ITPD20100155A1 - Metodo per la preparazione di coniugati mediante transglutaminasi - Google Patents

Metodo per la preparazione di coniugati mediante transglutaminasi Download PDF

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Gianfranco Pasut
Francesco M Veronese
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Description

TITOLO: "METODO PER LA PREPARAZIONE DI CONIUGATI MEDIANTE
TRANSGLUTAMINASI"
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda la preparazione di nuovi coniugati di proteine o peptidi con polimeri o altre molecole contenenti un gruppo amminico mediante catalisi enzimatica operata in condizioni tali da aumentare la specificità dell'enzima transglutaminasi (TGasi).
FONDAMENTI DELL'INVENZIONE
L'uso di enzimi per mediare il legame covalente tra due molecole presenta il vantaggio di una elevata specificità del sito di coniugazione portando in genere alla formazione di coniugati chimicamente più definiti di quanto non avvenga con altri metodi chimici.
Le transglutaminasi (TGasi) [EC2.3.2.13; proteinglutamine :gamma-glutamyltransferase] è una famiglia di proteine che catalizza l'addizione di un residuo acilico ad un'ammina primaria, dove il gruppo gamma-carbossamide di una glutammina di una sequenza peptidica è il gruppo acil donatore e un'ammina primaria è il gruppo acil accettore e amino donatore. Questo enzima, presente sia in procarioti che eucarioti, in natura genera soprattutto legami di "crosslinking" tra proteine catalizzando la formazione di ammidi tra lisine (amino donatore) e glutammine (acil donatore). Un tipico esempio è il "cross-linking" della fibrina mediato dalla TGasi fattore XlIIa. TGasi si trovano, ad esempio, nei mammiferi in organi quali il fegato, la pelle e i fluidi extracellulari [Greenberg C, S, et al. FASEB J. (1991) 5:3071-3077] come nei procarioti [Washizu K, et al. Biosci. Biotech. Biochem. (1994) 58:82-87].
È stato dimostrato da diversi autori che la TGasi è in grado di riconoscere, oltre al residuo di lisina, varie altre molecole con gruppi amminici primari quali substrati amino donatori. L'enzima è stato pertanto usato per modificare con polimeri in modo sito-specifico i residui di glutammine di alcune proteine [US6010871; US6331422; US6322996]. Ad esempio, Sato ha ottenuto coniugati di polietilen glicole (PEG) con interleuchina-2 , usando PEG terminanti con un'ammina primaria [Sato H. Adv. Drug Delivery Rev. (2002) 54:487-504].
L'articolo mette ben in evidenza che la TGasi ha dei requisiti molto restrittivi per il substrato acil donatore, i.e. riconosce solo alcune glutammine inserite in determinate sequenze amminoacidiche, mentre l'enzima è meno stringente per quanto riguarda il substrato amino donatore. Successivamente, Fontana in uno studio dettagliato su diverse proteine ha dimostrato che la selettività della TGasi verso alcune glutammine fra le molte presenti in una proteina è direttamente legata alla flessibilità della sequenza peptidica in cui sono contenute [Fontana A, et al. Adv. Drug Delivery Rev. (2008) 60:13-28]. In questo studio si conclude che le glutammine, per essere substrato della TGasi, devono essere inserite in sequenze dotate di alta flessibilità
conformazionale come evidenziabile dagli elevati valori di B-factor riscontrabili in tali sequenze. Lo studio evidenzia inoltre una correlazione tra i siti di transglutaminazione ed i siti di proteolisi limitata con enzimi quali tripsina e chimotripsina, in quanto solo siti presenti in regioni flessibili possono essere attaccati da proteasi. Da questo studio risulta quindi che la flessibilità della sequenza amminoacidica contenente la glutammina è precondizione per l'attacco da parte di TGasi.
È da sottolineare che non viene descritta la possibilità di modificare in modo reversibile la flessibilità della sequenza peptidica dei substrati acil donatori al fine di variare l'affinità della TGasi verso un determinato substrato.
Sarebbe invece molto desiderabile disporre di un modo per selezionare selettivamente o preferibilmente un sito di coniugazione rispetto ad un altro in una proteina o peptide contenenti più glutammine quali substrati acil donatori. In quanto, come riportato in letteratura, molte proteine anche di interesse terapeutico posseggono più di una glutammina con i requisiti necessari per essere substrato naturale dell'enzima (e.g. ormone della crescita, calcitonina, glucagone, catena A dell'insulina) [Fontana A, et al. Adv. Drug Delivery Rev.
(2008) 60:13-28; Gorman JJ, et al. J Biol. Chem. (1980) 255:1175-1180; FOLK JE, et al. J Biol. Chem. 1965
240:2951-2960]. Questo fatto impedisce per queste proteine l'ottenimento di soli prodotti monoconiugati mediante l'impiego di TGasi per la coniugazione con polimeri, ad esempio PEG-NH2.
L'impiego di questo enzima per ottenere coniugati di PEG con proteine o peptidi è stato descritto in brevetti ed articoli ma in ogni caso la reazione di coniugazione enzimatica viene condotta in veicoli acquosi al fine di preservare l'attività biologica e la specificità dell'enzima [US6010871; US6331422; US6322996; ITMI20061624 ; Sergi M, et al. In: PEGylated protein drugs : basic Science and clinical applications. Veronese FM (ed) Birkhauser: Berlin (G). (2009):75-88; Fontana A, et al. Adv. Drug Delivery Rev. (2008) 60:13-28]. È evidente che questo approccio può portare a monoconiugati PEG-proteina, prodotti molto desiderati perché più facili da purificare e caratterizzare, solo nei casi in cui la proteina in studio possieda una sola glutammina che risponda ai requisiti di substrato per la TGasi. Nel caso di proteine o peptidi contenenti più substrati acil donatori si ottengono miscele di mono e biconiugati dalle quali si ottiene il derivato desiderato mediante purificazioni mirate. Ad esempio, nell'intento di ottenere monoconiugati, in un brevetto è riportato un metodo che lega mediante TGasi all'ormone della crescita umano una piccola molecola bifunzionale, portante una specifica reattività per una successiva modifica. Tale metodo porta alla formazione di vari isomeri e il coniugato desiderato è stato isolato dagli altri isomeri ottenuti mediante purificazione con cromatografia di scambio ionico e quindi coniugato con un PEG avente una reattività specifica verso la molecola precedentemente legata [WO2006/134148]. In questo esempio si nota la necessità di sottoporre a ripetuti processi di purificazione gli intermedi e il prodotto finale al fine di ottenere il monoconiugato desiderato.
