CN102149726A - 稳定性提高的生长激素共轭物 - Google Patents

Abstract

公开了新的生长激素共轭物，其包括生长激素化合物(GH)和生长激素结合蛋白(GHBP)。本发明还包括通过位点特异性共轭作用来制备稳定、持久共轭物(hGH-GHBP)的新衍生化方法。新的GH-GHBP共轭物在促进蛋白的治疗应用的循环中具有延长的半衰期。GH-GHBP共轭物显示出药理学性能，例如，功能性的体内半衰期提高，肾过滤增加，蛋白酶保护作用提高和白蛋白结合增加。

Description

稳定性提高的生长激素共轭物

发明领域

本发明涉及生长激素共轭物和制备它们的方法。本文所描述的共轭物是通过位点特异性共轭作用与生长激素结合蛋白共轭的生长激素化合物。新的共轭物在循环中具有延长的半衰期，这使得该蛋白容易在治疗中使用。

发明背景

人生长激素(hGH)是191个氨基酸长度的蛋白，其具有二硫桥和22 kDa的分子量。二硫键连接53与165位和182与189位。hGH在促进生长、保持正常身体成分、合成代谢和脂类代谢中起到关键作用。它对中间代谢也有直接影响，例如降低葡萄糖吸收，提高脂解，提高氨基酸吸收和蛋白质合成。该激素还对其它组织产生影响，包括脂肪组织，肝脏，肠管，肾脏，骨干，结缔组织和肌肉。已经制备出重组hGH，并且可以以下列形式商购，例如∶Genotropin^TM(Pharmacia Upjohn)，Nutropin^TM和Protropin^TM(Genentech)，Humatrope^TM(Eli Lilly)，Serostim^TM(Serono)和Norditropin^TM(Novo Nordisk)。另外，还以下列名称销售在N端具有额外甲硫氨酸残基的类似物，例如∶Somatonorm^TM(Pharmacia Upjohn/Pfizer)。

尤其是如果所述蛋白是治疗性质的蛋白，尝试处理所给定的蛋白，以便提高其稳定性或半衰期。在这方面，通过使基团与所述蛋白共轭来修饰蛋白，是改变该蛋白性能的方式之一。hGH具有短的半衰期，由此在患有生长缺陷的孩子中需要至少三次注射，或在大多数情况下每天注射。目前的hGH治疗方案需要每天皮下注射。这已对患者产生许多困难，包括成本；除了患者对每天注射的耐受性问题之外，还有给药的容易程度问题。

为了提高治疗蛋白的稳定性、降低清除率和降低抗原性，已经建议了各种方法，包括治疗蛋白的化学修饰。产生持久生长激素的不同方法包括聚乙二醇化方法和形成持续释放制剂。

已经描述过，通过与生长激素结合蛋白(GHBP)共价结合，循环中的生长激素(GH)的半衰期可以得到显著地提高(G. Baumann等人，Metabolism-Clinical and Experimental 38(4), 330-333(1989))。令人遗憾的是，这种共轭物在临床使用上是不适宜的，这是因为其内在异质性，并且还因为其很可能不能刺激GH受体。还已经描述过，GH-连接基-GHBP融合蛋白在循环中的半衰期已经提高(I. R. Wilkinson等人，Nat.Med. 13(9), 1108-1113(2007))。令人遗憾的是，这种方法也具有它的问题。所以，在人造融合蛋白中，潜在的免疫原性“非自身”序列是在连接基和融合伴侣之间产生的。这种非自身序列可以导致对药物来说长期使用时高度不需要的免疫原性。

先前已经描述过，通过激素的翻译后共轭作用聚乙二醇化生长激素而使用转谷氨酰胺酶(TGase)，其中转谷氨酰胺酶用于在PEG选择性连接的蛋白的特殊位置产生连结点(WO 06134148，WO 05070468，US 60/957732)。另外，EP950665和EP785276描述了转谷氨酰胺酶介导的生理学活性蛋白的变化。

本发明概述

本文公开的是生长激素的新的修饰形式，其具有经过修饰并通过位点特异性共轭作用与GHBP结合的特定氨基酸残基。本公开还包括制备这种化合物的方法以及这种化合物的药学用途。与相应的非共轭的肽相比，通过本发明所公开方法由此获得的共轭物具有改善的药理学性能。这种药理学性能的例子包括：功能性的体内半衰期提高，免疫原性降低，改善肾过滤和蛋白酶保护，以及白蛋白结合改善。

在一方面，本发明提供了下式的组成物∶

A-B-C

其中

A是生长激素化合物的基团；

B是连接和间隔性二价残基；

C是生长激素受体单体化合物的胞外部分的基团；和

-是共价键，

其中在A与B之间的连接基和/或在B与C之间的连接基不是通过核酸的重组表达来提供的，该核酸包括编码具有结构A-B-C的融合蛋白的核酸序列。

本发明还提供了获得A-B-C的方法，包括下列步骤：

(a)   生长激素化合物的酶催衍生作用，和

(b)   使酶修饰的生长激素化合物与生长激素受体单体化合物共轭。

本发明还提供了治疗哺乳动物疾病状态的方法，该方法通过给予有效量的按照本发明所描述获得的hGH-GHBP共轭物，使生长激素的活性提高，因而使所述患病哺乳动物从中受益。

发明说明书

本发明涉及蛋白(尤其是人生长激素(hGH))和生长激素结合蛋白(GHBP)之间的蛋白共轭物。本文所描述的制备这种共轭物的一种方法包括：使hGH与GHBP通过位点特异性共轭作用而进行共轭。与hGH本身相比较，本发明提供的hGH-GHBP共轭物具有提高的药理学性能，例如稳定性、在循环中延长的半衰期、肾清除率，并且与hGH和hGH-GHBP的融合蛋白相比较，免疫原性降低，如下列所述：Baumann等人，Metabolism-Clinical and Experimental 38(4), 330-333(1989))和I. R. Wilkinson et al., Nat.Med. 13(9), 1108-1113(2007)。本文使用的“共轭物”意思是指稠合的或修饰的蛋白或肽，例如，与另一个化学部分或另一种蛋白结合的蛋白。共轭作用或被共轭的是指形成共轭物的行为或方法。

在一个实施方案中，本发明提供了下式的化合物∶

A-B-C

其中

A是生长激素化合物的基团；

B是连接和间隔性二价残基；

C是生长激素结合蛋白化合物的基团；和

-是共价键，

其中在A与B之间的连接基和/或在B与C之间的连接基不是通过核酸的重组表达来提供的，该核酸包括编码具有结构A-B-C的融合蛋白的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了下式的化合物∶

A-B-C

A是生长激素化合物的基团；

B是连接和间隔性二价残基；

C是生长激素结合蛋白化合物的基团；和

-是共价键，

其中B不是纯肽链。

在本发明背景中，术语“化合物”还包括所述化合物的可药用盐、前体药物和溶剂化物。在本发明背景下，术语“可药用盐”表示对患者无害的盐。这种盐包括可药用酸加成盐，可药用金属盐，可药用铵盐和可药用烷基化铵盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。合适无机酸的代表性例子包括盐酸，氢溴酸，氢碘酸，磷酸，硫酸，硝酸等等。合适有机酸的代表性的例子包括甲酸，乙酸，三氯乙酸，三氟乙酸，丙酸，苯甲酸，肉桂酸，柠檬酸，富马酸，乙二醇酸，乳酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，草酸，苦味酸，丙酮酸，水杨酸，琥珀酸，甲磺酸，乙磺酸，酒石酸，抗坏血酸，双甲基双羟萘酸，双亚甲基水杨酸，乙二磺酸，葡糖酸，柠康酸，天冬氨酸，硬脂酸，棕榈酸，EDTA，乙二醇酸，对氨基苯甲酸，谷胺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸等等。可药用无机或有机酸加成盐的进一步例子包括列于J. Pharm. Sci. 1977，66，2中的可药用盐，将其结合到本文中作为参考。金属盐的例子包括锂、钠、钾、镁盐，等等。铵和烷基化铵盐的例子包括铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、乙基铵、羟乙基铵、二乙铵、丁基铵、四甲铵盐等等。

生长激素(GH)化合物是包括氨基酸序列的肽，该氨基酸序列与SEQ ID No. 1具有至少80%的同一性，并且这种肽在实施例7所描述的试验中具有hGH的至少10%的活性(换言之，GH化合物的EC₅₀值小于100xhGH的EC₅₀)。在一个实施方案中，GH化合物的活性至少是hGH活性的20%，例如至少30%，例如至少40%，例如至少50%，例如至少60%，例如至少70%，例如至少80%，例如至少90%，例如，基本上与hGH的活性相同。

在一个实施方案中，生长激素化合物是包括氨基酸序列的肽，该氨基酸序列与SEQ ID No. 1具有至少85%的同一性，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。在一个实施方案中，本生长激素化合物是这种肽的片段，该片段保留了大量的上述生长激素活性。

在一个实施方案中，生长激素化合物是包括氨基酸序列的肽，该序列至少与SEQ ID No. 1相似90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%。

在一个实施方案中，生长激素化合物是WO2006048777、WO2004022593、WO2005018659、WO2005074524、WO2005074546、WO2005074650、US5849535、US6136563、US6022711或US6143523所描述的生长激素类似物。

在一个实施方案中，生长激素化合物是hGH。

术语“肽”表示通过肽键连接的两种或多种氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然或非天然的氨基酸。该术语包括术语多肽和蛋白，其可以由通过共价相互作用(例如半胱氨酸桥)或非共价相互作用结合在一起的两种或多种多肽组成。应该理解，该术语还包括例如通过亲脂性基团、PEG或修复基团的连接而已经衍生的肽。术语肽包括任何合适的肽，并且可以与术语多肽和蛋白同义使用，除非另有说明，或同上下文相矛盾；条件是，读者可以认识到，各种含有相应氨基酸聚合物的分子可以带有显著差别而相关联，并由此形成本发明的各个实施方案(例如，由许多多肽链组成的肽(例如抗体)显著地不同于例如单链抗体、肽免疫粘附素或单链免疫原性的肽)。因此，通常应该将本文的术语肽理解为任何合适大小和组成(相关于蛋白质分子中的氨基酸的数目和相关联的链的数目)的任何合适的肽。此外，本文所描述的肽可以包括非天然存在的和/或非L氨基酸的残基，除非另有说明或同上下文相矛盾。

除非另有说明或同上下文相矛盾，否则，术语肽(和如果作为术语多肽和/或蛋白的各个实施方案所讨论的肽)还包括被衍生的肽分子。简要地说，在本发明的上下文中，衍生物是其中肽的一个或多个氨基酸残基已经被化学修饰的肽(例如被烷基化，酰化，酯的形成，或形成酰胺)，或所述氨基酸残基已经与一或多种非氨基酸的有机和/或无机原子或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基团，亲脂性的取代基(其任选可以通过间隔残基或基团例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸等等与该肽的氨基酸序列连接)，荧光团，生物素，放射性核素，等等)相关联的肽，并且可以还包括或替代性地包括非必要的、非天然存在的和/或非-L氨基酸残基，除非另有说明或同上下文相矛盾(然而，还应该认识到，可以认为这种衍生物本身构成本发明的独立特征，并且在肽的含义内的这种分子的内容是为了方便描述本发明起见，而不是暗示在裸肽和这种衍生物之间具有任何同等物种类)。这种氨基酸残基的非限制性例子包括：例如2-氨基己二酸，3-氨基己二酸，β-丙氨酸，β-氨基丙酸，2-氨基丁酸，4-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2-氨基异丁酸，3-氨基异丁酸，2-氨基-庚二酸，2,4-二氨基丁酸，锁链素，2,2'-二氨基庚二酸，2,3-二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，羟基赖氨酸，别羟基赖氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸，异锁链素，别异亮氨酸，N-甲基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸，6-N-甲基赖氨酸，N-甲基缬氨酸，戊氨酸，正亮氨酸，鸟氨酸和抑胃酶氨酸卤代氨基酸。应该理解，这种衍生作用不是本发明的衍生作用，而是这种衍生作用在本发明的共轭作用之前已经存在于生长激素化合物中，或在本发明的共轭作用之后进行的衍生作用。

本领域已知的术语“同一性”是指在两种或多种肽的序列之间的关系，通过比较该序列来测定。在本领域，“同一性”还指在肽之间的序列相关的程度(通过两个或多个氨基酸残基串之间的匹配数目来测定)。“同一性”测定两个或多个序列和其它序列之间相同匹配的百分比，具有通过具体数学模型或计算机程序(即“算法”)阐明的空位排列（gap alignment）(如果有的话)。相关肽的同一性可以容易地利用已知的方法来计算。这种方法包括但不局限于描述在下列中的那些方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., 和 Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 和 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073(1988)。

