CN117783317A - 一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统 - Google Patents
一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及多胺检测技术领域，具体涉及一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，检测包括以下步骤：收集待测样本中的肠道微生物，与13C‑菊粉共同孵育，收集培养基层和细胞层，分别提取代谢物，进行衍生化处理，使用液相色谱质谱联用进行分析。本发明公开的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，包括肠道微生物厌氧培养基、衍生化试剂、13C‑菊粉溶液、缓冲液、终止液、萃取溶剂、液相色谱装置和质谱装置。使用本发明提供的检测系统对肠道菌群多胺进行检测，只需进行一次样本处理，即可同时得到肠道菌群多胺合成功能的定性和定量结果，检测时间短，灵敏度高，操作难度低，适合广泛运用于大规模实验和分析中。
Description
技术领域
本发明涉及多胺检测技术领域，尤其是指一种基于液相色谱-质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统。
背景技术
多胺(包括腐胺PUT、精胺SPM、亚精胺SPD及其乙酰化代谢物等)是维持机体生长发育的重要物质，近年的研究表明，大肠癌、结直肠癌患者肠道局部的多胺浓度会显著升高，这与癌细胞需要持续的、高水平的多胺来维持其增殖有关。除此之外，在健康人群中，肠道内多胺通过肠壁吸收进入体循环，发挥改善认知能力、提高线粒体活性功能、延长预期寿命等功能。因此，分析肠内多胺的水平变化有助于评价疾病和健康状态。
现有技术通常使用高通量测序方法对肠道菌群组成进行深入表征，但由于多胺类物质的极性较大，高通量测序方法只能将研究停留在肠道菌群层面，无法评价肠道菌群产生多胺的代谢功能，因此涌现出许多对血液或尿液中的多胺进行定量分析的方法。Xiong等人公开了一种利用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测人血浆样品中的衍生化多胺的浓度的方法(Chromatographia,2016)，该方法使用将多胺衍生化处理后，评价肿瘤患者血浆中的多胺状态。CN106381326A公开了一种用于检测乙酰多胺的体外检测试剂盒及其检测方法，利用乙酰多胺氧化酶催化天然底物，检测样本中乙酰多胺的含量。CN110887910A公开了一种多胺及其合成通路物质的检测方法，采用丹磺酰氯或苯甲酰氯为衍生化试剂，利用LC-MS/MS技术建立了柑橘根系中9种生物胺提取及准确定量检测的方法。
上述技术以血液或尿液作为样本来源，并对其进行衍生化处理或乙酰化处理，用于定量多胺的静态浓度。然而肠道微生物在人体内持续进行代谢活动，上述方法无法以动态形式评价肠道多胺的代谢水平。且血浆中的多胺浓度虽然能够反映全身器官和组织的多胺水平，但无法直观体现肠内多胺水平。此外，经过一次样本处理只能得到多胺检测的单一结果，而无法对肠道菌群多胺合成功能进行包括多胺种类和多胺浓度在内的全方位评价。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明旨在开发一种检测肠道菌群多胺代谢活性和肠内多胺定量的检测方法，通过检测人源粪便中的多胺水平，从而评价肠道内多胺。本发明所提供的检测系统简化了待测样本的多胺处理，可以一次性大批量检测代谢物中的多胺，将对肠道微生物的研究分为细胞层和培养基层，揭示细胞内外代谢物的差异，结合同位素示踪代谢组学，联用液相色谱和质谱，依次对样品进行洗脱和示踪，通过一次样本处理即可得到肠道菌群多胺定性和定量的分析结果。
本发明的第一个目的是提供一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，检测系统包括肠道微生物厌氧培养基、13C-菊粉溶液、衍生化试剂、缓冲液、终止液、萃取溶剂、液相色谱装置和质谱装置。
进一步地，检测系统的检测对象为待测者的粪便。
进一步地，上述检测系统采用以下步骤进行检测：
步骤S1：厌氧培养待测样本中的肠道微生物，加入13C-菊粉孵育，分别收集上清液和沉淀为培养基层和细胞层，细胞层进行淬灭处理；
步骤S2：提取培养基层和细胞层中的代谢物，分别获得含有培养基层代谢物和细胞层代谢物的待测溶液，进行衍生化处理，衍生化试剂与待测溶液的体积比为2-5:1；