Per superare questi limiti ed estendere la monoconiugazione mediante TGasi anche ad altre proteine e peptidi sarebbe molto utile disporre di un metodo per ridurre il numero delle glutammine, presenti nella molecola da modificare, che possono rispondere ai requisiti di substrato della TGasi. Per ottenere ciò alcuni autori sono ricorsi alla preparazione di mutanti della proteina in cui siano presenti meno glutammine [US6322996; W02004/108667] od alternativamente a mutanti della TGasi stessa dotati di differente specificità di substrato [Zhao X, et al. J Biomol. Screening. (2010) 15:206-212]. In entrambi i casi questo richiede di sviluppare caso per caso il mutante desiderato, incidendo negativamente sull'aspetto economico della procedura di coniugazione enzimatica. Inoltre nel primo caso si potrebbero creare mutanti della proteina terapeutica che potrebbero scatenare reazioni immunitarie e nel secondo caso, in cui si usino mutanti della TGasi, si otterrebbero enzimi con la specificità desiderata solo per una determinata proteina perdendo quindi la generalità del metodo di coniugazione.
Gli studi presentati qui sopra mostrano come nel campo della bioconiugazione di polimeri di peptidi e proteine terapeutiche, la ricerca scientifica miri sempre più all'ottenimento di monoconiugati selettivi in cui il polimero sia legato in modo univoco e ripetibile ad un solo e determinato residuo aminoacidico nella sequenza peptidica [Harris MJ, et al. Nat. Rev. Drug Discov. (2003) 2:214-221; Pasut G., et al. Drug Discov Today (2005) 10:1451-1458], allo scopo di ottenere derivati più facilmente purificabili, caratterizzabili, con definite proprietà biologiche e più idonei all'uso clinico.
Dalle considerazioni sopra descritte si evince che un metodo di coniugazione enzimatica mediante TGasi per legare un polimero o altre molecole ad una proteina o un peptide, anche in quei casi in cui siano presenti più di una glutammina come substrato naturale, possa essere visto come una innovazione che completa le potenzialità della coniugazione enzimatica.
È oggetto della presente invenzione la descrizione di un metodo per aumentare la selettività della TGasi, che permette di ottenere in un singolo step, dei prodotti a basso grado di coniugazione, preferibilmente dei monoconiugati in cui la funzionalizzazione è a livello di un sito glutamminico anche nel caso di proteine o peptidi che in condizioni acquose di catalisi mediante TGasi formano isomeri posizionali e/o biconiugati .
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE
La TGasi è un enzima molto selettivo con stringenti requisiti di sequenza nei confronti dei residui di glutammine come substrato acil donatore. Esistono però diverse proteine e peptidi che presentano in condizioni acquose di catalisi per la TGasi più di una glutammina quale substrato dell'enzima. Allo scopo di ridurre nella sequenza peptidica di proteine o peptidi il numero di glutammine substrato della transglutaminasi (TGasi) , abbiamo scoperto che la presenza di opportuni solventi organici miscibili con l'acqua, nelle miscele di coniugazione enzimatica, può permettere l'ottenimento di un solo prodotto di coniugazione (monoconiugato) a livello di un solo specifico residuo glutamminico, anche per quelle proteine che contenendo più di un residuo glutamminico, nelle condizioni standard di catalisi mediante TGasi formano miscele di monoconiugati, biconiugati o policoniugati.
In questo brevetto viene rivelato come l'aggiunta di opportune concentrazioni di uno o più solventi organici miscibili con l'acqua nel tampone di coniugazione sia in grado di ridurre il numero di glutammine substrato della TGasi fino al solo numero di una per catena polipetidica, portando alla formazione di prodott con un basso grado di coniugazione, preferibilmente monoconiugati, di queste proteine con polimeri o altre molecole funzionali.
Sulla base dei risultati ottenuti il presente brevetto rivendica un metodo di coniugazione comprendente una reazione di transglutaminazione catalizzata da una transglutaminasi (TGasi) tra una proteina o un peptide contenenti due o più residui glutaminici quale substrato acil donatore ed una molecola contente almeno un gruppo amminico come substrato amino donatore, tale metodo caratterizzato dall'uso di almeno un solvente organico miscibile con l'acqua come cosolvente nella soluzione acquosa di reazione per aumentare la selettività di reazione e ridurre il numero di prodotti di coniugazione.
In altre parole, il brevetto rivendica un metodo per aumentare la selettività di una reazione di coniugazione, comprendente una reazione di transglutaminazione catalizzata da una transglutaminasi (TGasi) tra una proteina o un peptide contenenti due o più residui glutaminici quale substrato acil donatore ed una molecola contente almeno un gruppo amminico come substrato amino donatore, tale metodo caratterizzato dall'uso di almeno un solvente organico miscibile con l'acqua come cosolvente nella soluzione acquosa di reazione per aumentare la selettività di reazione e ridurre il numero di prodotti di coniugazione.
Il brevetto riporta anche un metodo per la preparazione in un solo step di coniugazione mediante TGasi degli specifici prodotti monoconiugati PEG-(Q20)calcitonina e di PEG-(Q141) hGH. Questi esempi mostrano come con il metodo rivendicato si ottenga solo un isomero quale prodotto di monoconiugazione diversamente da quanto avviene conducendo la medesima reazione di catalisi in un tampone privo di cosolventi.
Prodotti ottenuti con il metodo dell'invenzione, composizioni farmaceutiche che li comprendono ed il loro uso in terapia vengono anche descritti.
DESCRIZIONE
La presente invenzione fornisce un nuovo metodo per ottenere coniugati con TGasi, ad in particolare per ottenere monoconiugati, tali quali i mono coniugati PEG-(Q20) calcitonina e PEG-(Q141)hGH.
Il metodo rivelato in questa invenzione permette di ridurre il numero dei coniugati che si ottengono nelle usuali condizioni acquose (p.es. soluzione tamponata a pH vicino alla neutralità) tra molecole contenenti un gruppo amminico, quale substrato amino donatore, e proteine o peptidi aventi nella sequenza aminoacidica più di una glutammina substrato acil donatore. In particolare il nuovo metodo permette di aumentare la selettività della coniugazione mediante TGasi verso le glutammine e di ridurre o eliminare la possibilità di generare isomeri allo scopo di ottenere preferibilmente coniugati ad un solo sito (monoconiugati).
