JPS63276489A - ヒトモチリン前駆体、該前駆体含有クローン化ｄｎａ、その調製法並びに該クローン化ｄｎａが組込まれたプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はモチリン、殊にヒトモチリン前駆体のクローン
化ＤＮＡ、その断片、これらの調製法並びに上記のクロ
ーン化ＤＮＡ又は断片が組込まれたプラスミドに係る。

（従来の技術） モチリンはブラウン等によりブタの上部小腸粘膜から初
めて単離され、構造決定がなされた物質であってペプチ
ドホルモンの一種である［　ｒ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅ
ｒｏｌｏｇｙ」第６２巻第４０１０−４０４０頁（１９
７２年）及びｒ　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
」第５２巻第７−１０頁（１９７４年）］。

これらの文献に記載のブタモチリンは何れも抽出により
得られたものであり、２２個のアミノ酸からなっており
、分子量は約２７００である。ブタモチリンの生理作用
としては消化管運動亢進作用及び消化管平滑筋収縮作用
が良く知られている。

消化管運動亢進作用としては例えば胃排出時間を短縮す
る作用が報告され［ｒ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ
ｇｙｌ第８０巻第４５６−４６０頁（１９♂１年）、消
化管平滑筋収縮作用としては神経経路に依存せずにウサ
ギやヒトの背面庭部及び十二指腸に対して強い収縮作用
を有していることが知られている。従ってモチリンは、
胃腸運動ｆＣ進により術後等の胃腸障害における治療や
、或はこれを利用した胃腸障害の診断に有用であると考
えられてきた。

（発明が解決しようとする問題点乃至発明の目的） 従来技術によるモチリンはブタ由来のものであり、抽出
によって得られており、従って大量生産が極めて困難で
ある点に問題があった。尚、ヒトモチリンの構造は、従
来技術においては明らかにされていなかった。即ち、モ
チリンは胃腸障害治療薬としての有用性が期待されるに
も拘らず、その生産がネックとなって臨床治療に応用さ
れるに至っていないのである。

それ故に、本発明の基本的課題は、所謂バイオテクノロ
ジーを応用してヒトモチリン及びその関連物質の工業的
生産方法にアプローチすることにある。

本発明の主たる目的は、ヒトモチリン前駆体を含むその
クローン化ＤＮＡ及びその断片を提供することにある。

本発明の付随的目的は、ヒトモチリン前駆体を含むその
クローン（ヒＤＮＡ及びその断片を調製する方法を提供
することにある。

本発明の他の付随的目的は、ヒトモチリン前駆体を含む
そのクローン化ＤＮＡ及びその断片、例えばヒトモチリ
ンそれ自体及びモチリン以外の生理活性部位である断片
を微生物又は動物細胞において発現させ大量生産するた
めに、これらが組込まれたプラスミドを提供することに
ある。

（問題点を解決するための手段及び作用）本発明者等は
鋭意研究の結果、ヒトモチリン前駆体ＤＮＡのクローン
化に初めて成功し、その構造決定をなし、これによって
上記の基本的な問題点を解決するに至ったのである。

即ち、本発明によれば、基本的問題点はヒトモチリン前
駆体のアミノ酸配列をコードしている約５６０個のヌク
レオチドを含むクローン化一本鎖ＤＮＡ又はこの一本鎖
ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなるクローン化二本鎖ＤＮＡ
により解決されるのである。