步骤S3：终止衍生化反应，使用萃取溶剂进行液-液萃取获得衍生化产物，萃取溶剂与待萃取溶液的体积比为为2-10:1，使用液相色谱质谱联用进行分析。
进一步地，肠道微生物厌氧培养基包括氧气指示剂、半胱氨酸盐酸盐、酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢钾、氯化钠、二氨基硫酸、硫酸镁和二氯化钙。
优选地，氧气指示剂为刃天青。
优选地，肠道微生物培养基的组成为半胱氨酸盐酸盐300-303mg、酵母提取物250-260mg、胰蛋白胨500-550mg，磷酸二氢钾120-125mg、磷酸氢钾157-160mg、氯化钠241-243.2mg、二氨基硫酸242-244mg、硫酸镁25-26mg、二氯化钙25-27mg。
进一步地，衍生化试剂为芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺Fmoc-osu。使用该衍生物试剂得到的衍生化产物稳定，不仅可以在常温下进行检测，还能经过长时间放置而不发生降解。
优选地，进行衍生化处理时，将Fmoc-osu溶解于乙腈中。
优选地，缓冲液由碳酸氢钠、碳酸钠和EDTA组成，pH值调节至10.2。
进一步地，液相色谱的固定相为C18色谱柱，流动相A为甲酸-水溶液，流动相B为乙腈。
优选地，甲酸与水的质量比为1:1000。
进一步地，液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-10分钟，流动相B梯度从10％到90％；
10-14分钟，流动相B梯度保持为90％；
14-14.5分钟，流动相B梯度从90％到10％；
14.5-20分钟，流动相B梯度保持为10％。
进一步地，高分辨质谱装置采用正离子扫描，离子源参数设置为毛细管保持300℃，HESI探头保持325℃，鞘气流量35个单位，喷雾电压设置4000V，质荷比收集范围为75-1000。
优选地，步骤S1中，使用乙腈-甲酸混合液对细胞层进行淬灭。
优选地，步骤S2中，用于衍生化处理的试剂与待测溶液的体积比为2:1。
优选地，步骤S3中，使用甲酸终止衍生化反应。
优选地，甲酸与待测溶液的体积比为2:5。
优选地，步骤S3中，使用乙酸乙酯进行液-液萃取。
进一步地，步骤S3中，先使用液相色谱装置分离待测样本中各组分肠道多胺，再使用高分辨质谱装置对待测肠道多胺进行定量。
本发明的第二个目的是提供上述检测系统在制备肠癌诊断产品或肠内多胺代谢水平检测产品中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明简化了对于粪便样本中的多胺处理，剔除食物残渣后，单独孵育肠道微生物，检测粪便中肠道微生物组中的多胺浓度，排除膳食代谢所产生的外源性多胺的干扰，以此评价患者体内的多胺状态，以动态形式评价肠道多胺的代谢水平；
(2)本发明将肠道微生物的研究分为细胞层和培养基层，以揭示细胞内和细胞外的代谢物差异。使用本发明提供的检测系统，不仅能够评价已知的多胺代谢途径(腐胺途径)，还能够评价肠道菌群新代谢通路对多胺合成的贡献(非腐胺途径)；
(3)本发明将液相色谱和质谱联用，与13C-菊粉标记的稳定同位素示踪代谢组学相结合，快速直接检测肠道菌群的多胺合成功能，利用本发明的检测系统分析肠道微生物中多胺生物合成过程和代谢产物的13C标记模式，通过一次样品处理即可同时得到肠道菌群多胺合成功能的定性(多胺及代谢物种类)和定量(13C同位素富集比)结果。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是腐胺的代谢途径；
图2是鸟氨酸、亚精胺和腐胺衍生化产物的13C富集情况；
图3是非腐胺的代谢途径；
图4是精氨酸和胍丁胺衍生化产物的13C富集情况；
图5是5’-甲硫腺苷、乙酰化亚精胺和乙酰化腐胺的13C富集情况；
图6是腐胺衍生化产物的标准曲线；
图7是亚精胺衍生化产物的标准曲线；
图8是精胺衍生化产物的标准曲线；
图9是腐胺、精胺和亚精胺衍生化产物与内标甲苯磺丁脲的液相色谱结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
肠道微生物培养基：半胱氨酸盐酸盐303mg、酵母提取物250mg、胰蛋白胨500mg，将其溶于由120.6mg磷酸二氢钾、157.8mg磷酸氢钾、241.7mg氯化钠、242.8mg二氨基硫酸、25.1mg硫酸镁和25.3mg二氯化钙组成的溶剂中(采用500mL的去离子水溶解)。用氢氧化钠调节pH值至6.5后，加入0.1％/L刃天青。灭菌处理，通入二氧化碳至培养基澄清，排除其中的氧气。
