CN101506233A - 具有提高的特异性的转谷氨酰胺酶变异体 - Google Patents
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Abstract
提供了来自拉达链轮丝菌的转谷氨酰胺酶变异体，该变异体可提高对人生长激素Gln－141的选择性。
Description
发明领域
本发明涉及来自拉达链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)的新型转谷氨酰胺酶变异体。该变异体具有更高的选择性，可用于在指定的谷氨酰胺残基处进行肽的位点特异的修饰。
发明背景
已知通过将可适当改变特性的基团与蛋白结合可改变肽的特性和性质。特别是对治疗性的肽，需要或甚至必需对所述肽结合基团，以延长肽的半衰期。典型地，这种结合基团(conjugating group)是聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或脂肪酸——参见J.Biol.Chem.271，21969-21977(1996)。
转谷氨酰胺酶(TGase)以前被用于改变肽的特性。在食品工业，特别是奶制品工业已有多种技术可通过TGase，例如使肽交联。其它的文献描述了用TGase改变有生理活性的肽的特性方面的用途。EP950665、EP 785276和Sato，Adv.Drug Delivery Rev.54，487-504(2002)描述了含至少一个Gln的肽与胺-功能化PEG或类似配体在TGase存在下的直接反应。Wada in Biotech.Lett.23，1367-1372(2001)描述了具有脂肪酸的β-乳球蛋白通过TGase进行直接结合。Valdivia in J.Biotechnol.122，326-333(2006)报道了TGase可催化过氧化氢酶的位点特异的糖苷化反应。WO2005070468描述了TGase可用于将功能性基团整合到含谷氨酰胺的肽中，以形成功能化的肽，该功能化的肽在下一步可与例如，能和所述功能化的蛋白反应的PEG反应，从而形成PEG化的肽。
已知转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)是蛋白-谷氨酰胺-γ-谷氨酰胺转移酶，可催化反应：
其中Q-C(O)-NH2表示含谷氨酰胺的肽，Q’-NH2表示在上述反应中可提供整合到肽中的功能基团的胺供体。
体内的一般胺供体是肽结合的赖氨酸，因此上述反应可进行肽的交联。凝固因子XIII是一种转谷氨酰胺酶，它可使伤口处的血液凝固。不同的TGases各有差异，例如，Gln附近的氨基酸残基是作为底物的蛋白所必需的，即，不同的TGase根据Gln残基附近的氨基酸残基不同而以不同的含Gln肽作为底物。如果待修饰的肽含有多于一个Gln残基，则可开发利用该特性。如果需要选择性地仅在某些Gln残基处结合肽，则该选择性可通过选择仅接受相关Gln残基为底物的TGase来实现。
人生长激素(hGH)含有13个谷氨酰胺残基，因此任何介导hGH结合的TGase可能由于低选择性而被限制。已知在hGH的13个谷氨酰胺(Gln)残基中，有2个(Q141和Q40)谷氨酰胺可在TGase催化下产生反应(WO2006/134148)。这就需要鉴定可介导更特异的hGH功能化的TGases。
发明概述
目前已确定来自拉达链轮丝菌的mTGase(术语mTGase定义为通过其分离的微生物表达的TGase)(来自拉达链轮丝菌的可缩写为mTGase-SL)具有更高的位点特异性(也称为选择性)，比茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的mTGase高2倍。而且也发现，在mTGase的N末端例如由于不同的表达和加工策略或特意的修饰而增加的残基可增强这种位点特异性。例如，如果来自茂原链霉菌的mTGase对Gln141的选择性相对于对Gln40的选择性是1，则来自拉达链轮丝菌的天然、Met-、AlaPro-或GlyPro-mTGase的相对选择性分别为1.7、1.8、2.1和2.7。
本发明提供了对hGH中的Gln-141比hGH中的Gln-40具有更高特异性的转谷氨酰胺酶，这种特异性比具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对于hGH中Gln-141相对于其对hGH中Gln-40的特异性更高。
在一个实施方案中，本发明涉及含有与SEQ ID No.1中的氨基酸序列至少具有80％同一性的氨基酸序列的、经分离的肽，其中所述序列在SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
在一个实施方案中，本发明涉及含有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列至少具有80％同一性的氨基酸序列的、经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到10个氨基酸而修饰。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的肽的核酸构建体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明的肽的核酸的载体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含下述载体的宿主，该载体含有编码本发明的肽的核酸。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的肽的组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及结合hGH的方法，该方法包含将hGH与胺供体在存在本发明的肽的情况下进行反应。
附图简要描述
图1所示的是来自茂原链霉菌的mTGase序列与来自拉达链轮丝菌的mTGase的序列比对。
图2A反应空白：野生型hGH与1，3-dimaninol丙醇，未加入mTGase。
图2B.来自茂原链霉菌的AlaPro-mTGase。反应时间＝30分钟；选择性＝5.7；hGH转化率＝32％。
图2C.GlyPro-mTGase-SL；反应时间＝15分钟；选择性＝10.31；hGH转化率＝55％。
图2D.GlyPro-mTGase_Y75A-SL；反应时间＝300分钟；选择性＝17.33；hGH转化率＝40％。
图2E.GlyPro-mTGase_Y75F-SL；反应时间＝75分钟；选择性＝20.94；hGH转化率＝33％。
图2F.GlyPro-mTGase_Y75N-SL；反应时间＝90分钟；选择性＝15.66；hGH转化率＝50％。
图2G.GlyPro-mTGase_Y62H_Y75N-SL；反应时间＝75分钟；选择性＝26.33；hGH转化率＝38％。
图2H.GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F-SL；反应时间＝120分钟；选择性＝36.21；hGH转化率＝49.4％。
图3.通过HPLC分析由拉达链轮丝菌TGase催化的hGH突变体的反应混合物。上部：hGH-Q40N。第一个峰(26.5分钟，面积1238)是产物-Q141，第二个峰(29.7分钟，面积375)是其余的hGH-Q40N。底部：hGH-Q141N。第一个峰(19.2分钟，面积127)是产物-Q40，第二个峰(30.3分钟，面积1158)是其余的hGH-Q141N。
图4.通过HPLC分析由茂原链轮丝菌TGase催化的hGH突变体的反应混合物。上部：hGH-Q40N。第一个峰(26.9分钟，面积1283)是产物-Q141，第二个峰(30.1分钟，面积519)是其余的hGH-Q40N。底部：hGH-Q141N。第一个峰(19.5分钟，面积296)是产物-Q40，第二个峰(30.6分钟，面积1291)是其余的hGH-Q141N。
图5：来自表5的转氨基混合物3和4的CIE HPLC分析。峰1＝hGH，峰2＝在40位的转氨基物质，峰3＝在141位的转氨基物质，峰4＝在40/141位的转氨基物质。
发明内容
本发明涉及具有TGase活性的肽，该肽对hGH的Gln141比对hGH的Gln40具有更高的特异性，更具体地，本发明涉及对hGH的Gln141比对hGH的Gln40具有更高特异性的转谷氨酰胺酶肽，这种特异性高于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln141相对于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln40所具有的更高特异性。
术语“多肽”和“肽”在本文可互换使用，是指含有至少5个由肽键连接的连续氨基酸的化合物。连续的氨基酸可来自由遗传密码子编码的氨基酸，它们可以是不被遗传密码子编码的天然氨基酸及合成的氨基酸。不被遗传密码子编码的天然氨基酸是，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的氨基酸包括通过化学合成制造的氨基酸，即由遗传密码子编码的氨基酸的D异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基亮氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸和邻氨基苯甲酸。术语“结合物(conjugate)”作为名词是指修饰的肽，即具有结合部分(moiety bonded)以改变所述肽的性质的肽。作为动词，该术语是指肽结合某个部分(moiety)以改变所述肽的性质的过程。
在本文中，“具有TGase活性的肽”或“转谷氨酰胺酶”或类似术语是指具有催化谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺与各种作为胺供体的伯胺之间的酰基转移反应的能力的肽。
在本文中，“转氨基作用”、“转谷氨酰胺作用”、“转谷氨酰胺酶反应”或类似术语是指蛋白/肽的谷氨酰胺残基的γ-谷氨酰胺酰基转移到伯胺或赖氨酸的ε-氨基或水的反应，其中可释放出氨分子。
在本文中，术语“特异性”和“选择性”可互换使用，是指TGase对hGH中一个或多个特定的谷氨酰胺残基要比对hGH中其它特定的谷氨酰胺残基优先进行反应。针对本发明的目的，本发明的肽对于hGH中Gln-40相对于其对Gln141的特异性是根据实施例中所述的检测肽的结果来确定的。
本发明的肽用作针对转谷氨酰胺肽，例如hGH的转谷氨酰胺酶。肽的转谷氨酰胺作用用于制备例如WO2005/070468和WO2006/134148所描述的所述肽的结合物。
一种以hGH作为实施例制备结合的肽的方法包括hGH与含功能基团的胺供体之间的第一反应，以得到功能化的hGH，所述第一反应由TGase介导(即催化)。在第二反应步骤中，所述功能化hGH进一步与例如能与所述掺入的功能化基团反应的PEG或脂肪酸反应，从而获得结合的hGH。第一反应描述如下。
X表示功能化基团或潜在的功能化基团，即在进一步反应，例如氧化或水解反应中转化为功能化基团的基团。
微生物茂原链霉菌也称为茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)。可从该微生物中分离出TGase，该TGase的特征是具有较低分子量(～38kDa)，而且是不依赖钙的。来自茂原链霉菌的TGase已被充分描述，例如，已解出其晶体结构(US 156956；Appl.Microbiol.Biotech.64，447-454(2004))。
当上述反应由来自茂原链霉菌的TGase介导时，则hGH和H2N-X(胺供体)的反应主要在Gln-40和Gln-141上发生。上述反应可用于制备例如PEG化的hGH，以获得具有延长半衰期的治疗性生长激素产物。由于通常治疗性组合物需要是单化合物组合物，因此上述讨论的缺乏特异性需要进一步的纯化步骤，以分离出其中的Gln-40功能化的hGH、Gln-141功能化的hGH和/或Gln-40/Gln-141双功能化的hGH。
这种使用转谷氨酰胺酶结合人生长激素的用途在WO2005/070468、WO2006/134148、WO2006EP065440和WO2006EP065439中详细描述。
除了两个序列之间共有22个氨基酸差异外，分离自拉达链轮丝菌的TGase的序列具有与来自茂原链霉菌的序列相同的氨基酸序列(Yi-Sin Lin et al.，Process Biochemistry 39(5)，591-598(2004))。
来自拉达链轮丝菌的mTGase的序列在SEQ ID No.1中给出，来自茂原链霉菌的mTGase的序列在SEQ ID No.2中给出。