本発明によるこのＤＮＡは、式 ％式％ （式中において入、ｃ、”ｃ及びＴは、それぞれアデニ
ン、シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキ
シリボヌクレオチドを意味し且つ上記の式はアミノ酸に
対応するコドン毎の配列として示されている）にて示さ
れるヌクレオチド配列又はこれと生物学的に同等のヌク
レオチド配列を有している。ここで、生物学的に同等の
ヌクレオチド配列とは、例えば２つのコドン「↑ＴＡＪ
とｒｃ’ｒｃ」におけるようにコドンを構成するヌクレ
オチドの種類や配置が異なるにも拘らず同一のアミノ酸
（この場合は「ロイシン」）を指定するようなヌクレオ
チド配列を意味しており、従って上記のヌクレオチド配
列式にて示されるアミノ酸配列、即ちＭｅｔ−Ｖａ　ｌ
−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｌ−５ｅｒ−Ａｒ　Ｉ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−旧５−Ｖ
ａ１−人１龜−人１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｃｕ−Ａｌａ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｔｂｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａ　
ｌＰｒｏ−１］ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ｖａ　ｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−［１］ｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１Ａｓｐ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１］ｅ−人ｒｇ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｉｌｌ
ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−１］ｅ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−
Ａｓｎ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−人ｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ
−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−ｆｌｉｓ−Ａｌａ−＾１ａ
−Ｌｙｓと同一のアミノ酸配列をコードしているヌクレ
オチド配列を意味している。

上記のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を有している
ヒトモチリン前駆体のＤＮＡによれば、ヒトモチリンは
開始コドンである＾ＴＧが指定するメチオニン（Ｍｅｔ
）残基から数えて２６−４７番目の領域にコードされて
おり、コドンＧＣＣが指定するアラニン（Ａｌａ）残基
及びＡＡＧが指定するリジン（Ｌｙｓ）残基により両端
が仕切られていることが判る。尚、Ｎｅｔから始まる最
初の約２５個のアミノ酸はその構造に鑑みて分泌に関与
するシグナルペプチドに相当するものと考えられる。

本発明方法によれば、ヒトモチリン前駆体を含むクロー
ン化二本１］　ＯＮＡはヒト上部小腸由来のＲＮＡをｐ
ｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡに変じ、このｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ
とベクタプライマＤＮＡとを用いてｃＤＮＡライブラリ
を作成して大腸菌株の形質転換を行い、一方既知のブタ
モチリンのアミノ酸配列におけるＮ末端から　１−８番
目の配列である Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−１］ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙに相当するｍＲＮＡと相補的な式 にて示される２３個のデオキシリボヌクレオチドからな
る２４種類の混合物（但しＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４種類のす
べての可能性があるヌクレオチドの部位はイノシン［１
］を用いて合成した〉を予め調製しておき、上記の式（
Ａ）で示される合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの
Ｎ末端に標識を施し、これをプローベとして上記の形質
転換細胞をハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グしてハイブリダイズするポジティブクローンを得るこ
とにより調製することができる。上記においてプローベ
としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ）に関し
てはブタモチリンのアミノ酸のＮ末端から１−８番目の
配列に相当するものが選択され、又イノシンがＡ、Ｇ、
Ｔ、Ｃすべでの可能性があるところに用いられた理由は
ブタとヒトで配列の差が多少生じても対応でき且つこれ
らのアミノ酸に対応する合成オリゴデオキシリボヌクレ
オチドの種類をできる限り少なくなすためである。

ヒトモチリンを含むクローン化一本鎖ＤＮＡは、得られ
た上記のクローン化二本鎖ＤＮＡを自体公知の方法で分
解することにより、例えば９０℃で約３分間処理し、次
いで水冷することにより調製することができる。

上記のクローン化一本鎖又は二本鎖のヒトモチリン前駆
体を含むＤＮＡは自体周知の手法を用いて、例えば適当
な制限酵素を用いて断片を作成して接合して、又これに
よって作成できなかった部分については自体周知の方法
で合成し前記の接合断片に接合することによりヒトモチ
リン領域のみ、ヒトモチリン領域以外の生理活性領域等
からなるＤＮＡ断片となすことができる。

尚、上記のクローン化二本鎖ヒトモチリン前駆体を含む
０−＾又はこのＤＮＡ断片は自体公知の手法を用いてプ
ラスミドに組込むことができる。

即ち、例えば大腸菌からプラスミドを取出して精製し、
このプラスミドに制限酵素を作用させて特定の塩基位置
でプラスミドを切断し、上記のモチリン前駆体を含むＤ
ＮＡ又はその断片をＤＮＡリガーゼにより結合させるこ
とによりプラスミドに組込むことができる。