设计测定同一性的优选方法，以便在试验的序列之间得到最大的匹配程度。测定同一性的方法描述在可公开获得的计算机程序中。测定两个序列之间的同一性的优选的计算机程序方法包括：GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12, 387(1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, Muscle(Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research 32(5), 1792-97((2004)), clustal X and clustal W(Larkin MA等人，Bioinformatics 23, 2947-2948(2007)和tcoffee(Notredame, C., Journal of Molecular Biology 302, 205-217(2000)。BLASTX程序可公开地得自于the National Center for Biotechnology Information(NCBI)及其它渠道(BLAST Manual, Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul等人，上文)。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一性。

例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)，将测定百分比序列同一性的两个肽进行调整，使它们的相应氨基酸达到最佳匹配(通过该算法测定的“匹配范围”)。空位开放罚分(其是以平均对角线的3倍来计算的；“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是归属于每个理想氨基酸匹配的评分或数目(利用具体比较矩阵))和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的{分数(1/10)}倍({fraction (1/10)} times the gap opening penalty))以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62与该算法结合使用。该算法还使用标准的比较矩阵(参见Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure，vol. 5，supp.3(1978)for the PAM 250 comparison matrix；Henikoff等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 89，10915-10919(1992)for the BLOSUM 62 comparison matrix)。

肽序列比较的优选参数包括下列∶

算法∶Needleman等人，J. Mol. Biol. 48, 443-453(1970)；比较矩阵∶BLOSUM 62，得自于Henikoff等人，PNAS USA 89, 10915-10919(1992)；空位罚分∶12，空位长度罚分∶4，相似性阈值∶0。

GAP程序使用上述参数。上述参数是使用GAP算法的肽比较的缺省参数(以及终端空位不罚分)。

术语“相似性”是与同一性有关的概念，但与“同一性”相反，其是指包括相同匹配和保守置换匹配两者的序列关系。如果两个多肽序列具有例如(分数(10/20))相同的氨基酸，其余的都是非保守置换的氨基酸，则同一性和相似性两者的百分比都是50%。在相同的实施例中，如果有5个另外的位置存在保守置换，则同一性百分比仍然是50%，但相似性百分比是75%(分数(15/20))。因此，如果有保守置换，则在两个多肽之间的相似度比在那两个多肽之间的同一性百分比高。

保守性修饰包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽(和对编码核苷酸的相应修饰)将会产生具有与包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽的功能和化学特性相似的肽。与此相反，与包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽相比较，对按照本发明的肽的功能和/或化学特性方面显著修饰可以通过在氨基酸序列中选择取代来实现，它们在其对保持下列的效果方面具有显著差别：(a)在取代的区域内的分子骨架的结构，例如，薄片或螺旋构造形式，(b)分子在靶向位点的带电性或疏水性，或(c)侧链的体积（bulk）。

例如，“保守的氨基酸取代”可以包括带有非天然残基的天然氨基酸残基的取代，使得对该位置的氨基酸残基的极性或带电性有很小的效果或没有效果。此外，多肽中的任何天然残基还可以被丙氨酸取代，正如先前所描述的“丙氨酸扫描诱变”那样(参见，例如，MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl. 643, 55-67(1998); Sasaki等人，Adv. Biophys. 35, 1-24(1998)，其讨论了丙氨酸扫描诱变)。

当希望进行这种取代的时候，目标氨基酸取代(不论是保守的或非保守的取代)可以由本领域技术人员来确定。例如，氨基酸取代可用于鉴定按照本发明的肽的重要的残基，或提高或降低本文所描述肽对受体的亲合性，还有已经描述的突变。

基于常见的侧链性能，可以将天然存在的残基分类∶

1)疏水性的∶正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，lie；

2)中性亲水性的∶半胱氨酸，Ser，Thr，Asn，Gln；

3)酸性的∶Asp，Glu；

4)碱性的∶His，Lys，Arg；

5)影响链取向的残基∶Gly，Pro；和

6)芳香化的∶Trp，Tyr，Phe。

在产生这种变化的过程中，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于氨基酸的疏水性和带电特征，可以赋予每个氨基酸亲水指数，这些是∶异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域了解亲水氨基酸指数在对蛋白赋予交互性生物功能的重要性。Kyte等人，J. Mol. Biol., 157, 105-131(1982)。众所周知，某些氨基酸可以代替具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸，并且还保留类似的生物活性。在基于亲水指数产生的变化中，优选亲水指数在±2范围之内的氨基酸的取代，尤其优选在±1范围之内，更尤其优选在±0.5范围之内。蛋白的最大局部平均亲水性(取决于它的相邻氨基酸的亲水性)与它的免疫原性和抗原性有关，即与蛋白的生物学性质有关。

下列亲水值赋予下列氨基酸残基∶精氨酸(+3.0)；赖氨酸(’3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于类似的亲水性值所产生的变化中，优选亲水性值在±2范围之内的氨基酸的取代，尤其优选在±1范围之内，更尤其优选在±0.5范围之内。

本发明的肽还可以包括非天然存在的氨基酸。

在一个实施方案中，B不包括肽链。应该将本发明上下文中的肽链理解为连续肽键，其是由通过酰胺键连接的氨基酸残基组成的链。

应该理解，B的实际结构不是本发明的主要特征。当使本发明共轭物的生物学特性最佳化时，连接基的长度和性质由本领域技术人员来确定。

B可以例如包括至少10个共价键，B还可以由重复的C-S-C、C-O-C或C-C-C单元组成，例如，聚乙二醇分子(PEG)形式。术语“聚乙二醇”、“Peg”或“PEG”(聚(乙二醇))是指下列结构的多分散或单分散的双自由基

其中n是大于1的整数，它的分子量可以在大约100 Da至大约1,000,000 kDa之间的范围或更大。对本发明来说，B可以是例如大小为大约500至大约50,000 kDa的PEG，例如大约500，750，1,000，2,000，5,000，10,000，20,000，30,000，40,000或50,000 kDa，例如，在1,000和10,000之间。

通常，B的结构是所选择的使C与A共轭的方法的结果，如实施例中所举例说明。

C是生长激素受体单体化合物(确切地说，GHBP化合物)的基团。GHBP是GH受体的可溶性胞外部分，多半通过生长激素受体的解朊裂解来获得。这种蛋白结合40-50%的循环GH，并且似乎可以保护GH，避免它们消除和分解，由此调节GH作用。在正常生理条件下，GHBP与人血浆中大约一半的GH复合(参见Baumann等人，Endocrinol 122，976-984(1988))，并且起到储存器或缓冲剂的作用，阻抑血浆GH的摆动，延长GH半衰期，和通过与GHR竞争GH来调节GH生物活性(Baumann等人，J Endocrinol Invest. 17, 67(1994))。GHBP具有638个氨基酸长度，并且以SEQ ID No. 2的形式提供。

GHBP化合物是包括氨基酸序列的肽，该氨基酸序列与SEQ ID No. 2具有至少80%的同一性，并且该肽能够与具有KD < 100 nM的生长激素结合。在一个实施方案中，GHBP化合物是包括氨基酸序列的肽，该氨基酸序列与SEQ ID No. 2具有至少85%的同一性，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。在一个实施方案中，GHBP化合物包括GHBP的序列(SEQ ID No. 2)。在一个实施方案中，GHBP化合物是这种肽的片段，该片段保留了这种肽的大量的GHBP活性(也就是说，能够与GH结合)，例如，与这种肽的GHBP活性基本上相同。在一个实施方案中，GHBP化合物在N端具有丝氨酸。

在本发明中，在A与B之间的连接基和/或在B与C之间的连接基不是通过核酸的重组表达来提供的，该核酸包括编码具有结构A-B-C的融合蛋白的核酸序列。换言之，在A与B和B与C之间的连接基是通过修饰来建立的，这种修饰是在生长激素化合物和GHBP化合物的化合物表达(或形成)之后进行的。这种转译后的修饰在本领域为大家所熟知，并且包括，例如酰化，烷基化(例如∶甲基，乙基)，酰胺化，生物素化，甲酰化，糖基化和磷酸化。

在一个实施方案中，A-B-C不是直链肽。在一个实施方案中，B与GH化合物的N端相连接。在一个实施方案中，B与GH化合物的C端相连接。在一个实施方案中，B与GH化合物的氨基酸侧链相连接。在一个实施方案中，B与GHBP化合物的N端相连接。在一个实施方案中，B与GHBP化合物的C端相连接。在一个实施方案中，B与GHBP化合物的氨基酸侧链相连接。

在一个实施方案中，在制备本发明的GH-GHBP共轭物过程中产生的至少一个共价键是利用酶(如实施例中所举例说明)产生的。这种酶可以例如选自转谷氨酰胺酶、丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。在一个实施方案中，所述酶是转谷氨酰胺酶。这种转谷氨酰胺酶可以例如选自微生物的转谷氨酰胺酶、组织转谷氨酰胺酶和因子XIII和其变体。在一个实施方案中，所述酶是半胱氨酸蛋白酶。这种半胱氨酸蛋白酶可以例如选自木瓜蛋白酶、分选酶(sortase)A和分选酶(sortase)B。在一个实施方案中，所述酶是丝氨酸蛋白酶。这种丝氨酸蛋白酶可以例如选自羧肽酶Y(CPY)(PCT申请WO2005/035553 包括使用CPY的蛋白质修饰的一般公开内容)、胰蛋白酶和糜蛋白酶

本发明的化合物可以利用许多不同的方法来制备，其示范性的选择方法(不认为其是限制性的)如下所示。

本发明还提供了制备本发明的GH-GHBP共轭物的方法。

如上所述，在制备本发明的GH-GHBP共轭物过程中形成的至少一个共价键可以利用转谷氨酰胺酶产生。转谷氨酰胺酶可以包括微生物的转谷氨酰胺酶，例如，从下列分离出的那些：链霉菌；茂原链霉菌，S. cinnamoneum，灰肉链霉菌(将US5156956结合到本文中作为参考)，淡紫色链霉菌(将US5252469结合到本文中作为参考)和拉达卡链霉菌(将JP2003199569结合到本文中作为参考)。已经从枯草杆菌(公开在US 5731183中，将其结合到本文中作为参考)和各种粘菌中分离出了其它可使用的微生物转谷氨酰胺酶。可使用的微生物转谷氨酰胺酶的其它例子是公开在WO 96/06931(例如，得自于Bacilus lydicus的转谷氨酰胺酶)和WO 96/22366中的那些，将两者都结合到本文中作为参考。可使用的非微生物转谷氨酰胺酶包括豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶和得自于各种海洋渠道的转谷氨酰胺酶，例如比目鱼(公开在EP-0555649中，将其结合到本文中作为参考)和日本牡蛎(公开在US 5736356中，将其结合到本文中作为参考)。还可以使用它们的功能性类似物和衍生物。

在一个实施方案中，在本发明方法中使用的TG酶是微生物转谷氨酰胺酶。在一个实施方案中，TG酶得自于茂原链霉菌或其变体，例如，WO2007/020290和WO2008/020075中所描述的。在一个实施方案中，TG酶得自于S. ladakanum或其变体，例如，WO2008/020075中所描述的。

按照本发明，hGH与GHBP的共轭作用可以如下获得：通过TG酶介导的修饰，在GH化合物的序列中的特定赖氨酸(Lys)或谷氨酰胺(Glu)位置产生变化。hGH(SEQ ID No. 1)在38、41、70、115、140、145、158、168和172位具有9个赖氨酸残基，和13个谷氨酰胺残基在22、29、40、46、49、68、69、84、91、122、137、141和181位。不是所有这些都容易被有效修饰。在一个实施方案中，本发明中的GHBP在-末端用丝氨酸延长，形成式IV的化合物。用丝氨酸将蛋白的N端延长的方法可以容易地被本领域技术人员所认识(参见Sundstrom等人J Biol Chem 271, 32197(1996); Fuh等人J Biol Chem. 265, 3111(1990)。

式IV

TG酶介导的酶催修饰可以举例说明如下∶

R'-CONH₂ + H₂N-R'' → R'-CONH-R'' + NH₃,

其中R'-CONH₂和H₂N-R''是该酶促反应的底物。R'和R''不必包括蛋白部分，但R'和R''需要具有某种能够使酶辨别R'-CONH₂和H₂N-R''(作为底物)的结构。

