KR20150122191A

KR20150122191A - 기체 크로마토그래피/질량 분석법에 의해 생물학적 샘플에서 박테리아 종을 동정하는 방법

Info

Publication number: KR20150122191A
Application number: KR1020157025840A
Authority: KR
Inventors: 파올로 갈리아노
Original assignee: 알리팍스 홀딩 에스피에이
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2015-10-30
Also published as: JP2016513259A; CN105122058A; ITUD20130021A1; CA2901667A1; RU2015139524A; WO2014128629A1; US20160002696A1; EP2959293A1

Abstract

본 발명은 특정 박테리아 강에 특징적인 그래프 도표를 동정하기 위해서, 샘플의 대사산물 및 이화산물과 같은 휘발성 구성요소의 기체 크로마토그래피-질량 분석법(GC/MS)에 의해 분석을 실행하는 생물학적 샘플, 특정 소변 샘플에서 박테리아 강을 동정하는 방법에 관한 것이다.

Description

기체 크로마토그래피/질량 분석법에 의해 생물학적 샘플에서 박테리아 종을 동정하는 방법{Method to identify bacterial species by means of gas chromatography/mass spectrometry in biological samples}

본 발명은 기체 크로마토그래피/질량 분석법(GC/MS)을 기초로 한 기술에 의해 특히 소변 샘플과 같으나 이에 한정되지 않는 생물학적 샘플에서 박테리아 강을 동정하는 방법에 관한 것이다.

생물학적 샘플에서 빠르고 정확한 미생물 동정은 감염성 질환의 진단에 기초이며, 따라서 정확한 항생제 치료제의 제제화에 기초이다.

직접 및 간접인 다른 방법이 환자의 생물학적 샘플에서 병원성 박테리아의 동정을 위한 선행 기술로 공지되어 있다.

현재 "황금률"로 생각되는 주요 직접 방법은 특정 배지에서 배양으로부터 얻은 박테리아 콜로니의 생화학적 및 형태학적 테스트를 통한 동정으로 구성된다.

(예를 들어, 전통적인 배양 배지에) 사용된 배지에 따른 배양 기술은 완전하게 속에 특유하며(예를 들어, 클래드(Cled)라 불리는 기술) 또는 다른 방식으로, 동정된 콜로니의 특징을 다소 완벽하게 선택할 수 있다.

이런 기술들 중에서, 글루코오스 및 락토오스의 발효를 사용하는 기술(예를 들어, 맥콘키 배지 참조) 및 적혈구의 부분 또는 전체 용혈의 능력을 사용하는 기술(예를 들어 혈액한천배지를 사용하는 방법)이 공지되어 있다. 일부 그룹 또는 박테리아 강은 이런 특징들로부터 유래될 수 있다.

한 변수는 다양한 형태의 박테리아 강을 다른 방식으로 착색할 수 있는 색원성 배지를 함유하는 페트리 접시 상에 샘플들을 뿌림으로써 추정적인 동정 기술로 나타내어진다. 이런 경우에, 식별은 배지에서 성장하는 콜로니의 다른 색을 기초로 한 시각적 형태이다.

샘플의 전통적인 동정은 수동 또는 자동 시스템에 의해, 얻은 표준화된 박테리아 현탁액(0.5 맥파랜드 농축액)을 (상기 콜로니의 다양한 형태와 무관하게) 페트리 접시 상에 이미 분리된 콜로니와 접종시킴으로써 테스트되는 적절한 패턴의 생화학적 테스트를 분석함으로써 얻어진다.

최근에, 다른 분석 기술이 박테리아 세포를 동정하는데 속도와 정확성을 개선하는데 도움이 되도록 개발되었다. 이런 기술에서, 지질, 인지질, 리포폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 단백질 또는 핵산과 같은 박테리아 세포의 생화학적 성분은 각 박테리아에 대한 특이적 분류학적 마커를 결정하도록 검사된다.

핵산의 증폭, 혼성화 및 서열화와 같은 분자 생물학 기술들은 결과의 특이성, 민감성 및 신속성의 특징을 겸비하며 미생물학 실험에 더 큰 관심을 일으킨다. 그러나, 오늘날 이들은 여전히 매우 표준화된 방법이 아니며 또한 매우 비용이 많이 든다.

세포흐름분석은 생물학적 샘플에서 박테리아를 동정하기 위한 기술로서 제안되었으나, 실험적 증거는 특이성과 양성 예상치의 면에서 나쁜 결과를 보여주었다(Tuesta, ECCMID 2009). 제안된 다른 발광 기술은 또한 순수 콜로니의 연구에 제한되거나 면역학적 방법과 결합돼야 한다.

생물학적 기질 상에서 박테리아를 동정하기 위한 가장 최근 기술 중에서, 분자 진동을 기초로 한 라만 분광학을 사용하는 것을 제공하는 응용분야가 개발되었다. 이것은 진동 스펙트럼의 높은 특이성 및 해상도 및 살아있는 시스템에 전형적인 물 환경으로부터 약한 배경 신호 때문에, 통합 박테리아를 포함하는 생물학적 재료를 분석하기 위한 비 파괴적이며 비 침투적인 분석 기술이다. 그러나 라만 신호는 비교적 약하며 특수 금속 공명체(은, 금 및 구리) 상에서 분석물의 흡착을 이용하는 SERS 기술을 사용하여 증폭된다(예를 들어 CA 2668259A1 참조).