（発明の効果） 本発明によるヒトモチリン前駆体を含む二本鎖ＤＮＡ又
はその断片を組込んだプラスミドを微生物又は動物細胞
に取込ませて培養することによりモチリン前駆体、モチ
リン自体、更には他の生理活性物質を大量生産すること
ができる。従って、本発明は医薬原料等としてこれらを
用いる途を開くと云う効果を有している。尚、モチリン
部分以外のアミノ酸配列部分をコードしたＤＮＡ断片は
新たな生理活性物質の検索に用いることができる。

（実施例等） 次に、製造例及び構造決定のための試験例に関連して本
発明を更に詳細に説明する。

罠ｌ鮭ユ （ａ）ヒトモチリンのｍＲＮＡを含むｐｏｌｙ（Ａ）Ｒ
ＮＡの調製 ヒトモチリンは上部小腸等に存在していることがラジオ
イムノアッセイ等によって明らかにされている（　ｒ　
５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１ｇ第
１］巻第４７−５２頁１９７６年）、従って、外科的手
術により取出された上部小腸を原料とし、チルブライン
等の方法（ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第ｌ−ｑ巻
第５２９４−５２９９頁１９７９年）に準じ４Ｆグアニ
ジニウムチオシアネートにより全ＲＮ＆　＜１．２ｍｇ
）を抽出し、０．５Ｍ−にＣ１を含有する　１０ｍＭ−
トリス−塩酸バッファ　（ｐＨ７，５）を結合バッファ
としてオリゴｄＴセルロースに結合させ、次ににＣ１を
含有しないバッファで溶出させることによってｐｏ　１
ｙ（Ａ）ＲＮＡを約１５（ｌｕ　ｇ得た。

このＲＮＡを電気泳動により分析した結果、ｌ−ｑＳ及
び２８ＳのＲＮＡバンドに鑑みて分解されていないこと
が確認された。

（ｂ）ヒトモチリンのアミノ酸配列に相当するｍＲＮＡ
と相補的なりＮＡの合成 既知のブタモチリンのアミノ酸配列におけるＮ末端から
ｌ−ｑ番目の配列である Ｐｂｅ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−１］ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙに相当するｍＲＮＡと相補的な式 にて示される２３　（ｌＩのデオキシリボヌクレオチド
からなる２４種類の混合物（但しＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４種
類のすべての可能性があるヌクレオチドの部位はイノシ
ン（１］を用いて合成した）を調製した。これらのヌク
レオチドはそれぞれ可能性があるアミノ酸配列をすべて
網羅している。尚、各デオキシリボヌクレオチドの調製
は、ファルマシア社製のＤＮＡ合成装置「シーンアセン
ブラ−」を用いて行われた。

（ｃ）　ＣＤＮＡライブラリの作成 Ｏｋａｙａｍａ　−Ｂｅｒｇの方法（’Ｍｏ１．　Ｃｅ
１ｌ。

Ｂｉｏ、　Ｊ第２巻第１６１−１７０頁１９８２年）に
従って約３０μｇの上記ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡと４．３
μｇのベクタプライマＤＮＡとを用いてｃＤＮＡ　（プ
ラスミド）を合成し、モリソン等の方法（ｒ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１第６８巻第３２６−
３３１頁１９７９年）に従って大腸菌（８８１０１株）
の形質転換を行った。５０μＨ／ｍｌのアンピシリンを
含有する　Ｌト寒天培地を用いて形質転換細胞をスクリ
ーニングした処、アンピシリン耐性を示す形質転換細胞
がｌＩｇのｐｏｌｙ（ａ）ＲＮＡ当り約１００００個、
計量３０万個得られた。