在一个实施方案中，R'-CONH₂是肽，例如生长激素化合物，和H₂N-R''是亲核剂，例如WO2005/070468和WO2006/134148中描述的，将它们整体结合到本文中作为参考。在一个实施方案中，H₂N-R''包括上述的B，例如，以H-B-H形式，使得B是H₂N-R''的二价基。

在一个实施方案中，R'-CONH₂是肽，例如生长激素化合物，H₂N-R''是亲核剂，例如WO2008/003750中描述的，将其整体结合到本文中作为参考。在一个实施方案中，H₂N-R''包括上述的B，或可以被修饰的基团，使得得到的化合物包括上述B。

在一个实施方案中，H₂N-R''是肽，例如生长激素化合物，其可以与R'-CONH₂反应，例如US60/957732中描述的，将其整体结合到本文中作为参考。

不同的功能性R'-CONH₂和H₂N-R''化合物的一些例子如下所示，很明显，对于本发明来说，不应该限制B的结构。B的可能结构的更多例子可以在例如WO2005/070468、WO2006/134148、WO2008/003750和US60/957732中得到。

在WO2005/070468(和WO2006/134148)中指出，相当于H₂N-R''的化合物(当R'是肽时)可以是下式：

H₂N-D-R'''-X

其中

D代表键或氧；

R'''代表连接基(称为R'''连接基)或键；

X代表基团，其包括在构成肽R¹-C(=O)-NH₂的氨基酸残基中不易受影响的（not accessible）官能团或潜在官能团。

在一个实施方案中，D代表-O-。

在一个实施方案中，D代表单键。

在一个实施方案中，包含在X中的官能团或潜在官能团选自下列官能团或可以被活化为选自下列的官能团：酮-，醛-,-NH-NH₂,-O-C(=O)-NH-NH₂,-NH-C(=O)-NH-NH₂,-NH-C(=S)-NH-NH₂,-NHC(=O)-NH-NH-C(=O)-NH-NH₂,-NH-NH-C(=O)-NH-NH₂,-NH-NH-C(=S)-NH-NH₂,-NH-C(=O)-C₆H₄-NH-NH₂,-C(=O)-NH-NH₂,-O-NH2,-C(=O)-O-NH₂,-NH-C(=O)-O-NH₂,-NH-C(=S)-O-NH₂，炔基，叠氮化物和腈-氧化物。在一个实施方案中，包含在X中的官能团或潜在官能团选自下列基团之一或可以被活化为下列基团之一∶

其中R⁹选自H，C_1-6烷基，芳基和杂芳基。

术语“烷基”表示烷烃的单价基团。术语“亚烷基”表示烷烃的二价基。术语“烷烃”表示饱和的、直链、支链和/或环状烃。除非用其它数目的碳原子进行规定，否则，该术语表示具有1至30个(包括两端)碳原子的烃，例如1至20个(包括两端)，例如1至10个(包括两端)，例如1至6个(包括两端)；或15至30个碳原子(包括两端)。

术语“烯基”表示烯烃的单价基团。术语“亚烯基”表示烯烃的单价基团。术语“烯烃”表示包含至少一个碳-碳双键的直链、支链和/或环状烃。除非用其它数目的碳原子进行规定，否则，该术语表示具有2至30个(包括两端)碳原子的烃，例如2至20个(包括两端)，例如2至10个(包括两端)，例如2至5个(包括两端)；或15至30个碳原子(包括两端)。

术语“炔基”表示炔烃的单价基团。术语“亚炔基”表示炔的二价基。术语“炔烃”表示包含至少一个碳-碳三键的直链、支链和/或环状烃，并且它可以任选包含一个或多个碳-碳双键。除非用其它数目的碳原子进行规定，否则，该术语表示具有2至30个(包括两端)碳原子的烃，例如2至20个(包括两端)，例如2至10个(包括两端)，例如2至6个(包括两端)；或15至30个碳原子(包括两端)。

术语“杂烷烃”、“杂烯烃”和“杂炔烃”表示上述烷烃、烯烃和炔烃，其中一个或多个杂原子或基团已经插入到所述部分的结构中。杂基团和原子的例子包括-O-，-S-，-S(=O)-，-S(=O)2-，-C(=O)- -C(=S)-和-N(R*)-，其中R*代表氢或C1-6-烷基。因此，杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基分别是杂烷烃、杂烯烃和杂炔烃的二价基。杂烷烃的例子包括：

术语“亚芳基”表示芳基的二价基。术语“芳基”表示同素环的芳香环基团或稠合的同素环系统基团，其中至少一个环是芳香环。典型的芳基包括苯基，联苯基，萘基，四氢萘基等等。

术语“亚杂芳基”表示杂芳基的二价基。术语“杂芳基”表示芳香环基团，例如，具有5至7个环原子，或表示稠合的芳香环系统基团，例如具有7至18个环原子，其中至少一个环是芳香环，并且包含一个或多个杂原子作为环原子，杂原子选自氮、氧或硫杂原子，其中N-氧化物和硫一氧化物和硫二氧化物是允许的杂芳取代。实例包括呋喃基，噻吩基，噻吩基，吡咯基，咪唑基，吡唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，

唑基，异

唑基，

二唑基，噻二唑基，异噻唑基，吡啶基，哒嗪基，吡嗪基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲哚基和吲唑基，等等。

R'''连接基表示起到分隔X与NH₂-D-功能的部分，并且可以在许多方面视为相当于B的连接基。连接基R'''的一个功能是在肽和GHBP之间的连接基中提供合适的柔韧性，以便在后面的步骤中与X相连接。R'''的典型实例包括直链、支链和/或环状C_1-10-亚烷基，C_2-10-亚烯基，C_2-10-亚炔基，C_2-10-杂亚烷基，C_2-10-杂亚烯基，C_2-10-杂亚炔基，其中可以插入一个或多个同素环的芳香化合物双游离基或杂环化合物双游离基。R'''的具体例子包括

其中*代表连结点。

在一个实施方案中，R'''代表-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-NH-CH₂-或-(CH₂)₄-CH(NHCOCH₃)-CO-NH-CH₂-。在一个实施方案中，R'''代表C_1-6-亚烷基。在一个实施方案中，R'''代表C_1-3-亚烷基。在一个实施方案中，R'''代表亚甲基或亚丙基。

在随后的步骤中，通过在X基团和包含该修饰基团的化合物之间的反应来连接修饰基团，其中所述化合物还包括可以与X基团选择性反应的基团。按照本发明，这种修饰基团是生长激素结合蛋白化合物的基团。

对于更多详细内容，请参阅WO2005/070468和/或WO2006/134148。

在WO2008/003750中指出，相当于H₂N-R''的化合物(当R'是肽时)是下式的苯胺或杂芳基胺

R^c-R^b-R^a-NH₂

其中

R^a代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C_1-6-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基或芳基；

R^b代表键或连接基，其中所述连接基包括选自下列一组的双自由基：-C(=O)-NH-,-NH-,-O-,-S-,-O-P(O)(OH)-O-,-O-C(=O)-NH-,-NH-C(=O)-NH-,-(CH₂)_1-10-,-O-(CH₂)₃-NH-C(=O)-,-C(=O)NH(CH₂)_2-30-,-(CH₂)_1-30-C(=O)NH(CH₂)_2-30-,-(CH₂)_0-30-C(=O)NH-(CH2CH2O)1-10-(CH₂)_1-5-C(=O)-,-C(=O)NH-[(CH₂CH₂O)_1-10-(CH₂)_1-5-C(=O)]_1-5NH(CH₂)_2-30-,-C(=O)-,-(CH₂)_1-30-NHC(=O)-,-(CH₂)_1-30C(=O)-,-NHC(=O)NH(CH₂)_2-30-,-(CH₂)_1-30-NHC(=O)NH(CH₂)_2-30-,-(CH₂)_0-30C(=O)NH(CH₂)_2-30-NHC(=O)-(CH₂)_0-30-,-(CH₂)_0-30C(=O)NH(CH₂CH₂O)_1-30-CH₂CH₂NHC(=O)-(CH₂)_0-30，或-NH(CH₂)_2-30-，

，

，和其组合，和

R^c代表改变性能的基团的基团，其中术语“改变性能的基团”表示化学基团，当其与所述肽连接时，可以改变该肽的一或多种物理化学或药理学性能。这种性能可以是溶解性，组织和器官分布状态，亲油性，对各种蛋白酶分解的敏感性，对血浆蛋白(例如白蛋白)的亲合性，功能性的体内半衰期，血浆体内半衰期，平均滞留时间，廓清率，免疫原性和肾过滤。本领域众所周知的是，几种类型的化学基团可以具有这种改变性能的效果。按照本发明，改变性能的基团是上述GHBP的基团。

在一个实施方案中，R^a代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C_1-6-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_5-22-芳基。在一个实施方案中，R^a代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C_1-6-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-18-芳基。在一个实施方案中，R^a代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C_1-6-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_4-16-芳基。在一个实施方案中，R^a代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C_1-6-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-8-芳基。在一个实施方案中，R^a代表C_5-22-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。在一个实施方案中，R^a代表C_6-18-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。在一个实施方案中，R^a代表C_6-14-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。在一个实施方案中，R^a代表C_5-22-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。在一个实施方案中，R^a代表C_6-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。在一个实施方案中，R^a代表C_6-14-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。在一个实施方案中，R^a代表C_6-8-亚芳基，C_12-18-亚芳基或C_5-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。在一个实施方案中，R^a代表亚苯基或亚吡啶基。在一个实施方案中，R^a代表1,4-亚苯基。

在一个实施方案中，R^b代表键，-C(=O)NH-，或

。

在一个实施方案中，R^b代表-C(=O)NH-。

对于更多详细内容，请参阅WO2008/003750。

在US60/957732(和享有US60/957732的优先权的PCT申请)中指出，与hGH共轭并用于连接改变性能基团的化合物可以是通式∶R⁷-Gln-Gly-R⁸，其中R⁷和R⁸是目标取代基，其中它们中的至少一个包括适合于进一步修饰的化学基团。

在一个实施方案中，与hGH共轭并用于连接改变性能基团的化合物具有下式∶

在一个实施方案中，R⁷是

在一个实施方案中，R⁷是CBz；R⁸选自H，炔丙基或4-氨基苄基；Y是OH或=O；X是CH₂OH或OH。在一个实施方案中，R⁷是CBz，R⁸是H，Y是OH，和X是CH₂OH。在一个实施方案中，R⁷是CBz，R⁸是4-氨基苄基，Y是=O，和X是OH。在一个实施方案中，R⁷是CBz，R⁸是炔丙基，Y是=O，和X是OH。这种化合物的例子如下所示

在一个实施方案中，半胱氨酸蛋白酶用于蛋白的酶介导的修饰。半胱氨酸蛋白酶具有催化机理，其在催化三元体中涉及亲质子的半胱氨酸硫醇。本发明的半胱氨酸蛋白酶可以选自木瓜蛋白酶、分选酶(sortase)A和分选酶(sortase)B。本发明还提供了用于修饰多肽的丝氨酸蛋白酶。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶是CPY、胰蛋白酶或糜蛋白酶。

如上所述，被共轭的化合物应该具有能够使它们成为特定酶的底物的结构。PCT申请WO2005/035553(和WO2006/084888)描述了CPY的底物的通用结构。

被共轭的化合物上的聚糖部分也可以用于共轭作用。如果聚糖是双天线复合物类型，那么唾液酸可以在温和条件下选择性地氧化，产生反应性的醛，如WO2008025856中所述。然后这些可以用于与化合物的化学共轭作用，这种化合物是用能够与醛反应的部分功能化的化合物。反应性的醛也可以使用半乳糖氧化酶、通过半乳糖残基的酶致氧化来产生，如WO2005014035所述。复合聚糖任选需要用唾液酸酶修饰，或用半乳糖基转移酶和UDP-Gal进行半乳糖苷化，而后与半乳糖氧化酶反应。在另一个实施方案中，将用炔烃衍生物功能化的UDP-Gal转变为双天线聚糖，随后用以与由叠氮基衍生的hGH分子共轭，如WO2006035057所述。

如果在要被共轭的化合物上不存在聚糖，或没有发现它们适合于共轭，那么可以将Asn-XXX-Thr/Ser一致位点引入到肽序列中(利用定向诱变)，由此，可以将新的N-糖基化位点设计到GHBP中。

化学过程I

在一个实施方案中，本发明的hGH-GHBP共轭物可以按照下面说明的方式制备∶

肽结合的赖氨酸起胺供体的作用，得到肽的交叉结合。

在一个实施方案中，选择性地修饰hGH(SEQ ID No. 1)的Lys145。在一个实施方案中，修饰hGH的至少两个Lys-残基。

化学过程II

在一个实施方案中，本发明讲述了用改变性能基团衍生的苯胺或杂芳基胺来处理衍生自肽化合物的醛或酮，得到亚胺或α-氨基醇（hemiaminal）。在一个实施方案中，用改变性能基团衍生的苯胺或杂芳基胺来处理衍生自肽化合物的醛。

