JP2008073044A - シグナルペプチド、それをコードするdna配列、該配列を含む発現構築物、プラスミド及び微生物細胞並びに組み換えタンパク質の発酵的製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シグナルペプチドであって、切断部位前の最後の3つのアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン(AFA)であることを特徴とするシグナルペプチドによって解決される。
【選択図】なし
Description
1. 可溶性タンパク質として細胞内産生;
2. 封入体("インクルージョンボディー")として細胞内産生;
3. ペリプラズム又は栄養培地への分泌。
− BLR:Ray他(2002年)、Novagenで購入できる
− K802=CGSC*5610:Yang他(1998年)
− WCM105:EP0338410号B1に従って製造できる
− MM28=CGSC*#5892:Nagahari他(1985年)
− RV308=ATCC**31608;EP0677109号B1
− RR1:ATCC**31434:Nagahari他(1985年)
である。
* 大腸菌ストックセンター(E.coli Genetic Stock Center)CGSC(830 Kline Biology Tower,MCD Biology Department,266 Whitney Ave.,PO box 208103,Yale University,New Haven)から購入できる
** LGC Promochem(Mercatorstr.51,46485 Wesel,ドイツ在)から購入できる
産生されたタンパク質の分泌は、宿主細胞のsec装置によって行われる。引き続きペリプラズムへの分泌の後に、シグナルペプチダーゼ(例えばE.コリではLepB)によって本発明によるシグナルペプチドは開裂されて、所望の組み換えタンパク質が生ずる。
出発プラスミドとして、プラスミドpCGTを以下のように作製する:
配列番号4を有し、クレブシエラ・ニューモニアエM5a1由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ(CGTアーゼ)遺伝子を有するDNA断片(Genbank番号M15264)を、遺伝子合成によって製造した。このDNA断片を、発現ベクターpJF118ut(図2)中にクローニングした。該ベクターは、DSMZ−ドイツ微生物細胞培養収集館(Braunschweig)で番号DSM18596として寄託されている。pJF118utは、公知の発現ベクターpKK223−3(Amersham Pharmacia Biotech)の誘導体であり、β−ラクタマーゼ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子の他に、さらに同様にプラスミド上に存在するLacIq遺伝子産物によって再始動されかつ例えばD−ラクトースもしくはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)のようなインデューサーによってスイッチオンすることができるtacプロモーターをも有する。プラスミドpJF118utを、制限酵素EcoRIで完全に切断し、かつそれぞれ直鎖状DNA断片の5′末端で突出した塩基を、S1ヌクレアーゼで分解した。前記のようにして予備調製されたベクターDNA分子を、CGTアーゼを含むDNA断片(配列番号4)とT4−リガーゼを使用してライゲーションした。菌株DH5αを、ライゲーションバッチでCaCl2法に従って形質転換し、その際、アンピシリン(100mg/l)によってプラスミド保有細胞について選択した。アンピシリン耐性形質転換体から、再びプラスミドを単離し、そして制限分析によって調査した。前記のようにして作製された、CGTアーゼ遺伝子の発現がtacプロモーターの制御下にあるプラスミドを、pCGTと呼称した(図3)。
phoA−IFNα2b 配列番号5
phoA: MKQSTIALALLPLLFTPVTKA
配列番号9
ompA: MKKTAIAIAVALAGFATVAQA
配列番号10
cgt: MKRNRFFNTSAAIAISIALNTFFCSMQTIA
配列番号3
AFA: MKRNRFFNTSAAIAISIALQIFFPSASAFA
配列番号2
前記のクローニングによって以下の4つのプラスミドが得られた:
− pKP651(phoA−シグナル配列) 図4
− pKP652(ompA−シグナル配列) 図5
− pKPIFN(cgt−シグナル配列) 図6
− pBaBIFN1(AFA:本発明によるシグナル配列) 図7
これらのプラスミドを、公知の方法によってE.コリ菌株DH5αに導入した。本発明による基株DH5α/pBaBIFN1は、DSMZ(ドイツ微生物細胞培養収集館、D−38142 Braunschweig)で番号DSM18343としてブタペスト条約に従って寄託された。