本发明的肽对于hGH的Gln-141比对hGH的Gln-40更具特异性，它显著高于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对于hGH中的Gln-141相对于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对hGH中的Gln-40的特异性，其中特异性如实施例所述进行测定。因此，本发明的肽可用于hGH转谷氨酰胺化的方法中，与使用具有氨基酸序列为SEQ ID No.2的TGase所进行的反应相比，可增加Gln-40功能化的hGH或Gln-141功能化的hGH的产量。
因此，在一个实施方案中，本发明的转谷氨酰胺酶肽对于hGH的Gln-141比其对hGH的Gln-40具有更高的特异性，该特异性高于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对于hGH中Gln-141相对于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对hGH中Gln-40的特异性。在一个实施方案中，本发明的肽对于Gln-141相对于本发明的肽对于Gln-40的特异性要比具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对于Gln-141相对于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对于Gln-40的特异性高至少1.25、例如至少1.50、例如至少1.75、例如至少2.0、例如至少2.5、例如至少3.0、例如至少3.5、例如至少4.0、例如至少4.5、例如至少5.0、例如至少5.5、例如至少6.0、例如至少6.5、例如至少7.0、例如至少7.5、例如至少8.0、例如至少8.5、例如至少9.0、例如至少9.5、例如至少10.0倍。
在一个实施方案中，本发明的转谷氨酰胺酶肽对于hGH的Gln-141比本发明的转谷氨酰胺酶肽对于hGH的Gln-40具更高的特异性，该特异性高于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽或具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列并在N末端增加了Ala-Pro的肽对于hGH中Gln-141相对于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽或具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列并在N末端增加了Ala-Pro的肽对于hGH中Gln-40的特异性。因为具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列并在N末端增加了Ala-Pro的肽与具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽具有相同的特异性(参见实施例)。在一个实施方案中，本发明的肽对于Gln-141相对于本发明的肽对Gln-40的特异性要比具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对于Gln-141相对于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对Gln-40的特异性高至少1.25、例如至少1.50、例如至少1.75、例如至少2.0、例如至少2.5、例如至少3.0、例如至少3.5、例如至少4.0、例如至少4.5、例如至少5.0、例如至少5.5、例如至少6.0、例如至少6.5、例如至少7.0、例如至少7.5、例如至少8.0、例如至少8.5、例如至少9.0、例如至少9.5、例如至少10.0倍。
在一个实施方案中，本发明的肽包含基于来自拉达链轮丝菌的mTGase序列，并在特定的氨基酸残基处具有突变和/或具有额外的N末端增加的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，本发明的肽包含基于来自茂原链霉菌的mTGase的序列，并额外具有N末端增加的氨基酸残基的序列。
本发明特别涉及来自拉达链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的新型变异体。该变异体具有提高的选择性，可用于在指定的谷氨酰胺残基进行肽的位点特异的修饰。
在本文中，术语“变异体”是指给定多肽的天然发生的变异或给定的肽或蛋白重组制备的或修饰的变异，其中一个或多个氨基酸残基通过氨基酸取代、增加、删除、插入或颠换而被修饰。
在一个实施方案中，本发明提供经分离的肽，其包含与SEQ IDNo.1的氨基酸序列至少有80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
术语“同一性”在本领域中是指通过比较序列而测定的两个或多个肽的序列的相关性。在本领域中，“同一性”也是指通过两个或多个氨基酸残基串之间的匹配数目而测定的肽间的序列相关性的程度。“同一性”测定的是通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)所确定的两个或多个序列间具有更少缺口比对(若有的话)的一致匹配的百分比。相关肽的同一性可通过已知方法进行计算。这些方法包括，但不限定于，在ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part1，G riffin，A.M.，and G riffin，H.G.，eds.，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M.Stockton Press，New York，1991；和Ca rillo et al.，SIAM J.Applied Math.48，1073(1988)中描述的方法。
优选的测定同一性的方法设计为在被检测的序列间给出最大的匹配性。测定同一性的方法描述在公开获得的计算机程序中。优选的测定两个序列间同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux et al.，Nucl.Acid.Res.12，387(1984)；Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，Wis.)，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))。BLASTX程序可从国立生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual，Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul et al.，同上)公开获得。众所周知的SmithWaterman算法也可用于测定同一性。
例如，通过计算机算法GAP(Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，Wis)，可通过测定百分比序列同一性而将两个肽进行比对，以使其各自的氨基酸进行最优匹配(“匹配范围”通过算法进行测定)。空位开口罚分(它是通过3乘以平均对角线来计算的；“平均对角线”是所用比较矩阵的平均对角线；“对角线”是通过特定比较矩阵分配给每个最优氨基酸匹配的分数或数目)和空位延伸罚分(它通常是空位开口罚分的{分数(1/10)}倍)，及比较矩阵，例如PAM 250或BLOSUM 62与算法联合使用。标准比较矩阵(参见Dayhoff et al.，Atlas of Protein Sequence and Structure，vol.5，supp.3(1978)关于PAM 250比较矩阵；Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.SciUSA 89，10915-10919(1992)关于BLOSUM 62比较矩阵)也通过算法使用。
优选的肽序列比较的参数包括以下：
算法：Needleman et al.，J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；比较矩阵：BLOSUM 62 from Henikoff et al.，PNAS USA 89，10915-10919(1992)；空位罚分：12，空位长度罚分：4，相似性临界值：0。
GAP程序使用上述参数。上述参数是通过GAP算法进行肽比较(对末端空位没有罚分)的缺省参数。
在一个实施方案中，本发明提供如上所述的经分离的肽，其中所述氨基酸序列在对应于Tyr62的位点被修饰，其中修饰包括用不同于Tyr的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。在一个实施方案中，在对应于Tyr62位的氨基酸残基的修饰包括用选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp和Val的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。在一个实施方案中，对应于Tyr62位的Tyr被选自His、Met、Asn、Val、Thr和Leu的氨基酸残基取代。
在一个实施方案中，本发明提供如上所述的经分离的肽，其中所述氨基酸序列在对应于Tyr75的位点被修饰，其中修饰包括用不同于Tyr的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。在一个实施方案中，在对应于Tyr75位的氨基酸残基的修饰包括用选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp和Val的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。在一个实施方案中，对应于Tyr75位的Tyr被选自Ala、Phe、Asn、Met或Cys的氨基酸残基取代。
在一个实施方案中，本发明提供如上所述的经分离的肽，其中所述氨基酸序列在对应于Ser250的位点被修饰，其中修饰包括用不同于Ser的氨基酸残基取代原来的丝氨酸残基。在一个实施方案中，在对应于Ser250位的氨基酸残基的修饰包括用选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr和Val的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供经分离的肽，其包含与SEQ IDNo.1的氨基酸序列至少有80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的氨基酸序列，其中所述序列通过在N末端增加一个或多个，例如1到9个、例如1到8个、例如1到7个、例如1到6个、例如1到5个、例如1到4个、例如1到3个、例如1到2个、例如1个氨基酸而被修饰。在一个实施方案中，所述序列通过在N末端增加Met而被修饰。
在一个实施方案中，本发明提供经分离的肽，其包含与SEQ IDNo.1的氨基酸序列至少有80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的氨基酸序列，其中所述序列通过在N末端增加一个或多个，例如2到9个、例如2到8个、例如2到7个、例如2到6个、例如2到5个、例如2到4个、例如2到3个、例如2个氨基酸而被修饰。在一个实施方案中，增加的氨基酸残基是二肽自由基Gly-Pro-。在一个实施方案中，增加的氨基酸残基是二肽自由基Ala-Pro-。
在一个实施方案中，本发明提供经分离的肽，其包含与SEQ IDNo.2的氨基酸序列至少有80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加一个或多个，例如1到9个、例如1到8个、例如1到7个、例如1到6个、例如1到5个、例如1到4个、例如1到3个、例如1到2个、例如1个氨基酸而被修饰。在一个实施方案中，所述序列通过在N末端增加Met而被修饰。
在一个实施方案中，本发明提供经分离的肽，其包含与SEQ IDNo.2的氨基酸序列至少有80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加一个或多个，例如2到9个、例如2到8个、例如2到7个、例如2到6个、例如2到5个、例如2到4个、例如2到3个、例如2个氨基酸而被修饰。在一个实施方案中，增加的氨基酸残基是二肽自由基Gly-Pro-。在一个实施方案中，增加的氨基酸残基是二肽自由基Ala-Pro-。
在一个实施方案中，与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％同一性的氨基酸序列是在WO2007020290中描述的任一项TGases的氨基酸序列。因此，本发明提供了这种TGases，它通过在N末端增加1到10个氨基酸而被修饰。
本发明也提供了具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的TGase。