术语“肽衍生的醛(或酮)”或“衍生自肽的醛(或酮)”表示已经共价连接了醛或酮官能团的肽，或已经在肽上产生醛或酮官能团的肽。制备肽衍生的醛的方法为本领域技术人员所熟知，并且任何已知的这些方法可以用于制备实现本文所公开的本发明所需要的肽衍生的醛。

在一个实施方案中，可以按照下面说明的方式制备共轭物hGH-GHBP∶

该方法采用阻断hGH与醛反应的可能性。如果使用小的非位阻的醛(例如甲醛)，那么可能发生二烷基化。或者，可以使用位阻的醛。在两种情况下，不能进行进一步的烷基化。使用NaCNBH₃的还原性烷基化作用是在中等至低pH值条件下进行的，同时限制过量的醛，引起在N端发生烷基化。相关PEG化的例子由Baker等人(Bioconjugate Chem. 17，179-188(2006))提供。在连续的步骤中，TG酶介导的酶促反应在141位导致Gln的修饰。hGH与GHBP的共轭作用是通过还原性烷基化作用发生的。本文举例说明了还原性烷基化作用，并且在本领域是普遍公认的。

在一个实施方案中，进行高碘酸盐介导的Ser-GHBP(用丝氨酸在N-末端延长的GHBP)的氧化，产生在还原胺化中与苯胺共轭的化合物，并且该反应描述如下∶

在合适还原剂例如NaCNBH₃的存在下，使得到的化合物3-氧代丙酰基-GHBP与转谷氨酰胺酶修饰的hGH反应，得到如下所示的式(VI)的hGH-GHBP∶

化学过程III

在一个实施方案中，可以按照下面说明的方式制备共轭物hGH-GHBP∶

如上所述的衍生方法可以提供在Gln-141位连接hGH的PEG连接基。在N-末端用丝氨酸延长的GHBP(如本文其它地方所描述)，提供修饰的GHBP，其可以与TG酶修饰的hGH共轭，形成hGH-GHBP。

化学过程IV

在一个实施方案中，可以按照下面说明的方式制备共轭物hGH-GHBP∶

在化学过程IV的头两步中，首先将原料化合物氧化为醛，由此引入生长激素的N端的封端，其随后在还原胺化反应中与苯胺反应。引入这种封端，可以提高最终化合物的产率和纯度。在第三个步骤中，使用转谷氨酰胺酶催化的转氨反应，在谷氨酰胺中，在相当于hGH中141位的位置，位点选择性地引入把手(handle)。在第四步中，这种把手(handle)转变为醛，最后在第五步中，其与GHBP化合物的N端共轭。

普通化学-还原剂

本文提及NaCNBH₃作为合适还原剂的例子。然而，可以考虑许多其它试剂作为NaCNBH₃的替代物，作为将亚胺转化为仲胺的还原剂。由此，衍生自氧化碳水化合物和蛋白的亚胺在水溶液中被商购的硼烷(BH₃)和吡啶的加合物还原(Hashimoto等人，J. Biochem. 123, 468-478(1998)；Yoshida and Lee, Carbohydr. Res 251, 175-186(1994))。相关的试剂是硼烷和下列的加合物：二甲硫醚，膦，亚磷酸酯，取代的吡啶，嘧啶，咪唑，吡唑，噻唑，硫化物，醚，等等。NaCNBH₃的其它替代方案是催化氢化(非均相或均相)，NaBH₄(Ehrenfreund-Kleinmann等人，Biomaterials 23, 1327-1335(2002)；Zito 和 Martinez-Carrion, J. Biol. Chem. 255, 8645-8649(1980))，NaCNHB(OAc)₃(Drummond等人，Proteomics 1, 304-310(2001))，NADPH(NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的还原形式)或相关的二氢吡啶(Itoh等人，Tetrahedron Lett. 43, 3105-3108(2002))，或NaBH₄和AcOH的混合物。NADPH也可以与合适的酶组合使用，例如谷氨酸脱氢酶(Fisher等人，J. Biol. Chem. 257, 13208-13210(1982))。这些试剂中的每一个可能需要调节溶液的pH值，以便提供高速率的亚胺还原(如果相比于形成氢的速率(水合氢离子还原))。由此，一些试剂可以在中性或碱性反应条件下将亚胺还原，而其它试剂可能需要更酸性的反应条件。此外，一些这类试剂可能需要使用共溶剂，例如甲酰胺，NMP，乙腈，乙二醇，异丙醇，等等，以便提高所有反应物的溶解性，或为了降低水的浓度，并由此降低水合氢离子还原的速率。在一个实施方案中，NaCNBH₃用作还原剂。

本发明涉及具有提高的药理学性能的生长激素化合物共轭物，其中提高的药理学性能具体是指，例如，功能性的体内半衰期提高，血浆体内半衰期提高，平均滞留时间提高，肾清除率降低或免疫原性降低。

以正常含义使用术语“功能性的体内半衰期”，即，肽(例如生长激素)或共轭肽(例如生长激素)的50%生物活性还存在于身体/目标器官内时的时间，或肽(例如生长激素)或肽(例如生长激素)共轭物的活性达到其初始值的50%时的时间。作为测定功能性体内半衰期的替代方案，可以测定“体内血浆半衰期”，即，在廓清之前，达到50%的肽(例如生长激素)或肽(例如生长激素)共轭物在血浆或血液中循环时的时间。血浆半衰期的测定常常比测定功能性半衰期更简单，并且血浆半衰期的幅度通常很好地指示出功能性体内半衰期的幅度。血浆半衰期的替代术语包括：血浆半衰期，循环半衰期，循环的半衰期，血清廓清率，血浆清除率和廓清半衰期。

本发明的化合物产生生长激素活性，并且可以用于治疗能够受益于循环生长激素数量增加的疾病或状态。这种疾病或状态包括：生长激素缺陷(GHD)；特纳综合征；普拉德威利综合症(PWS)；努南综合症；唐氏综合征；慢性肾脏疾患，幼年型类风湿关节炎；囊性纤维化，接受HAART治疗的儿童中的HIV感染(HIV/HALS儿童)；因为胎龄短而造成的出生儿童矮小(SGA)；极低出生体重(VLBW)但SGA的出生儿童身材矮小；骨架发育异常；季肋发育不全；软骨发育不全；突发性的短身材(ISS)；成人中的GHD；长骨(例如胫骨，腓骨，股骨，肱骨，辅骨，尺骨，锁骨，掌骨，跖骨和指骨)骨折；松质骨（spongious bones）(例如，短桨（scull），手的基底和脚的基底（base of food)）骨折；肌腱或韧带手术之后的患者，例如手、膝盖或肩部手术；具有或经历牵引成骨的患者；臀部或（关节）盘置换的患者，半月板修复，脊柱制动术或假臂固定，例如在膝盖、臀部、肩部、肘、腕部或颌中；已经固定骨接合物质例如钉、螺丝和板的患者；具有骨折的不结合或不良结合的患者；截骨术(osteatomia)之后的患者，例如从胫骨或第一趾骨截骨；接枝植入之后的患者；由创伤或关节炎所引起的膝盖关节软骨退化；特纳综合征患者中的骨质疏松症；人类中的骨质疏松症；长期透析中的成年患者(APCD)；APCD中的营养不良相关的心血管疾病；APCD中的

病体质逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；老年APCD；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合症；Chron's疾病；肝功能削弱；HIV感染的男性；短肠综合征；中心性肥胖症；HIV相关的脂肪营养不良综合征(HALS)；男性不育症；成人择期手术之后的患者，洒精/药物解毒或神经创伤；衰老；高龄孱弱老人；骨关节炎；外伤损伤的软骨；勃起功能障碍；肌纤维痛；记忆病症；抑郁症；外伤性脑损伤；蛛网膜下出血；极低出生体重；代谢性综合症；糖皮质激素肌病；或由于糖皮质激素治疗儿童造成的身材矮小。按照本发明的生长激素化合物共轭物也可以用于促进肌肉组织、神经组织或伤口的愈合；促进或增进血液流向损伤组织；或降低损伤组织的感染速率。本发明由此提供了治疗这些疾病或状态的方法，该方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的按照本发明的生长激素化合物共轭物。

本文使用的按照本发明化合物的“治疗有效量”是指足够治愈、减轻或部分地抑制所给定疾病和其并发症的临床表现的数量。将足够实现该目标的数量定义为“治疗有效量”。每个目的的有效量取决于例如疾病或损伤的严重程度以及患者的体重、性别、年龄和常规状态。可以理解，可以使用常规实验测定合适剂量，通过建立数值矩阵，并试验矩阵中的不同点，这都在受过训练的医生或兽医的普通技术范围之内。

典型地，给予的衍生的生长激素的量在10^-7-10^-3 g GH/kg体重的范围，例如10^-6-10^-4 g GH/kg体重，例如10^-5-10^-4 g GH/kg体重，其中g GH表示没有GHBP的GH肽的重量。

在一个实施方案中，本发明提供了按照本发明的生长激素化合物共轭物在制备药物中的用途，该药物用于治疗上述疾病或状态。

本发明还涉及药物组合物，其包含按照本发明的生长激素化合物共轭物。在一方面，这种药物组合物包含按照本发明的生长激素化合物共轭物，其存在浓度为10-15 mg/ml至200 mg/ml，例如10-10 mg/ml至5 mg/ml，其中所述组合物具有从2.0至10.0的pH值。该组合物可以进一步包含缓冲系统、防腐剂、张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，该药物组合物是水性组合物，即包含水的组合物。这种组合物典型地是溶液剂或混悬剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物是水溶液。将术语“水性组合物”定义为：该组合物包含至少50% w/w水。同样，将术语“水溶液”定义为：包含至少50%w/w水的溶液，将术语“水悬剂”定义为：包含至少50%w/w水的混悬剂。

在一个实施方案中，药物组合物是冷冻干燥的组合物，在使用之前，医生或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。

在一个实施方案中，药物组合物是干燥组合物(例如冷冻干燥或喷雾干燥)，其不用任何预先溶解就可随时使用。

在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含按照本发明的生长激素化合物共轭物的水溶液，和缓冲剂，其中所述按照本发明的生长激素化合物共轭物的存在浓度为0.1-100 mg/ml或以上，和其中所述组合物具有大约2.0至大约10.0的pH值，且其中mg GH表示没有GHBP的GH肽的重量。

在本发明的一个实施方案中，组合物的pH值选自2.0至10.0，向上的渐变性为0.1，例如2.1、2.2、2.3等等。

在本发明的一个实施方案中，缓冲剂选自下面一组：乙酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，双甘氨肽，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，精氨酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠和三(羟甲基)-甲胺，N-二羟乙基甘氨酸，麦黄酮(tricine)，苹果酸，琥珀酸盐，马来酸，富马酸，酒石酸，门冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂的每个构成了本发明的替代性的实施方案。

在本发明的一个实施方案中，组合物进一步包含可药用防腐剂。在本发明的一个实施方案中，防腐剂选自下面一组：苯酚，邻甲酚，间甲酚，对甲酚，对羧基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，2-苯氧乙醇，对羟基苯甲酸丁酯，苯乙醇，苯甲醇，氯丁醇和硫柳汞(thiomerosal)，溴硝丙二醇，苯甲酸，咪唑啉基脲(imidurea)，双氯苯双胍己烷，脱氢醋酸钠，氯甲酚，对羟苯甲酸乙酯，氯化苄乙胺，氯酚醚(chlorphenesine)(3p-氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)或其混合物。在本发明的一个实施方案中，防腐剂存在的浓度是0.1 mg/ml至20 mg/ml。在本发明的一个实施方案中，防腐剂存在的浓度是0.1 mg/ml至5 mg/ml。在本发明的一个实施方案中，防腐剂存在的浓度是5 mg/ml至10 mg/ml。在本发明的一个实施方案中，防腐剂存在的浓度是10 mg/ml至20 mg/ml。这些具体防腐剂的每个构成了本发明的替代性的实施方案。防腐剂在药物组合物中的用途对于技术人员是众所周知的。为方便起见，参考Remington∶The Science and Practice of Pharmacy，第二十版本，2000。

