CN113801914B - 基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测l-丝氨酸的方法 - Google Patents

基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测l-丝氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L‑丝氨酸的方法，属于氨基酸检测技术领域。该方法包括：将含有L‑丝氨酸的待测样品与大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶体外反应生成红色物质，通过观察红色物质的颜色或者测定其含量，定性或定量检测待测样品中L‑丝氨酸含量。本发明公开的方法工艺操作简单易行、反应步骤少，并且既能直接肉眼定性检测，又能定量检测L‑丝氨酸的含量。

Description

基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法
技术领域
本发明涉及氨基酸检测技术领域，涉及基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法。
背景技术
L-丝氨酸属于人体非必需极性氨基酸，主要参与机体蛋白质的生物合成，也是嘌呤、嘧啶、磷脂等的重要前体，在免疫调节、肿瘤代谢等过程中是重要的角色，有望作为部分癌症的肿瘤标志物。在药用方面，L-丝氨酸广泛应用于氨基酸输液和营养添加剂，其衍生剂也有优良的药用价值和生物学活性，在化妆品产业方面，因L-丝氨酸有润湿性和保湿性而被大量添加于高级化妆品中。随着对L-丝氨酸研究和认识的深入，以及医药保健事业的不断发展，L-丝氨酸的需求量也在不断增加。因此提供一种快速简便测定混合氨基酸中L-丝氨酸的含量的检测方法，尤其能排除D-丝氨酸、环丝氨酸、丝氨酸类似物和丝氨酸衍生物干扰的检测技术，对L-丝氨酸的开发利用具有极其重要的意义。
目前，国内外用来检测氨基酸含量的方法主要分为仪器法、显色法、化学发光法和酶反应法等，仪器检测方法通常有HPLC、GC-MS、LC-MS、NMR和氨基酸自动分析仪等，显色法有变色酸-分光光度法、纸层析-分光光度法以及茚三酮显色法，化学发光法主要是毛细管电泳-电致化学发光法，酶法有丝氨酸氨基转移酶法和胱硫醚裂解酶法等。
其中，液相色谱法、气相色谱法以及色谱质谱联用等仪器法灵敏度好，准确度高，但需要昂贵的仪器设备、专门实验室、受专业培训的实验人员以及高昂的费用维护成本和较高的实验耗材。茚三酮显色法作为最基本和最传统的检测方法，其操作简便、反应快速，但是其对反应条件的要求较高，需要对反应温度、pH、时间进行精确控制，并且对不同种类的氨基酸具有不同的灵敏度，不适合分析对精确性要求较高的样品。荧光猝灭法可以避免大部分氨基酸的干扰，但是样品需要经过复杂的磷酰化预处理，并且检测结果误差较大。纸层析-分光光度法操作简便，但是其稳定性差，不适用大批量样品的分析检测。变色酸-分光光度法反应速度快，操作简单，准确度高，但抗干扰能力差。
酶反应法具有良好的专属性和精准性，但目前所用的酶法反应步骤多，影响测定因素多，检测信号往往不能直接观察或者不能直接测定。因此非常有必要发展一种反应简便且反应后可以直接肉眼观察的酶法测定L-丝氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，该方法工艺操作便利、反应步骤少，并且既能直接肉眼定性检测，又能定量检测L-丝氨酸的含量。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，包括：将含有L-丝氨酸的待测样品与大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶体外反应生成红色物质，通过观察红色物质的颜色或者测定其含量，定性或定量检测待测样品中L-丝氨酸含量。
优选的是，定性检测待测样品中L-丝氨酸含量方法为：通过肉眼观察反应后是否有稳定的红色物质的生成，以及红色物质颜色的深浅，定性判定待测样品中L-丝氨酸的有无以及含量的多少。
优选的是，定量检测待测样品中L-丝氨酸含量方法包括：
测定L-丝氨酸标准液的吸光度，构建标准曲线；
测定反应后的红色物质的吸光度，并代入所述标准曲线的方程中，定量得到待测样品中L-丝氨酸的含量。
优选的是，测定所述L-丝氨酸标准液的吸光度和所述红色物质的吸光度所用波长均为528nm。
优选的是，所述大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的是，所述待测样品与所述大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶等体积混合反应。