プラスミドpKP651(phoA−シグナル配列)、pKP652(ompA−シグナル配列)、pKPIFN(cgt−シグナル配列)及びpBaBIFN1(本発明によるAFA−シグナル配列)(実施例1を参照のこと)を、菌株WCM105(EP0338410号B1に従って製造できる)中に通常の方法(CaCl2−形質転換によって)に従って導入した。プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン(100mg/L)によって実施した。
− WCM105/pKP651(phoA−シグナル配列)
− WCM105/pKP652(ompA−シグナル配列)
− WCM105/pKPIFN(cgt−シグナル配列)
− WCM105/pBaBIFN1(AFA−シグナル配列)
得られた菌株中でのインターフェロンα2bの産生を調査した。そのために、それらの菌株を、100mg/Lのアンピシリンと1%のグルコースとを有する10mlのLB培地中で30℃において培養した。600nmでの光学密度(OD600)が0.5になったら、インターフェロンα2bの産生を、IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を0.5mMまで添加することによって誘導する。培養上清において、24時間後、48時間後及び72時間後で、形成されかつ分泌されたインターフェロンを、SDSゲル中でのタンパク質の分離と抗インターフェロン特異抗体でのイムノブロットでの検出によって以下のようにして定量化した。
モジュール:Amersham:Hoefer TE 22 Mini Tank Transfer Unit、コード番号:80−6204−26。
Whatmanフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品(スポンジ)で転写バッファー(Invitrogen カタログ番号LC3675)に気泡なく染み込ませた。
転写条件:I=200mAの一定の電流、U=無制限、運転時間60分
25mlのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で30分間振り動かす。
25mlのプレハイブリダイゼーションバッファー+0.15μg/ml(→3.75μg)の抗ヒトIFNΑ抗体(Pepro Tech EC,Biozolを経由した カタログ番号:500−P32A)中で該メンブレンをインキュベートする。
1×PBSと一緒に室温で10秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
1×PBSと一緒に室温で15分間2回振り動かし、バッファーを捨てる。
25mlのプレハイブリダイゼーションバッファー+25μl(1:1000)のヤギ抗ウサギIgGセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(HRP)(Southern Biotech、Biozolを経由した カタログ番号4050−05)中で該メンブレンをインキュベートする。
1×PBSと一緒に室温で10秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
1×PBSと一緒に室温で15分間2回振り動かし、バッファーを捨てる。
Lumi−Lightウェスタンブロッティング基質(Roche,カタログ番号2015200)を準備する:Lumi−Lightルミノール/エンハンサー溶液とLumi−Light安定ペルオキシド溶液とを1:1の比率で混合する:NCメンブレン当たり3ml。
プレハイブリダイゼーションバッファー:1×PBS中の5%脱脂粉乳
10×PBS:100mMのNaH2PO4、1.5MのNaCl、NaOHでpH7.5、0.5%のTriton100
1×PBS:10×PBSを完全脱塩水で1:10希釈したもの
定量的評価は、Biorad社製のGS−800 Calibrated Densitometerでイムノブロットをスキャンすることによって、Quantity One 1−D分析ソフト(Biorad)を用いて、施与されたスタンダードと比較することによって実施した。
これらの結果は、配列番号2の本発明によるシグナル配列が、産生されるべきタンパク質の収率及び分泌に関して、別のシグナル配列より優れていることを一義的に示している。
プラスミドpCGT(実施例1を参照)は、CGTアーゼのためのシグナル配列と読み枠内で融合されたCGTアーゼのための遺伝子を有する。このシグナル配列を、ここで本発明によるシグナル配列と交換した。
プラスミドpCM703AFAとプラスミドpCGT(実施例3を参照)を、以下の菌株に通常の方法に従って(例えばCaCl2法によって)形質転換により導入した:
− K802=CGSC*5610:Yang他(1998年)
− WCM105:EP0338410号B1に従って製造できる
プラスミド保有菌株についての選択は、アンピシリン(100mg/L)によって実施した。それによって以下の本発明による菌株:
− WCM105/pCM703AFA
− K802/pCM703AFA
及び以下の対照菌株:
− WCM105/pCGT
− K802/pCGT
が得られた。
試験バッファー:5mMのトリス塩酸バッファー(>pH6.5)、5mMのCaSO4・2H2O