在本发明的一个实施方案中，组合物进一步包含等渗压试剂。在本发明的一个实施方案中，等渗压试剂选自盐(例如氯化钠)，糖或糖醇，氨基酸(例如甘氨酸，组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，门冬氨酸，色氨酸，苏氨酸)，糖醇(例如丙三醇(甘油)，1,2-丙二醇(丙二醇)，1,3-丙二醇，1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)，或其混合物。可以使用任何糖，例如单、二或多糖，或水溶性的葡聚糖，包括例如果糖，葡糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，支链淀粉，糊精，环糊精，可溶性淀粉，羟乙基淀粉和羧甲纤维素钠。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。将糖醇定义为：具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括，例如，甘露糖醇，山梨糖醇，肌醇，半乳糖醇，卫矛醇，木糖醇和阿糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上述的糖或糖醇可以单独或组合使用。对使用数量没有固定限制，只要糖或糖醇可溶于液体药剂并且不会不利地影响使用本发明方法所获得的稳定效果即可。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度在大约1 mg/ml和大约150 mg/ml之间。在本发明的一个实施方案中，等渗压试剂的存在浓度是1 mg/ml至50 mg/ml。在本发明的一个实施方案中，等渗压试剂的存在浓度是1 mg/ml至7 mg/ml。在本发明的一个实施方案中，等渗压试剂的存在浓度是8 mg/ml至24 mg/ml。在本发明的一个实施方案中，等渗压试剂的存在浓度是25 mg/ml至50 mg/ml。这些具体等渗压试剂的每个构成了本发明的替代性的实施方案。等渗压试剂在药物组合物中的用途对于技术人员是众所周知的。为方便起见，参考Remington∶The Science and Practice of Pharmacy，第二十版，2000。

通过下列实施方案进一步说明本发明，但不局限于下列实施方案。

1. 具有下式的化合物∶

A-B-C

A是生长激素化合物的基团；

B是连接和间隔性二价残基；

C是生长激素结合蛋白化合物的基团；和

-是共价键，

其中在A与B之间的连接基和/或在B与C之间的连接基不是通过核酸的重组表达来提供的，该核酸包括编码具有结构A-B-C的融合蛋白的核酸序列。

2. 按照实施方案1的化合物，其中B不是纯肽链。

3. 具有下式的化合物∶

A-B-C

A是生长激素化合物的基团；

B是连接和间隔性二价残基；

C是生长激素结合蛋白化合物的基团；和

-是共价键，

其中B不是纯肽链。

4. 按照实施方案1至3的任一项的化合物，其中生长激素化合物包括氨基酸序列，其与SEQ ID No. 1具有至少80%的同一性，并且该生长激素化合物在实施例7所描述试验中具有至少10% hGH的活性。

5. 按照实施方案4的化合物，其中生长激素化合物包括氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No.1具有至少85%的同一性，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。

6. 按照实施方案4或实施方案5的化合物，其中生长激素化合物的活性为hGH的至少20%，例如至少30%，例如至少40%，例如至少50%，例如至少60%，例如至少70%，例如至少80%，例如至少90%，例如，基本上具有与hGH相同的活性。

7. 按照实施方案1至6的任一项的化合物，其中生长激素化合物是如下列中所述的生长激素类似物：WO2006048777，WO2004022593，WO2005018659，WO2005074524；WO2005074546，WO2005074650，US5849535，US6136563，US6022711或US6143523。

8. 按照实施方案1至6的任一项的化合物，其中生长激素化合物是hGH。

9. 按照实施方案1至8的任一项的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括氨基酸序列，其与SEQ ID No. 2具有至少80%的同一性，并且该肽能够与具有KD < 100 nM的生长激素结合。

10. 按照实施方案9的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括氨基酸序列的肽，其与SEQ ID No.2具有至少85%的同一性，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。

11. 按照实施方案10的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括SEQ ID No. 2的氨基酸序列。

12. 按照实施方案1至8的任一项的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括肽的片段，其包括氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No. 2具有至少80%的同一性，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%，例如100%的同一性，该片段保留了这种肽的大(significant)量GHBP活性。

13. 按照实施方案1至12的任一项的化合物，其中共价键A-C或B-C中的至少一个是通过酶形成的。

14. 按照实施方案13的化合物，其中所述酶选自转谷氨酰胺酶、丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。

15. 按照实施方案14的化合物，其中所述酶是选自微生物转谷氨酰胺酶、组织转谷氨酰胺酶和因子XIII的转谷氨酰胺酶。

16. 按照实施方案15的化合物，其中微生物转谷氨酰胺酶是来源于茂原链霉菌（S. mobaraense）或S. ladakanum的转谷氨酰胺酶。

17. 按照实施方案15的化合物，其中微生物转谷氨酰胺酶是如WO2007/02029、WO2008/020075和/或WO2008/020075所述的转谷氨酰胺酶。

18. 按照实施方案1至17的任一项的化合物，其中B包括至少10个共价键。

19. 按照实施方案18的化合物，其中B包括至少30个共价键。

20. 按照实施方案19的化合物，其中B包括至少80个共价键。

21. 按照实施方案20的化合物，其中B包括至少300个共价键。

22. 按照实施方案21的化合物，其中B包括至少1000个共价键。

23. 按照实施方案22的化合物，其中B包括至少3000个共价键。

24. 按照实施方案1至23的任一项的化合物，其中B包括PEG单元。

25. 按照实施方案24的化合物，其中B包括结构

其中n是大于1的整数，且该结构的分子量在大约100 Da至大约1,000,000 kDa之间。

26. 按照实施方案24或实施方案25的化合物，其中B包括大约300至大约50,000 kDa的PEG单元。

27. 按照实施方案26的化合物，其中B包括具有下列分子量的PEG单元：例如，大约300，500，750，1,000，2,000，5,000，10,000，20,000，30,000，40,000或50,000 kDa。

28. 按照实施方案26的化合物，其中B包括具有大约1,000至10,000分子量的PEG单元。

29. 按照实施方案1至3的任一项的化合物，其中B选自-CH₂-CH₂-，

30. 按照实施方案15至17的任一项的下式的化合物，

其中P-C(O)-NH-代表生长激素化合物基团，其是通过从Gln的侧链的-NH₂中除去氢而获得的；

D代表键或氧；

R代表连接基或键；

E代表连接基或键；

A代表肟，腙，苯腙，缩氨基脲，三唑或异

唑烷部分；和

Z是上述生长激素结合蛋白化合物的基团。

31. 按照实施方案30的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括氨基酸序列，其与SEQ ID No. 2具有至少80%的同一性，并且该肽能够与具有KD < 100 nM的生长激素结合。

32. 按照实施方案31的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括氨基酸序列，其与SEQ ID No.2具有至少85%的同一性，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。

33. 按照实施方案32的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括SEQ ID No. 2的氨基酸序列。

34. 按照实施方案30的化合物，其中生长激素结合蛋白化合物包括肽的片段，该肽包括氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No. 2具有至少80%的同一性，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%，例如100%的同一性，该片段保留了这种肽的大(significant)量GHBP活性。

35. 按照实施方案30至34的任一项的化合物，其中A代表肟或三唑部分。

36. 按照实施方案30至35的任一项的化合物，其中生长激素化合物是在相当于SEQ ID No. 1中的141位的位置共轭的。

37. 按照实施方案15至17的任一项的式(I)的化合物，

(I)

其中

Prot代表上述生长激素化合物的基团，其中所述基团形式上是通过从所述生长激素化合物的氨基(-NH₂)上形式（formal）除去氢原子而产生的，

R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基或芳基；

R²代表键或连接基，其中所述连接基包括选自下列的双自由基：C(=O)NH, NH, O, S, OP(O)(OH)O, OC(=O)NH, NHC(=O)NH,(CH₂)₁₁₀, O(CH₂)₃NHC(=O), C(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₁₃₀C(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₀₃₀C(=O)NH(CH₂CH₂O)₁₁₀(CH₂)₁₅C(=O), C(=O)NH[(CH₂CH₂O)₁₁₀(CH₂)₁₅C(=O)]₁₅NH(CH₂)₂₃₀, C(=O),(CH₂)₁₃₀-NHC(=O),(CH₂)₁₃₀C(=O), NHC(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₁₃₀-NHC(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₀₃₀C(=O)NH(CH₂)₂₃₀NHC(=O)(CH₂)₀₃₀,(CH₂)₀₃₀C(=O)NH(CH₂CH₂O)₁₃₀CH₂CH₂NHC(=O)(CH₂)₀₃₀或NH(CH₂)₂₃₀，

,

，和其组合，和

R³代表上述生长激素结合蛋白化合物的基团；

R⁴代表氢或C₁₆-烷基；和

R⁵代表-CH₂-或-C(=O)-。

38. 按照实施方案37的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_5-22-芳基。

39. 按照实施方案38的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-18-芳基。

40. 按照实施方案39的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_4-16-芳基。

41. 按照实施方案40的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-8-芳基。

42. 按照实施方案37至41的任一项的化合物，其中R¹代表C_5-22-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

43. 按照实施方案42的化合物，其中R¹代表C_6-18-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

44. 按照实施方案43的化合物，其中R¹代表C_6-14-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

45. 按照实施方案37至41的任一项的化合物，其中R¹代表C_5-22-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

46. 按照实施方案45的化合物，其中R¹代表C_6-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

47. 按照实施方案46的化合物，其中R¹代表C_6-14-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

48. 按照实施方案37至41的任一项的化合物，其中R¹代表C_6-8-亚芳基，C_12-18-亚芳基或C_5-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

49. 按照实施方案48的化合物，其中R¹代表亚苯基或亚吡啶基。

50. 按照实施方案49的化合物，其中R¹代表1,4-亚苯基。

51. 按照实施方案37至50的任一项的化合物，其中R²代表键，-C(=O)-，C(=O)NH，或

。

52. 按照实施方案51的化合物，其中R²代表C(=O)NH。

53. 按照实施方案37至52的任一项的化合物，其中R⁴代表氢。

54. 按照实施方案37至52的任一项的化合物，其中R⁴代表C_1-6-烷基。

55. 按照实施方案37至54的任一项的化合物，其中R⁵代表-CH₂-。

56. 按照实施方案37至54的任一项的化合物，其中R⁵代表-C(=O)-。

57. 按照实施方案37至56的任一项的化合物，其中Prot是从生长激素化合物衍生的下式的醛或酮所获得的：

R⁶-C(=O)-R⁵-Prot,

其中

R⁵如上所述，和

R⁶代表氢或任选取代的α-碳原子。

58. 按照实施方案57的化合物，其中R⁶代表氢，C₁₆-烷基或C₁₆-环烷基。

59. 按照实施方案58的化合物，其中R⁶代表氢，甲基，乙基，丙基，环丙基，环丁基，环戊基，或环己基。

60. 按照实施方案59的化合物，其中R⁶代表氢或甲基。

61. 按照实施方案37至60的任一项的化合物，其中Prot代表上述生长激素化合物的基团，其中所述基团形式上是通过从所述生长激素化合物的氨基(-NH₂)上除去氢原子所产生的，且其中所述氨基是肽的N端氨基，肽中的赖氨酸残基的侧链氨基，或肽中的谷氨酰胺或天冬酰胺(C(=O)NH₂)残基的侧链氨基。

62. 按照实施方案61的化合物，其中Prot代表生长激素化合物的基团，其形式上是通过从N端氨基上除去一个氢原子所产生的。

63. 按照实施方案61的化合物，其中Prot代表生长激素化合物的基团，其形式上是通过从肽中的赖氨酸残基的侧链氨基上除去一个氢原子所产生的。

64. 按照实施方案61的化合物，其中Prot代表生长激素化合物的基团，其形式上是通过从肽中的谷氨酰胺或天冬酰胺残基的侧链氨基上除去一个氢原子所产生的。

65. 按照实施方案37至64的任一项的化合物，其中Prot基团代表肽基团，其形式上是通过从谷氨酰胺的侧链氨基羰基(H₂N-CO-)上、在相当于SEQ ID No. 1的40位的位置除去一个氢原子所产生的。

66. 按照实施方案37至64的任一项的化合物，其中Prot基团代表肽基团，其形式上是通过从谷氨酰胺的侧链氨基羰基(H₂N-CO-)上、在相当于SEQ ID No. 1中的141位的位置除去一个氢原子所产生的。