多胺衍生化试剂：碳酸氢钠1.05g，碳酸钠1.325g，EDTA0.042g，溶解在25mL的超纯水中，使用5M的氢氧化钠调节其pH值至10.2，作为缓冲液。将10.12mg的Fmoc-Osu(芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺)溶解在6mL的乙腈中，作为衍生化试剂。
实施例1：粪样处理
1.人粪便样本的收集。
将约50mg的新鲜人粪便样本收集于无菌的微量离心管中，并在30分钟内将样品转移至厌氧袋中，以保证肠道微生物的活力。
2.肠道微生物的分离和13C-菊粉的孵育。
使用注射器吸取2mL肠道微生物培养基转移至装有粪样的微量离心管中，用干净的玻璃棒捣碎后，转移至厌氧管1中。再向微量离心管中加入700uL肠道微生物培养基洗涤，并转移至厌氧管1中。将厌氧管1低速离心(600rpm，10min)，除去下层沉淀中未消化的较大的食物颗粒，使用注射器将上清转移至厌氧管2中，采用3000rpm，10min离心来收集肠道微生物。弃去上清后，使用注射器向肠道微生物中加入5.4mL肠道微生物培养基，涡旋混匀后，将其分别转移至厌氧管3和4中，每支厌氧管各装有1.8mL的肠道微生物混悬液。向三只厌氧管中加入13C-菊粉溶剂各0.2mL。在37℃的环境下孵育24小时后，对三支厌氧管离心(3000rpm，10min)，收集的上清即为培养基层，将下层沉淀采用1mL肠道微生物培养基洗涤后再次以3000rpm，5min的条件离心，收集得到的沉淀即为细胞层。
实施例2：粪样分析
1.从培养基层中提取代谢物进行非靶向的稳定同位素示踪代谢组学分析
将培养基分装在微量离心管中，每支离心管中分装1mL培养基，随后进行冻干，除去培养基中的水。将冻干后的粉末溶解在乙腈(含有0.2％的甲酸)中，随后离心收集上清。加入衍生化试剂对上清进行衍生化处理(衍生化试剂加入体积为上清体积的2倍)，加入甲酸终止衍生化反应(甲酸的加入体积为上清体积的0.4倍)，加入乙酸乙酯进行液液萃取(乙酸乙酯的加入体积为上清体积的10倍)，最后氮吹干乙酸乙酯，加入乙腈水复溶后即可进行高分辨质谱分析。
2.从细胞层中提取代谢物进行非靶向的稳定同位素示踪代谢组学分析
向得到的细胞提取物中加入乙腈(含有0.2％的甲酸)将其淬灭。通过涡旋短暂均匀后，5000rpm，10min离心，收集上清，采用上述相同方式进行衍生化处理、氮吹和分析。
3.使用液相色谱质谱进行稳定同位素示踪代谢组学分析
使用赛默飞世尔科技SII液相色谱系统和赛默飞世尔科技Q Exactive Orbitrap质谱仪与加热的电喷雾电离源(包括VF-D11-A紫外检测器、VF-P10-A自动进样器和VH-C10-A柱温室)接口进行液相色谱-质谱分析。质谱仪在正离子模式下运行，以70000的分辨率收集完整的扫描。离子源参数设置如下：加热毛细管保持在330℃，HESI探头保持在325℃，鞘气流量设置为35个单位，辅助气流设置为12个单位，备用气流设置为3个单位，喷雾电压设置为4000V。质谱数据采集在75-1000质荷比的范围内进行。使用Ajer Venusil XBP C18色谱柱(2.1×50mm，5μm)和保护柱(SecurityGuard Cartridges C18 4×2.0mm)实现色谱分离。缓冲液A相为0.1％甲酸水；缓冲液B相是乙腈。色谱梯度以0.200ml/min的流速运行如下：0-10分钟，线性梯度从10％到90％，B相；10-14分钟，保持在90％，B相；14-14.5分钟，线性梯度至10％，B相；14.5-20分钟，在10％的B相下平衡；32分钟，停止运行。进样体积为5μL。
4.使用LC-MS/MS进行验证
液项色谱仪采用的的是日本岛津液相系统，包括控制器CBM-20A，自动进样器Sil-20A，二元输液泵LC-20AC，脱气机DUG-20A3；串联质谱仪是AB SCIEX4000 QTrap，配有电喷雾电离源；柱温箱CTO-20A的温度保持在40℃；采用的色谱柱为艾杰尔Venusil XBP C18色谱柱(2.1×50mm，5μm)，液相分离的流动相为0.1％的甲酸水(A相)和纯乙腈(B相)。流动相梯度为0.5min，10％的B相；1min，90％的B相；3.0min，90％的B相；3.1min，10％的B相；5min，停止；流速为0.4mL/min，注入样品的量为10μL。LC-MS/MC收集和分析软件为Analyst。串联的质谱仪采用电喷雾电离的模式(ESI)，使用正离子模式扫描，总扫描时间为1.2601sec。质谱的具体参数如下：Curtain Gas为10psi，GS1为30psi，GS2为30psi，IonSpray Voltage为4500V，离子源温度(TEM)为450℃，CXP值为13，EP值为10。