优选的是，反应时间为60-180min。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，由于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶是以L-半胱氨酸为底物，催化生成L-丙氨酸和单质硫，纯化的半胱氨酸脱硫酶由于结合了辅基磷酸吡哆醛，肉眼观察呈现黄色，紫外可见分光光度计扫描在395nm处具有特征性吸收峰。而根据发明人前期的研究易知该酶在一种IscA-/SufA-双蛋白缺陷的细菌中表达，肉眼观察该酶变成了红色，紫外可见分光光度计扫描在528nm处具有稳定的特征性吸收峰。经过大量的试验，通过将IscA-/SufA-双蛋白缺陷大肠杆菌来源的半胱氨酸脱硫酶与L丝氨酸进行体外反应，也能生成稳定的红色物质并且专一性依赖于L-丝氨酸，更为重要的是红色颜色的深浅，以及528nm处的吸收峰的高低与反应液中添加的L-丝氨酸呈现剂量依赖关系，从而实现了待测样品中的L-丝氨酸定性和定量测定。本发明公开的检测方法工艺操作便利、反应步骤少，既能直观定性又能精确定量，还能有效的防止D-丝氨酸、环-丝氨酸、丝氨酸类似物以及其它氨基酸的干扰，这为不同领域中L-丝氨酸的快速检测提供了科学的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为定性和半定量测定L-丝氨酸直观图以及标准比色卡；
图2为孵育时间优化及标准曲线的建立；A：孵育时间和波长对酶促反应的影响；B：最优孵育时间的筛选；C：标准曲线。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例中所用的大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
MELPIYLDYSATTPVDPRVAEKMMQFMTMDGTFGNPASRSHRFGWQAEEAVDIARNQIADLVGADPREIVFTSGATESDNLAIKGAANFYQKKGKHIITSKTEHKAVLDTCRQLEREGFEVTYLAPQRNGIIDLKELEAAMRDDTILVSIMHVNNEIGVVQDIAAIGEMCRARGIIYHVDATQSVGKLPIDLSQLKVDLMSFSGHKIYGPKGIGALYVRRKSRVRIEAQMHGGGHERGMRSGTLPVHQIVGMGEAYRIAKEEMATEMERLRGLRNRLWNGIKDIEEVYLNGDLEHGAPNILNVSFNYVEGESLIMALKDLAVSSGSACTSASLEPSYVLRALGLNDELAHSSIRFSLGRFTTEEEIDYTIELVRKSIGRLRDLSPLWEMYKQGVDLNSIEWAHHHHHH
实施例1基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶定性/半定量检测L-丝氨酸的方法
1、试剂
A、1M L-丝氨酸标准液；
B、反应液：40mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，100μM大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶、0.4mML-半胱氨酸；
2、将L-丝氨酸标准液分别稀释成五个浓度，分别为A：0.00mM、B：0.25mM、C：0.50mM、D：1.00mM、E：2.00mM，将系列浓度标准液以及待测样品100μL分别与100μL反应液混合，室温(25℃)孵育2h，肉眼观察，拍照，建立标准比色卡。
如图1所示，在0-2mM浓度范围内，L-丝氨酸标准液与反应液进行酶促反应后的颜色由淡黄色变为淡粉色并逐渐加强变为红色。通过裸眼观察这个颜色的变化具备很好的区分度，不同的颜色及颜色的深浅能很好的反映L-丝氨酸的有和无，以及浓度的高低。由此可知，本发明定性/半定量检测L-丝氨酸的实验方法可行，并且方便快捷。
实施例2基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶定量检测L-丝氨酸的方法
1、试剂
A、1M L-丝氨酸标准液；
B、反应液：40mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，100μM大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶、0.4mML-半胱氨酸。
2、最佳反应时间和线性范围的确定
A、确定反应时间
将待测L-丝氨酸与反应液等体积混合，在25℃条件下，培养不同时间，测定波长528nm下吸光度，以时间为横轴，以528nm吸光度值为纵轴绘制曲线。
B、确定最佳线性范围
将L-丝氨酸标准品分别稀释成三个浓度，分别为0.50mM、1.00mM、2.00mM，将系列浓度标准液以及待测样品100μL分别与100μL反应液混合，室温(25℃)孵育2h，分别测定样品管和标准管在波长528nm下的吸光度。
3、绘制标准曲线
以标准液浓度为横坐标，波长528nm下测定的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合，获得曲线方程和R2值。
