JP6961592B2 - 生体試料のバクテリアの活動を検出する方法及び対応する検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、検出装置でガスクロマトグラフィに基づく技術を用いて、生体試料（限定されないが特に血液試料）に含まれるバクテリア種の活動及び存在を検出するための方法に関する。

本発明はまた、生体試料に含まれるバクテリアの活動を検出するための検出装置に関する。

本発明による方法は、分析されるさまざまな生体試料においてバクテリアの存在を検出するために、例えばヒトの診断法や、獣医学分野、食品、及びその他の分野において採用され得る。

生体試料中の、バクテリアと微生物の活動を迅速かつ正確に検出することは、感染症を診断し、そして正しい抗生物質治療を策定する際に基本となる。

バクテリアの活動を検出する主な直接法では、バクテリアの増殖を促進させることが可能な特定の栄養素を有する培地又は培養液に、生体試料を配置する。

培地又は培養液を使用する技術は、培地又は培養液の特性と、バクテリアの増殖自体を促進させる条件に応じて変化する待ち時間を特徴とする。

バクテリアの存在を検出する他の技術は、試験管、又は他の適切な容器（例えば一般的にバイアルと称するもの）のヘッドスペースに存在するガスを分析することである。

「ヘッドスペース」とは、検討される試料の上部に位置する密封された試験管内部の自由体積を意味する。

現在は、試験管の底に配置される錠剤とバクテリア負荷を含む生体試料とを接触させ、バクテリアより生じるガスを吸収する機能を有する培地又は培養液を加えて使用する試験管が用いられる。

米国特許出願公開第２０１０／０２５５５２９号には、試験管の培地に生体試料を植菌（シーディング）することによって、生体試料のガス状物質を検出するための方法が記載される。

さらにまた上記出願公開には、誤検出の可能性がある測定を排除するためバクテリアが試料に存在し複製しているという信号として、空中に通常存在するＣＯ_２量と比較したＣＯ_２の増加を測定することで生体試料が陽性であるか陰性であるかを区別するために、異なる時間間隔で二酸化炭素（ＣＯ_２）の反復測定を行う方法が記載されている。

ＣＯ_２の検出が不確かである場合、すなわち、検出されたＣＯ_２の含有量がバクテリアの存在を確実に証明するための閾値をぎりぎり超えない程度の一定の範囲にある場合は、ヘッドスペースを再度ガスで飽和させるために、第一段階に加えて、さらなる培養が第二段階として実施される。

従来の手順と比較し改良されるが、これらの技術は、試料に存在するバクテリア負荷に応じて変化するＣＯ_２を検出するための時間を要する。そして、培養によりバクテリアが確実に存在すると判断できるようにするためには、数日かかることもある。

検出に要する時間が反応の即時性と一致しないことはよくあることである。

全血試料のガスを分析するために、ＣＯ_２を検出するためのガスを捕捉する装置を用い得ることは公知である。例えば従来技術で公知である、例えばＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ及びＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎにより提案される装置が用いられ得る。

例えばＦ．Ｇａｒｄｉｎｉらによる文献、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９，１９９７年，１０３―１１４の、食品分野の他の解決策には、食品試料が配置される密封された試験管のヘッドスペースのＣＯ_２の分析についての記載がある。そして、試験管内に存在するバクテリア数を、ヘッドスペースで測定されるＣＯ_２の割合のみと相関させる。

この解決策では、血液試料に通常存在するＣＯ_２量よりかなり多い、多量のＣＯ_２（すなわち３００ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）より多量）を測定することにより、食品試料のバクテリア数に関する情報を得ることは可能であるので、この特定の分野に限られる。

Ｆ．Ｇａｒｄｉｎｉらにより記載される解決策でも、ＣＯ_２の量が３００ｐｐｍより低い場合は、長い時間かけて測定しても正確かつ信頼性が高い結果が示されることはない。

あるいはバクテリアの存在は、試験管自体のストッパーに配置されるセンサによって（例えばＶｅｒｓａｔｒｅｋ―Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ装置を用いて）、確定及び測定される圧力の変化を検出することにより検出することができる。

バクテリアの活動を検出する他の技術としては、例えばＣＯ_２、Ｏ_２、Ｈ_２といった、測定され検出されるガス種を確認せずに、試験管内部で圧力の違いを評価することを提供する。