Sulla base di queste premesse il brevetto rivendica un metodo di coniugazione comprendente una reazione di transglutaminazione catalizzata da una transglutaminasi (TGasi) tra una proteina o un peptide contenenti due o più residui glutamminici quale substrato acil donatore ed una molecola contentente almeno un gruppo amminico come substrato amino donatore. Tale metodo è caratterizzato dall'uso di almeno un solvente organico miscibile con l'acqua come cosolvente nella soluzione acquosa di reazione che aumenta la selettività di reazione e riduce il numero di prodotti di coniugazione.
In altre parole, il brevetto rivendica un metodo per aumentare la selettività di una reazione di coniugazione, comprendente una reazione di transglutaminazione catalizzata da una transglutaminasi (TGasi) tra una proteina o un peptide contenenti due o più residui glutaminici quale substrato acil donatore ed una molècola contente almeno un gruppo amminico come substrato amino donatore, tale metodo caratterizzato dall'uso di almeno un solvente organico miscibile con l'acqua come cosolvente nella soluzione acquosa di reazione per aumentare la selettività di reazione e ridurre il numero di prodotti di coniugazione.
Il brevetto riporta anche un metodo per la preparazione in un solo step di coniugazione mediante TGasi degli specifici prodotti monoconiugati PEG-(Q20)calcitonina e di PEG-(Q141) hGH. Questi esempi mostrano come con il metodo rivendicato si ottenga solo un isomero quale prodotto di monoconiugazione diversamente da quanto avviene conducendo la medesima reazione di catalisi in un tampone privo di cosolventi.
Prodotti ottenuti con il metodo dell'invenzione, composizioni farmaceutiche che li comprendono ed il loro uso in terapia vengono anche descritti.
La reazione di transglutaminazione condotta nelle condizioni del presente metodo è particolarmente vantaggiosa in quanto permette anche di aumentare la resa di prodotti a basso grado di funzionalizzazione, in particolar modo di prodotti monofunzionalizzati .
La reazione di transglutaminazione secondo il metodo della presente invenzione è condotta in una soluzione acquosa, preferibilmente tamponata, in presenza di almeno un solvente organico, miscibile con l'acqua, in opportune concentrazioni, in modo tale che l'attività catalitica dell'enzima sia ancora presente e che la specificità dell'enzima venga modificata rispetto alle condizioni di soluzione acquosa del tampone di catalisi in cui usualmente lavorano le TGasi. La modifica della specificità della TGasi in seguito ad aggiunta del solvente organico nel tampone di catalisi può essere dovuta ad un'azione diretta del cosolvente sull'enzima, sui substrati o dalla combinazione di entrambe che causano un cambiamento nel processo di riconoscimento da parte dell'enzima dei siti di coniugazione a livello del substrato proteico.
Nel metodo rivelato in questo brevetto il substrato acil donatore e il substrato amino donatore vengono solubilizzati in una soluzione acquosa preferibilmente tamponata (ad esempio con un tampone fosfato 0,1 M pH 7) contenente tra il 5% al 80% (v/v) di uno o più solventi organici miscibili con l'acqua. A questa soluzione viene aggiunta una aliquota di TGasi preventivamente solubilizzata in una soluzione acquosa preferibilmente tamponata (ad esempio con un tampone fosfato 0,1 M pH 7). La reazione viene lasciata reagire per un tempo sufficiente ad ottenere il prodotto di coniugazione.
I solventi sono, preferibilmente ma non esclusivamente, etanolo, metanolo e DMSO.
La percentuale di solvente organico può variare in funzione del substrato acil donatore ma sempre tale da mantenere l'attività dell'enzima.
Per esempio, nel metodo dell'invenzione almeno un cosolvente organico è presente in una quantità dal 5% e l'80% (v/v), più preferibilmente tra il 20% ed il 70% (v/v), ancora più preferibilmente tra il 30% e il 65% (v/v), ed ancora più preferibilmente tra il 40% e il 60% (v/v).
In una forma preferita dell'invenzione, almeno un cosolvente organico è etanolo, metanolo o DMSO, e tale cosolvente è preferibilmente presente nella miscela di catalisi in una quantità tra il 5% e 180% (v/v), più preferibilmente tra il 30% e il 70% (v/v) ancora più preferibilmente tra il 50% e il 65% (v/v) ed ancora più preferibilmente è del 50% (v/v) nel caso dell'etanolo e del 60% (v/v) nel caso del metanolo, ed è preferibilmente in una quantità tra il 10% e il 40% (v/v) e più preferibilmente tra il 25% e il 35% (v/v) e ancora più preferibilmente è del 30% nel caso del DMSO.
Il substrato acil donatore è una proteina o un peptide contenente due o più siti glutamminici potenziali substrati della transglutaminase . In alcuni casi più preferiti il substrato acil donatore è calcitonina o l'ormone della crescita (hGH) o un anticorpo.
Preferibilmente la calcitonina ha la sequenza SEQ ID NOI e l'ormone della crescita la sequenza SEQ ID N02, oppure sono mutanti di tali sequenze contenenti almeno l'80%, preferibilmente il 90%, più preferibilmente il 95% e ancora più preferibilmente il 98% delle sequenze riportate rispettivamente in SEQ ID NOI e SEQ ID N02.
La molecola contenente un gruppo amminico, che agisce come substrato amino donatore, possiede almeno un gruppo amminico substrato della TGasi, quale una ammina primaria, o contiene un gruppo che può essere modificato per inserire nella struttura chimica un gruppo amminico substrato della TGasi, ed è una molecola selezionata tra: un polimero sintetico o naturale preferibilmente idrofilo e solubile in acqua, un agente diagnostico quale un chelato di un radioisotopo o una molecola fluorescente, un oligonucleotide quale un oligonucleotide antisenso un aptamero o un siRNA, una proteina o un peptide, un farmaco, una tossina, una molecola eterobifuzionale .
Preferibilmente, la molecola contenente un gruppo amminico che agisce come substrato amino donatore è un polimero avente preferibilmente un peso molecolare (MW) medio tra i 200 Da e i 300000 Da, determinato secondo i metodi noti in letteratura (Leslie Howard Sperling. Introduction to physical polymer Science. John Wiley and Sons, 2006), più preferibilmente tra 3000-100000 Da, ancora più preferibilmente tra 5000-80000 Da, e ancora più preferibilmente tra 10000-40000 Da.