实施例3：13C标记结果
使用本发明的方法标记评价已知途径中肠道菌对多胺的代谢活性(图1)，评价了衍生化后的Ornithine鸟氨酸，SPD亚精胺和PUT腐胺的13C富集情况(图2)。其中[Fmoc]是衍生化反应后在目标化合物上结合的官能团，SPD和PUT分别为Spermidine亚精胺和Putrescine腐胺的缩写。根据图片显示，鸟氨酸和腐胺的13C富集情况比较相似，即鸟氨酸的M+3、4、5均存在且M+5富集程度高，腐胺的M+2、3、4均存在且M+4富集程度高，符合图1中的鸟氨酸是腐胺的前体化合物。亚精胺的M+1、2、4、6、7均存在且M+2富集程度高，与腐胺的富集情况相比有差异，而腐胺是亚精胺的前体化合物，不符合图1中的代谢途径。因此通过使用本发明的方法我们评价了已知途径中肠道菌对多胺代谢的活性。
使用本发明的检测系统评价新发现途径中肠道菌对多胺的代谢活性(图3)，本发明评价了衍生化后的Arginine精氨酸、Agmatine胍丁胺的13C富集情况(图4)。根据图片显示，精氨酸和胍丁胺的M+2均存在且13C富集程度相比于其他标记而言较高，与SPD亚精胺的13C富集情况相似，符合F图途径中的胍丁胺是腐胺的前体化合物。因此，通过使用本发明的方法发现并评价了新途径中肠道菌对多胺代谢的活性。
在上述代谢通路的图1和图3中，通过本发明的方法分析了肠道微生物代谢产生的其他化合物的活性，其他化合物的相关13C同位素富集情况如图5所示。主要包括MTA：5'-甲硫腺苷；衍生化后的SPD_Acyl：乙酰化亚精胺；衍生化后的Acetyl Putrescine：乙酰化腐胺。采用本发明的方法，能在人粪便样本中检测到多胺乙酰化后的产物，且其均具有13C-菊粉的标记，其中，MTA具有M+2到M+8的全标记。而MTA和多胺以及多胺的乙酰化物对肿瘤的发生均具有显著的影响，因此，使用本发明的方法对肠道菌群生成的这些代谢物活性进行检测，在癌症患者的治疗中是具有潜力的。
实施例4：定量结果
(1)标准曲线与定量下限
使用本发明中的检测系统，通过分析不同浓度的多胺标准品与多胺相对于内标的峰面积的比值来获得定量曲线。以多胺的浓度和内标浓度的比值为横坐标，多胺峰面积与内标化合物峰面积的比值为纵坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。方法验证期间，配合使用衍生化试剂共配制三条标准曲线，每条线性回归方程的回归系数r均大于0.9926，回归系数r如下表所示，线性良好，平均准确度均在±15％以内，[Fmoc]2-PUT的定量下线为5ng/mL，[Fmoc]2-SPD和[Fmoc]3-SPM的定量下线为1ng/mL，结果如下所示。
表1三种衍生化产物的标准曲线
(2)准确度与精密度
日内精密度和准确度是通过四个浓度梯度的质控(QC)样品检验的，QC样本分别为LLOQ、LQC、MQC和HQC。精密度和准确度的平均误差值均在15％以内，符合相应要求。其中，[Fmoc]2-PUT的QC样品浓度分别为5、10、50和400ng/mL，[Fmoc]2-SPD和[Fmoc]3-SPM的QC样品浓度分别为1、3、10和80ng/mL。使用本发明的衍生化试剂进行处理后，采用LC-MS/MS测定分析。根据相应的标准曲线计算准确度与精密度，测定方法验证期间所配制的QC样品，如下表所示。
表2三种衍生化产物的准确度与精密度
(3)稳定性
使用本发明的衍生化试剂考察了三种化合物样品提取后的LQC和HQC在不同条件下的稳定性，包括室温放置2小时的短期稳定性、4℃冰箱放置24h的储存稳定性和进样盘放置24h的过夜稳定性。结果表明，不同条件下的稳定性均符合要求，结果如下表所示：
表3三种衍生化产物的稳定性
(4)基质效应
分析三个不同的LQC和HQC来评估基质效应，其中，[Fmoc]2-PUT的准确度为88.83％，精密度为4.59％；[Fmoc]2-SPD的准确度为97.28％，精密度为7.81％；[Fmoc]3-SPM的准确度为99.77％，精密度为12.47％。三者的准确度均在100±15％以内，精密度均小于15％，符合相应标准。
(5)残留效应
在定量上限样品后分析空白样品，其中，[Fmoc]2-PUT样品的残留为19.79％，内标的残留为0.26％；[Fmoc]2-SPD样品的残留为10.91％，内标的残留为0.22％；[Fmoc]3-SPM样品的残留为25.74％，内标的残留为0.22％。内标的残留均在5％以内，符合相应要求，待测物的残留在20％以内，符合相应要求。