他の公知の解決策（例えば国際公開第２０１４／１２８６２９号（ＷＯ´６２９）及び国際公開第２００６／０７９８４６号（ＷＯ´８４６））では、分析される試料に存在する菌種を確認するための方法について記載される。そして、この特定の場合では、ヘッドスペースに存在する有機物又は有機的に生成された物質である、気体サンプルを取り除き分析する。

これらの公知の解決策では、単一測定を行うが（ｏｎｅ ｓｐｏｔとも称する）、検討される試料におそらく存在するバクテリアの増殖及び複製に関する情報の提供はない。

米国特許出願公開第２０１０／０２５５５２９号 国際公開第２０１４／１２８６２９号 国際公開第２００６／０７９８４６号

Ｆ．Ｇａｒｄｉｎｉらによる，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９，１９９７年，１０３―１１４

本発明の１つの目的は、素早く使いやすく、そして確実な結果を保証する、生体試料のバクテリアの活動及び存在を検出するための方法を完成させることである。

本発明の別の目的は、ＣＯ_２の存在と同時にＯ_２の存在も検出することができ、例えば、ＣＯ_２量の増加及びＯ_２の減少（すなわち、炭素及び酸素結合を形成するために用いられる）の検証を可能にする方法を提供することである。ガス成分の連続流を計測することにより測定を行うことができる。

本発明の別の目的は、存在するバクテリアを検出するために必要とされる生体試料の量を低減できる方法を提供することであり、血液試料におけるＣＯ_２を検出する公知の方法では、１０ｍｌを超える全血が用いられる試験管を必要とする。

従来技術の欠点を克服して、これらの目的とその他の目的及び利点を得るために、出願人は、本発明を考案して、テストして、実施した。

本発明は独立クレームにおいて記載され、特徴づけられる。その一方で、従属クレームには、主たる発明概念に対する、本発明又は変形例の他の特徴が記載される。

上記の目的に従い本発明は、無機ガス状物質を分析することにより、バクテリアの活動、すなわち、生体試料内で複製している生菌を検出するための方法に関する。
無機ガス状物質とは、特には限定しないが、生体試料が導入された、密封された試験管のヘッドスペースにあるＣＯ_２、Ｈ_２、Ｏ_２等である。

本発明は、生菌は自身の代謝のサインとしてＣＯ_２の発生を伴う活性代謝の１つを有するという原則と、減少するＯ_２の同時の測定とに基づく。

ＣＯ_２及びＯ_２の測定は有利には、動的測定として行われる。すなわち、さまざまな読出時間で、ヘッドスペース内部のガス状物質の連続流において行われる。

従って、ヘッドスペースにおける密封されたバイアルに挿入された生体試料についての一連の動的測定は、時間的な測定曲線を提供することができる。そこから、特にＣＯ _２ の増加と、炭素と結合するＯ _２ の減少とによって決定される、バクテリアが複製する際の活動の動態が構築される。

本発明の方法は、生体試料に存在する真菌及び酵母の検出においても応用される。

従って本発明の方法は、無機ガス状物質（例えば特にＣＯ_２、Ｈ_２及び／又はＯ_２）の含有量を分析するためにヘッドスペースに含まれるガスの除去を提供する。

実施例において、生体試料におそらく存在するバクテリアの複製を容易にするために、本発明は、ヘッドスペースに、バクテリアの複製の速度を上げる、炭化水素（メタン、エタン、プロパン及び他の類似物又は相当物質）といった補助（ａｄｊｕｖａｎｔ）物質の導入を提供する。

有利な実施例において、本発明は試料を収集するためにバイアル内部に溶解（ｌｙｓａｎｔ）物質を導入する。そして、これにより赤血球を分解し、細胞間バクテリアが試料試験管で複製可能となる。

例えば、読み込みのスタートの時間Ｔ０で検出され、続く間隔Ｔ１，Ｔ２，．．．，Ｔｎで経時的に再読される無機ガス状物質の存在の検出により、時間的な検出曲線（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を構成することができる。そして、その成長動態に基づいて、無機物の検出によって引き起こされるその急激な変化を検出することで、バクテリアの存在を検出するための時間を低減させる。