基質:試験バッファー(pH6.5)中の10%のNoredux溶液
試験バッチ:1mlの基質溶液+1mlの遠心分離された培養上清(5分、12000rpm)+3mlのメタノール
反応温度:40℃
酵素試験:
・ 溶液を予熱する(約5分、40℃で)。
A=活性
G=CDの含有率(mg/l)=試験バッチ:単位表面×104/標準溶液(10mg/ml)/単位表面
V1=希釈係数/試験バッチ(→5)
V2=希釈係数/酵素溶液
t=反応時間(分)(→3)
MG=分子量(g/モル)(CD→973)
1ユニット=1マイクロモルの産物/分
第2表は、本発明による菌株の高められた特異的なシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ収率を示している。
実施例5:本発明によるシグナル配列を使用することによるヒルジン産生の改善
特許EP0448093号B1に記載されるプラスミドpCMT203を、使用されるシグナル配列を本発明によるシグナル配列AFAと交換することで改変させた。この交換は、実施例1及び実施例3と同様に実施した。得られたプラスミドをpCMT203AFAと呼称した。pCMT203及びpCMT203AFAを、菌株WCM105(EP0338410号B1に従って製造できる)中に、通常の方法による形質転換によって(例えばCaCl2−形質転換によって)導入した。
− WCM105/pCMT203
− WCM105/pCMT203AFA
両方の菌株を、EP0448093号B1に記載されるように、10lの発酵器中で培養し、そして得られたヒルジンを、EP0448093号B1に記載されるように、IPTGの添加45時間後に定量化した。
実施例6:本発明によるシグナル配列を使用することによる、機能的なFab抗体フラグメントの産生の改善
本実施例は、良好に特徴付けられた抗リゾチーム抗体D1.3のFabフラグメントの改善された製造を記載する。
配列番号12を有するDNA断片(重鎖)を、遺伝子合成によって製造し、そして該DNA断片は、E.コリのompA遺伝子のシグナル配列と、Fabフラグメントの重鎖(VH−CH1)のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。この読み枠直後に6個のヒスチジンコドンが引き続き、従って融合タンパク質のC末端を形成している。このヒスチジンタグによって、後に完全に会合されたFabフラグメントの簡単な精製が親和性クロマトグラフィーによって可能となる。このDNA断片を、制限酵素EcoRI及びPstIで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターpJF118utとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がtacプロモーターの制御下にあるプラスミドを、pHC−Anti−Lysozymと呼称した。
Claims (10)
- 組み換えタンパク質との切断部位を有するシグナルペプチドであって、その切断部位前の最後の3個のアミノ酸が、アラニン−フェニルアラニン−アラニン(AFA)であることを特徴とするシグナルペプチド。
- 請求項1記載のシグナルペプチドであって、アミノ酸配列:MKRNRFFNTSAAIAISIALQIFFPSASAFA(配列番号1)を有するか、又は配列番号1と比較して、1〜10個の、有利には1〜5個の、特に有利には1〜3個のアミノ酸が、切断部位前の最後の3個のアミノ酸を除いて改変されているアミノ酸配列を有することを特徴とするシグナルペプチド。
- 請求項1又は2記載のシグナルペプチドをコードするDNA配列。
- 請求項3記載のDNA配列であって、塩基配列:
- 発現シグナルと、請求項3又は4に記載のDNA配列と、読み枠内で結合された組み換えタンパク質をコードする組み換え遺伝子とを含む発現構築物。
- 請求項3又は4記載のDNA配列又は請求項5記載の発現構築物を有するプラスミド。
- 請求項3又は4記載のDNA配列又は請求項5記載の発現構築物又は請求項6記載のプラスミドを有する微生物細胞。
- 請求項7記載の微生物細胞であって、それが腸内細菌科の細菌株の細胞、有利にはエシェリキア・コリの種の菌株の細胞であることを特徴とする微生物細胞。
- 組み換えタンパク質の発酵的製造方法において、請求項7又は8記載の微生物細胞を、発酵培地中で培養し、該微生物細胞が組み換えタンパク質をシグナルペプチド−タンパク質融合物の形で産生し、その際、該シグナルペプチドは、請求項1又は2記載のシグナルペプチドでありかつ該シグナルペプチドは、細胞質膜を通じてペリプラズム中にシグナルペプチド−タンパク質融合物を分泌した場合に、シグナルペプチドと組み換えタンパク質との間の切断部位で開裂され、そして所望の組み換えタンパク質がペリプラズム中もしくは発酵培地中で得られ、その組み換えタンパク質を発酵後に精製することを特徴とする方法。
- 請求項9記載の方法において、組み換えタンパク質が、工業的アプローチで使用されるタンパク質又は医薬作用物質として使用されるタンパク質であることを特徴とする方法。
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