4、测定样品中L-丝氨酸的含量
根据上述获得的标准曲线方程和样品管的吸光度值，求得L-丝氨酸浓度。
如图2所示，随着L-丝氨酸标准品与反应液孵育时间的延长，代表红色的528nm处的吸收峰从无到有，并且逐渐增高(图2A)，在2h到达最高，且在1h内保持稳定(图2B)，由此可见，最优的孵育时间的2h，根据优化的孵育时间进行测定，绘制的标准曲线在0.5-2.0mM有较好线性范围(图2C)。由此可见，本发明定量检测L-丝氨酸的实验方法可行。
实施例3抗其他L型氨基酸能力的测定
将待测L-丝氨酸和其它L型氨基酸(4mM)各500μL分别与500μL大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶混合，37℃，250rpm震荡培养2h，裸眼观察颜色深浅并拍照。
结果显示，只有L-丝氨酸与大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶孵育后呈现红色，其它氨基酸及不加氨基酸的对照都呈现浅黄色，这表明本发明提供的方法可以直接肉眼观察红色的产生与否，判断是否含有L-丝氨酸，同时易知该方法具备较好的抗其它L型氨基酸干扰的能力，具有较好的特异性。另外，发明人通过实验还证实，该检测方法对D-丝氨酸、环丝氨酸和丝氨酸的衍生物均具有较好的抗干扰能力。上述结果表明利用本发明提供的方法定性检测L-丝氨酸的可行性，并且操作简便易行，具备较好的特异性。
实施例4L-丝氨酸累积细菌IscA-/SufA-双敲除菌L-丝氨酸含量测定
1.IscA/SufA双敲除菌的培养
iscA-/sufA-双突变菌(其构建方法参照硕士学位论文童贞珍“大肠杆菌IscA和SufA在铁硫簇生物合成中的功能研究”)及对照野生型大肠杆菌MC4100，在LB液体培养基中以250rpm(转数/分钟)，37℃过夜培养，过夜培养的菌液分别1:50稀释到含有500mL新鲜准备的LB培养基的三角瓶，同样条件继续培养至OD600nm达到0.6(对数生长期)，离心收获细菌。
2.代谢物提取
取上述大肠杆菌菌体，每个样本中加入50mL预冷甲醇/乙腈/水(2:2:1，v/v/v)，涡旋混合，冰浴中超声20min，-20℃孵育1h沉淀蛋白，14000rpm、4℃离心20min，取上清，真空干燥。检测时加入100μL缓冲液(40mM Tris-HCl，pH9.0)复溶，14000rcf 4℃离心20min，取上清液。
3.测定样品浓度
取第2步上清液和L-丝氨酸标准品，分别与反应液孵育2h，拍照并测定528nm吸光度，绘制标准曲线，计算样品浓度。
通过肉眼观察，相对于不加L-丝氨酸对照(淡黄色)，野生型MC4100的提取物与反应液反应后呈现浅粉色(与比色卡比较，判断L-丝氨酸浓度介于0.00-0.25mM之间)，iscA-/sufA-双突变菌的提取物与反应液反应后呈现深粉色(与比色卡比较，判断L-丝氨酸浓度介于0.50-1mM之间)；通过定量测定计算野生型MC4100的提取物L-丝氨酸含量为0.21mM。iscA-/sufA-双突变菌的提取物L-丝氨酸含量为0.53mM。可见，两种方法测定结果相一致。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Leu Pro Ile Tyr Leu Asp Tyr Ser Ala Thr Thr Pro Val Asp
1 5 10 15
Pro Arg Val Ala Glu Lys Met Met Gln Phe Met Thr Met Asp Gly Thr
20 25 30
Phe Gly Asn Pro Ala Ser Arg Ser His Arg Phe Gly Trp Gln Ala Glu
35 40 45
Glu Ala Val Asp Ile Ala Arg Asn Gln Ile Ala Asp Leu Val Gly Ala
50 55 60
Asp Pro Arg Glu Ile Val Phe Thr Ser Gly Ala Thr Glu Ser Asp Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ile Lys Gly Ala Ala Asn Phe Tyr Gln Lys Lys Gly Lys His
85 90 95
Ile Ile Thr Ser Lys Thr Glu His Lys Ala Val Leu Asp Thr Cys Arg
100 105 110
Gln Leu Glu Arg Glu Gly Phe Glu Val Thr Tyr Leu Ala Pro Gln Arg
115 120 125
Asn Gly Ile Ile Asp Leu Lys Glu Leu Glu Ala Ala Met Arg Asp Asp
130 135 140