최근에 다양한 조합을 가진, 예를 들어, 기체 크로마토그래피 또는 열분해 방법과 결합된 질량 분석법은 높은 민감성과 특이성을 가진 박테리아의 빠른 동정을 위한 방법의 개발을 위한 가장 전도 유망한 기술인 것으로 보인다. 질량 분석법을 사용하는 이런 기술의 설명이 지질 프로파일(US 2011/086384, WO 2008/058024A2) 또는 유전자 프로파일(US 5605798) 또는 신진대사 프로파일(WO 2011/064000 A1)이 아닌 단백질 프로파일(WO 2009/065580 A1)을 연구하기 위해 제공되는 특허 문헌에 보고되었다.

1996년 한 방법이 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight)로 불리는 질량 분석법의 특정 기술을 기초로 한 박테리아를 동정하는데 완벽하였다.

모든 질량 분석법 기술은 샘플에 존재하는 분자의 분자량을 측정하는 것을 가능하게 하나, 다른 기술과 달리 MALDI-TOF 질량 분석법은 복잡한 기질로 이루어진 샘플을 분석하는 것을 가능하게 한다. 이런 기술을 사용하여, 처음으로 박테리아 세포를 분석하는 것이 가능하다. 이런 분석의 결과는 신호가 세포벽에 약하게 연결된 단백질 구성요소 및 분석 단계 동안 분자의 부분 용해된 후 배출된 분자로부터 생기는 질량 스펙트럼이다. 이런 단백질 구성요소의 분자량은 강으로부터 강까지 변하며 박테리아 세포를 분석함으로써 얻은 질량 스펙트럼은 분석된 박테리아 강과 밀접하게 관련된 매우 구체적인 지문을 나타낸다.

이 기술은 페트리 접시로부터 소정수의 콜로니를 채취하여 장치의 레이저 조사 혈소판의 적절한 벽 상에 위치시킨다.

뒤이어, 적절한 기질이 첨가되고 혈소판은 장치에 의한 레이저 조사 및 질량 스펙트럼의 기록 이전 37℃에서 자동 온도 조절에 의해 건조된다.

상기된 방법의 한 변형(브루커 이름으로 WO 2009/065580A1)은 양성 혈액배양 플라스크에서 응용분야를 제공하는데, 이의 재료는 원심분리되고 얻은 펠렛은 장치의 샘플-운반 혈소판의 적절한 웰에 위치된다. 그런 후에 방법은 이전에 기술된 대로 지속된다.

공지된 특허 문헌은 박테리아의 분리된 콜로니의 단백질, 지질 또는 유전자 프로파일 또는 다른 경우 생물학적 샘플의 원심분리 재료로부터 얻은 박테리아 펠릿을 분석하는 것을 제공한다.

문헌 WO 2011/064000은 GC/TOF/MS 시스템을 사용하는 대조군 샘플에 대해 샘플의 신진대사 프로파일의 비교 분석을 사용하여 동물 생물학적 샘플(쥐)에서 박테리아에 의해 유발된 감염을 관찰, 동정 또는 진단하는 방법을 기술한다.

분석되고 기술된 동물 모델에서, 메타볼로믹(metabolomic)으로 불리는 전체 신진대사 프로파일은 감염된 대상의 건강을 관찰하기 위해 풍부한 바이오마커에서 변이를 탐지하도록 사용되었다.

동일한 문헌은 또한 낮은 분자량을 가진 구성요소의 혈청으로부터 용매에 의한 추출 이후 GC/TOF/MS 시스템을 사용하는 분석을 기초로 박테리아 감염을 관찰, 동정 또는 진단하는 방법을 제안하였다. 그러나 얻은 데이터는 박테리아 균주의 특정 대사산물을 동정하게 하지 않으나, 혈청에 존재하는 대사산물의 과다- 또는 과소-발현을 동정하게 한다. 데이터의 매우 다양한 분석은 단지 이런 변화가 박테리아 균주와 관련될 수 있다는 것을 강조한다.

더욱 최근에 고체상 미세 추출(SPME) 지지체 상의 적절한 배지 브로스에서 성장된 휘발성 대사산물/이화산물의 농도를 기초로 하고 뒤이어 GC/MS에 의해 분석되는 새로운 분석 방법이 완벽하였다. 이 시스템은 만족할만한 결과를 제공하였고, 어떻게 다른 박테리아가 다른 대사작용/이화작용 프로파일을 유도하여, 이들이 생물학적 기질에서 동정되게 하는 지를 보여준다. 이런 시스템의 한 단점은 필수적으로 SPME 농축 단계에 필요한 시간과 비용과 관련이 있다.