本发明的肽具有如US 5,156,956中所述的检测法测定的TGase活性。简言之，对给定肽的活性测定是通过以苄氧基羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸和羟胺为底物，在没有Ca2+的情况下进行反应，在存在三氯乙酸时，形成铁复合物和氧肟酸，然后测定525nm的吸收，通过标准曲线测定氧肟酸的量，从而计算活性。相对于本发明的目的，在所述检测法中具有转谷氨酰胺酶活性的肽被认为具有转谷氨酰胺酶活性。特别是本发明的肽比具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的、来自拉达链轮丝菌的TGase的活性高30％以上，例如50％以上、例如70％以上、例如90％以上。
本发明的肽可通过不同方法进行制备。可通过本领域已知的肽合成方法制备肽。如果肽比较大，则通过合成几个肽片段，然后连接起来以提供本发明的肽是比较方便的。但在特定的实施方案中，本发明的肽是通过发酵含编码本发明的肽的核酸构建体的合适宿主而制备的。
在一个实施方案中，本发明提供编码本发明的肽的核酸构建体。
本文所用术语“核酸构建体”是指任何cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA来源的核酸分子。术语“构建体”是指核酸节段，它可以是单链或双链的，它是基于完整的或部分天然存在的编码目标蛋白的核苷酸序列构建的。构建体可选择地，可包含其它核酸节段。
编码本发明的肽的本发明的核酸构建体可以是基因组或cDNA来源，例如，通过制备基因组或cDNA文库，并根据标准技术(参见J.Sambrook et al，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2dedition，Cold Spring Harbor，New York)，通过合成的寡核苷酸探针进行杂交，并根据本领域已知方法引入突变筛选编码全长或部分蛋白的DNA序列而获得。
编码蛋白的本发明的核酸构建体也可根据建立的标准方法通过合成而制备，例如，如Beaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters 22，1859-1869(1981)所述的亚磷酰胺方法，或如Matthes et al.，EMBOJournal 3，801-805(1984)所述的方法制备。根据Phosphoamidite法，寡核苷酸是在例如自动DNA合成仪中合成、然后进行纯化、退火、连接并克隆到合适的载体中。
另外，核酸构建体可以通过将合成的、基因组的或cDNA来源(如果合适)的对应于完整核酸构建体各部分的片段根据标准技术连接，从而制备合成的和基因组来源的混合物、合成的和cDNA来源的混合物或基因组的和cDNA来源的混合物。
核酸构建体也可用特异引物通过聚合酶链反应进行制备，例如US 4,683,202或Saiki et al.，Science 239，487-491(1988)所述。
核酸构建体优选地是DNA构建体，该术语在下文中广泛应用。
在一个实施方案中，本发明提供含如本发明所述的核酸构建体的重组载体。
在一个实施方案中，本发明提供含如本发明所述的载体的宿主。
插入本发明的DNA构建体的重组载体可以是任何便于进行重组DNA操作的载体，载体的选择通常根据其导入的宿主细胞而确定。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。选择性地，载体在导入宿主细胞后可整合到宿主细胞的基因组中，与其整合的染色体一起复制。
载体优选地是表达载体，其中编码本发明的蛋白的DNA序列可操作地连接到其它DNA转录所需的DNA节段中。通常，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或含二者的元件。术语“可操作地连接”是指将节段根据其所需目的进行安排，以使其发挥功能，例如，转录在启动子处起始，并沿编码蛋白的DNA序列进行。
启动子是指任何在所选择的宿主细胞中具有转录活性的DNA序列，它可来源于编码宿主细胞同源或异源蛋白的基因。
用于酵母宿主细胞中的合适启动子的例子包括来自酵母糖酵解基因的启动子(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.255，12073-12080(1980)；Alber andKawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1，419-434(1982))或乙醇脱氢酶基因(Younget al.，in Genetic Enginee ring of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al，eds.)，PIenum Press，New York，1982)，或the TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(Russell et al.，Nature 304，652-654(1983))的启动子。
用于丝状真菌宿主细胞的合适的启动子的例子是，例如ADH3启动子(McKnight et al.，The EMBO J.4，2093-2099(1985))或tpiA启动子。其它有用的启动子的例子是那些来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉(A.niger)酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶基因的启动子。优选地是TAKA-淀粉酶和gluA启动子。
用于细菌宿主细胞的合适的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BAN淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)碱性蛋白酶基因、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilusd)木糖酶基因的启动子，或噬菌体Lambda PR或PL启动子或大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
如果需要，编码本发明的蛋白的DNA序列也可以可操作地连接合适的终止子，例如人生长激素终止子(Palmiter et al.，op.cit.)或(对于真菌宿主)TPI1(Alber and Kawasaki，op.cit.)或ADH3(McKnightet al.，op.cit.)终止子。载体可进一步包括元件，例如多聚腺苷化信号(例如来自SV40或腺病毒5Elb区)、转录增强序列(例如SV40增强子)和翻译增强序列(例如编码腺病毒VA RNAs的序列)。
本发明的重组载体进一步可包括使载体在所用宿主细胞中复制的DNA序列。
当宿主细胞是酵母细胞时，使载体复制的合适序列是酵母质粒2μ复制基因REP 1-3和复制原点。
当宿主细胞是细菌细胞时，使载体复制的序列是DNA聚合酶III复合体编码基因和复制原点。
载体也可以包括选择性标记，例如，其产物在宿主细胞中补充缺陷的基因，例如，编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因(如P.R.Russell，Gene 40，125-130(1985)所述)，或对药物，例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤赋予抗性的基因。对丝状真菌而言，选择性标记包括amdS、pyrG、argB、niaD和sC。
为了指导本发明的蛋白进入宿主细胞的分泌途径，可在重组载体中提供分泌信号序列(也称为引导肽序列、原序列或前序列)。分泌信号序列与编码蛋白的DNA序列在正确的阅读框连接。分泌信号序列通常位于编码蛋白的DNA序列的5′端。分泌信号序列通常与蛋白相关或来自编码另一种分泌蛋白的基因。
对于在酵母细胞中分泌而言，分泌信号序列可编码任何确保有效指导表达蛋白进入细胞的分泌途径的信号肽。信号肽可以是天然存在的信号肽，或其功能部分，或是合成的肽。合适的信号肽包括α-因子信号肽(参见US 4,870,008)、鼠唾液淀粉酶信号肽(参见O.Hagenbuchle et al.，Nature 289，643-646(1981))、修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls et al.，Cell 48，887-897(1987))、酵母BAR1信号肽(参见WO 87/02670)、或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani et al.，Yeast 6，127-137(1990))。
为了在酵母中有效分泌，编码引导肽的序列也可以插入到信号序列的下游和编码蛋白的DNA序列的上游。引导肽的功能是指导表达的蛋白从内质网进入高尔基体，然后进入分泌泡而分泌到培养基中(即，蛋白通过细胞壁，或至少通过细胞膜而进入酵母细胞的周质空间)。引导肽可以是酵母的α-因子引导肽(其用途描述在例如US4,546,082、EP 16 201、EP 123 294、EP 123 544和EP 163 529中)。选择性地，引导肽可以是合成的引导肽，即它是自然界不存在的引导肽。合成的引导肽可以例如，如WO 89/02463或WO 92/11378中所述而构建。
对于在丝状真菌中的用途而言，信号肽可方便地来自编码曲霉淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶或柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因。信号肽优选地来自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。
将编码本蛋白的DNA序列、启动子和选择性地终止子和/或分泌信号肽分别连接并插入到含复制所需信息的合适载体中的流程是本领域技术人员已知的(参见例如，Sambrook et al.，如前文所引)。
导入本发明的DNA构建体或重组载体的宿主细胞可以是任何能产生本蛋白的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
通过培养可产生本发明的蛋白的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性菌，例如芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽胞杆菌(B.megatherium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)菌株，或链霉菌，例如浅青紫链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。细菌的转化可通过原生质体转化或感受态细胞以本领域已知方式进行(参见Sambrook etal.，同上)。其它合适的宿主包括茂原链霉菌、浅青紫链霉菌和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(Appl.Microbiol.Biotechnol.64，447-454(2004))。
当在细菌，例如大肠杆菌中表达蛋白时，蛋白可典型地以不溶性颗粒(称为包含体)在细胞质中维持，或通过细菌分泌序列分泌到周质空间。在前一种情况下，将细胞裂解，回收颗粒并变性，然后通过稀释变性剂而使蛋白重新折叠。在后一种情况下，可通过例如超声或透析裂解细胞，以释放周质空间的内容物而从周质空间回收蛋白。
合适的酵母细胞的例子包括酵母(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞。用异源DNA转化酵母细胞并产生异源蛋白的方法描述在例如US 4,599,311、US4,931,373、US 4,870,008、5,037,743和US 4,845,075中，所有这些均通过参考整合在文中。转化的细胞通过选择性标记，通常是药物抗性或在缺乏特定营养例如亮氨酸时能够生长而确定的表型进行选择。用于酵母中的优选载体是描述在US 4,931,373中的POT1载体。在编码本发明的蛋白的DNA序列之前可增加信号序列和选择性地增加引导肽序列，例如如上所述。合适的酵母细胞的进一步的例子是克鲁维斯酵母(Kluyveromyces)菌株，例如乳酸克鲁维斯酵母(K.lactis)、汉逊氏酵母(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)，或毕赤酵母(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)(参见Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.132，3459-3465(1986)；US 4,882,279)。
