また更に抗体遺伝子に人為的突然変異を起こすこ
とにより、アミノ酸配列の一部異なる完全抗体もしくは
各種抗体由来断片を得ることができる。
明かになったことによって、この遺伝子を動物細胞や大
腸菌などの宿主細胞に導入し発現させ、抗体を多量に得
ることが可能となる。更には完全抗体のみならず、ある
種の抗体断片、たとえば重鎖のみ、軽鎖のみ、Ｆab断
片、Ｆ(ab)'2断片、Ｆv断片、ドメイン断片（dＡb）、
ＣＤＲ断片などの各種抗体由来断片を得ることが可能と
なる。また更に抗体遺伝子に人為的突然変異を起こすこ
とにより、アミノ酸配列の一部異なる完全抗体もしくは
各種抗体由来断片を得ることができる。
【００４６】現在までの研究の結果、ＣＬＮ−lgＧは、
たとえばヒト胃ガン、肺ガン、脳腫瘍、悪性黒色腫など
のごときヒト癌細胞に働き、それ自体の作用でこれら癌
細胞の増殖を抑制し、或は癌細胞を死滅させ、さらには
補体もしくはＫ−細胞やマクロフアージなどの助けを借
りて癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こす
ことが期待される。しかし、ＣＬＮ−lgＧの遺伝子を改
変し抗体のアミノ酸を一部置換することにより、更に抗
体の活性を上昇させることが可能である。たとえば抗原
との結合親和性や、免疫担当細胞を介した抗癌活性、あ
るいは組織への浸潤性などが上昇するように改変でき
る。さらには、たとえば細胞毒性、酵素活性、免疫誘導
活性などを抗体分子もしくはその断片に遺伝子レベルで
付加する毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体分子
もしくはその断片に遺伝子レベルで付加することで、よ
り抗癌活性の高い分子をデザインすることが考えられ
る。具体例を挙げれば、癌特異的抗体をキャリアーとし
て利用して、例えば化学療法剤結合−ヒトモノクローナ
ル抗体、インターフエロン結合−ヒトモノクローナル抗
体、高分子毒素結合−ヒトモノクローナル抗体、薬物入
りリポゾーム結合−ヒトモノクローナル抗体、などの形
で癌細胞の増殖抑制や死滅を誘導する薬剤として有用で
ある。また、抗体に放射線感受性物質を結合させて患者
に投与し、癌細胞に選択的に集積させ、治療、診断の効
果を上げることも考えられる。このような癌に対する利
用に際しては、ヒトモノクローナル抗体として完全な抗
体を用いてもよいし、前述したとおり、例えば重鎖の
み、軽鎖のみ、Ｆab断片、Ｆ(ab)'2断片、Ｆv断片、ド
メイン断片（dＡb）、ＣＤＲ断片などの特異的抗原認識
部位を含むより小さな断片を用いることもできる。
たとえばヒト胃ガン、肺ガン、脳腫瘍、悪性黒色腫など
のごときヒト癌細胞に働き、それ自体の作用でこれら癌
細胞の増殖を抑制し、或は癌細胞を死滅させ、さらには
補体もしくはＫ−細胞やマクロフアージなどの助けを借
りて癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こす
ことが期待される。しかし、ＣＬＮ−lgＧの遺伝子を改
変し抗体のアミノ酸を一部置換することにより、更に抗
体の活性を上昇させることが可能である。たとえば抗原
との結合親和性や、免疫担当細胞を介した抗癌活性、あ
るいは組織への浸潤性などが上昇するように改変でき
る。さらには、たとえば細胞毒性、酵素活性、免疫誘導
活性などを抗体分子もしくはその断片に遺伝子レベルで
付加する毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体分子
もしくはその断片に遺伝子レベルで付加することで、よ
り抗癌活性の高い分子をデザインすることが考えられ
る。具体例を挙げれば、癌特異的抗体をキャリアーとし
て利用して、例えば化学療法剤結合−ヒトモノクローナ
ル抗体、インターフエロン結合−ヒトモノクローナル抗
体、高分子毒素結合−ヒトモノクローナル抗体、薬物入
りリポゾーム結合−ヒトモノクローナル抗体、などの形
で癌細胞の増殖抑制や死滅を誘導する薬剤として有用で
ある。また、抗体に放射線感受性物質を結合させて患者
に投与し、癌細胞に選択的に集積させ、治療、診断の効
果を上げることも考えられる。このような癌に対する利
用に際しては、ヒトモノクローナル抗体として完全な抗
体を用いてもよいし、前述したとおり、例えば重鎖の
み、軽鎖のみ、Ｆab断片、Ｆ(ab)'2断片、Ｆv断片、ド
メイン断片（dＡb）、ＣＤＲ断片などの特異的抗原認識
部位を含むより小さな断片を用いることもできる。
【図１】図１は、ヒトκ鎖サブグループ１に属する２４
の可変領域配列のＫabat ＆ Ｗu plotを示す。
の可変領域配列のＫabat ＆ Ｗu plotを示す。
【図２】図２は、ヒト重鎖サブグループ３に属する２１
の可変領域配列のＫabat ＆ Ｗu plotを示す。
の可変領域配列のＫabat ＆ Ｗu plotを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/13 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ
Claims (10)
- 【請求項１】 下記のアミノ酸配列 【化１】 を有する超可変領域Ｈv1、Ｈv2及びＨv3から選ばれる少
なくとも１つの超可変領域を含むことを特徴とする免疫
グロブリン重鎖可変領域断片。 - 【請求項２】 下記のアミノ酸配列 【化２】 を有する免疫グロブリン重鎖可変領域断片。