2012년 5월30일에 발행된 Heather D. Bean et al에 의한 논문: "Bacterial volatile discovery using sold phase microextraction and comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry"은 원심분리를 사용하여 배지 브로스로부터 추출 후 박테리아 이화생성물의 프로파일의 연구를 기술하며; 상청액은 여과 후 SPME를 사용하여 분석된다.

2011년 발행된 Khalid Muzaffar Banday et al에 의한 논문: "Use of urine volatile organic compounds to discriminate tuberculosis patients from healthy patients"은 결핵 환자 및 건강 환자 사이의 구별을 가능하게 하는 방법을 기술한다. 소변에서 발견된 마커는 소변 수준에서 박테리아의 대사작용/이화작용의 생성물이 아니며 결핵의 진행에 의한 전신 수준에서 대사이상증 생성물이다.

1984년에 발행된 T. J. Davies et al에 의한 논문: "VOLATILE PRODUCTS FROM ACETYLCHOLINE AS MARKERS IN THE RAPID URINE TEST USING HEAD-SPACE GAS-LIQUID CHROMATOGRAPHY"은 소변 박테리아 대사산물/이화산물이 분석되지 않으나 아세틸콜린이 생물학적 샘플에 주입되고 이런 물질의 박테리아 신진대사의 생성물이 연구되는 방법을 기술한다.

2004년 발행된 WO 2004/081527에서, 질량 분석법을 기초로 하지 않고 이온 이동성을 기초로 한 방법인 "Systems for differential ion mobility analysis"이 기술된다.

따라서 요구가 발생하였고 본 발명의 목적은 생물학적 샘플, 특히 소변 샘플에서 박테리아를 동정하기 위한 새로운 기술을 개발하는 것이며, 이 기술은 헤드스페이스(headspace)(SHS) 기체 크로마토그래피/질량 분석법(GC/MS)의 조합 기술을 사용하여 현재 기술에 의해 얻을 수 있는 것과 비교하여 더욱 중요하고, 정확하고 빠른 결과를 얻는다.

본 발명의 다른 목적은 자연 소변 샘플을 사용하여 박테리아 강을 동정하는 것이다.

다른 목적은 성장 및 강화 배지를 사용하지 않고 감염된 소변 샘플에서도 박테리아 균주의 동정을 얻는 것이다.

다른 목적은 동정의 신뢰성에 영향을 미치는 공동 존재 없이 생물학적 샘플에 존재하는 혼합 박테리아 콜로니의 공동 존재에 관한 정보를 허용가능하다.

본 출원인은 종래 기술의 단점을 극복하고 이런 및 다른 목적 및 장점을 얻기 위해 본 발명을 고안, 테스트 및 구현하였다.

정의

용어는 본 발명에 사용될 것이며 이를 위해 사전 정의가 제공되어야 한다.

액체 성장 배지의 그래프: 이것은 브로스 도표로도 불리는 배지 브로스의 기체 크로마토그래피/질량분석법 시스템(이하에서 GC/MS로 약칭한다)에 의해 탐지가능한 물질들의 다양한 피크의 그래프를 의미한다(BP).

대사작용 피크: 이것은 박테리아 강이 복제를 위한 영양분으로 소비되는 배지 브로스에 제공된 물질을 동정하는 GC/MS 도표이다(MPP).

이화작용 피크: 이것은 박테리아 강에 의해 생산된 물질을 동정하는 GC/MS 도표이다(CPP).

메타볼로믹 라이브러리: 이것은 신진대사 또는 성장을 위해 소비된 물질을 참조하여 각 박테리아 강의 다양한 특정 피크를 포함하는 GC/MS 도표의 조합이다(ML).

케타볼로믹 ( Catabolomic ) 라이브러리: 이것은 이화작용에 의해 생산된 물질을 참조하여 각 박테리아 강의 다양한 특정 피크를 포함하는 GC/MS 도표의 조합이다(CL).

선택적 고체 배지: 이것은 선택적 작용 물질(SSM)이 첨가된 고체 성장 배지이다.

선택적 액체 배지: 이것은 선택적 작용 물질(SLM)이 첨가된 고체 성장 배지이다.

비-감염된 자연 소변의 그래프: 이것은 임의의 배지의 부존재하에서 비 감염 자연 소변에서 GC/MS 시스템에 의해 탐지가능한 물질의 다양한 피크의 조합이다(NUP).

감염된 자연 소변의 그래프: 이것은 배지의 존재 또는 부존재하에서 감염된 소변에서 GC/MS 시스템에 의해 탐지가능한 물질의 다양한 피크의 조합이다(CNUP).

정적 헤드스페이스: 이것은 박테리아 배지 위의 용기(바이알)의 부피이다(SHS).

본 발명은 독립항에 설명되고 특징이 묘사되는 반면 종속항은 본 발명의 다른 특징 또는 주요 발명의 사상에 대한 변형을 기술한다.

본 발명은 이화작용 및/또는 대사작용 이후 박테리아에 의해 생성된 휘발성 물질의 SHS/GC/MS 탐지 및 분석 시스템을 사용하여 생물학적 샘플에서 박테리아 강을 탐지하고 동정하는 방법을 제공한다.