其它真菌细胞的例子是丝状真菌，例如曲霉(Aspergillus spp.)、脉孢霉(Neurospora spp.)、镰孢霉(Fusarium spp.)或木霉(Trichodermaspp.)的细胞，特别是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉菌株。用曲霉表达蛋白的例子描述在例如EP 272 277和EP 230 023中。尖镰孢霉(F.oxysporum)的转化可如例如Malardier et al.Gene 78，147-156(1989)所述进行。
当用丝状真菌作为宿主细胞时，可用本发明的DNA构建体进行转化，方便时可通过将DNA构建体整合到宿主染色体中而获得重组宿主细胞。这种整合通常被认为利于DNA序列更可能在细胞中稳定维持。可根据传统方法，例如同源或异源重组而将DNA构建体整合到宿主染色体中。
然后在合适的营养培养基中，在可表达所需肽的条件下培养上述转化或转染的宿主细胞，然后从培养基中回收得到的蛋白。
用于培养细胞的培养基可以是任何传统的适于宿主细胞生长的培养基，例如含合适的补充剂的基本或复合培养基。合适的培养基可从供应商获得或根据公开配方(例如，美国典型培养物保藏中心目录)制备。然后可从培养基中通过传统方法回收细胞产生的蛋白，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，沉淀上清中的蛋白样组分或通过盐，例如硫酸铵过滤，然后根据所研究蛋白的性质，通过各种色谱方法，例如离子交换色谱、凝胶阻滞色谱、亲和色谱等进行纯化。
在一个实施方案中，本发明提供含本发明的肽的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供结合肽的方法，其中所述方法包括将所述肽与胺供体在存在本发明的肽的情况下反应。在一个实施方案中，待结合的肽是生长激素。在一个实施方案中，肽是hGH或其变异体或衍生物。
在本文中，术语“衍生物”是指多肽或其变异体或片段，它通过对母体肽修饰，即共价连接任何类型的分子，优选地是生物素化而获得。典型的修饰是酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等。
在一个实施方案中，本发明提供结合上述生长激素的方法，其中在对应于hGH的Gln-141位结合的生长激素的量相对于对应于hGH的Gln-40位结合的hGH的量，显著高于当在所述方法中使用具有SEQID No.2所示的氨基酸序列的肽代替本发明的肽时在对应于hGH的Gln-141位结合的hGH的量相对于hGH的Gln-40位结合的hGH的量。
在一个实施方案中，本发明提供结合hGH的方法，其中在对应于hGH的Gln-141位结合的生长激素的量相对于对应于hGH的Gln-40位结合的hGH的量，显著高于当在所述方法中使用具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽代替本发明的肽时在对应于hGH的Gln-141位结合的hGH的量相对于hGH的Gln-40位结合的hGH的量。
在一个实施方案中，本发明提供制备在对应于141位结合了hGH的方法，其中所述方法包括将所述hGH与胺供体在存在本发明的肽的情况下反应。
在一个包括本发明的方法的实施方案中，结合的hGH用于制备聚乙二醇化的hGH，其中所述聚乙二醇化在结合位点发生。
在一个实施方案中，本发明提供结合了生长激素药物制品的方法，该方法包括将所述hGH或其变异体或衍生物与胺供体在存在本发明的肽的情况下进行反应的步骤。在一个实施方案中，生长激素是hGH或其变异体或衍生物。
在一个实施方案中，本发明提供聚乙二醇化的生长激素药物制品的方法，该方法包括将所述hGH或其变异体或衍生物与胺供体在存在本发明的肽的情况下进行反应的步骤，然后用得到的结合了生长激素的肽制备聚乙二醇化的生长激素，其中所述的聚乙二醇化发生在结合位点。在一个实施方案中，生长激素是hGH或其变异体或衍生物。在一个实施方案中，聚乙二醇化的生长激素是在Gln141位处聚乙二醇化的hGH。在一个实施方案中，聚乙二醇化的生长激素是如WO2006/134148所述的聚乙二醇化的生长激素。
在一个实施方案中，本发明提供用本发明的肽制备结合的生长激素的用途。在一个实施方案中，生长激素是hGH或其变异体或衍生物。在一个实施方案中，生长激素在对应于hGH的Gln141位结合。
在一个实施方案中，本发明提供治疗缺乏生长激素的患者的疾病或症状的方法，该方法包括给药所需患者如本发明的方法制备的药物制品，其中结合的肽是生长激素。在一个实施方案中，疾病或症状涉及在患者中缺乏生长激素的疾病或症状，选自生长激素缺乏症(GHD)；特纳综合征；Prader-Willi综合症(PWS)；奴南综合征；唐氏综合征；慢性肾病，幼年类风湿性关节炎；囊性纤维症；接受HAART治疗的儿童的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于孕龄期出生的矮小儿童(SGA)；除SGA外的低出生体重出生的矮小儿童(VLBW)；季肋发育不全；软骨发育不全；特发性矮小(ISS)；成人GHD；长骨骨折，例如胫骨、腓骨、大腿骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、跖骨(matatarsea)和指骨；海绵骨骨折，例如scull、手基底部和足基底部；腱或韧带例如手、膝盖或肩膀损伤的患者；具有或经历牵张成骨的患者；髋或盘(discus)取代后的患者、半月板修复、脊柱连接或例如膝盖、髋、肩膀、肘、腕或颚的假肢固定；骨缝术材料，例如指甲、螺丝钉及板固定的患者；不连接或连接不正的骨折患者；例如胫骨或第一个脚趾截骨后的患者；接受移植的患者；外伤或关节炎引起的膝关节软骨恶化；具有特纳综合征的患者的骨质疏松症；男性骨质疏松症；慢性透析的成人患者(APCD)；APCD营养不良相关的心血管疾病；APCD逆转心力衰竭恶病质；APCD癌症；APCD慢性梗阻性肺病；APCD HIV；具有APCD的老人；APCD慢性肝病；APCD疲劳综合症；克罗恩病；肝功能损伤；HIV感染的男性；短肠综合征；中枢神经肥大；HIV-相关的脂肪营养不良综合症(HALS)；男性不育；主要的非急需手术、酒精/药物解毒或神经性外伤；衰老；孱弱老人；骨关节炎；软骨外损伤；勃起功能障碍；纤维肌痛(fibromyalgia)；记忆损伤；抑郁症；脑外损伤；蛛网膜下腔出血；低出生体重儿；代谢综合症；糖皮质激素肌病；由于糖皮质激素治疗的矮小儿童。
以下是本发明的实施方案的列表，该列表不进行限制：
实施方案1：相对于hGH的Gln-40，对hGH的Gln-141具有特异性的转谷氨酰胺酶肽，其特异性高于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln-141相对于其对hGH的Gln-40的特异性。
实施方案2：如实施方案1所述的转谷氨酰胺酶肽含有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同一性至少为80％的氨基酸序列。
实施方案3：如实施方案2所述的转谷氨酰胺酶肽含有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同一性至少为85％的氨基酸序列。
实施方案4：如实施方案3所述的转谷氨酰胺酶肽含有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同一性至少为90％的氨基酸序列。
实施方案5：如实施方案4所述的转谷氨酰胺酶肽含有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同一性至少为95％的氨基酸序列。
实施方案6：如实施方案2到5任一项所述的转谷氨酰胺酶肽，其中所述的氨基酸序列在对应于SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
实施方案7：含有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同一性至少为80％的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ IDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
实施方案8：如实施方案7所述的经分离的肽含有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同一性至少为85％的氨基酸序列，其中所述序列在对应于SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
实施方案9：如实施方案8所述的经分离的肽含有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同一性至少为90％的氨基酸序列，其中所述序列在对应于SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
实施方案10：如实施方案9所述的经分离的肽含有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同一性至少为95％的氨基酸序列，其中所述序列在对应于SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
实施方案11：如实施方案10所述的经分离的肽含有如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列，其中所述序列在对应于SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点进行修饰。
实施方案12：如实施方案6到11任一项所述的经分离的肽，其中所述的序列在对应于Tyr62的位点进行修饰，其中修饰包括用不同于Tyr的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。
实施方案13：如实施方案12所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的氨基酸的修饰包括用选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp和Val的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。
实施方案14：如实施方案13所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用选自His、Met、Asn、Val、Thr和Leu的氨基酸残基取代。
实施方案15：如实施方案14所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用His取代。
实施方案16：如实施方案14所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用Val取代。
实施方案17：如实施方案14所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用选自Met、Asn、Thr和Leu的氨基酸残基取代。
实施方案18：如实施方案17所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用Met取代。
实施方案19：如实施方案17所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用Asn取代。
实施方案20：如实施方案17所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用Thr取代。
实施方案21：如实施方案17所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr62位的Tyr用Leu取代。
实施方案22：如实施方案6到21任一项所述的经分离的肽，其中所述的氨基酸序列在对应于Tyr75的位点被修饰，其中修饰包括用不同于Tyr的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。
实施方案23：如实施方案22所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的氨基酸的修饰包括用选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp和Val的氨基酸残基取代原来的酪氨酸残基。
实施方案24：如实施方案23所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Ala、Phe、Asn、Met、Leu或Cys取代。