In forme preferite dell'invenzione la molecola contenente un gruppo amminico che agisce come substrato amino donatore è un polimero selezionato tra quelli del seguente gruppo: poli (etilenglicole) (PEG) di struttura lineare o ramificata (branched), preferibilmente monofunzionale, avente preferibilmente un peso molecolare (MW) medio tra i 2000 Da e i 40000 Da, più preferibilmente tra i 2000 Da e i 30000 Da e ancora più preferibilmente tra 5000 Da e 20000 Da.
I poli(etilenglicoli) maggiormente preferiti sono mPEG-NH2 10000 Da, mPEG-NH220000 Da, mPEG-NH240000 Da, mPEG-NH2branched 10000 Da, mPEG-NH2branched 20000 Da e mPEG-NH2branched 40000 Da. Altri polimeri sono polivinilpirrolidone; poliacriloilmorf olina; N-idrossi-etil metacrilammide copolimero; poli(2-etil-ossazolina) ; acido poliglutammico; acido ialuronico/; acido polisialico; e copolimeri di PEG-poliaminoacidi .
Esempi di possibili TGasi includono, preferibilmente ma non esclusivamente, TGasi microbiche come quelle da Streptomyces mobaraense, da Streptomyces cinnamoneum e da Streptomyces griseocarneum (US 5,156,956, qui incluso come riferimento bibliografico), da Streptomyces lavendulae (US 5,252,469, qui incluso come riferimento bibliografico), e da Streptomyces ladakanum (JP2003199569, qui incluso come riferimento bibliografico) . Si fa notare che membri del vecchio genere Streptovertìcìllìum sono ora inclusi nel genere Streptomyces (Kaempfer, J. Gen. Microbiol. 137, 1831-1892 (1991)). Altre TGasi adatte sono da Bacillus subtilis (US 5,731,183, qui incluso come riferimento bibliografico) e da vari Myxomycetes. Altri esempi di TGse adatte sono quelle descritte in WO96/06931 e W096/22366, entrambi qui inclusi come riferimento bibliografico. Esempi di adatte TGasi non-microbiche includono, preferibilmente ma non esclusivamente, TGasi da fegato di cavia, varie TGasi di origine marina (EP-0555649, qui incluso come riferimento bibliografico), e TGasi da ostrica giapponese Crassostrea gigas (US 5,736,356, qui incluso come riferimento bibliografico) . Inoltre, TGasi adatte possono essere eventuali mutanti con specificità alterata rispetto all'enzima nativo come ad esempio quelli inclusi in W02008020075, qui incluso come riferimento bibliografico.
Preferibilmente, l'enzima viene aggiunto alla miscela di reazione fino a raggiungere un rapporto enzima / substrato acil donatore compreso tra 1:1 e 1:100 (p/p), o comunque tale da avere una attività enzimatica rilevabile.
In un caso preferito il substrato acil donatore è il polipeptide calcitonina,· il substrato amino donatore è mPEG-NH2 (10 kDa, 20 kDa o 40 kDa), la TGasi è microbica da Streptomyces mobaraense, e il tampone di catalisi è fosfato 0,1 M pH 7 addizionato di etanolo (50% v/v). In questo caso si ottiene dalla miscela di reazione solo il derivato mPEGlOkDa-(Q20)calcitonina, mPEG20kDa-(Q20)calcitonina o mPEG40kDa-(Q20) calcitonina a seconda del peso molecolare del PEG.
In un altro caso preferito il substrato acil donatore è la proteina hGH, il substrato amino donatore è mPEG-NH2 (5 kDa, 20 kDa o 40 kDa), la TGasi è microbica da Streptomyces mobaraense, e il tampone di catalisi è composto da fosfato 0,1 M pH 7 addizionato di etanolo (50% v/v). In questo caso si ottiene dalla miscela di reazione solo il derivato mPEG5kDa-(Q141)hGH, mPEG20kDa- (Q141)hGH o mPEG40kDa-(Q141)hGH a seconda del peso molecolare di PEG.
In un altro caso preferito il substrato acil donatore è il polipeptide calcitonina, il substrato amino donatore è mPEG-NH2(5 kDa, 20 kDa o 40 kDa), la TGasi è microbica da Streptomyces mobaraense, e il tampone di catalisi è fosfato 0,1 M pH 7 addizionato di DMSO (30% v/v). In questo caso si ottiene dalla miscela di reazione solo il derivato mPEG5kDa-(Q20) calcitonina, mPEG20kDa- (Q20)calcitonina o mPEG40kDa- (Q20) calcitonina a seconda del peso molecolare del PEG.
Oggetto del presente brevetto è anche un monoconiugato, preferibilmente un monoconiugato di un polimero, che preferibilmente è il PEG e una proteina o un peptide contenenti due o più residui glutamminici, che preferibilmente sono calcitonina o hGH. Tali coniugati sono ottenibili utilizzando il metodo della presente invenzione.
I coniugati oggetto della presente invenzione sono quelle molecole a basso grado di funzionalizzazione, preferibilmente monoconiugati ad uno specifico residuo glutamminico, ottenibili mediante il metodo rivendicato, partendo da una proteina o un peptide contenete due o più residui glutamminici come potenziali substrati acil donatori. In altre parole i coniugati, preferibilmente monoconiugati dell'invenzione sono quelle molecole ottenute usando peptidi o proteine che funzionalizzate mediante transglutaminazione con TGasi in assenza di solvente porterebbero alla formazione di coniugati a più alto grado di derivatizzazione e/o eterogeneità. Esempi di proteine o peptidi contenenti due o più residui glutamminici come potenziali substrati acil donatori per la TGasi sono, calcitonina, hGH, glucagone, alfa-sinucleina, beta-caseina, fibronectina, fibrinogeno catena alfa, ormone stimolante il rilascio dell'ormone della crescita (GRF), anticorpi e frammenti di anticorpi.
Prodotti preferiti ottenibili con la presente invenzione sono coniugati, preferibilmente monoconiugati, di una delle proteine o uno dei peptidi sopra riportati con un polimero quale il PEG-NH2, prodotti ancora più preferiti della presente invenzione sono i seguenti monoconiugati: mPEG-(Q20) calcitonina, dove il peso molecolare (MW) del PEG è 10000 Da, o 20000 Da o 40000 Da, e mPEG-(Q141)hGH, dove il peso molecolare (MW) del PEG è 5000 Da o 20000 Da o 40000 Da. In queste formule i simboli Q20 e Q141 rappresentano rispettivamente i residui della glutammina nelle rispettive sequenze peptidiche SEQ ID NOI and SEQ ID N02, in cui è avvenuta la coniugazione.