한 바람직한 형태의 실시태양에서, 자연 소변 또는 액체 배지가 첨가된 자연 소변과 같으나 이에 제한되지 않는 생물학적 샘플이 적절하게 밀봉된 바이알에 삽입되고; GC/MS 분석을 거치는 휘발성 물질을 생물학적 샘플 위의 부피(헤드스페이스)에서 적절한 채취(pick-up) 시스템을 사용하여 샘플 채취하였다.

한 바람직한 형태의 실시태양에서, 휘발성 샘플의 부피에서 고정된 양이 GC/MS 분석을 위해 기체 크로마토그래피 주입기에 제공된다.

다른 바람직한 형태의 실시태양에서, 휘발성 물질을 채취하기 위해서, 바이알의 밀폐 요소를 천공하고 내부에 박테리아에 의해 생성된 휘발성 물질이 존재하는 생물학적 샘플 위 원하는 양의 기체 질량을 채취하는 바늘 시스템이 사용된다.

본 발명은 살아있는 박테리아가 성장의 원료로 사용된 물질(대사산물) 및 생산된 물질(이화산물)의 자신의 고유 대사작용 및 이화작용을 가진다는 원리를 기초로 한다.

본 발명에 따라, 휘발성 대사산물 및 이화산물이 분석될 생물학적 샘플, 특히 소변이 주입되고, 접종되거나 뿌려진 바이알 내부에 배치된, 박테리아 배지 위에 상당량으로 채취되는 적어도 한 단계가 제공된다.

한 변형예에 따라, 휘발성 대사산물 및 이화산물은 고체상 미세추출(SPME)의 기술을 사용하여 채취된다.

그런 후에 본 발명은 휘발성 대사산물/이화산물이 GC/MS를 사용하여 분석되는 적어도 한 단계를 제공한다.

이런 분석의 목적은 구체적인 메타볼로믹 프로파일(MPP) 및 구체적인 케타볼로믹 프로파일(CPP)를 만들기 위해서 각 박테리아 강에 대한 대사작용 마커 및 이화작용 마커의 존재를 동정하는 것이다. 배지 또는 배지 브로스 단독(BP)에 관한 도표에 의한 비교를 통해, 메타볼로믹 및 카테볼로믹 프로파일은 다양한 박테리아 균주와 관련된 구체적인 라이브러리를 구성하게 하며, 이것이 그 안에 존재하는 가능한 박테리아 감염에 대한 연구에서 생물학적 샘플의 분석에서 동정을 허용한다.

이 방법을 사용하면, 본 발명은 비교적 짧은 측정 시간 내에(예를 들어 샘플당 5분의 범위) 분석된 생물학적 샘플에 존재하는 박테리아 강을 동정하게 하고, 따라서 가능한 표적화된 항생제 치료를 시작하게 한다.

본 발명은 또한 미생물학에서 자동제어에 적합한 결과를 제공하기 위해 다른 자동 시스템에 쉽게 통합될 수 있다.

제한적이지 않은 본 발명에서 제안된 케이스에서, 다른 실험실 기술보다 다음의 작동 장점을 가진다.

박테리아 동정의 경우, 공지된 MALDI-TOF 시스템은 펠렛이 박테리아 분리 재료로부터 제조될 것을 필요로 한다. 당업자에게 공지된 대로, MALDI-TOF 방법의 한계는 펠렛에 존재하는 한 콜로니 이상인 혼합 콜로니가 나타날 때 탐지 한계로 제공된다.

헤드스페이스의 검사가 검사될 샘플이 접종된 밀봉된 바이알에서 직접 실행되기 때문에 본 발명에 따른 방법은 어떠한 펠렛도 제조될 것을 필요로 하지 않는다. 따라서 채취한 휘발성 물질의 분석은 각 박테리아 강에 대한 구체적인 크로마토그래피 도표를 제공하며 동일한 샘플에 존재하는 하나 이상의 박테리아의 존재에 의해 덜 영향을 받는다.

사실, 각 박테리아 강은 다른 균주의 공동 존재와 상관없이 메타볼로믹/케타볼로믹 구성요소를 발현하기 때문에, 본 발명은 상기 공지된 기술에 의해 얻는 것이 불가능하거나 매우 어려운 것인, 혼합 콜로니의 존재에 대한 정보를 얻게 한다.

상기한 대로, 본 발명은 임의의 펠렛의 특정한 제조를 필요로 하지 않는데, 즉, 상기 펠렛을 얻기 위해 샘플의 어떠한 처리 및 상응하는 원심분리를 필요로 하지 않는다.

분석될 샘플의 헤드스페이스의 분석은 자연 샘플 또는 액체 성장 배지가 첨가된 자연 샘플에 의해 또는 액체 배지에서 희석된 페트리 접시로부터 분리된 콜로니에 의해 충족될 수 있다.