67. 按照实施方案14的化合物，其中所述酶是选自羧肽酶Y、胰蛋白酶和糜蛋白酶的丝氨酸蛋白酶。

68. 按照实施方案14的化合物，其中所述酶是选自木瓜蛋白酶、分选酶(sortase)A和分选酶(sortase)B的半胱氨酸蛋白酶。

69. 按照实施方案1至68的任一项的化合物，其中共价键A-C或B-C中的至少一个是与半胱氨酸残基结合的硫醚键。

70. 药物组合物，其包含按照实施方案1-69的任一项的化合物和可药用载体。

71. 治疗哺乳动物疾病状态的方法，对于这种疾病状态哺乳动物可以从生长激素的活性提高而受益，该方法包括给予哺乳动物有效量的按照实施方案70的药物组合物。

72. 按照实施方案1至69的任一项的化合物，用于治疗。

73. 按照实施方案1至69的任一项的化合物，用于治疗哺乳动物的疾病状态，对于该疾病状态哺乳动物从生长激素的活性提高而受益。

74. 按照实施方案1至69的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组合物用于治疗哺乳动物的疾病状态，对于该疾病状态哺乳动物从生长激素的活性提高而受益。

75. 制备按照实施方案1至69的任一项的化合物的方法，所述方法包括

(a)   生长激素化合物的酶催衍生化，和

(b)   使步骤(a)的酶催衍生的生长激素化合物与生长激素结合蛋白化合物共轭。

76. 制备按照实施方案30至36的任一项的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

i)    在一个或多个步骤中，在能够将所述第一个化合物催化结合到所述生长激素化合物中的转谷氨酰胺酶的存在下，使上述生长激素化合物与包含一个或多个官能团或潜在官能团的第一个化合物反应，形成官能化的生长激素化合物，其中所述官能团或潜在官能团在构成所述生长激素化合物的任何氨基酸残基中不易受影响（not accessible）；和

ii)   任选将潜在的官能团活化；和

iii)  在一个或多个步骤中，使所述官能化的生长激素化合物与包含一个或多个官能团的第二个化合物反应，其中所述官能团不与在构成所述肽的氨基酸残基中易受影响（accessible）的官能团反应，其中在所述第二个化合物中的所述官能团能够与在所述第一个化合物中的所述官能团反应，使得在所述官能化的肽和所述第二个化合物之间形成共价键，和其中所述第二个化合物包含上述生长激素结合蛋白化合物的基团。

77. 按照实施方案76的方法，其中包含Gln-残基的由下式代表的生长激素化合物

在转谷氨酰胺酶的存在下、在一个或多个步骤中与下式代表的含氮亲核剂(第一个化合物)反应，

形成下式的转氨肽

,

任选将包含在X中的潜在官能团活化，

所述转氨生长激素化合物进一步与下式的第二个化合物反应

形成下式的共轭生长激素化合物

其中D代表键或氧；

R代表连接基或键；

X代表基团，其包括在构成肽P-C(=O)-NH₂的氨基酸残基中不易受影响（not accessible）的官能团或潜在官能团；

Y代表包含一个或多个官能团的基团，该官能团与X中存在的官能团反应，并且该官能团不与肽P-C(O)-NH₂中易受影响（accessible）的官能团反应；

E代表连接基或键；

A代表由包含在X和Y中的官能团之间的反应所形成的部分；和

Z包含上述生长激素结合蛋白化合物的基团。

78. 按照实施方案77的方法，其中代表肟，腙，苯腙，缩氨基脲，三唑或异

唑烷部分。

79. 按照实施方案77或实施方案78的方法，其中包含在X中的官能团或潜在官能团选自下列官能团或可以被活化为选自下列的官能团：酮-，醛-，-NH-NH2,-O-C(O)-NH-NH2,-NH-C(O)-NH-NH2,-NH-C(S)-NH-NH2,-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2,-NH-NH-C(O)-NH-NH2,-NH-NH-C(S)-NH-NH2,-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2,-C(O)-NH-NH2, –O-NH2,-C(O)-O-NH2,-NH-C(O)-O-NH2,-NH-C(S)-O-NH2，炔烃，叠氮化物或腈-氧化物。

80. 按照实施方案77至79的任一项的方法，其中存在于Y中的官能团选自：酮-，醛-，-NH-NH2,-O-C(O)-NH-NH2,-NH-C(O)-NH-NH2,-NH-C(S)-NH-NH2,-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2, -NH-NH-C(O)-NH-NH2,-NH-NH-C(S)-NH-NH2,-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2,    -C(O)-NH-NH2, –O-NH2,-C(O)-O-NH2,-NH-C(O)-O-NH2,-NH-C(S)-O-NH2，炔烃，叠氮化物和腈-氧化物。

81. 按照实施方案77至80的任一项的方法，其中X选自或可以活化为酮-或醛衍生物，Y选自-NH-NH₂,-O-C(O)-NH-NH₂,-NH-C(O)-NH-NH₂,-NH-C(S)-NH-NH₂,-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH₂,-NH-NH-C(O)-NH-NH₂,-NH-NH-C(S)-NH-NH₂,-NH-C(O)-C₆H₄-NH-NH₂,-C(O)-NH-NH₂,-O-NH₂,-C(O)-O-NH₂,-NH-C(O)-O-NH₂和-NH-C(S)-O-NH₂。

82. 按照实施方案81的方法，其中包含在X中的潜在基团选自：

其中R⁹选自H，C_1-6烷基，芳基和杂芳基。

83. 按照实施方案77至80的任一项的方法，其中X和Y各自代表由炔烃和三唑组成的，或由炔烃和腈-氧化物组成的组中的不同成员。

84. 按照实施方案77或81的任一项的方法，其中所述含氮的亲核剂选自：4-(氨甲基)苯基乙酮，4-(2-氨乙基)苯基乙酮，N-(4-乙酰基苯基)2-氨基乙酰胺，1-[4-(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮，1-[3-(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮，1,4-二(氨氧基)丁烷，3-氧杂戊烷-1,5-二氧基胺，1,8-二氨氧基-3,6-二氧杂辛烷，1,3-二(氨氧基)丙-2-醇，1,11-二(氨氧基)-3,6,9-三氧杂十一烷，1,3-二氨基-2-丙醇，1,2-二(氨氧基)乙烷和1,3-二(氨氧基)丙烷。

85. 制备按照实施方案37至66的任一项的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)   用改变性能基团衍生的苯胺或杂芳基胺来处理衍生自生长激素化合物的醛或酮，得到亚胺或α-氨基醇（hemiaminal），其中所述改变性能基团包括上述生长激素结合蛋白或其片段，

(b)   用合适还原剂例如NaCNBH₃处理这种亚胺或α-氨基醇(hemiaminal)，得到仲胺。

86. 按照实施方案85的方法，其中生长激素化合物衍生的醛或酮是通过高碘酸盐介导的肽化合物的氧化来制备的，其中肽化合物包含2-氨基乙醇子结构。

87. 按照实施方案85的方法，其中生长激素化合物衍生的醛或酮是通过缩醛或半缩醛的水解来制备的。

88. 按照实施方案85的方法，其中生长激素化合物衍生的醛是通过高碘酸盐介导的肽的氧化来制备的，其中肽包含丝氨酸或苏氨酸作为N端氨基酸。

89. 按照实施方案85的方法，其中生长激素化合物衍生的醛是通过高碘酸盐介导的、用1,3-二氨基-2-丙醇酶催转氨化的肽的氧化来制备的。

90. 按照实施方案85的方法，其中生长激素化合物衍生的醛或酮是如下制备的：供给遗传修饰或未修饰的有机体，产生带有非天然氨基酸的、包含醛或酮官能团的所述肽，其中所述氨基酸结合进肽中，而后对已经结合了非天然氨基酸的肽进行分离和纯化。

91. 按照实施方案90的方法，其中非天然氨基酸是(乙酰基苯基)丙氨酸或(甲酰基苯基)丙氨酸。

92. 按照实施方案90或实施方案91的方法，其中编码肽的mRNA包括至少一个编码苯丙氨酸的密码子。

93. 按照实施方案85至92的任一项的方法，其中改变性能基团衍生的苯胺或杂芳基胺具有下式

(III)

其中R¹、R²和R³如实施方案37所定义。

94. 按照实施方案93的方法，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_5-22-芳基。

95. 按照实施方案94的方法，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-18-芳基。

96. 按照实施方案95的方法，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_4-16-芳基。

97. 按照实施方案96的方法，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-8-芳基。

98. 按照实施方案93至97的任一项的方法，其中R¹代表C_5-22-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

99. 按照实施方案98的方法，其中R¹代表C_6-18-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

100. 按照实施方案99的方法，其中R¹代表C_6-14-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

101. 按照实施方案93至97的任一项的方法，其中R¹代表C_5-22-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

102. 按照实施方案101的方法，其中R¹代表C_6-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

103. 按照实施方案102的方法，其中R¹代表C_6-14-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

104. 按照实施方案93至97的任一项的方法，其中R¹代表C_6-8-亚芳基，C_12-18-亚芳基或C_5-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

105. 按照实施方案104的方法，其中R¹代表亚苯基或亚吡啶基。

106. 按照实施方案105的方法，其中R¹代表1,4-亚苯基。

107. 按照实施方案93至106的任一项的方法，其中R²代表键，C(=O)NH，或

。

108. 按照实施方案107的方法，其中R²代表C(=O)NH。

109. 按照实施方案85至108的任一项的方法，其中生长激素化合物衍生的醛或酮具有下式

R⁶-C(=O)-R⁵-Prot,

其中

Prot如实施方案37所述，

R⁵是-CH₂-或-C(=O)-，和

R⁶代表氢或任选取代的α-碳原子。

110. 按照实施方案109的方法，其中R⁵代表-CH₂-。

111. 按照实施方案109的方法，其中R⁵代表-C(=O)-。

112. 按照实施方案109至111的任一项的方法，其中R⁶代表氢，C₁₆-烷基或C₁₆-环烷基。

113. 按照实施方案112的方法，其中R⁶代表氢，甲基，乙基，丙基，环丙基，环丁基，环戊基，或环己基。

114. 按照实施方案113的方法，其中R⁶代表氢或甲基。

115. 按照实施方案85至114的任一项的方法，其中改变性能基团是在相当于SEQ ID No.1中的40位的位置与肽共轭的。

116. 按照实施方案85至114的任一项的方法，其中改变性能基团是在相当于SEQ ID No.1中的141位的位置与肽共轭的。

117. 式(III)的化合物，

(III)

其中R¹、R²和R³如实施方案37所定义。

118. 按照实施方案117的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_5-22-芳基。

119. 按照实施方案118的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-18-芳基。

120. 按照实施方案119的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_4-16-芳基。

121. 按照实施方案120的化合物，其中R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基，或C_6-8-芳基。

122. 按照实施方案117至121的任一项的化合物，其中R¹代表C_5-22-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

123. 按照实施方案122的化合物，其中R¹代表C_6-18-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

124. 按照实施方案123的化合物，其中R¹代表C_6-14-亚芳基，其是任选取代的，如上所述。

125. 按照实施方案117至121的任一项的化合物，其中R¹代表C_5-22-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

126. 按照实施方案125的化合物，其中R¹代表C_6-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

127. 按照实施方案126的化合物，其中R¹代表C_6-14-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

128. 按照实施方案117至121的任一项的化合物，其中R¹代表C_6-8-亚芳基，C_12-18-亚芳基或C_5-18-亚杂芳基，其是任选取代的，如上所述。

129. 按照实施方案128的化合物，其中R¹代表亚苯基或亚吡啶基。

130. 按照实施方案129的化合物，其中R¹代表1,4-亚苯基。

131. 按照实施方案117至130的任一项的化合物，其中R²代表键，-C(=O)-，C(=O)NH，或

。

132. 按照实施方案131的化合物，其中R²代表C(=O)NH。

133. 制备按照实施方案15至17的任一项的化合物的方法，该方法包括

i)    在转谷氨酰胺酶的存在下，使上述生长激素化合物与具有下式的第一个化合物接触∶R⁷GlnGlyR⁸，其中R⁷和R⁸是适合于进一步修饰的基团，和

ii)   在一个或多个步骤中，使步骤i)的产物与包含一个或多个官能团的第二个化合物反应，其中所述官能团不与构成所述肽的氨基酸残基中易受影响（accessible）的官能团反应，且其中在所述第二个化合物中的所述官能团能够与R⁷和/或R⁸反应，使得在步骤i)的产物和所述第二个化合物之间形成共价键，和其中所述第二个化合物包含上述生长激素结合蛋白化合物的基团。

134. 按照实施方案133的方法，其中R⁷包含芳香或杂芳香族基团。

135. 按照实施方案134的方法，其中R⁷是苄氧羰基(PhCH₂OC(=O))。

136. 按照实施方案133至135的任一项的方法，其中R⁸是包含选自下列的官能团的基团：CHO，ONH₂，ArNH₂，炔基，叠氮化物，NHNH₂，CHXCH₂Y或CHYCH₂X(其中X是O或N，Y是O)，缩醛或各种潜在的醛，SH，ZCH₂C=O(其中Z是Cl、Br或I)。