Oggetto dell'invenzione è anche una preparazione farmaceutica o diagnostica comprendente almeno un monoconiugato ottenibile mediante il metodo della presente invenzione, la preparazione comprendente eventualmente anche un ulteriore agente terapeuticamente attivo o diagnostico, e opzionalmente anche un eccipiente farmaceuticamente accettabile. Tale preparazione farmaceutica può essere per uso orale, parenterale, rettale, topico, vaginale, oftalmico o inalatorio.
Infine, oggetto dell'invenzione è anche un metodo di trattamento o un metodo di diagnosi comprendente la somministrazione di una formulazione farmaceutica come definita qui sopra.
Breve descrizione delle Figure
Fig 1 mostra i profili cromatografici di sCT, della miscela di reazione PEG5kDa-sCT in presenza ed in assenza di cosolventi. In presenza di cosolventi si forma un derivato monoconiugato, mentre si ottiene una miscela di mono e biconiugati in assenza di solventi organici. La separazione è stata effettuata utilizzando una colonna reversed phase Agilent C18 (4.6 x 250 mm) al flusso di 1 mL/min con un gradiente lineare in acetonitrile (10-70%) per un periodo di 25 min. L'effluente dalla colonna è stato monitorato misurando l'assorbanza a 226 nm .
Fig. 2 è un'analisi ESI-TOF di PEG-sCT ottenuta in presenza di cosolventi. Le analisi sono state condotte utilizzando uno strumento API-TOF Mariner™ (Applied Biosystems).
Fig. 3 è una sovrapposizione dei profili cromatografici di hGH e della miscela di reazione PEG5kDa-hGH in assenza di cosolventi. Una miscela di mono e biconiugati si forma dopo 18 ore a temperatura ambiente. La separazione è stata effettuata utilizzando una colonna gel filtrazione Agilent GF-250 (4,6 x 250 mm) al flusso di 0,3 mL/min in 0,1 M tampone fosfato, 0,2 M NaCl contenente il 20% di acetonitrile. L'effluente dalla colonna è stato monitorato misurando l'assorbanza a 280 nm.
Fig. 4 è una comparazione dei profili cromatografici di hGH, della miscela di reazione PEG5kDa-hGH e PEG540-hGH in presenza di cosolventi. La separazione è stata effettuata utilizzando una colonna reversed phase Agilent C18 (4,6 x 250 mm) al flusso di 1 mL/min con un gradiente lineare in acetonitrile (40-70%) per un periodo di 25 min. L'effluente dalla colonna è stato monitorato misurando l'assorbanza a 280 nm.
Fig 5 Analisi ESI-TOF di PEG-hGH ottenuto in presenza di cosolventi.
Fig 6 riporta i profili cromatografici di sCT e della miscela di reazione POZ5kDa-sCT in presenza di DMSO. In tali condizioni si forma un derivato monoconiugato. La separazione è stata effettuata nelle stesse condizioni riportate in figura 3.
Fig 7 mostra l'eluizione dei frammenti ottenuti dopo digestione triptica di sCT e PEG540Da-sCT. La separazione è stata effettuata nelle stesse condizioni riportate in figura 3.
Fig 8 mostra lo spettro di massa del digerito PEG-hGH. In particolare è riportata la regione di massa compresa tra 560-700 Da per mostrare la derivatizzazione con il PEG del frammento Glnl41-Lysl45 . Il segnale a 583,82Da m/z corrisponde al frammento doppia carica Glnl41-Lysl45 coniugato a PEG.
Fig 9 mostra lo spettro far-UV CD e lo spettro di fluorescenza di sCT con e senza cosolventi: Gli spettri sono stati registrati alla concentrazione di proteina di 0,1 mg/mL in 10 mM tampone fosfato pH 7.
Fig 10 mostra lo spettro far-UV CD e lo spettro di fluorescenza di hGH con e senza cosolventi. Gli spettri sono stati registrati alla concentrazione di proteina di 0,1 mg/mL in 10 mM tampone fosfato pH 7.
Fig 11 mostra il grafico dell'effetto ipocalcemizzante di sCT e dei derivati PEG-sCT in ratti Sprangue-Dawley.
ESEMPI
Esempio 1: Preparazione di PEG-calcitonina mediante TGasi in tampone di catalisi acquoso
Ad una soluzione di calcitonina di salmone (sCT) (1 mg/mL) in 0,1 M tampone fosfato pH 7 si aggiunge mPEG-NH2(5 kDa) in eccesso molare di 10 volte. Dopo dissoluzione completa del polimero, si aggiunge TGasi da Streptomyces mobaraense in quantità catalitiche (rapporto E/S, 1:50). La reazione viene lasciata in agitazione per 3 ore a temperatura ambiente e monitorata mediante RP-HPLC. Il profilo cromatografico riportato in figura 1 conferma la modifica della sCT mediata da TGasi e la comparsa di mono e biconiugati che indicano la coniugazione di PEG alle due glutammine presenti: Glnl4 ed Gln20 .
Esempio 2: Preparazione di PEG-calcitonina mediante TGasi in tampone di catalisi contenente DMSO usando PEG al alto peso molecolare
mPEG-NH2 (5 kDa) viene incubato con sCT in 0,1 M tampone fosfato pH 7 addizionato del 30% (v/v) di DMSO. Una soluzione di TGasi da Streptomyces mobaraense viene aggiunta in rapporto E/S di 1:15 e la reazione viene lasciata procedere per 3 ore a temperatura ambiente. L'analisi della miscela di reazione mediante RP-HPLC conferma la formazione di un nuovo coniugato (Figura 1). Il picco raccolto dalla RP-HPLC e caratterizzato mediante spettrometria di massa MALDI, è risultato essere un monoconiugato .
Esempio 3: Preparazione di PEG-calcitonina mediante TGasi in tampone di catalisi contente DMSO usando PEG monodisperso La coniugazione di PEG a calcitonina è stata condotta usando le condizioni descritte nell'esempio 2 eccetto che in questo caso è stato usato boc-PEG-NH2 (556 Da) come substrato amino donatore. Tale PEG è stato scelto perché è facilmente rilevabile mediante spettrometria di massa ESI-TOF.
In queste condizioni l'analisi RP-HPLC della miscela di reazione sovrapposta all'analisi della sCT di partenza mostra la formazione di un nuovo prodotto. Questo prodotto, separato in RP-HPLC e analizzato mediante massa, conferma la presenza di un derivato a PM di 3972,72 Da, che corrisponde alla sCT (3430,7 Da) legata ad una catena di polimero (Figura 2).