1) 절차 및 액체 배지에서 소변 샘플의 제조

ATCC(American Type Culture Collection) 미생물의 공지된 균주를 건강한 환자로부터의 자연 소변 샘플에 첨가하고 액체 배지 브로스를 함유하는 바이알에 삽입하였다. 그런 후에 샘플을 맥파란 탁도의 다양한 수준에서 탐지하였고 뒤이어 GC/MS 기술을 사용하여 분석하였다.

분석의 결과는 첨가된 ATCC 균주의 카테볼로믹 프로파일(CPP) 특징을 나타내었다.

결과는 또한 BP 그래프에 대한 차이로서 첨가된 ATCC 균주의 메타볼로믹 프로파일(MPP) 특징을 나타내었다.

2) 절차 및 페트리 접시에서 소변 샘플의 제조

ATCC 미생물의 공지된 균주를 건강한 환자로부터의 자연 소변 샘플에 첨가하였다. 이렇게 얻은 샘플을 페트리 접시에 뿌렸다. 그런 후에 샘플을 분리된 콜로니를 위한 보정 루프(calibrated loop)를 가진 배지로부터 채취하였고 액체 배지 상에서 희석하였다. 뒤이어 샘플을 맥파란 탁도의 다양한 수준에서 탐지하였고 뒤이어 SHS/GC/MS 기술을 사용하여 읽었다.

이 경우에 또한, 분석의 결과는 BP 그래프에 대한 차이로서, 첨가된 ATCC 균주의 카테볼로믹 프로파일(CPP) 특징 및 첨가된 ATCC 균주의 메타볼로믹 프로파일(MPP) 특징 모두를 나타내었다.

3) 절차 및 자연 소변 샘플의 제조

ATCC 미생물의 공지된 균주를 건강한 환자로부터의 자연 소변 샘플에 첨가하였다. 그런 후에 샘플을 맥파란 탁도의 다양한 수준에서 탐지하였고 뒤이어 GC/MS 기술을 사용하여 읽었다. 분석의 결과는 첨가된 ATCC 균주의 카테볼로믹 프로파일(CPP) 특징을 나타내었다.

결과의 설명

이 기술을 사용하면, 본 발명이 고체 배지 또는 페트리 접시 또는 액체 성장 배지에 뿌려진 ATCC 박테리아 균주를 함유하는 소변 샘플 또는 자연 소변 샘플에 특이적인 이화작용 피크(CPP) 및 대사작용 피크(MPP)를 탐지하게 한다는 것이 분명하다.

본 발명은 또한 GC/MS 장치에서 읽기 전에 임의의 전처리 없이, 즉 박테리아의 농축 펠렛을 얻기 위해 샘플을 원심분리할 필요 없이 샘플을 사용하여 소변 샘플에 존재하는 박테리아 강을 동정하게 한다.

따라서 본 발명은 박테리아 동정을 가능하게 하며 이에 의해 반응은 자동 흐름 시스템에서 얻을 수 있다.

본 발명은 각 개별 박테리아 강에 대한 메타볼로믹 피크(MPP) 및 케타볼로믹 피크(CPP)를 동정하는 것을 가능하게 하여, 각 박테리아 강에 대한 구체적인 메타볼로믹 라이브러리(LB) 및 케타볼로믹 라이브러리(CL)의 제조를 가능하게 하는 특유한 GC/MS 도표를 제공한다.

대사작용 피크(MPP)는 박테리아 영양분으로서 도표 "액체 배지 그래프(BP)"에 의한 비교를 통해 박테리아 균주에 의해 소비된 물질의 도표를 제공한다.

따라서 본 발명은 고체 성장 배지(페트리 접시)를 사용하고 액체 배지를 사용하며 그리고 배지 없이 자연 샘플로부터 각 박테리아 강에 대한 구체적인 라이브러리를 사용하는 것을 가능하게 한다.

소변에 존재하는 박테리아 균주는 대사산물에 특이적인 라이브러리(ML) 및 이화산물에 특이적인 라이브러리(LB)를 나타낸다.

소변 샘플의 대사작용 피크(MPP) 및 소변 샘플의 이화작용 피크(CPP)의 탐지는 후속 GC/MS 분석을 위한 박테리아 역가의 최적 값을 확인하기 위해서, 맥파란 탁도의 다른 수준에서 실행하였다.

상기한 대로 본 발명은 임의의 성장 배지 없이 자연 소변 샘플에서 박테리아 동정을 얻는 것을 가능하게 한다.

분석 절차: 상기한 대로, 본 발명에 따른 방법은, 예를 들어, 박테리아 배지가 함유된 바이알인 밀봉된 용기의 위 부피, 즉, 헤드스페이스에 존재하는 휘발성 대사산물/이화산물의 분석을 기초로 한다. 휘발성 분자 강은 SHS 시스템을 사용하여 채취되거나 한 변형예에 따라, SPME 시스템을 사용하여 채취되며, 이것이 샘플의 어떠한 처리 없이 GC/MS에 의한 직접 분석을 가능하게 한다.

분석 시간에 급격한 감소를 얻기 위해, SHS 시스템의 정확한 매개 변수화를 실행하며 빠른 크로마토그래피(빠른 GC)를 사용하는 것이 제공되었다. SPME/GC/MS 시스템에 대한 30-35분의 크로마토그래피 분석의 통상적인 시간은 7-10분으로 감소되었다.