（ｄ）クローニング クローニングは、ｒ　Ｇｅｎｅ　Ｊ第１θ巻第６３−６
７頁１９８０年に記載の方法に従って行われた。

即ち、上記の（ｅ）に記載の方法により得られ、アンピ
シリン耐性を示す約３０万個の形質転換細胞の内で約５
万個の形質転換細胞を対象としてニトロセルロースフィ
ルタにレプリカし、５０Ａｔｇ／ｓ＋ｌのアンピシリン
を含有する寒天プレート上で３−４時間培養した後に、
更に、５００μｇ／鵬１のクロラムフェニコールを含有
する　ＬＢ−寒天プレートに移し３７℃で一夜培養した
。フィルタ上に生じたコロニーを０．５Ｎ−ＮａＯＨに
よりフィルタに固定した後に中和してｐＨ７，５となし
、次いで１．５Ｍ−ＮａＣ１を含有するトリス−塩酸バ
ッファ（ｐ）ｌ　７．５）に上記のフィルタを浸漬して
菌体のカスを除去した。その後にフィルタを風乾し、８
０℃で２時間ベーキングしてスクリーニング用の被験フ
ィルタとした。

一方、形質転換細胞のスクリーニングはグルンシュタイ
ン等の方法（ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、１．　Ａｅａｄ
、　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡＪ第７２巻第３９６１−３９６５頁１９７５年
）に準じ下記のようにして行われた。

即ち、上記（１］）に記載の方法で合成され且つ式Ａ　
で示される各オリゴデオキシリボヌクレオＮ末端に［γ
−”ＰＩＡＴＰとＴ４キナーゼで標識を施してスクリー
ニング用プローベとなした。これらの各オリゴデオキシ
リボヌクレオチドの比活性は１−２　ｘ　１０６ｃｐｓ
／ｐｍｏｌであった。

上記の被験フィルタ上の形質転換細胞を、このプローベ
にて５０℃でのハイブリダイゼーションによりスクリー
ニングし、オートラジオダラムでの感光により判定した
処、約５万個の形質転換細胞の内で唯１個がハイブリダ
イズするポジティブクローンであった。

このポジティブクローン、即ちヒトモチリン前駆体含有
クローンを電気泳動により解析した結果、ｐｏ　１ｙ（
ｄ人）（ｄＴ）及びｐｏ　Ｉｙ（ｄＧ）（ｄＣ）のテイ
ル部分を含み約６５０ｂＰのｃＤＮＡ挿入部位を含んで
いることが判明した。このｃＤＮＡは二本鎖ＤＮＡであ
り、後記の試験例において示されているように、塩基配
列が解明されているので、適当な制限酵素断片及び一部
合成したＤＮＡを用いることによりヒトモチリン前駆体
部分、ヒトモチリン部分、又は生理活性を示す他の部分
からなるＤＮＡ断片となすことができる。尚、このよう
な二本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ断片を９０℃で約３分
間処理し、次いで水冷すれば分解して一本鎖のものとな
る。

Ｌ１涯 （クローン化ヒトモチリン前駆体の塩基配列決定及び相
当するアミノ酸配列） クローン化ヒトモチリンのｃＤＮＡ挿入部位の塩基配列
決定はマキサム及びギルバートの方法（ｒＭｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、」第６５巻第４９９−５６
０頁１９８０年）及び変性プラスミドを用いる服部等の
ダイデオキシ法（「＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍｇ第１
５２巻第２３２−２３８頁１９８６年）に従ってクロー
ン化ヒトモチリン前駆体を制限酵素で切断した断片をＰ
ＵＣ１９プラスミドにサブクローニングして行った。