实施方案25：如实施方案24所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Phe取代。
实施方案26：如实施方案24所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Asn取代。
实施方案27：如实施方案24所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Ala、Met、Leu或Cys取代。
实施方案28：如实施方案27所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Ala取代。
实施方案29：如实施方案27所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Met取代。
实施方案30：如实施方案27所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Leu取代。
实施方案31：如实施方案27所述的经分离的肽，其中在对应于Tyr75位的Tyr用Cys取代。
实施方案32：如实施方案6到31任一项所述的经分离的肽，其中所述氨基酸序列在对应于Ser250的位点进行修饰，其中修饰包括用不同于Ser的氨基酸残基取代原来的丝氨酸残基。
实施方案33：如实施方案32所述的经分离的肽，其中在对应于Ser250位的氨基酸的修饰包括用选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr和Val的氨基酸残基取代原来的丝氨酸残基。
实施方案34：如实施方案33所述的经分离的肽，其中在对应于Ser250位的氨基酸的修饰包括用选自Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Leu、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr和Val的氨基酸残基取代原来的丝氨酸残基。
实施方案35：如实施方案33所述的经分离的肽，其中在对应于Ser250位的氨基酸残基的修饰包括用Gly取代原来的丝氨酸残基。
实施方案36：如实施方案33或实施方案35所述的经分离的肽，其中在对应于Ser250位的氨基酸残基的修饰包括用选自Cys、Leu、Pro、Trp、Tyr和Val的氨基酸残基取代原来的丝氨酸残基。
实施方案37：如实施方案36所述的经分离的肽，其中所述Ser250用Cys取代。
实施方案38：如实施方案36所述的经分离的肽，其中所述Ser250用Leu取代。
实施方案39：如实施方案36所述的经分离的肽，其中所述Ser250用Pro取代。
实施方案40：如实施方案36所述的经分离的肽，其中所述Ser250用Trp取代。
实施方案41：如实施方案36所述的经分离的肽，其中所述Ser250用Tyr取代。
实施方案42：如实施方案36所述的经分离的肽，其中所述Ser250用Val取代。
实施方案43：含有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同一性至少为80％的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案44：如实施方案43所述的经分离的肽，含有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同一性至少为85％的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案45：如实施方案44所述的经分离的肽，含有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同一性至少为90％的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案46：如实施方案45所述的经分离的肽，含有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的同一性至少为95％的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案47：如实施方案46所述的经分离的肽，含有如SEQ IDNo.1所所示的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案48：如实施方案2到42任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案49：含有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的同一性至少为80％的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案50：如实施方案49所述的经分离的肽，含有与SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的同一性至少为85％的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案51：如实施方案50所述的经分离的肽，含有与SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的同一性至少为90％的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案52：如实施方案51所述的经分离的肽，含有与SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的同一性至少为95％的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案53：如实施方案52所述的经分离的肽，含有如SEQ IDNo.2所所示的氨基酸序列，其中所述序列在N末端通过增加1到10个氨基酸残基而修饰。
实施方案54：如实施方案49到53任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在选自对应于SEQ ID No.2的Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327位点的氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基被进一步修饰。
实施方案55：如实施方案54所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的Gly-250的氨基酸残基被修饰。
实施方案56：如实施方案55所述的经分离的肽，其中所述Gly-250用Thr取代。
实施方案57：如实施方案55所述的经分离的肽，其中所述Gly-250用Ser取代。
实施方案58：如实施方案49到57任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在距离对应于SEQ ID No.2的Cys-64的氨基酸残基小于20
的一个或多个氨基酸残基被修饰。
实施方案59：如实施方案58所述的经分离的肽，其中所述序列在距离对应于SEQ ID No.2的Cys-64的氨基酸残基小于15的一个或多个氨基酸残基被修饰。
实施方案60：如实施方案59所述的经分离的肽，其中序列在对应于SEQ ID No.2中Cys64位的位点不被修饰。
实施方案61：如实施方案59或60所述的经分离的肽，其中所述序列在选自对应于SEQ ID No.2的Val-30、Tyr-62、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278和Leu-285位的氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基被修饰。
实施方案62：如实施方案61所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的Tyr-62的氨基酸残基被修饰。
实施方案63：如实施方案61或实施方案62所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被His、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Thr、Val或Trp取代。
实施方案64：如实施方案61到63任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Glu取代。
实施方案65：如实施方案61到63任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Trp取代。
实施方案66：如实施方案61到63任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Thr或Val取代。
实施方案67：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被His取代。
实施方案68：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Glu取代。
实施方案69：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Ile取代。
实施方案70：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Met取代。
实施方案71：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Asn取代。
实施方案72：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Gln取代。
实施方案73：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Thr取代。
实施方案74：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Val取代。
实施方案75：如实施方案66所述的经分离的肽，其中所述Tyr-62被Trp取代。
实施方案76：如实施方案61到75任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的His-277和Tyr-278的一个或多个氨基酸残基被修饰。
实施方案77：如实施方案61到76任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的Leu-285的氨基酸残基被修饰。
实施方案78：如实施方案77所述的经分离的肽，其中所述Leu-285被Thr取代。
实施方案79：如实施方案61到78任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在选自对应于SEQ ID No.2的Val-252、Asn-253和Phe-254位的氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基被修饰。
实施方案80：如实施方案59到79任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的Val-30的氨基酸残基被修饰。
实施方案81：如实施方案80所述的经分离的肽，其中所述SEQID No.2中的Val-30被Ile取代。
实施方案82：如实施方案54所述的经分离的肽，其中所述序列在选自对应于SEQ ID No.2的Asp-4、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221和Lys-327位的氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基被进一步修饰。
实施方案83：如实施方案82所述的经分离的肽，其中所述Asp-4被Glu取代。
实施方案84：如实施方案82或实施方案83所述的经分离的肽，其中所述Asp-4被Glu取代，在位点1、2和3的氨基酸被删除。
实施方案85：如实施方案82到84任一项所述的经分离的肽，其中对应于SEQ ID No.2的Arg-89的氨基酸残基被Lys取代。
实施方案86：如实施方案82到85任一项所述的经分离的肽，其中对应于SEQ ID No.2的Glu-115的氨基酸残基被Asp取代。
实施方案87：如实施方案82到86任一项所述的经分离的肽，其中对应于SEQ ID No.2的Ser-210的氨基酸残基被Gly取代。
实施方案88：如实施方案82到87任一项所述的经分离的肽，其中对应于SEQ ID No.2的Asp-221的氨基酸残基被Ser取代。