Esempio 4: Preparazione di PEG-calcitonina mediante TGasi in tampone di catalisi contenente etanolo
La coniugazione di PEG a calcitonina è stata condotta usando le condizioni descritte nell'esempio 3, ma utilizzando un diverso cosolvente, nello specifico etanolo (50% v/v). In queste condizioni si ottiene un coniugato che mediante analisi in MS-MALDI risulta essere un monoconiugato.
Esempio 5: Preparazione di PEG-hGH mediante TGasi in tampone di catalisi acquoso
Ad una soluzione di hGH (1 mg/mL) in 0,1 M tampone fosfato pH 7 si aggiunge mPEG-NH25 kDa in eccesso molare di 10 volte. Dopo dissoluzione completa del polimero, si aggiunge l'enzima TGasi da Streptomyces mobaraense in quantità catalitiche (rapporto E/S, 1:50). La reazione viene lasciata in agitazione per 4 ore a temperatura ambiente e monitorata mediante cromatografia SEC-HPLC. Il profilo cromatografico, riportato in figura 3, conferma l'avvenuta coniugazione mediata da TGasi con la comparsa di prodotti mono e biPEGhilati.
Esempio 6: Preparazione di PEG-hGH mediante TGasi in tampone di catalisi contente etanolo o metanolo con PEG ad alto peso molecolare
Ad una soluzione di hGH (1 mg/mL) in 0,1 M tampone fosfato pH 7 addizionato di etanolo (50 v/v) o metanolo (60% v/v) viene aggiunto mPEG-NH2(5 kDa) in eccesso molare di 100 volte. Una soluzione di TGasi da Streptomyces mobaraense viene aggiunta in rapporto E/S di 1:5 e la reazione viene lasciata procedere per 18 ore a temperatura ambiente. L'analisi cromatografica in RP-HPLC mostra la formazione di un solo derivato (In figura 4 è riportato il profilo cromatografico della miscela di reazione in presenza di etanolo). Tale prodotto, purificato ed analizzato in gel filtrazione, eluisce al tempo di ritenzione di hGH monoconiugato, confermando la presenza di una sola catena di PEG legata alla proteina.
Esempio 7: Preparazione di PEG-hGH mediante TGasi in tampone di catalisi contente etanolo o metanolo con PEG monodisperso La coniugazione di PEG a hGH è stata condotta usando le condizioni descritte nell'esempio 6 eccetto che il substrato amino donatore è in questo caso boc-PEG-NH2 monodisperso (556 Da) .
In queste condizioni l'analisi cromatografica in RP-HPLC della miscela di reazione mostra la formazione di un nuovo prodotto (Figura 4) che, analizzato mediante massa ESI-TOF, da un peso molecolare di 22665,6 Da che corrisponde ad hGH (22126 Da) legato ad una catena di PEG (Figura 5).
Esempio 8: Preparazione di POZ-calcitonina mediata da TGasi in tanpone contenente DMSO
Poli (2-etil-ossazblina) (POZ-NH25 KDa), in eccesso di 10 volte rispetto la proteina, viene incubato con sCT (1 mg/mL) in 0,1 M tampone fosfato pH 7 contenente DMSO al 30% (v/v). Una soluzione di TGasi da Streptomyces mobaraense viene aggiunta in rapporto E/S di 1:15 e la reazione viene lasciata procedere per 3 ore a temperatura ambiente. La miscela di reazione analizzata mediante cromatografia RP-HPLC conferma la modifica di circa il 50% di calcitonina e la formazione di un monoderivato (Figura 6).
Esempio 9: Determinazione del sito di coniugazione nei campioni di PEG-calcitonina preparati
A 20 pg di PEG540Da-sCT, disciolti in 20 μL di 50 mM Tris pH 7,8, vengono aggiunti 1,6 pL di tripsina (Sigma-Aldrich, Milano, IT) (rapporto E/S, 1:50 (p/p)). La soluzione viene incubata per 3h a 37°C. Contemporaneamente la digestione triptica viene eseguita anche sulla sCT nativa. Ciascun digerito triptico viene analizzato in RP-HPLC e i prodotti vengono raccolti ed analizzati in massa ESI-TOF. In figura 7 è mostrato il profilo cromatografico della sCT nativa. I 3 picchi (chiamati a,b,c) corrispondono rispettivamente al frammento Leul2-Lysl8 (854 Da), Leul9-Arg24 (776 Da) e Cysl-Lysll (1124 Da). Il frammento Thr25-Pro32 (733.7 Da) non viene separato in queste condizioni poiché è molto idrofilo. La mancanza di tale residuo non influenza però la determinazione del sito di legame in quanto non contiene residui di glutammina. La sovrapposizione di tale profilo cromatografico con quello di eluizione di PEG540Da-sCT dimostra che i frammenti a e c vengono identificati, mentre il frammento b è scomparso. Un nuovo prodotto viene identificato (picco d) che analizzato mediante analisi di spettrometria di massa mostra un peso molecolare di 1316 Da, che corrisponde al residuo Leul9-Arg24 legata ad una catena di PEG monodisperso. Questo indica che la Gln20 è un substrato specifico della TGasi in presenza di cosolventi essendo l'unica Gin presente in questo peptide.
Infine la digestione triptica viene condotta anche sul derivato PEG5kDa<_>sCT. Anche in questo caso l'analisi in HPLC mostra la presenza del frammento a, del frammento c e di un nuovo frammento a tempi di ritenzione maggiori, ma non del frammento b (dati non mostrati). La mancanza totale del frammento b è ascrivibile alla sola coniugazione della Gln20 ad una catena di PEG.