第１図にはヒトモチリン前駆体含有クローンのｃＤＮＤ
ＮＡと、塩基配列決定に用いられた制限酵素と、塩基配
列決定のストラテジーとが示されている。最上段の数字
は、中段において枠で仕切られたヒトモチリン前駆体領
域を基準として示した塩基の番号であり、Ｐｖｕｌｌ等
は用いられた制限酵素基であり、括弧内の数字は切断部
位乃至塩基配列決定の開始位置（塩基の番号）であり、
枠で仕切られた上記のヒトモチリン前駆体領域の内でＳ
領域はシグナルペプチドに相当するものと思われる領域
を示し、「モチリン」と表示されている領域はヒトモチ
リンに相当するものと思われる領域を示している。第１
図の下段において、水平な矢印はそれぞれの制限酵素に
よる塩基配列決定の方向と範囲を示しており、矢印の末
端に垂直線が付されているのは５°末端を放射標識した
ものでその位置を示し、矢印の末端に丸印が付されてい
るのは上記の服部等のグイデオキシ法に従って行われた
ものであって丸印が塩基配列決定開始位置を示している
。

第２図には、このようにして決定されたヒトモチリン前
駆体含有クローンのｃＤＮＡにおける塩基配列（ｃＤＮ
Ａと相補的配列）及びヒトモチリン前駆体部分の塩基配
列に相当するアミノ酸配列が示されている。第２図にお
いて塩基配列の上側に付された数字は第１図におけると
同様にヒトモチリン前駆体領域を基準として示した塩基
の番号であり、アミノ酸配列の下側に付された数字はヒ
トモチリン前駆体領域におけるアミノ酸残基の番号であ
り、実線で枠組みした領域は既知のブタモチリンと同一
の塩基配列を有する領域であってヒトモチリンに相当す
ると思われる領域を示し、破線で枠組みした領域は既述
の実施例で形質転換細胞のスクリーニング用プローベと
して用いた領域をそれぞれ示している。

ヒトモチリン前駆体部分は開始コドンであるＡＴＧから
始まり終始コドンであるＴＧＡで終了する長い翻訳可能
配列（オープンリーディングフレーム）として存在し、
その内に既知のブタモチリンと同一のアミノ酸をコード
している塩基配列が認められ、この塩基配列は実線で枠
組みされているようにメチオニン（Ｎｅｔ）を　１とす
るアミノ酸番号において２６番目のフェニルアラニン（
ｐｈｅ）から４７番目のグルタミン（Ｇｌｎ）迄に位置
していた。ヒトモチリン前駆体領域の始めの部分、即ち
第１番目のＮｅｔから第２５　　番目の＾１ａ迄はその
構造に鑑みて、殊に第６番目の＾１ａから第２５番目の
＾１ａ迄は比較的疎水性に冨んだアミノ酸が並んでいる
ので分泌蛋白質に一般的に見られるシグナル配列と考え
られ（第１図のＳ領域）、又上記のモチリン領域に相当
する部分の後端は塩基性アミノ酸であるリジン（Ｌｙｓ
）が二つ並んだ構造により仕切られているので、モチリ
ンは前駆体の形で分泌された後に血中等におけるプロテ
アーゼにより切断されてマチュアーなモチリンになるも
のと考えられる。

ｅユ （ヒＩ・モチリン組込みプラスミドの製造）本製造例に
ついては、殊に第３図を参照しつつ説明する。先ず、第
１及び２図に示されるようなヒトモチリン前駆体のｃＤ
ＮＡクローンを制限酵素旧ｎｆｌ及びＢａ１ｌにより切
断して約４９（１ｂｐのフラグメン１−を得た０次に、
このフラグメントのＨｉｎｆｌ断点にＮｂｅ　Ｉリンカ
−を付加し、又Ｂａ１ｌ断点にＸｈｏｌリンカ−を付加
したくこれらのリンカ−は何れもファルマシア社製のＤ
ＮＡ合成装置を用いて調製された）。

一方、動物細胞での発現に用いる市販のプラスミド（フ
ァルマシア社製のｒｐＭｓＧＪ）を制限酵素Ｎｈｅｌ及
びＸｂｏｌにより切断し、上記のリンカ−結合しトモチ
リン前駆体フラグメントを、上記プラスミドの断点の粘
着末端と結合させることによりヒトモチリン前駆体の組
込まれたプラスミドを得た。