实施方案89：如实施方案82到88任一项所述的经分离的肽，其中对应于SEQ ID No.2的Lys-327的氨基酸残基被Thr取代。
实施方案90：如实施方案54到89任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在选自对应于SEQ ID No.2中Ala-226和Pro-227位的氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基被修饰。
实施方案91：如实施方案90所述的经分离的肽，其中所述Ala-226被Asp取代。
实施方案92：如实施方案90所述的经分离的肽，其中对应于SEQID No.2的Pro-227的氨基酸残基被Arg取代。
实施方案93：如实施方案54到92任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的Tyr-75的氨基酸残基被取代。
实施方案94：如实施方案93所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被不同于Glu的氨基酸所取代。
实施方案95：如实施方案94所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被不同于Asp或Glu的氨基酸所取代。
实施方案96：如实施方案95所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被不同于酸性氨基酸残基的氨基酸所取代。
实施方案97：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Ala取代。
实施方案98：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Cys取代。
实施方案99：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Phe取代。
实施方案100：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Leu取代。
实施方案101：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Met取代。
实施方案102：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Asn取代。
实施方案103：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Pro取代。
实施方案104：如实施方案93到96任一项所述的经分离的肽，其中所述Tyr-75被Ser取代。
实施方案105：如实施方案54到104任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的Tyr-302的氨基酸残基被修饰。
实施方案106：如实施方案105所述的经分离的肽，其中所述Tyr-302被不同于Tyr的碱性氨基酸残基所取代。
实施方案107：如实施方案106所述的经分离的肽，其中所述Tyr-302被Arg或Lys所取代。
实施方案108：如实施方案107所述的经分离的肽，其中所述Tyr-302被Arg所取代。
实施方案109：如实施方案54到108任一项所述的经分离的肽，其中所述序列在对应于SEQ ID No.2的Asp-304的氨基酸残基被修饰。
实施方案110：如实施方案109所述的经分离的肽，其中所述Asp-304被碱性氨基酸残基所取代。
实施方案111：如实施方案110所述的经分离的肽，其中所述Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代。
实施方案112：如实施方案111所述的经分离的肽，其中所述Asp-304被Lys取代。
实施方案113：如实施方案43到112任一项所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到9个氨基酸而修饰。
实施方案114：如实施方案113所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到8个氨基酸而修饰。
实施方案115：如实施方案114所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到7个氨基酸而修饰。
实施方案116：如实施方案115所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到6个氨基酸而修饰。
实施方案117：如实施方案116所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到5个氨基酸而修饰。
实施方案118：如实施方案117所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到4个氨基酸而修饰。
实施方案119：如实施方案118所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到3个氨基酸而修饰。
实施方案120：如实施方案119所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到2个氨基酸而修饰。
实施方案121：如实施方案120所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1个氨基酸而修饰。
实施方案122：如实施方案121所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加Met而修饰。
实施方案123：如实施方案43到112任一项所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2到9个氨基酸而修饰。
实施方案124：如实施方案123所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2到8个氨基酸而修饰。
实施方案125：如实施方案124所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2到7个氨基酸而修饰。
实施方案126：如实施方案125所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2到6个氨基酸而修饰。
实施方案127：如实施方案126所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2到5个氨基酸而修饰。
实施方案128：如实施方案127所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2到4个氨基酸而修饰。
实施方案129：如实施方案128所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2到3个氨基酸而修饰。
实施方案130：如实施方案129所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2个氨基酸而修饰。
实施方案131：如实施方案130所述的经分离的肽，其中增加的二肽自由基是Gly-Pro-。
实施方案132：如实施方案130所述的经分离的肽，其中增加的二肽自由基是Ala-Pro-。
实施方案133：如实施方案7到132任一项所述的经分离的肽，该肽具有转谷氨酰胺酶活性。
实施方案134：如实施方案1到6或实施方案133任一项所述的经分离的肽，该肽相对于hGH的Gln-40而言，对hGH的Gln-141具有特异性，而且该特异性高于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln-141相对于其对hGH的Gln-40的特异性。
实施方案135：如实施方案1到6或实施方案133任一项所述的经分离的肽，该肽相对于hGH的Gln-40而言，对hGH的Gln-141具有特异性，而且该特异性高于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln-141相对于其对hGH的Gln-40的特异性。
实施方案136：包含SEQ ID No.1的序列的经分离的肽。
实施方案137：具有SEQ ID No.1的序列的经分离的肽。
实施方案138：编码如实施方案1到137任一项所述的肽的核酸构建体。
实施方案139：含实施方案138的核酸构建体的载体。
实施方案140：含实施方案139的载体的宿主细胞。
实施方案141：含如实施方案1到137任一项所述的肽的组合物。
实施方案142：结合肽的方法，其中所述方法包括将所述肽与胺供体在如实施方案1到137任一项所述的肽存在的情况下进行反应。
实施方案143：如实施方案142所述的肽的结合方法，其中所述被结合的肽是生长激素。
实施方案144：如实施方案143所述的方法，其中所述生长激素是hGH或其变异体或衍生物。
实施方案145：如实施方案144所述的生长激素的结合方法，其中在对应于hGH的Gln-141位结合的生长激素的量相对对应于hGH的Gln-40位结合的hGH的量，显著高于当在所述方法中使用具有SEQID No.2所示的氨基酸序列的肽代替实施方案1到137任一项所述的肽时，在对应于hGH的Gln-141位结合的hGH的量相对hGH的Gln-40位结合的hGH的量。
实施方案146：如实施方案142所述的hGH的结合方法，其中在对应于hGH的Gln-141位结合的生长激素的量相对对应于hGH的Gln-40位结合的hGH的量，显著高于当在所述方法中使用具有如SEQID No.1所示的氨基酸序列的肽代替实施方案1到137任一项所述的肽时，在对应于hGH的Gln-141位结合的hGH的量相对对应于在hGH的Gln-40位结合的hGH的量。
实施方案147：制备在对应于141位发生结合的hGH的方法，其中所述方法包括将所述hGH与胺供体在如实施方案1到137任一项所述的肽存在的情况下进行反应。
实施方案148：如实施方案142到147任一项所述的方法，其中结合的hGH用于制备聚乙二醇化的hGH，其中所述的聚乙二醇化发生在结合位点。
实施方案149：制备结合了生长激素药物制品的方法，该方法包括将所述hGH或其变异体或衍生物与胺供体在如实施方案1到137任一项所述的肽存在的情况下进行反应的步骤。
实施方案150：如实施方案149所述的方法，其中所述生长激素是hGH或其变异体或衍生物。
实施方案151：制备聚乙二醇化的生长激素药物制品的方法，该方法包括将所述hGH或其变异体或衍生物与胺供体在如实施方案1到137任一项所述的肽存在的情况下进行反应的步骤，并用得到的结合了生长激素的肽制备聚乙二醇化的生长激素，其中所述聚乙二醇化发生在结合位点。
实施方案152：如实施方案151所述的方法，其中所述的生长激素是hGH或其变异体或衍生物。
实施方案153：如实施方案152所述的方法，其中聚乙二醇化的生长激素是在Gln141位聚乙二醇化的hGH。
实施方案154：如实施方案1到137所述的肽在制备结合的生长激素方面的用途。
实施方案155：如实施方案154所述的用途，其中生长激素是hGH或其变异体或衍生物。
实施方案156：如实施方案154或实施方案155所述的用途，其中生长激素在对应于hGH的Gln141位结合。
实施方案157：治疗患者缺乏生长激素相关的疾病或症状的方法，该方法包括对所需患者给药通过如实施方案149到153任一项所述的方法制备的药物制品。
实施方案158：如实施方案157所述的方法，其中缺乏生长激素相关的疾病或症状选自生长激素缺乏症(GHD)；特纳综合征；Prader-Willi综合症(PWS)；奴南综合征；唐氏综合征；慢性肾病，幼年类风湿性关节炎；囊性纤维症；接受HAART治疗的儿童的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于孕龄期出生的矮小儿童(SGA)；除SGA外的低出生体重出生的矮小儿童(VLBW)；季肋发育不全；软骨发育不全；特发性矮小(ISS)；成人GHD；长骨骨折，例如胫骨、腓骨、大腿骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、跖骨(matatarsea)和指骨；海绵骨骨折，例如scull、手基底部和足基底部；腱或韧带例如手、膝盖或肩膀损伤的患者；具有或经历牵张成骨的患者；髋或盘(discus)取代后的患者、半月板修复、脊柱连接或例如膝盖、髋、肩膀、肘、腕或颚的假肢固定；骨缝术材料，例如指甲、螺丝钉及板固定的患者；不连接或连接不正的骨折患者；例如胫骨或第一个脚趾截骨后的患者；接受移植的患者；外伤或关节炎引起的膝关节软骨恶化；具有特纳综合征的患者的骨质疏松症；男性骨质疏松症；慢性透析的成人患者(APCD)；APCD营养不良相关的心血管疾病；APCD逆转心力衰竭恶病质；APCD癌症；APCD慢性梗阻性肺病；APCDHIV；具有APCD的老人；APCD慢性肝病；APCD疲劳综合症；克罗恩病；肝功能损伤；HIV感染的男性；短肠综合征；中枢神经肥大；HIV-相关的脂肪营养不良综合症(HALS)；男性不育；主要的非急需手术、酒精/药物解毒或神经性外伤；衰老；孱弱老人；骨关节炎；软骨外损伤；勃起功能障碍；纤维肌痛(fibromyalgia)；记忆损伤；抑郁症；脑外损伤；蛛网膜下腔出血；低出生体重儿；代谢综合症；糖皮质激素肌病；由于糖皮质激素治疗的矮小儿童。