Esempio 10: Determinazione del sito di coniugazione nei campioni di PEG-hGH preparati
A 400 pg di hGH-PEG e di hGH, disciolti in 400 μL di tampone 50 mM TRIS, 6 M Gdn, pH 9, viene aggiunto TCEP (concentrazione finale 5 mM) e la miscela di reazione viene lasciata ad agitare per un'ora a 37°C. Poi iodoacetammide (concentrazione finale 25 mM) viene aggiunta e la reazione di carbossimetilazione viene condotta al buio per mezz'ora a 37°C. Dopo purificazione, i prodotti ridotti e carbossimetilati , vengono sottoposti a digestione triptica per una notte a 37°C. Dopo desalificazione su colonna pepclean™ (C18 spin column Pierce), i frammenti peptidici di hGH e di hGH-PEG vengono determinati mediante spettrometria di massa ESI-TOF . Dalle analisi di massa del digerito di hGH vengono individuati ed identificati la maggior parte dei frammenti triptici con una percentuale di copertura di sequenza dell'85%. Il digerito di hGH-PEG mostra tutti i frammenti identificati nel hGH nativo tranne che i frammenti corrispondenti alle sequenze Glnl41-Lysl45, Phel46-Lysl68 e Serl84-Phel91 . Un nuovo frammento doppia carica con peso molecolare [583Da+2H]<+2>presente soltanto nel digerito di PEG-hGH corrisponde al frammento Glnl41-Lysl45 (626,31Da) legato ad una catena di PEG (540Da), vedi figura 8. Il frammento Glu39-Cys41, contenente il residuo Gln40 che dalla letteratura è riportato essere substrato acil donatore della TGasi in condizioni acquose di catalisi, non viene identificato nei digeriti triptici dei campioni poiché ha un peso molecolare basso e non viene rilevato dallo strumento. La totale assenza del frammento Glnl41-Lysl45 e la mancanza del frammento Glu39-Cys41 coniugato al PEG (con massa di 944,2 Da o la corrispondente doppia carica [M+2H]<Z+>) indicano che il residuo Glnl41 è legato totalmente al PEG. I frammenti non identificati Phel46-Lysl68 e Serl84-Phel91 non contengono glutammine e quindi non sono rilevanti al fine dell'analisi.
Esempio 11: Effetto dei cosolventi organici sulla conformazione di calcitonina e hGH
A) Effetto dei solventi organici sulla fluorescenza e sullo spettro CD di sCT.
Un incremento nella fluorescenza della tirosina è osservata con l'aumento della percentuale di solvente organico aggiunto al tampone fosfato. Anche se la polarità del solvente incrementa l'intensità di fluorescenza, questa non è accompagnata a modifica dei massimi di emissione, eccetto che un leggero red shift della tirosina in presenza di DMSO (Figura 9b). Gli spettri CD risultano più esaustivi in quanto mostrano che in presenza di cosolventi organici la struttura secondaria di sCT viene modificata. Mentre in condizioni fisiologiche la sCT è largamente disordinata, in ambiente con bassa costante dielettrica essa adotta una spiccata struttura a-elica (Figura 9a). Il dato potrebbe suggerire che una struttura maggiormente ordinata rende la sCT un substrato meno flessibile per la TGasi con una conseguente diminuzione dei siti possibili di legame.
B) Effetto dei solventi organici sulla fluorescenza e sullo spettro CD di hGH.
L'unico residuo di triptofano nella sequenza di hGH, presente in una regione poco esposta al solvente, può essere conveniente per studi strutturali. Mentre la presenza di DMSO non modifica l'ambiente intorno al Trp, la presenza di etanolo ad alte percentuali determina un "red shift" del massimo di emissione nella direzione di una piena esposizione di tale residuo (Figura 10b). Gli spettri CD mostrano che la proteina mantiene la struttura secondaria e la sua compattezza anche ad alte concentrazioni di etanolo con un incremento di α-elica dal 46% al 56% (Figura 10a).
Esempio 12: Farmacodinamica in ratti di PEG-calcitonina oggetto della presente invenzione
Gli effetti biologici dei derivati ottenuti nella presente invenzione sono stati valutati come la capacità di sviluppare una risposta ipocalcemica in vivo. Dopo anestesia, ratti Sprangue-Dawley con peso compreso tra 180-250 g sono stati divisi in gruppi e ogni gruppo ha ricevuto una delle seguenti formulazioni mediante iniezione in vena caudale: sCT, mPEGskDa-sCT o mPEG10kDa-sCT alla dose di 40μg/kg (sCT equiv.). Campioni di plasma sono stati prelevati a tempi predeterminati (0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 e 24 ore) ed analizzati mediante saggio colorimetrico al calcio (Vinci Biochem, Vinci IT) per valutare i livelli di calcio nel sangue. Il saggio mostra che entrambi i coniugati sono attivi riducendo i livelli plasmatici di calcio dopo somministrazione. In particolare, la percentuale di calcio nel plasma rispetto alla soluzione salina è stata ridotta al 60% del valore iniziale dopo somministrazione di mPEG10kDa-sCT a 6 ore post somministrazione. Diversamente, allo stesso tempo i livelli plasmatici di calcio sono tornati ai livelli basali dopo somministrazione di sCT nativa (Figura 11). Da notare che il peso molecolare del PEG è critico per un'attività prolungata, infatti il derivato mPEG5kDa-sCT mostra un profilo farmacodinamico simile alla sCT non coniugata.

Claims (15)

  1. TITOLO: "METODO PER LA PREPARAZIONE DI CONIUGATI MEDIANTE TRANSGLUTAMINASI" RIVENDICAZIONI 1) Metodo di coniugazione comprendente una reazione di transglutaminazione catalizzata da una transglutaminasi (TGasi) tra una proteina o un peptide contenenti due o più residui glutamminici quale substrato acil donatore ed una molecola contente almeno un gruppo amminico come substrato amino donatore, tale metodo caratterizzato dall'uso di almeno un solvente organico miscibile con l'acqua come cosolvente nella soluzione acquosa di reazione per aumentare la selettività di reazione e ridurre il numero di prodotti di coniugazione.
  2. 2) Metodo come descritto nella rivendicazione 1 per la preparazione di un prodotto monoconiugato, ovvero di un prodotto in cui la molecola contenente almeno un gruppo amminico è legata solo ad un specifico sito della proteina o del peptide, oppure per la preparazione di un prodotto biconiugato, ovvero di un prodotto in cui due molecole contenenti almeno un gruppo amminico sono legate rispettivamente a due specifici siti della proteina o del peptide.
  3. 3) Un metodo come descritto nelle rivendicazioni 1-2 in cui almeno un cosolvente organico è presente in una quantità dal 5% e l'80% (v/v), più preferibilmente tra il 20% ed il 70% (v/v), ancora più preferibilmente tra il 30% e il 65% (v/v), ed ancora più preferibilmente tra il 30% e il 60% (v/v), ed in cui opzionalmente la soluzione acquosa di reazione contiene anche un tampone.