첫 단계에서 배지 브로스에 관한 샘플을 분석하여 블랭크(blank)를 얻었다. 그런 후에, 배지+박테리아 균주의 샘플을 다른 맥파란 값에서 분석하였다.

각 박테리아 균주에 대해 특이적인 GC/MS 도표의 분석이 각 박테리아(이화산물)의 특징적인 분자 강을 동정하게 하고 배지(대사산물)에 특유한 강의 풍부함에 상당한 감소를 나타내게 하였다.

한 바람직한 해결책에서, 정확한 크로마토그래피 잔류 시간 및 질량/적재량 비(m/z)를 특징으로 하는 각 박테리아 균주에 대한 특징적인 강의 탐지를 "재구성된 이온 크로마토그램"(RIC)로 알려진 기술을 사용하여 실행하였다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

첨부된 도면은 비 제한적인 실시예로서 제공되며 일부 그래프를 도시한다.
도 1은 박테리아 균주 대장균을 함유하는 브로스의 GC/MS 도표와 비교된 액체 성장 배지의 GC/MS 도표를 도시한다.
도 2는 신진대사 영영소의 작용으로서 영양적 또는 메타볼로믹 피크의 감소를 도시하는 일련의 RIC 도표를 도시한다.
도 3-6은 이화작용의 생성물로서 ATCC 박테리아 균주에 존재하는 특정 물질의 이화작용 피크의 도표의 예를 도시한다.
도 7-9는 m/z 108(K. pneumoniae에 대한 특징), m/z 88(E. faecalis에 대한 특징) 및 m/z 162(E. coli에 대한 특징)를 가진 강에 관한 RIC 도표를 도시한다.
도 10-14는 E. coli, E. faecalis, K. pneumoniae, P. mirabilis 및 S. epidermidis의 박테리아 균주에 의해 각각 감염된 자연 소변에 대해 얻은 도표를 도시한다.

이하에서 예로서, 성장 배지에서 배양된(접종된) 박테리아 균주의 분석의 일부 실시예를 기술하며 얻은 분석 결과를 도면에 도시할 것이다.

ATCC 균주로부터의 공지된 박테리아 균주를 재구성하고 박테리아 복제물을 만들 수 있는 펩톤의 혼합물을 함유하는 액체 배지에 접종하였다.

박테리아 성장을 성장의 수준을 알기 위해 맥파란 탁도의 수준을 측정함으로써 관찰하였다.

탁도를 측정하면 다양한 적절한 맥파란 수준을 분류하는 것이 가능하였다.

일단 박테리아 성장의 진행이 액체 배지 브로스에서 탐지될 때, 박테리아 균주를 함유하는 배지 브로스의 양을 검사한 각 박테리아 강에 대해 채취하였다.

헤드스페이스에 존재하는 휘발성 성분을 SHS에 의해 채취하고 GC/MS 장치 속에 자동으로 주입하였다.

도 1은, 상부에서, 액체 성장 배지로부터 얻은 GC/MS 도표를 도시한다. 상기 액체 성장 배지에 의해 방출된 휘발성 물질을 GC/MS를 사용하여 분석하였고 최종 도표는 특정 물질의 다양한 피크를 나타내었다. 이것은 "성장 배지 그래프" 또는 "브로스 도표(BP)" 또는 "블랭크 도표"로 정의된다. 도 1은 하부에서 대장균의 존재하에서 동일한 브로스의 헤드스페이스에서 채취한 물질로부터 얻은 도표를 도시한다(1 맥파란).

대사작용 피크의 그래프

공지된 ATCC 박테리아 균주를 액체 성장 배지에 삽입하였고(뿌렸고) 다양한 맥파란 값에서 헤드스페이스에 존재하는 휘발성 물질을 GC/MS 장치에 주입하였다.

존재하는 박테리아는 대사작용된 물질, 즉 영양물의 원료로서 액체 성장 배지로부터 추출된 물질의 특정 피크를 가진 크로마토그래피 도표를 나타내었다.

상기 도표에 나타내어진 영양성 또는 메타볼로믹 피크는, "브로스 도표"(BP)로부터 피크가 이들의 대사작용 영양물의 작용에 의해 감소하는 한, 브로스로부터 추출된 물질의 특이성을 강조한다. 이 점에 대해 도 2에 도시된 비교 도표를 참조해야 하며, 여기서 역시 그래프의 상부는 배지 단독에 관한 도표를 도시하는 반면 하부는 대장균의 균주의 배지에서 뿌리기 하에서 도표를 도시한다.

피크는 "박테리아 메타볼로믹 그래프"로 정의될 수 있고 배지 브로스 단독에 관한 그래프 또는 "배지 도표"와 비교와 비교되어, 9.50 내지 10.00분의 시간 간격에서 도시된 것과 같이, 배지 브로스에서만 탐지가능한 다양한 피크의 소모 또는 오히려 감소를 나타내었다.