(6)选择性
使用本发明的衍生化试剂产生的[Fmoc]2-Put，[Fmoc]2-Spd和[Fmoc]3-Spm三个多胺衍生化产物与内标甲苯磺丁脲(Tolbutamide)的峰型良好，信号稳定，相互之间没有干扰，且活性炭处理后的空白粪样基质对产物与内标的峰无干扰。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于，所述检测系统包括肠道微生物厌氧培养基、13C-菊粉溶液、衍生化试剂、缓冲液、终止液、萃取溶剂、液相色谱装置和高分辨质谱装置。
2.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于，采用以下步骤进行检测：
步骤S1：厌氧培养待测样本中的肠道微生物，加入13C-菊粉孵育，分别收集上清液和沉淀为培养基层和细胞层，对培养基层进行冻干处理，对细胞层进行淬灭处理；
步骤S2：提取培养基层和细胞层中的代谢物，分别获得含有培养基层代谢物和细胞层代谢物的待测溶液，进行衍生化处理，衍生化试剂与待测溶液的体积比为2-5:1；
步骤S3：终止衍生化反应，使用萃取溶剂进行液-液萃取获得衍生化产物，萃取溶剂与待萃取溶液的体积比为2-10:1，使用液相色谱-质谱联用进行分析。
3.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述检测系统的检测对象为待测者的粪便。
4.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述肠道微生物厌氧培养基包括氧气指示剂、半胱氨酸盐酸盐、酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢钾、氯化钠、二氨基硫酸、硫酸镁和二氯化钙。
5.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述衍生化试剂为芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺Fmoc-osu。
6.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述液相色谱的固定相为C18色谱柱，流动相A为甲酸-水溶液，流动相B为乙腈。
7.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于，所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-10分钟，流动相B梯度从10％到90％；
10-14分钟，流动相B梯度保持为90％；
14-14.5分钟，流动相B梯度从90％到10％；
14.5-20分钟，流动相B梯度保持为10％。
8.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述高分辨质谱装置采用正离子扫描，离子源参数设置为毛细管保持300-350℃，HESI探头保持300-350℃，鞘气流量20-35个单位，喷雾电压设置3500-4500V。
9.根据权利要求1所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统，其特征在于：所述高分辨质谱装置质荷比收集范围为75-1000。
10.如权利要求1-9任一项所述的肠道菌群多胺代谢活性检测系统在制备肠癌诊断产品或肠内多胺代谢水平检测产品中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202311636347.0A CN117783317A (zh) | 2023-12-01 | 2023-12-01 | 一种基于液相色谱质谱联用的肠道菌群多胺代谢活性检测系统 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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| CN117783317A true CN117783317A (zh) | 2024-03-29 |
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2023
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