  4. 4) Un metodo come descritto nelle rivendicazioni 1-3 in cui almeno un cosolvente organico è etanolo, metanolo o DMSO, ed in cui tale cosolvente è preferibilmente presente nella miscela di catalisi in una quantità tra il 5% e 180% (v/ v), più preferibilmente tra il 30% e il 70% (v/v) ancora più preferibilmente tra il 50% e il 65% (v/v) ed ancora più preferibilmente è del 50% (v/v) nel caso dell'etanolo e del 60% (v/v) nel caso di metanolo, ed è preferibilmente in una quantità tra il 10% e il 40% (v/v) e più preferibilmente tra il 25% e il 35% (v/v) e ancora più preferibilmente è del 30% (v/v) nel caso del DMSO.
  5. 5) Metodo come descritto nelle rivendicazioni 1-4 in cui la transglutaminase (TGasi) è ottenuta da una delle seguenti fonti: Streptomyces mobaraense, Streptomyces cinnamoneum, Streptomyces griseocarneum, Streptomyces lavendulae, Streptomyces ladakanum, Bacìllus subtìlis, Myxomycetes, fegato di cavia, da un organismo marino come l'ostrica giapponese Crassostrea gigas, oppure è un mutante di una transglutaminase ottenuta da tali fonti comprendente almeno l'80%, preferibilmente almeno l'85%, più preferibilmente almeno il 90%, e ancora più preferibilmente almeno il 95% della sequenza aminoacidica dell'enzima nativo.
  6. 6) Metodo come descritto in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui la proteina o peptide contenenti due o più residui glutamminici è la calcitonina con sequenza SEQ ID NOI, l'ormone della crescita umano (hGH) con sequenza SEQ ID N02, o un mutante comprendente almeno l'80%, preferibilmente almeno l'85%, più preferibilmente almeno il 90%, e ancora più preferibilmente almeno il 95% della sequenza aminoacidica SEQ ID NOI o SEQ ID N02.
  7. 7) Metodo come descritto in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui la molecola contenente un gruppo amminico che agisce come substrato amino donatore è selezionata tra: un polimero sintetico o naturale preferibilmente idrofilo e solubile in acqua, un agente diagnostico quale un chelato di un radioisotopo o una molecola fluorescente, un oligonucleotide quale un oligonucleotide antisenso un aptamero o un siRNA, una proteina o un peptide, un farmaco, una tossina, una molecola eterobifuzionale .
  8. 8) Metodo come descritto in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui la molecola contenente un gruppo amminico che agisce come substrato amino donatore è un polimero avente preferibilmente un peso molecolare (MW) medio tra i 200 Da e i 300000 Da, più preferibilmente tra 3000-100000 Da, ancora più preferibilmente tra 5000 Da e 80000 Da, e ancora più preferibilmente tra 10000 Da e 40000 Da.
  9. 9) Metodo come descritto in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui la molecola contenente un gruppo amminico che agisce come substrato amino donatore è un polimero selezionato tra quelli del seguente gruppo: poli (etilenglicole) (PEG) di struttura lineare o ramificata (branched) , preferibilmente monofunzionale, avente preferibilmente un peso molecolare (MW) medio tra i 2000 Da e i 40000 Da, più preferibilmente tra i 2000 Da e i 30000 Da e ancora più preferibilmente tra 5000 Da e 20000 Da, e dove i poli(etilenglicoli) maggiormente preferiti sono mPEG-NH210000 Da, mPEG-NH220000 Da, mPEG-NH240000 Da, mPEG-NH2branched 10000 Da, mPEG-NH2branched 20000 Da e mPEG-NH2branched 40000 Da; polivinilpirrolidone ; poliacriloilmorfolina; N-idrossi-etil metacrilammide copolimero; poli(2-etil-ossazolina) ; acido poliglutammico; acido ialuronico; acido polisialico; e copolimeri di PEG-poliaminoacidi .
  10. 10) Un monoconiugato, preferibilmente un monoconiugato di un polimero, che preferibilmente è il PEG e una proteina o un peptide contenenti due o più residui glutamminici, che preferibilmente è la calcitonina con sequenza SEQ ID NOI, hGH con sequenza SEQ ID N02, o un mutante comprendente almeno l'80%, preferibilmente almeno l'85%, più preferibilmente almeno il 90%, e ancora più preferibilmente almeno il 95% della sequenza aminoacidica SEQ ID NOI o SEQ ID N02, tale coniugato ottenibile utilizzando il metodo come descritto in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni.
  11. 11) Un coniugato ottenibile con un metodo come descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, dove la TGasi è da Streptomyces mobaraense, la soluzione acquosa contenente la TGasi è tampone fosfato 0,1 M pH 7, il cosolvente organico nella miscela di reazione è etanolo in una quantità del 50% (v/v), o è DMSO in una quantità del 30% (v/v), il substrato acil donatore è calcitonina e il substrato amino donatore è selezionato tra mPEG-NH210000 Da, mPEG-NH220000 Da, e mPEG-NH240000 Da, il cui coniugato avente la formula: mPEG-(Q20)calcitonina, ed il peso molecolare (MW) del PEG è rispettivamente 10000 Da, 20000 Da o 40000 Da.
  12. 12) Un coniugato ottenibile con un metodo come descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, dove la TGasi è da Streptomyces mobaraense , la soluzione acquosa contenente la TGasi è tampone fosfato 0,1 M pH 7, il cosolvente organico presente nella miscela di reazione è il metanolo o 1'etanolo, ed è presente in una quantità del 50% (v/v) nel caso dell'etanolo e del 60% (v/v) nel caso del metanolo, il substrato acil donatore è hGH e il substrato amino donatore è selezionato tra mPEG-NH25000 Da, mPEG-NH2 20000 Da, e mPEG-NH240000 Da, il cui coniugato avente la formula: mPEG-(Q141)hGH dove il peso molecolare (MW) del PEG è rispettivamente 5000 Da, 20000 Da, 40000 Da.
  13. 13) Una preparazione farmaceutica o diagnostica comprendente almeno un coniugato ottenuto come definito in qualsiasi delle rivendicazioni 10-12, e comprendente eventualmente anche un ulteriore agente terapeuticamente attivo o diagnostico, e opzionalmente anche un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
  14. 14) Una preparazione farmaceutica come definita nella rivendicazione 13 per uso orale, parenterale, rettale, topico, vaginale, oftalmico o inalatorio.
  15. 15) Un metodo di trattamento o un metodo di diagnosi comprendente la somministrazione di una formulazione secondo qualsiasi delle rivendicazioni 13-14.
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