다시 말하면, GC/MS에 의한 측정은, 특정 피크에 의해, 상기 박테리아의 신진대사를 나타내는 가능하게 하였고, 배지 브로스 단독의 피크와 비교함으로써, 브로스 단독에 대해 특정 피크의 상대적 감소에 의해 박테리아가 제공하는 물질의 탐지를 나타내는 것을 가능하게 하였다.

영양적 박테리아 대사산물의 분석이 각 박테리아 강에 대한 특징을 나타내기 때문에, 특정 피크의 탐지는 각 박테리아 강에 관한 "메타볼로믹 라이브러리"를 작성하는 것을 가능하게 한다.

케타볼릭 피크의 그래프

동일한 분석과 비교를 ACTT 박테리아 균주로 실행하였고, 도 3-6에 도시된 도표로부터 볼 수 있듯이, 이것이 이들의 이화작용의 생성물로서 특정 물질의 이화작용 피크를 제공하였다.

상기와 같이, 도면은 브로스 단독에 의해(상부) 및 박테리아 균주의 존재에 의의해(대장균) 얻은 GC/MS 도표의 성장을 나타내며 비 질량/박테리아 적재량(m/z)의 다양한 값을 가진다(도 3: m/z = 45; 도. 4: m/z = 60; 도. 5: m/z = 70; 도. 6: m/z = 112).

이 경우에도 역시, 특정 피크의 존재 때문에 각 박테리아 강에 대해 특징적인 박테리아 이화산물의 분석은 각 박테리아 강의 "카타볼로믹 라이브러리"를 작성하는 것을 가능하게 하였다.

결론적으로, GC/MS 장치를 사용함으로써, 각 박테리아 강에 대해, "메타볼로믹 라이브러리" 및 "케타볼로믹 라이브러리"를 얻는 것이 가능하였고, 이는 찾게 될 박테리아 강을 동정하는데 비교 장치로서 사용될 수 있다.

어떤 경우에도 본 발명은 두 라이브러리를 개별적으로 사용하는 것이 가능한데; 예를 들어, "케타볼로믹 라이브러리" 단독이 박테리아 강을 동정하는데 충분할 수 있는데, 이는 박테리아 균주의 분명한 인식을 제공할 수 있고 페트리 접시 또는 자연 소변으로부터 직접 샘플을 채취함으로써 사용될 수 있기 때문이다.

이런 기술을 평가하기 위해서, 예를 들어 30개 박테리아 균주를 분석하였다.

GC/MS로 분석된 각 박테리아 강은 대사작용 피크 및 이화작용 피크에 관한 도표에 특징적인 특유의 그래프를 제공하였다.

상기한 대로, 도표는 각 박테리아 강에 대한 구체적인 라이브러리를 생성하는 것을 가능하게 하였다.

각 박테리아 강에 특징적인 피크를 동정하였기 때문에, 분석 시간은 특징적인 피크를 탐지할 수 있는 최종 도표를 얻기 위해 필요한 시간으로 감소하였고, 특징적인 피크를 탐지할 수 있고, 이런 방식으로 매일의 정해진 순서에 적합한 분석 시간을 얻는 것을 가능하게 한다.

상기로부터 GC/MS 측정 동역학에서, 각 개별 강의 이화산물에 관한 피크의 특정 그래프 및 동시에 배지 브로스로부터 추출된 물질에 관한 피크의 그래프를 가진 박테리아 균주의 샘플에 대해, 어떻게 본 발명이 각 강의 박테리아 신진대사 및 이의 이화작용의 동역학에 의해 다른 박테리아 강을 분석하고 동정하게 하는 지가 분명하다.

각 박테리아 강에 관한 그래프 도표는 성장을 촉진하기 위해 박테리아가 접종된 배지 브로스에 의해 생산된 대사산물 및 소비된 물질 모두에 대한 특유의 피크를 가진다는 것이 발견되었다.

소비된 대사산물의 탐지 및 생산된 이화산물의 탐지 모두를 위한 각 박테리아 강의 도표는 각 박테리아 강에 대해 특이적이며 따라서 데이터에 기인할 수 있는 상대 그래프를 분석함으로써, 즉, 각 박테리아 강의 라이브러리에 함유된 참조 데이터와 비교함으로써 동정을 가능하게 하였다.

"케타볼로믹 라이브러리"를 사용하여 개별 박테리아 강의 동적 분석을 얻기 위해서, 바람직하나 제한적이지 않은 해결책은 액체 성장 배지를 사용하는 것이다.

본 발명은 따라서, GC/MS 측정 동안 이의 동역학에서, 박테리아 강이 공급하는 물질, 즉 박테리아 신진대사 및 이화작용 또는 이의 특정한 이화작용에 의해 탐지된 물질의 크로마토그램을 사용하는 비교 및 탐지를 나타낸다.

동일한 방법이 30개 다른 박테리아 균주에 의해 감염된 소변을 함유하는 브로스를 분석하는데 사용될 수 있다. 배지 브로스 단독의 존재하에서 관찰된 것과 어느 정도 다른, 메타볼로믹 및 케타볼로믹 프로파일이 관찰되었으나, 이 경우에도 소변의 존재하에서 박테리아 이화작용으로부터 얻은 분자 강을 동정하는 것이 가능하였다.