137. 按照实施方案133的方法，其中第一个化合物具有下式

。

138. 按照实施方案133至136的任一项的方法，其中生长激素化合物是在赖氨酸残基处共轭的。

139. 按照实施方案138的方法，其中生长激素化合物是在相当于SEQ ID No.1中的145位的位置共轭的。

在下面的实施例中进一步说明本发明。然而，应该理解，这些实施例仅仅是说明性的目的，不应该以任何方式用于限制本发明的范围。

实施例

实施例中使用的TG酶是得自于茂原轮链丝菌的微生物转谷氨酰胺酶(按照US5156956)。

实施例还包括下列一般方法∶

毛细管电泳

毛细管电泳是使用Agilent Technologies 3DCE系统(Agilent Technologies)进行的。数据采集和信号处理是使用Agilent Technologies 3DCE ChemStation进行的。毛细管是64.5cm(56.0 cm有效长度)、50μm i.d.“Extended Light Path Capillary”(得自于Agilent)。UV检测是在200 nm处进行的(16 nm Bw，参比380 nm和50 nm Bw)。移动电解质是磷酸盐缓冲液，50mM，pH7(方法A)。用0.1M NaOH调节毛细管3min，然后用Milli-Q水调节2 min，并用电解质调节3 min。每次操作之后，用Milli-Q水冲洗毛细管2 min，然后用磷酸冲洗2min，并用Milli-Q水冲洗2min。在50 mbar下进行水动力注射4.0 s。电压是+25 kV。毛细管温度是30℃，运行时间是10.5min。

Maldi-Tof质谱

使用Autoflex Maldi-Tof仪器(Bruker)测定分子量。使用alfa-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质来制备样品。

RP-HPLC

在Agilent 1100系统上进行RP-HPLC分析，使用Vydac 218TP54 4.6mm x 250mm 5μm C-18硅胶柱(The Separations Group，Hesperia)。在214 nm、254 nm、280 nm和301 nm处利用UV进行检测。用0.1%三氟醋酸/水将柱平衡，用0至90%乙腈(相对于0.1%三氟醋酸/水)的合适梯度来洗脱样品。

LC-MS

LC-MS分析是在PE-Sciex API 100或150质谱仪(配备两个Perkin Elmer Series 200微型泵，Perkin Elmer Series 200自动取样器，Applied Biosystems 785A UV检测器和Sedex 75蒸发光散射检测器)上进行的。在室温下，以1.5 ml/min的速率洗脱Waters Xterra 3.0 mm x 50 mm 5m C-18硅胶柱。用5%乙腈/0.1%三氟醋酸/水将其平衡，用5%乙腈/0.1%三氟醋酸/水洗脱1.0 min，而后用线性梯度至90%乙腈/0.1%三氟醋酸/水洗脱7 min。利用UV检测(在214nm处)和蒸发光散射进行检测。将一部分柱洗脱物引入PE-Sciex API 100质谱仪的离子喷雾接口。在操作期间，每2秒扫描质量范围300-2000 amu。

蛋白的定量

使用NanoDrop ND-1000 UV-光谱仪，通过在280 nm处测定吸光度，估算蛋白浓度。

测定衍生位点的酶催肽图

使用还原和烷基化蛋白的Asp-N分解来完成肽图。按照标准方法，首先用DTT(二硫苏糖醇)和碘乙酰胺处理蛋白。使用HPLC将烷基化产物纯化。随后，用内切蛋白酶Asp-N(Boehringer)(以1:100的酶∶底物比例)将烷基化的纯化产物消化过夜。使用C-18柱和标准三氟醋酸/乙腈缓冲系统，将消化物进行HPLC分离。将得到的肽图与非衍生的hGH的肽图进行比较，收集具有不同保留时间的馏份，并使用Maldi-tof质谱进行进一步的分析。

SDS page

使用NuPAGE 4%-12% Bis-Tris凝胶剂(Invitrogen NP0321BOX)，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。该凝胶剂是银染色(Invitrogen LC6100)或Coomassie染色(Invitrogen LC6065)的，并且其中还相关的是用碘化钡将PEG染色，如M. M. Kurfurst在Anal.Biochem. 200(2):244-248，1992中的描述。

蛋白色谱

在?kta Explorer色谱系统和得自于GE Health Care的柱上进行蛋白色谱。使用Q-琼脂糖凝胶HP 26/10柱进行阴离子交换。起始缓冲液是20 mM三乙醇胺缓冲液(pH8.5)，洗脱缓冲液是起始缓冲液+ 0.2M NaCl。典型地用0-75%洗脱缓冲液(超过15个柱体积)的梯度洗脱化合物。使用HiPrep 26/10柱进行脱盐和缓冲液交换。

实施例1

SER-GHBP的制备

基于pNNC13(Zbasic2mt-D4K-hGH)(其在与Zbasic区域(mvdnkfnkerrrarreirhlpnlnreqrrapirslrddpsqsanllaeakklnraqapkyrggsddddksfptiplsrlfdnamlrahrlhqlafdtyqefeeayipkeqkysflqnpqtslcfsesiptpsnreetqqksnlellrisllliqswlepvqflrsvfanslvygasdsnvydllkdleegiqtlmgrledgsprtgqifkqtyskfdtnshnddallknygllycfrkdmdkvetflrivqcrsvegscgf)的融合过程中表达野生型hGH)，产生Ser-hGH类似物表达质粒。

借助于得自于Stratagene的QuikChange? XL定位诱变试剂盒，用下列一对引物将额外的Ser插入在Phe(成熟型hGH的第一个氨基酸)前面∶

5’端∶pNNC13 Ser-F

5’-GGATCAGACGACGACGACAAAagcTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3’ 和

3’端∶pNNC13 Ser-R

5’-GGATAAGGGAATGGTTGGGAAgctTTTGTCGTCGTCGTCTGATCC-3’。

利用pET11a-Zbasic2mt-D4K-Ser-hGH，将大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。将单菌落接种到含有100μg/ml Amp的100ml LB介质中，并在37℃培育。当OD600达到0.6时，将细胞培养物温度降低至30℃，并在30℃，用1mM IPTG引发细胞4小时。通过在3000g离心15分钟(Eppendorf离心机5810R)，采集细菌细胞。将细胞颗粒重新悬浮在细胞溶解缓冲液(25 mM Na2HPO4，25 mM NaH2PO4，pH7，5 mM EDTA，0.1% Triton X-100)中，并通过在30 kpsi下进行细胞破裂而使细胞破碎(Constant Cell Disruption Systems)。通过在10000g下离心30分钟，将溶胞产物澄清。保留上清液，并用于纯化，除去颗粒。

在SP-琼脂糖凝胶上纯化Zbasic2mt-D4K-Ser-hGH，使用逐步的梯度洗脱(缓冲液A∶25 mM Na2HPO4，25 mM NaH2PO4，pH7；缓冲液B∶25 mM Na2HPO4，25 mM NaH2PO4，pH7，1M NaCl)。随后使用肠激酶将蛋白断裂，释放Ser-hGH。在丁基琼脂糖凝胶4FF柱上进一步纯化Ser-hGH，以便从Zbasic2mt-D4K区域和肠激酶中分离产物(缓冲液A∶100 mM Hepes，pH7.5；缓冲液B∶100 mM Hepes，pH7.5，2M NaCl，使用线性梯度)。将Ser-hGH的最终产物进行缓冲液交换，并从50 mM NH₄HCO₃(pH7.8)中冷冻干燥出来。

实施例2

N-羰基氧基苄基-谷氨酰胺酰基-甘氨酰-(4-氨基-苯丙氨酸)[Z-Gln-Gly-(4-氨基-Phe)-OH](化合物2)的制备

将第一个氨基酸与树脂连接∶向2-氯三苯甲基氯树脂(Pepchem，2 g，1.5 mmol/g)中加入Fmoc-(4-Boc-氨基-Phe)-OH(Fluka，2.26 g，4.5 mmol)(溶解在DCM(16 ml)和二异丙基乙胺(780μl)的混合物中)。将浆液搅拌5 min，而后加入二异丙基乙胺(1540μl)。继续搅拌1小时，而后加入甲醇(5 ml)，并继续额外搅拌15 min。使树脂滴干，并用二氯甲烷(DCM)(6 x 30 ml)洗涤，而后用N-甲基吡咯烷酮(NMP)(6 x 30 ml)洗涤。

除去Fmoc基团∶向该树脂中加入20%哌啶/NMP(20 ml)，并保持反应15 min。使树脂滴干，再次用20%哌啶/NMP(20 ml)处理1小时。使树脂滴干，并用NMP(6 x 30 ml)洗涤。连接Z-Gln-Gly-OH∶向该树脂中加入Z-Gln-Gly-OH(Bachem，1.52 g，4.5 mmol)和羟基苯并三唑(HOBt，0.61 g，4.5 mmol)的NMP溶液，而后加入二异丙基碳二亚胺(DIC)(700μl，4.5 mmol)。反应过夜之后，使树脂滴干，并用NMP(6 x 30 ml)洗涤，而后用DCM(6 x 30 ml)洗涤。

从固体载体上分离：使树脂滴干，除去大部分DCM。将其用三氟乙酸(TFA)(12.6 ml)、水(0.6 ml)、DCM(5.8 ml)和三异丙基硅烷(0.8 ml)的混合物处理。反应1小时之后，将树脂在15 min之内慢慢地过滤到二乙醚(100 ml)中，将其额外搅拌30 min。离心回收得到的沉淀，用二乙醚洗涤3次。将固体真空干燥过夜。根据¹H-NMR和LC-MS，证明产物是纯的和同质的。

实施例3

用Z-Gln-Gly-(4-氨基-Phe)-OH(化合物2)将hGH转酰胺化，获得Z-Gln(hGH)-Gly-(4-氨基-Phe)-OH(化合物3)

制备三个溶液∶ 1)溶解在1 ml 20 nM三乙醇胺缓冲液(pH8.5)中的hGH(40 mg，1.8μmol)；2)溶解在2 ml 20 nM三乙醇胺缓冲液(pH8.5)中的Z-Gln-Gly-OH(202 mg，412μmol)，使用10%三乙醇胺溶液(2.4 ml)将pH值调节至8.15；3)将转谷氨酰胺酶(1%，在与麦芽糖糊精的固体混合物中，36 mg，9 nmol)溶解在1 ml 20 nM三乙醇胺缓冲液(pH8.5)中。

将溶液1和2混合，并加入111μl溶液3。pH值是8.2，体积是5.5 ml。用CE监控反应。在室温反应5小时之后，CE分析显示存在新的产物，其具有提高的迁移时间，显示了向转酰胺化产物的大约70%转化率。向该反应混合物中加入10 mM N-乙基马来酰亚胺水溶液(300μl)，并将其在5℃保存过夜。将该混合物加载到15 ml HiPrep柱(GE Healthcare)上，并使用三乙醇胺缓冲液(pH8.5)洗脱，除去低分子量物质和盐。收集相关的级分，回收36.6 mg蛋白(基于UV吸收测定)。

实施例4

Ser-GHBP氧化为二醛基（glyoxalyl）-GHBP

如下面实施例6所述，将Ser-GHBP氧化为二醛基(glyoxalyl)-GHBP。

实施例5

用实施例3的化合物3将二醛基（glyoxalyl）GHBP还原胺化

利用类似于实施例6的(E)部分所描述的方法，用实施例3的化合物3对二醛基（glyoxalyl）-hGHBP进行还原胺化，得到GH-GHBP共轭物。

实施例6

(A)Ser-hGH氧化为二醛基(glyoxalyl)-hGH(II)

制备下列溶液∶

缓冲液A∶ 将三乙醇胺(119 mg，0.8 mmol)溶解在水(40 ml)中。将pH值调节至8.5。

缓冲液B∶ 将3-甲硫基丙醇(725 mg，7.1 mmol)溶解在缓冲液A(10 ml)中。

高碘酸盐∶ 将NaIO₄(48.1 mg，0.225 mmol)溶解在水(1.0 ml)中。

4-氨基苯甲酸∶ 将10 mg(73μmol)4-氨基苯甲酸(Mwt.∶137)溶解在2.5 ml 50%乙酸、50%缓冲液A中

将Ser-hGH(50 mg，2.3μmol)溶解在冷缓冲液A(5.0 ml)中，并加入1.0 ml缓冲液B。加入高碘酸盐溶液(0.5 ml)。在4℃(冰箱)静置20 min之后，将该混合物转入渗析管(Amicon Ultra-15 device；截留10.000)，并用缓冲液A渗析四次。