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实施例
实施例1
以GlyPro-TGase形式克隆前肽-mTGase及产生突变体
来自拉达链轮丝菌ATCC27441的TGase
来自拉达链轮丝菌的前肽mTGase的序列(前肽-mTGase是由编码来自拉达链轮丝菌的TGase的DNA在另一种微生物，例如大肠杆菌中表达而产生的肽)如SEQ ID No.3所示。前肽部分是SEQ ID No.3的氨基酸1-49，其余序列是如SEQ ID No.1所示的成熟的mTGase。成熟的mTGase部分(SEQ ID No.1)与来自茂原链霉菌的mTGase(SEQ ID No.2)的相应部分的同一性为93.4％，如图1所示。
将3C-蛋白酶序列LEVLFQGP(3C)克隆在拉达链轮丝菌的前肽-TGase的前肽结构域(SEQ ID No.3的aa 1-49)和成熟的mTGase结构域之间。3C-蛋白酶可在LEVLFQGP位点的Q和G之间特异切割，从而得到两个额外的、加到成熟的mTGase(如SEQ ID No.1所示)N末端的氨基酸残基，Gly-Pro。对于在大肠杆菌中表达，将编码Met-前肽-(3C)-mTGase的DNA克隆到pET39b(Novagen)表达载体的NdeI和BamHI位点之间，然后转移到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)进行位点定向诱变。例如，以前肽-(3C)-mTGase序列为模板进行PCR，从而产生Y75A、Y75F、Y62H_Y75N和Y62H_Y75F突变(以SEQ ID No.1的编号)。
实施例2
具有增加的N末端氨基酸残基的TGase突变体的选择性
制备GlyPro-mTGase
在30℃，用添加了30μg/ml卡那霉素的LB培养基培养pET39b_Met-前肽-(3C)-mTGase/大肠杆菌BL21(DE3)细胞至光密度为0.4，然后细胞用0.1mM IPTG诱导4小时。通过离心收获细胞沉淀。
提取细胞沉淀的可溶性部分，并通过阴离子交换、Q-SEPHAROSEHP柱纯化而获得纯的前肽-(3C)-mTGase蛋白。然后将该蛋白用3C-蛋白酶(来自脊髓灰质炎病毒)，以相对于前肽-(3C)-mTGase蛋白1:100(w/w)的比例，在20℃消化过夜。将消化混合物通过阳离子交换柱、SP SEPHAROSE HP/Source 30S进一步纯化，以获得通过TGase活性检测法鉴定的活性mTGase。
制备AlaPro-mTGase
除了用肠激酶(EK)代替3C蛋白酶来消化前肽之外，以与GlyPro-mTGase相同的方法制备AlaPro-mTGase。简要地说，来自茂原链霉菌的前肽-mTGase在大肠杆菌中表达，并出现在可溶性部分。通过Q SEPHAROSE HP离子交换色谱纯化前肽-mTGase，并用EK消化获得AlaPro-mTGase。然后，在SP SEPHAROSE HP离子交换柱上进一步纯化AlaPro-mTGase。
为了比较不同的N末端额外序列对来自拉达链轮丝菌的mTGase的选择性的影响，分别对来自拉达链轮丝菌Met-mTGase、AlaPro-mTGase形式的mTGase和野生型mTGase进行克隆、表达和纯化。
与上述由EK产生的、来自茂原链霉菌的AlaPro-mTGase相比，GlyPro-mTGase-SL是由3C蛋白酶(来自脊髓灰质炎病毒)消化前肽-3C-mTGase-SL产生的，其比用EK消化特异性更高，而且回收量也更高。
实施例3
高选择性变异体的筛选检测---用于评估N末端额外序列对拉达链轮
丝菌的mTGase选择性的影响的动力学方法
制备hGHO40N和hGHO141N
通过位点定向诱变构建hGH的突变体hGHQ40N和hGHQ141N。它们在N末端具有4个额外的氨基酸残基，在大肠杆菌中以MEAE-hGHQ40N和MEAE-hGHQ141N表达，并以与野生型重组hGH相同的方式纯化。简言之，从大肠杆菌粗裂解液中通过Q SEPHAROSEXL色谱回收可溶性MEAE-hGH突变体，然后用苯基SEPHAROSE FF进一步纯化。用DAP-1酶消化部分纯化的MEAE-hGH突变体，在42℃反应1小时，以除去N末端的MEAE。最后，用38％冷乙醇沉淀hGH突变体，然后用7M尿素溶解，并用Source 30Q柱纯化。
动力学反应
在200μl的、含200mM NaCl，50uM hGHQ141N或hGHQ40N，100uM丹酰尸胺(DNC，Fluka)的20mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中进行动力学反应。通过加入2μg mTGase起始反应，并在26℃运行。在Ex/Em：340/520nm每隔20秒监测荧光，监测1小时。用0-2000之间收集的数据通过二阶多项式(2nd order polynomial)拟和过程曲线，从而获得斜率。拟和计算基于在更早时间段(0-2000秒)收集的数据，这时过程曲线(progress curves)的斜率是线性的，而且逆反应相对最小。
实施例4
毛细管电泳验证TGase突变体的高选择性：
hGH的转谷氨酰胺反应
以1，3-二氨基-丙醇为胺供体进行转谷氨酰胺反应。通过加入TGase蛋白起始反应，在室温下温育2小时。在时间间隔(15-30分钟)采集样品，在液氮中冻存，并储存在-20℃以通过CE分析转化率和选择性。反应混合物列在表1中。
表1
用野生型hGH和1，3-二氨基-丙醇制备转谷氨酰胺反应混合物。首先用溶在TrisHCl，5mM，pH 7.0中的储液制备hGH工作溶液(working solution)，然后用于反应中。
*1，3-dap： 1，3-二氨基-丙醇
CE分析
首先将进行转谷氨酰胺反应的冻存样品用水进行1:10稀释，然后用Beckman Coulter的P/ACE MDQ进行CE，毛细管为30.5cm x 50umi.d.，并在20℃，在214nm进行UV检测。由于转谷氨酰胺化hGH的pI约为5.80-6.20，因此在TrisHCl，50mM，pH 8.0中进行CE分析。
毛细管首先用0.1M HCl平衡0.5分钟，并用蒸馏水清洗1.5分钟，注射样品0.5分钟，最后在+15kV运行25分钟进行样品分离。
从CE谱(profile)可看出，野生型hGH、在Q141单取代的hGH和在Q40单取代的hGH的保留时间(retention time)分别为6.5、7.9和10分钟。
实施例5
评估高选择性mTGase突变体
与茂原链霉菌的野生型mTGase(以AlaPro-mTGase形式)的选择性相比，突变体的选择性提高。通过筛选检测法来评估N末端变异体的选择性。以野生型hGH为底物，1，3-二氨基-丙醇为胺供体进行转谷氨酰胺反应，通过CE分析评估所有突变体的选择性。
实施例6
不同N末端序列对拉达链轮丝菌的mTGase选择性的影响
通过实施例3所述检测法比较具有不同N末端额外序列的拉达链轮丝菌的mTGase变异体对hGHQ141(以hGHQ40N为底物)和hGHQ40(以hGHQ141为底物)的选择性。
如表2所示的结果表明，拉达链轮丝菌的mTGase的总体选择性高于茂原链霉菌的AlaPro-mTGase。
在拉达链轮丝菌的mTGase的4个具有不同N末端序列的不同版本中，GlyPro-mTGase具有最高的选择性，RS为2.7。虽然未获得拉达链轮丝菌的mTGase的晶体结构，但表2所示的结果表明，mTGase的N末端也参与mTGase与其底物，例如hGH，结合袋的构象变化。提高的选择性可能由于mTGase结合袋的挤压，从而导致在底物特定位点，例如hGH的Q141，的Gln残基更易于被mTGase催化而进行转谷氨酰胺反应。拉达链轮丝菌野生型GlyPro-mTGase的选择性进一步通过CE测定的转谷氨酰胺反应进行确定，然后基于上述结果，在拉达链轮丝菌的GlyPro-mTGase中产生进一步的突变。
由于没有观察到茂原链霉菌的不同N末端版本的mTGase的选择性有差异，因此以茂原链霉菌的AlaPro-mTGase为参照，通过由实施例3所述的筛选检测法计算的RS(相对选择性)来评估选择性的提高。
表2
具有不同N末端序列的拉达链轮丝菌mTGase变异体的选择性的比较。以茂原链霉菌的AlaPro-mTGase为参照。计算的选择性是将针对hGHQ141(以hGHQ40N为底物)的活性与针对hGH40(以hGHQ141为底物)的活性相比。
1RS：相对选择性，突变体的选择性对茂原链霉菌的野生型mTGase的选择性的比率。
实施例7
基于拉达链轮丝菌的GlyPro-mTGase通过位点定向诱变产生的mTGase
突变体
以野生型hGH为底物，1，3-二氨基丙醇为胺供体，通过GlyPro-mTGase进行转谷氨酰胺反应。通过CE评估相对于hGH的Q40，转谷氨酰胺作用对Q141的选择性。以茂原链霉菌的AlaPro-mTGase为参照，拉达链轮丝菌的GlyPro-mTGase为基准评估选择性的提高。结果列在表3中。每个突变体的CE图如图2B到图2H所示。
列在表3的结果表明包括Y75A、Y75F、Y75N、Y62H_Y75N和Y62H_Y75F在内的所有突变体均比GlyPro-mTGase-SL的选择性有所提高。最高的选择性突变体是GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F，当hGH转化率为49.2％时，选择性为36.2，比茂原链霉菌的AlaPro-mTGase高6.4倍。在38.1％的较低hGH转化率下进行进一步的测定，则选择性提高7.6倍。用GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F变异体进行重复的转谷氨酰胺反应，当突变体和参照mTGase的hGH转化率均约为40％时，该突变体的选择性比茂原链霉菌的AlaPro-mTGase的选择性提高7.6倍。
表3
mTGase变异体的选择性的比较
1来自CE图谱，野生型hGH、在Q141单取代的hGH和在Q40单取代的hGH的保留时间分别为6.5、7.9和10分钟。
2该实验单独进行，其中参照AlaPro-mTGase的选择性为10.1，hGH转化率为38.1。
拉达链轮丝菌的GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F的序列列如SEQ IDNo.4所示。
拉达链轮丝菌的前肽-(3C)-MTGase的肽序列列如SEQ ID No.5所示。
实施例8
检测拉达链轮丝菌和茂原链轮丝菌的mTGase对于hGH的Gln-141相对
于Gln-40的选择性
该检测法使用2个hGH突变体，每个突变体均在Gln-40和Gln-141位之一由天冬酰胺残基取代谷氨酰胺，只留下1个谷氨酰胺进行反应。如Kunkel TA et al.，Methods in Enzymology 154，367-382(1987)，和Chung Nan Chang et al.，Cell 55，189-196(1987)所述制备所述突变体。hGH中突变体Q40N是hGH的Gln-141的模式底物，Q141N是Gln-40的模式底物。
向含225mM1，3-二氨基-2-丙醇和35mM Tris的400μl缓冲液(通过加入浓缩的HCl将pH调整为8.0)加入600μl突变的hGH(1.5mg/ml)和5μl TGase(1.6mg/ml)，反应混合物在25℃温育30分钟。
用Mono Q 5/5GL 1ml(GE Health)柱通过FPLC进行随后的分析，并在280nm进行UV检测。缓冲液A：20mM三乙醇胺，pH 8.5；缓冲液B：20mM三乙醇胺，0.2M NaCl，pH 8.5；流速：0.8ml/min。洗脱梯度如下定义：
| 步骤 | 时间/分钟 | ％A | ％B |
| 1 | 2.00 | 100.0 | 0.0 |
| 2 | 4.00 | 70.0 | 30.0 |
| 3 | 5.00 | 70.0 | 30.0 |
| 4 | 35.00 | 50.0 | 50.0 |
然后从分配给两个产物Q141和Q40的曲线(如图3和4所示)下的两个面积(以绝对单位)的比率来计算选择性的比率。通过拉达链轮丝菌的TGase(SEQ ID No.1)和茂原链轮丝菌(SEQ ID No.2)的TGase得到的结果如表4所示。Q40N+其产物-Q141＝Q141N+其产物-Q40，归一化(normalized)到100。