- 【請求項３】 下記のアミノ酸配列 【化３】 を有する超可変領域Ｈv1、Ｈv2及びＨv3から選ばれる少
なくとも１つの超可変領域をコードする塩基配列を含む
ことを特徴とする免疫グロブリン重鎖可変領域の少なく
とも一部をコードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片。 - 【請求項４】 請求項２記載のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ及びＲＮＡ塩基配列。 - 【請求項５】 下記の塩基配列 【化４】 を有する請求項４記載のＤＮＡ塩基配列及びこれに対応
するＲＮＡ塩基配列。 - 【請求項６】 下記のアミノ酸配列 【化５】 を有する超可変領域Ｈv1、Ｈv2及びＨv3から選ばれる少
なくとも１つの超可変領域を含むことを特徴とする免疫
グロブリン軽鎖可変領域断片。 - 【請求項７】 下記のアミノ酸配列 【化６】 を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域断片。
- 【請求項８】 下記のアミノ酸配列 【化７】 を有する超可変領域Ｈv1、Ｈv2及びＨv3から選ばれる少
なくとも１つの超可変領域をコードする塩基配列を含む
ことを特徴とする免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なく
とも一部をコードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片。 - 【請求項９】 請求項７記載のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ及びＲＮＡ塩基配列。 - 【請求項１０】 下記の塩基配列 【化８】 を有する請求項９記載のＤＮＡ塩基配列及びこれに対応
するＲＮＡ塩基配列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32141892A JPH06141884A (ja) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列及びそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32141892A JPH06141884A (ja) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列及びそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141884A true JPH06141884A (ja) | 1994-05-24 |
Family
ID=18132331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32141892A Pending JPH06141884A (ja) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列及びそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06141884A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004048571A1 (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 病巣組織に対する抗体 |
| WO2006066408A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Viventia Biotech Inc. | Cancer specific antibody and cell surface proteins |
| US8008076B2 (en) | 2004-04-27 | 2011-08-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of producing a nucleic acid encoding an antibody |
-
1992
- 1992-11-06 JP JP32141892A patent/JPH06141884A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US8084576B2 (en) | 2004-12-21 | 2011-12-27 | Viventia Biotechnologies Inc. | Cancer associated glucose transporter 8 variant |
| AU2005318836B2 (en) * | 2004-12-21 | 2012-03-22 | Viventia Bio Inc. | Cancer specific antibody and cell surface proteins |
| US8697075B2 (en) | 2004-12-21 | 2014-04-15 | Viventia Bio Inc. | Cancer specific antibody and cell surface proteins |
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