将残余物浓缩至2.5 ml体积。

(B)用4-氨基苯甲酸将二醛基（glyoxalyl）-hGH II还原胺化

将氧化的Ser-hGH溶液在制备其之后立即加入到4-氨基苯甲酸溶液中，并将得到的混合物在4℃慢慢地转动。1小时之后，加入NaCNBH₃(100μl，20 mg NaCNBH₃和15μl AcOH的0.5 ml水溶液)。将该混合物在4℃、在暗处保存。

42小时之后，用缓冲液A将该混合物稀释10倍，并将产物III用离子交换色谱法纯化。

(C)使用1,3-二氨基-2-丙醇对III的转氨作用

制备下列溶液∶

缓冲液A∶ 将三乙醇胺(119 mg，0.8 mmol)溶解在水(40 ml)中。将pH值调节至8.5。

亲核剂溶液∶ 将1,3-二氨基丙醇(90 mg，1.0 mmol)溶解在缓冲液A(300μl)中。用浓盐酸将pH值调节至8.5，并用缓冲液A将体积调节至600μl。

酶溶液∶ 将25 mg TG酶溶解在200μl缓冲液A中。

通过超滤将纯化产物III浓缩至1.7 ml。将1.0 ml乙二醇(30%)与亲核剂溶液一起加入到该溶液中。最终加入酶溶液，并用缓冲液A将总体积调节至3.5 ml。

将反应在室温下保持4-6小时。

用缓冲液A将该反应溶液稀释10倍，并将产物IV用离子交换色谱法纯化。

(D)IV的氧化

制备下列溶液∶

缓冲液B∶ 将3-甲硫基丙醇(725 mg，7.1 mmol)溶解在缓冲液A(10 ml)中。

缓冲液C∶ 将HEPES(5.96 g)溶解在水(1.0 l)中。将pH值调节至7.0。

高碘酸盐∶ 将NaIO₄(48.1 mg，0.225 mmol)溶解在水(1.0 ml)中。

向IV(10 mg，0.5μmol)的溶液中加入0.2 ml缓冲液B，而后加入高碘酸盐溶液(0.03 ml)。在冷却下培养20 min之后，将该混合物用缓冲液C渗析4次。将残余物浓缩至1 ml。

(E)用GHBP将V还原胺化

使用与M.Sundstrom等人在J.Biol.Chem. 271(50):32197-32203(1996)中所描述方法类似的方法，获得GHBP，不同的是，在最后的离子交换色谱步骤之后，用25 mM HEPES缓冲液(pH7.0)将GHBP渗析，并浓缩至5 mg/ml的最后浓度。

在25 mM HEPES缓冲液(pH7.0)中，将得自于D.的最终溶液(1 ml，10 mg，0.45μmol V)与GHBP溶液(2 ml，10 mg 0.3μmol)混合，并将得到的混合物在室温下慢慢地转动。

1小时之后，分批地加入NaCNBH₃(100μl，20 mg NaCNBH₃的0.5 ml水溶液)。将该混合物在室温下、在暗处保存18-24小时。

将该混合物用1M tris溶液稀释至50mM的最后浓度(pH7.5)，并施加到离子交换柱上，通过用NaCl₂的梯度洗脱柱，获得产物VI。

实施例7

测定生长激素活性的BAF-3GHR试验

BAF-3细胞(鼠的前B淋巴样细胞系，源于骨髓)的生长和存活最初是IL-3依赖性的。IL-3活化JAK-2和STAT(它们是相同的介质)，当刺激时，GH活化。转染hGH受体之后，将该细胞系转变成生长激素-依赖性细胞系。这种克隆可用于评估不同生长激素样品对BAF-3GHR的存活的影响。

在37℃、5% CO₂条件下，将BAF-3GHR细胞在饥饿介质(不含生长激素的培养基)中培育24小时。

洗涤细胞，再悬浮在饥饿介质中，并播种在平皿中。将10μl生长激素化合物或hGH(处于不同浓度)或对照物加入到细胞中，并在37℃、5% CO₂条件下将平皿培养68小时。

将AlamarBluea加入到每个孔中，并将细胞进一步培养4小时。AlamarBluea是氧化还原指示剂，其由于细胞代谢固有的反应而减少，并因此间接测定了活细胞数目。

在荧光读盘机中测定细胞的代谢活性。样品的吸光度用细胞的%表达，该细胞没有用生长激素化合物或对照物刺激，并且可以由浓度-响应曲线来计算活性(刺激50%细胞的化合物的数量，EC₅₀值)。

序列表

 

<110>  Novo Nordisk A/S

       Johansen, Nils Langeland

 

<120>  稳定性提高的生长激素共轭物

 

<130>  7743.204-WO

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  191

<212>  PRT

<213>  智人

 

<400>  1

 

Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg

1               5                   10                  15     

 

 

Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu

            20                  25                  30         

 

 

Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro

        35                  40                  45             

 

 

Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu

65                  70                  75                  80 

 

 

Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val

                85                  90                  95     

 

 

Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp

            100                 105                 110        

 

 

Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu

        115                 120                 125            

 

 

Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser

    130                 135                 140                

 

 

Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe

                165                 170                 175    

 

 

Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

            180                 185                 190    

 

 

<210>  2

<211>  638

<212>  PRT

<213>  智人

 

<400>  2

 

Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala

            20                  25                  30         

 

 

Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser

        35                  40                  45             

 

 

Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly

65                  70                  75                  80 

 

 

Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln

                85                  90                  95     

 

 

Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys

        115                 120                 125            

 

 

Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp

    130                 135                 140                

 

 

Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu

                165                 170                 175    

 

 

Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr

            180                 185                 190        

 

 

Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp

        195                 200                 205            

 

 

Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys

    210                 215                 220                

 

 

Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln

                245                 250                 255    

 

 

Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile

            260                 265                 270        

 

 

Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser

        275                 280                 285            

 

 

Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro

    290                 295                 300                

 

 

Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu

305                 310                 315                 320

 

 

Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe

                325                 330                 335    

 

 

His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu

            340                 345                 350        

 

 

Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser

        355                 360                 365            

 

 

Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser

    370                 375                 380                

 

 

Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn

385                 390                 395                 400

 

 

Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg

                405                 410                 415    

 

 

Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn

            420                 425                 430        

 

 

Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val

        435                 440                 445            

 

 

Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala

    450                 455                 460                

 

 

Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser

465                 470                 475                 480

 

 

Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala

                485                 490                 495    

 

 

Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser

            500                 505                 510        

 

 

Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe

        515                 520                 525            

 

 

Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile

    530                 535                 540                

 

 

Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu

545                 550                 555                 560

 

 

Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala

                565                 570                 575    

 

 

Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val

            580                 585                 590        

 

 

Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile

        595                 600                 605            

 

 

Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser

    610                 615                 620                

 

 

Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro

625                 630                 635            

 

Claims (15)

1.具有下式的化合物∶

A-B-C

A是生长激素化合物的基团；

B是连接和间隔性二价残基；

C是生长激素结合蛋白化合物的基团；和

-是共价键，

其中在A与B之间的连接基和/或在B与C之间的连接基不是通过核酸的重组表达来提供的，该核酸包括编码具有结构A-B-C的融合蛋白的核酸序列。

2.具有下式的化合物∶

A-B-C

A是生长激素化合物的基团；

B是连接和间隔性二价残基；

C是生长激素结合蛋白化合物的基团；和

-是共价键，

其中B不是纯肽链。

3.按照权利要求1至2的任一项的化合物，其中共价键A-C或B-C中的至少一个是通过酶形成的。

4.按照权利要求1至3的任一项的化合物，其中B包括至少10个共价键。

5.按照权利要求1至4的任一项的化合物，其中B包括PEG单元，其中B任选包括下列结构：

其中n是大于1的整数，该结构的分子量在大约100 Da至大约1,000,000 kDa之间。

6.按照权利要求1-5的任一项的化合物，其中B选自∶

-CH₂-CH₂-，

。

7.按照权利要求3的下式化合物

其中P-C(O)-NH-代表生长激素化合物基团，其是通过从Gln的侧链的-NH₂中除去氢而获得的；

D代表键或氧；

R代表连接基或键；

E代表连接基或键；

A代表肟，腙，苯腙，缩氨基脲，三唑或异

唑烷部分；和

Z是生长激素结合蛋白化合物的基团。

8.按照权利要求3的式(I)化合物

(I)

其中

Prot代表上述生长激素化合物的基团，其中所述基团形式上是通过从所述生长激素化合物的氨基(-NH₂)上形式（formal）除去氢原子而产生的，

R¹代表亚芳基或亚杂芳基，其任选被下列取代：C₁₆-烷基，卤素，氰基，硝基，羟基，羧基或芳基；

R²代表键或连接基，其中所述连接基包括选自下列的双自由基：C(=O)NH, NH, O, S, OP(O)(OH)O, OC(=O)NH, NHC(=O)NH,(CH₂)₁₁₀, O(CH₂)₃NHC(=O), C(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₁₃₀C(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₀₃₀C(=O)NH(CH₂CH₂O)₁₁₀(CH₂)₁₅C(=O), C(=O)NH[(CH₂CH₂O)₁₁₀(CH₂)₁₅C(=O)]₁₅NH(CH₂)₂₃₀, C(=O),(CH₂)₁₃₀-NHC(=O),(CH₂)₁₃₀C(=O), NHC(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₁₃₀-NHC(=O)NH(CH₂)₂₃₀,(CH₂)₀₃₀C(=O)NH(CH₂)₂₃₀NHC(=O)(CH₂)₀₃₀,(CH₂)₀₃₀C(=O)NH(CH₂CH₂O)₁₃₀CH₂CH₂NHC(=O)(CH₂)₀₃₀或NH(CH₂)₂₃₀，

,，和其组合，和

R³代表生长激素结合蛋白化合物的基团；

R⁴代表氢或C₁₆-烷基；和

R⁵代表-CH₂-或-C(=O)-。

9.药物组合物，其包含按照权利要求1至8的任一项的化合物和可药用载体。

10.治疗哺乳动物疾病状态的方法，对于这种疾病状态哺乳动物可以从生长激素的活性提高而受益，该方法包括给予该哺乳动物有效量的按照权利要求9的药物组合物。

11.制备按照权利要求1至8的任一项的化合物的方法，所述方法包括

(a) 生长激素化合物的酶催衍生化，和

(b) 使步骤(a)的酶催衍生的生长激素化合物与生长激素结合蛋白化合物共轭。

12.制备按照权利要求3的化合物的方法，该方法包括

i)  在转谷氨酰胺酶的存在下，使生长激素化合物与具有下式的第一个化合物接触∶R⁷GlnGlyR⁸，其中R⁷和R⁸是适合于进一步修饰的基团，和

ii) 在一个或多个步骤中，使步骤i)的产物与包含一个或多个官能团的第二个化合物反应，其中所述官能团不与构成所述肽的氨基酸残基中易受影响（accessible）的官能团反应，且其中在所述第二个化合物中的所述官能团能够与R⁷和/或R⁸反应，使得在步骤i)的产物和所述第二个化合物之间形成共价键，和其中所述第二个化合物包含生长激素结合蛋白化合物的基团。

13.制备按照权利要求7的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

i)  在一个或多个步骤中，在能够将所述第一个化合物催化结合到所述生长激素化合物中的转谷氨酰胺酶的存在下，使生长激素化合物与包含一个或多个官能团或潜在官能团的第一个化合物反应，形成官能化的生长激素化合物，其中所述官能团或潜在官能团在构成所述生长激素化合物的任何氨基酸残基中不是易受影响的（not accessible）；和

ii) 任选将潜在的官能团活化；和

iii)   在一个或多个步骤中，使所述官能化的生长激素化合物与包含一个或多个官能团的第二个化合物反应，其中所述官能团不与构成所述肽的氨基酸残基中易受影响（accessible）的官能团反应，且其中在所述第二个化合物中的所述官能团能够与在所述第一个化合物中的所述官能团反应，使得在所述官能化的肽和所述第二个化合物之间形成共价键，和其中所述第二个化合物包含生长激素结合蛋白化合物的基团。

14.制备按照权利要求8的化合物的方法，所述方法包括下列步骤：

(a) 用改变性能的基团衍生的苯胺或杂芳基胺来处理衍生自生长激素化合物的醛或酮，得到亚胺或α-氨基醇（hemiaminal），其中所述改变性能的基团包括生长激素结合蛋白或其片段，

(b) 用合适还原剂例如NaCNBH₃处理这种亚胺或α-氨基醇（hemiaminal），得到仲胺。

15.式(III)的化合物，

(III)

其中R¹、R²和R³如权利要求8所定义。