表4
| 酶 | Q40N | 产物-Q141 | Q141N | 产物-Q40 | Gln 40对Gln 141的转谷氨酰胺作用 | Gln 40对Gln 141(归一化) |
| 来自茂原链轮丝菌的mTGase | 29 | 71 | 81 | 19 | 19:71 | 21:79 |
| 来自拉达链轮丝菌的mTGase | 23 | 77 | 90 | 10 | 10:77 | 11:89 |
实施例9
hGH的聚乙二醇化
a)将hGH溶解在磷酸缓冲液(50mM，pH 8.0)中。将该溶液与胺供体，例如溶解在磷酸缓冲液(50mM，1ml，pH 8.0，在溶解胺供体后将pH用稀释的盐酸调整为8.0)中的1，3-二氨基-丙-2-醇溶液混合。
最后加入溶解在磷酸缓冲液(50mM，pH 8.0，1ml)中的TGase溶液(～40U)，并通过加入磷酸缓冲液(50mM，pH 8)而将体积调整为10ml。将合并的混合物在37℃温育约4小时。将温度降低到室温，并加入N-乙基-马来酰亚胺(TGase抑制剂)至终浓度为1mM。在反应1小时后用10倍体积的tris缓冲液(50mM，pH 8.5)稀释混合物。
b)然后可选择地将从a)获得的转谷氨酰胺化的hGH进一步反应，以激活存在于胺供体中的潜在功能基团。
c)然后将从a)或b)获得的功能化hGH与能与引入hGH中的功能基团反应的、适当功能化的PEG进行反应。作为实施例，通过羰基部分(醛或酮)与烷氧基胺反应可形成肟键。
实施例10
hGH的聚乙二醇化
步骤a
将hGH溶解在三乙醇胺缓冲液(20mM，pH 8.5，40％ v/v乙二醇)中。将该溶液与胺供体，例如溶解在三乙醇胺缓冲液(20mM，pH 8.5，40％ v/v乙二醇，在溶解胺供体后将pH用稀释的盐酸调整为8.6)中的1，3-二氨基-丙-2-醇溶液混合。
最后加入溶解在pH 6.0的20mM PB中的来自茂原链轮丝菌的AlaPro-mTGase(AlaPro-mTGase-SM)或来自拉达链轮丝菌的GlyPro-mTGase Y62H_Y75F(GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL)溶液(～0.5-7mg/g hGH)，并将体积调整到5-15mg/ml hGH(20mM，pH8.5)。将合并的混合物在室温下温育1-25小时。通过CIE HPLC分析反应混合物，如表5和图5所示。TA 40是指在40位的转谷氨酰胺反应，TA 141是指在141位的转谷氨酰胺反应，TA 40/141是指在40和141位的转谷氨酰胺反应。
表5
| 反应时间(小时)/酶 | 剩余的hGH(面积％) | TA 40(面积％) | TA 141(面积％) | TA 40/141(面积％) |
| 1/AlaPro-mTGase-SM | 63.6 | 4.4 | 27.5 | 1.3 |
| 1/GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL | 63.0 | 1.7 | 32.0 | 0.3 |
| 22/AlaPro-mTGase-SM | 38.4 | 6.2 | 40.5 | 3.6 |
| 22/GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL | 48.3 | 3.5 | 37.5 | 0.6 |
| 25/GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL＊ | 9.9＊ | 2.5 | 65 | 3.7 |
*75％ hGH在起始物质中
步骤b
然后可选择地将从a)获得的转谷氨酰胺化的hGH进一步反应，以激活存在于胺供体中的潜在功能基团。
步骤c
然后将从a)或b)获得的功能化hGH与能与引入hGH中的功能基团反应的、适当功能化的PEG进行反应。作为实施例，通过羰基基团(醛或酮)与烷氧基基团反应可形成肟键。
实施例11
拉达链轮丝菌的TGase突变体的选择性
每个反应均在室温下，在20mM Tris-HCl，pH 7.4及含100μM单丹酰尸胺(通过将粉末溶解在醋酸中，并用1M Tris-HCl，pH 8.5缓冲平衡而制备)和50μM Q141N或Q40N人生长激素的200mMNaCl缓冲液中进行。将TGase加入到混合物中起始反应。在ext/em.340/520nm每隔30秒测定荧光。估测对Q40N和Q141N的初反应速率，并用于计算选择性。
本实验对几种拉达链轮丝菌GlyPro-TGase突变体的结果如表6所示。
表6
| 特定突变 | RSAQ141 | RSA Q40 | RS |
| GlyPro-S250A | 4,23 | 2,57 | 1,65 |
| GlyPro-S250C | 5,34 | 3,02 | 1,77 |
| GlyPro-S250D | 1,04 | 0,76 | 1,37 |
| GlyPro-S250F | 2,63 | 1,85 | 1,42 |
| GIyPro-S250G | 2,42 | 1,77 | 1,37 |
| GIyPro-S250H | 2,25 | 1,40 | 1,61 |
| GlyPro-S250L | 3,59 | 1,90 | 1,89 |
| GlyPro-S250M | 3,25 | 2,22 | 1,46 |
| GlyPro-S250P | 3,99 | 1,86 | 2,15 |
| GlyPro-S250Q | 1,92 | 1,62 | 1,18 |
| GIyPro-S250R | 0,83 | 0,59 | 1,41 |
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>具有提高的特异性的转谷氨酰胺酶变异体
<130>7608.504-WO
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>331
<212>PRT
<213>拉达链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)
<400>1
<210>2
<211>331
<212>PRT
<213>茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)
<400>2
<210>3
<211>380
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>在大肠杆菌中表达的来自拉达链轮丝菌的TGase
<400>3
<210>4
<211>333
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自拉达链轮丝菌的GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F
<400>4
<210>5
<211>388
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>来自拉达链轮丝菌的前肽-(3C)-MTGase
<400>5
Claims (28)
1.转谷氨酰胺酶肽，该肽对hGH的Gln141比其对hGH的Gln40具有更高特异性，该特异性高于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln141相对于具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln40的特异性。
2.如权利要求1所述的转谷氨酰胺酶肽，含有与SEQ ID No.1中氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的转谷氨酰胺酶肽，其中所述的氨基酸序列在对应于SEQ ID No.1中氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点上进行了修饰。
4.含有与SEQ ID No.1中氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列在SEQ ID No.1中氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点上进行了修饰。
5.如权利要求4所述的经分离的肽，其含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其中所述序列在对应于SEQ ID No.1中氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位点上进行了修饰。
6.如权利要求5所述的经分离的肽，其中对应于Tyr62位的氨基酸残基是Met、Asn、Thr或Leu。
7.如权利要求3-6中任一项所述的经分离的肽，其中对应于Tyr75位的氨基酸残基是Ala、Met、Leu或Cys。
8.如权利要求3-7任一项所述的经分离的肽，对应于Ser250位的氨基酸残基是Cys、Leu、Pro、Trp、Tyr或Val。
9.含有与SEQ ID No.1中氨基酸序列至少具有80％同一性的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到10个氨基酸残基而进行了修饰。
10.如权利要求9所述的经分离的肽，其含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其中所述序列通过在N末端增加1到10个氨基酸残基而进行了修饰。
11.含有与SEQ ID No.2中氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加1到10个氨基酸残基而进行了修饰。
12.如权利要求11所述的经分离的肽，其含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其中所述序列通过在N末端增加1到10个氨基酸残基而进行了修饰。
13.如权利要求9-12任一项所述的经分离的肽，其中所述序列通过在N末端增加2个氨基酸残基而进行了修饰。
14.如权利要求4-13任一项所述的经分离的肽，该肽对hGH的Gln141比其对hGH的Gln40具有更高特异性，这种特异性高于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln141相对于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的肽对hGH的Gln40的特异性。
15.含有SEQ ID No.1的序列的经分离的肽。
16.具有SEQ ID No.1的序列的经分离的肽。
17.编码如权利要求1-16任一项所述的肽的核酸构建体。
18.包含权利要求17的核酸构建体的载体。
19.包含权利要求18的载体的宿主细胞。
20.包含如权利要求1-16任一项所述的肽的组合物。
21.结合肽的方法，所述方法包括：将所述肽与胺供体在如权利要求1-16任一项所述的肽存在下进行反应。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述生长激素是hGH或其变异体或其衍生物。
23.如权利要求22所述的结合生长激素的方法，其中，在对应于hGH的Gln-141位结合的生长激素的量相对对应于hGH的Gln-40位结合的hGH的量，显著高于当用如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列代替如权利要求1-16任一项中的肽时，在对应于hGH的Gln-141位结合的hGH的量相对在hGH的Gln-40位结合的hGH的量。
24.制备在对应于141位的位置结合的hGH的方法，其中所述方法包括将所述hGH与胺供体在存在如权利要求1-16任一项所述的肽的情况下进行反应。
25.制备结合的生长激素的药物组合物的方法，该方法包括将所述hGH或其变异体或其衍生物与胺供体在如权利要求1-16任一项所述的肽存在的情况下进行反应的步骤。
26.制备聚乙二醇化的生长激素的药物组合物的方法，该方法包括将所述hGH或其变异体或其衍生物与胺供体在如权利要求1-16任一项所述的肽存在的情况下进行反应的步骤，并用得到的结合的生长激素的肽制备聚乙二醇化的生长激素，其中所述的聚乙二醇化发生在上述结合的位点。
27.如权利要求1-16任一项所述的肽在制备结合的生长激素中的用途。
28.治疗与患者缺乏生长激素相关的疾病或症状的方法，该方法包括给予所需患者通过如权利要求25或权利要求26所述的方法制备的药物制品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C04 | Withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Open date: 20090812 |