Thr Ile Leu Val Ser Ile Met His Val Asn Asn Glu Ile Gly Val Val
145 150 155 160
Gln Asp Ile Ala Ala Ile Gly Glu Met Cys Arg Ala Arg Gly Ile Ile
165 170 175
Tyr His Val Asp Ala Thr Gln Ser Val Gly Lys Leu Pro Ile Asp Leu
180 185 190
Ser Gln Leu Lys Val Asp Leu Met Ser Phe Ser Gly His Lys Ile Tyr
195 200 205
Gly Pro Lys Gly Ile Gly Ala Leu Tyr Val Arg Arg Lys Ser Arg Val
210 215 220
Arg Ile Glu Ala Gln Met His Gly Gly Gly His Glu Arg Gly Met Arg
225 230 235 240
Ser Gly Thr Leu Pro Val His Gln Ile Val Gly Met Gly Glu Ala Tyr
245 250 255
Arg Ile Ala Lys Glu Glu Met Ala Thr Glu Met Glu Arg Leu Arg Gly
260 265 270
Leu Arg Asn Arg Leu Trp Asn Gly Ile Lys Asp Ile Glu Glu Val Tyr
275 280 285
Leu Asn Gly Asp Leu Glu His Gly Ala Pro Asn Ile Leu Asn Val Ser
290 295 300
Phe Asn Tyr Val Glu Gly Glu Ser Leu Ile Met Ala Leu Lys Asp Leu
305 310 315 320
Ala Val Ser Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ser Ala Ser Leu Glu Pro Ser
325 330 335
Tyr Val Leu Arg Ala Leu Gly Leu Asn Asp Glu Leu Ala His Ser Ser
340 345 350
Ile Arg Phe Ser Leu Gly Arg Phe Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Tyr
355 360 365
Thr Ile Glu Leu Val Arg Lys Ser Ile Gly Arg Leu Arg Asp Leu Ser
370 375 380
Pro Leu Trp Glu Met Tyr Lys Gln Gly Val Asp Leu Asn Ser Ile Glu
385 390 395 400
Trp Ala His His His His His His
405

Claims (6)

1.一种基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，包括：将待测样品与大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶体外反应生成红色物质，通过观察所述红色物质的颜色或者通过吸光度测定所述红色物质的含量，定性或者定量检测待测样品中L-丝氨酸含量；
所述大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，定性检测待测样品中L-丝氨酸含量方法为：通过肉眼观察反应后是否有稳定的红色物质的生成，以及红色物质颜色的深浅，定性判定待测样品中L-丝氨酸的有无以及含量的多少。
3.如权利要求1所述的基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，定量检测待测样品中L-丝氨酸含量方法包括：测定L-丝氨酸标准液的吸光度，构建标准曲线；
测定反应后的红色物质的吸光度，并代入所述标准曲线的方程中，定量得到待测样品中L-丝氨酸的含量。
4.如权利要求3所述的基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，测定所述L-丝氨酸标准液的吸光度和所述红色物质的吸光度所用波长均为528nm。
5.权利要求1述的基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，所述待测样品与所述大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶等体积混合反应。
6.权利要求1述的基于大肠杆菌半胱氨酸脱硫酶检测L-丝氨酸的方法，其特征在于，反应时间为60-180min。
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