이런 강의 일부는 각 박테리아 균주에 특이적이었고, 따라서 브로스 + 소변 시스템에서 성장된 박테리아에 관한 데이터를 함유하는 라이브러리를 생산하는 것을 가능하게 한다. 라이브러리는 감염된 소변 샘플에 존재하는 특정 박테리아 강을 동정하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 도 7-9는 브로스 + 비 감염된 소변의 샘플로부터 얻은 것과 비교된 m/z 108(K. pneumoniae에 대한 특징), m/z 88(E. faecalis에 대한 특징) 및 m/z 162(E. coli에 대한 특징)를 가진 강에 관한 RIC 도표를 도시한다.

상기 방법의 유효성은 임의의 배지의 부존재하에서, 자연 소변 샘플에 대해 테스트하였다.

얻은 결과는 이런 조건에서 각 박테리아 균주에 특이적인 휘발성 이화산물이 탐지될 수 있다는 것을 나타낸다.

도 10-14는 E. coli, E. faecalis, K. pneumoniae, P. mirabilis 및 S. epidermidis의 박테리아 균주에 의해 각각 감염된 자연 소변에 대해 얻은 도표의 예를 를 도시한다.

이런 도면에서, 특정 이온 강의 RIC 그래프(재구성된 이온 크로마토그램)은 비 감염된 소변의 그래프와 비교된다.

m/z 117 및 24.90분의 잔류 시간을 가진 강은 E. coli에 대해서만 존재하며, m/z 60 및 8.07분의 잔류 시간을 가진 강은 E. faecalis에 특징적이라는 것이 관찰될 수 있다. 같은 방식으로, m/z 60 및 7.80분의 잔류 시간 및 m/z 42 및 5.60분의 잔류 시간을 가진 이온은 각각 K. pneumoniae 및 P. mirabilis에 대해 특이적이다. 7.54의 잔류 시간을 가진 S. epidermidis에 대해 탐지된 m/z 79를 가진 이온은 또한 다른 균주에 존재하나, 다른 잔류 시간을 가지며, 이는 다른 분자 강 때문이라는 것을 나타낸다.

다음 청구항에 정의된 대로 본 발명의 분야와 범위를 벗어나지 않고, 본 발명에 대해 변화 및 변형이 가능할 수 있다.

Claims

생물학적 샘플, 특히 소변 샘플에서 박테리아 강을 동정하는 방법으로서, 상기 방법은 배지 또는 배지 브로스에 생물학적 샘플을 뿌리고 특정 박테리아 강에 특징적인 그래프 도표를 동정하기 위해서 상기 생물학적 샘플의 대사산물 및 이화산물과 같은 휘발성 구성요소의 기체 크로마토그래피-질량 분석법(GC/MS)에 의한 분석을 실행하게 하며, 기체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하는 분석은 각 박테리아 강에 대한 대사작용 마커 및 이화작용 마커의 존재를 동정하고 상기 마커를 동정함으로써, 동정될 각 박테리아 종에 관한 특정 메타볼로믹 프로파일 및 특정 케타볼로믹 프로파일을 제조하게 하며, 생물학적 샘플에 존재하는 특정 박테리아 강의 동정은 생물학적 샘플 없는 특정 배지에 관한 도표에 대해 GC/MS 분석에 의해 얻은 특정 도표를 비교함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
분석될 생물학적 샘플은 밀폐되고 밀봉된 테스트 튜브 또는 바이알 속에 주입되고 GC/MS 분석을 거치게 될 휘발성 구성요소는 생물학적 샘플 위 부피 또는 정적 헤드스페이스(SHS)에서 채취되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
생물학적 샘플은 자연 생물학적 샘플로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 자연 생물학적 샘플은 자연 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
생물학적 샘플은 액체 배지 브로스에 의해 풍부해진 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
생물학적 샘플은 페트리 접시로부터 채취되고 액체 배지 브로스를 함유하는 측정 테스트 튜브 또는 바이알에서 희석된 콜로니로부터 얻은 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
특정 박테리아 강의 동정은 감염된 자연 소변 샘플 및 비 감염된 자연 소변 샘플로부터 얻은 GC/MS 데이터를 비교함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
대사작용 피크(MPP), 즉, 박테리아 강이 복제를 위해 영양물로서 배지에 존재하는 물질을 동정하는 GC/MS 도표 및 이화작용 피크(CPP), 즉, 박테리아 강에 의해 생산된 물질을 동정하는 GC/MS 도표의 피크는 GC/MS 분석을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서,
생물학적 샘플의 대사작용 피크(MPP) 및 생물학적 샘플의 이화작용 피크(CPP)의 탐지는 후속 GC/MC 분석을 위해 박테리아 역가의 최적 값을 동정하도록, 맥파란 탁도의 다른 정도에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
샘플은 고체상 미세추출(SPME) 기술에 의해 헤드스페이스에서 채취되는 것을 특징으로 하는 방법.