このプラスミドは、第３図の末尾に示されるように、マ
ウスマンマリ−腫瘍ウィルスのロングターミナルリピー
ト　（！ＩｔＭＴＶ　−ＬＴＲ）である強力な１０モー
タの下流にヒトモチリン前駆体のｅＤＮＡクローンを有
している。

従って、このプラスミドをＬ細胞やＣＨＯ細胞に導入す
ることによって、動物細胞でヒトＧＩＰ前駆体を容易に
且つ大量に発現させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるクローン化ヒトモチリン前駆体を
含むｅＤＮＡ領域並びに該領域の塩基配列決定のために
用いられた制限酵素と、塩基配列決定のストラテジーと
を示す図面、第２図は決定されたヒトモチリン前駆体含
有クローンのｃＤＮ人における塩基配列及びヒトモチリ
ン前駆体部分の塩基配列に相当するアミノ酸配列とを示
す図面、第３図はヒトモチリン前駆体組込みプラスミド
を調製する工程を示す説明図である。 第１図 ト 手続補正書（自発） 昭和６２年８月２１日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトモチリン前駆体のアミノ酸配列をコードして
   いる約５５０個のヌクレオチドを含むクローン化一本鎖
   ＤＮＡ又はこの一本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなるク
   ローン化一本鎖ＤＮＡ。
2. （２）式 【アミノ酸配列があります】 −−−３′ （式中においてＡ、Ｃ、Ｇ及びＴは、そ れぞれアデニン、シトシン、グアニン及び チミン塩基を有するデオキシリボヌクレオ チドを意味し且つ上記の式はアミノ酸に対 応するコドン毎の配列として示されてい る） にて示されるヌクレオチド配列又はこれと生物学的に同
   等のヌクレオチド配列を有していることを特徴とする、
   特許請求の範囲第１項に記載のクローン化一本鎖ＤＮＡ
   又はこの一本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなるクローン
   化二本鎖ＤＮＡ。
3. （３）アミノ酸配列が 【アミノ酸配列があります】 であることを特徴とする、特許請求の範囲第１又は２項
   に記載のクローン化一本鎖ＤＮＡ又はこの一本鎖ＤＮＡ
   と相補ＤＮＡとからなるクローン化二本鎖ＤＮＡ。
4. （４）アミノ酸配列が 【アミノ酸配列があります】 の一部領域であることを特徴とする、ヒト由来のクロー
   ン化一本鎖ＤＮＡ断片又はこの一本鎖ＤＮＡ断片と相補
   ＤＮＡ断片とからなるクローン化二本鎖ＤＮＡ断片。
5. （５）ヒトモチリン前駆体のアミノ酸配列をコードして
   いる約５５０個のヌクレオチドを含むクローン化一本鎖
   ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡ又はこの二
   本鎖ＤＮＡの断片が組込まれているプラスミド。
6. （６）ヒト上部小腸由来のＲＮＡをｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮ
   Ａに変じ、このｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡとベクタプライマ
   ＤＮＡとを用いてｃＤＮＡライブラリを作成して大腸菌
   株の形質転換を行い、一方既知のブタモチリンのアミノ
   酸配列におけるＮ末端からｌ−ｑ番目の配列である Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔ
   ｙｒ−Ｇｌｙに相当するｍＲＮＡと相補的な式 【アミノ酸配列があります】（Ａ） にて示される２３個のデオキシリボヌクレオチドからな
   る２４種類の混合物（但しＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃすべての可能
   性があるヌクレオチドの部位はイノシン［１］を用いて
   合成）のＮ末端に標識を施し、これをプローベとして上
   記の形質転換細胞をハイブリダイゼーションによりスク
   リーニングしてハイブリダイズするポジティブクローン
   としてクローン化二本鎖ＤＮＡを得、必要に応じ常法に
   より一本鎖ＤＮＡに分解することを特徴とする、ヒトチ
   モリン前駆体のアミノ酸配列をコードしている約５５０
   個のヌクレオチドを含むクローン化一本鎖ＤＮＡ及びこ
   の一本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなるクローン化二本
   鎖ＤＮＡの調製法。