従来技術における公知の応用とは異なり、本発明は、検出される増加曲線（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）を得て、例えばｐｐｍまでの量を定量化できるようにする。

可能な実施例によると、従って本発明は、１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍの範囲で、生体試料のバクテリアの存在に関係する無機物（例えばＣＯ_２）を同定できるようにする。

実施例において、バクテリアのための栄養物質を備える培地又は培養液を導入することも提供され、そして、有利には増殖を促進させる。このようにして、分析のために必要とされる時間を結果として減少させる、バクテリア増殖に好ましい培養が作り出される。

実施例において、ＣＯ_２、Ｈ_２及び／又はＯ_２の濃度の変化を検出するための分析は、熱電導度検出を有する高速の、小型化されたガスクロマトグラフを用いて行われる。

具体的にはマイクロ・ガスクロマトグラフを用いて、試験管内部に針を導入し、ヘッドスペース分のガス量が除去される。

この解決策では、針は、試験管のヘッドスペースで発生するガスを除去することが可能な吸引部材に接続している。

本発明の変形例によれば、２本目の針を用いて試験管の内部から採取される量のガスを再導入することについても提供される。

マイクロ・ガスクロマトグラフ内部へヘッドスペース量のガスを再導入することにより、マイクロ・ガスクロマトグラフが無機ガス状物質の検出を容易にするガスの循環を作り出せるようにする。
流れを測定することにより、針に接続されるポンプが吸引可能なガス状物質を有することができるように、時間ごと検出できる量のガス状物質の増加値（δ）を測定できるようにする。
連続流を測定することより、第２（２回目）の試料採集で、測定可能かつ利用可能なガスを見つけ、測定時間にＣＯ_２の増加及びＯ_２の減少を比較できるようにする。

再循環するこの流れがなければ、第２の試料採集により利用できるガスは発見されない。なぜなら、それは第１の試料採集によって抽出されているからだ。

実施例において、生体試料の撹拌又は細菌培養ができるように、磁性素子を試験管内部に設けることができる。
被検試料の混合は、溶解物質の挿入により赤血球の細胞溶解を容易にするだけでなく、培養液に栄養素材料を供給するために、バクテリアの複製を促進させる。

添付の図面を参照して非限定的な実施例として与えられ、本発明のこれらの特徴および他の特徴は、いくつかの実施例の以下の説明から明らかになる。

一実施例による検査法の概略図である。

理解しやすくするために、可能であれば、図面中の同一の共通の要素を識別するために、同じ参照番号が使用されている。一実施例の要素及び特徴が、更なる説明なしに他の実施例に適宜組み込まれることができるものと理解される。

図１は、生体試料が入った気密封止試験管の、ＣＯ_２、Ｈ_２及び／又はＯ_２の存在及び量を検出することによって、バクテリアの活動を検出するための、すなわち、生きており複製しているバクテリアの存在を検出する方法１０を記載するために用いる。

例えば、生体試料１４は、以下に限定されないが、血液、尿、唾液、粘液、涙液、又は他の適切な試料から成ることができる。

実施例において、生体試料１４は、試験管又はバイアル１２に挿入されて、最適に封止され殺菌される。

試験管１２は、自己気密する膜（例えばゴム）を備え、そして、例えば針が通過できるストッパー１６によって封止される。

試験管１２内部に最低限の生体試料１４（例えば５ｍｌ未満）を導入することによって、生体試料１４は分析される。

たとえ少量の生体試料１４しか利用できない場合も、例えば新生児のための分析の場合も、この態様により有利には本方法を適用できるようにする。

本発明の一態様では、試験管１２内の、ストッパー１６と生体試料１４の高さ間に定められる、すなわち生体試料１４より上部には、自由体積又はヘッドスペース１８が残される。

ヘッドスペース１８では、ガス又は揮発性物質の蓄積が可能である。それは、バクテリア（バクテリア異化作用）によって試験管１２内部で増殖の間に生じる無機ガス状物質である。

以下に、例えばＣＯ_２、Ｈ_２及び／又はＯ_２といった無機ガス状物質として理解される揮発性物質を参照する。無機ガス状物質は、本開示内容において定められ、有機物を含まない。

実施例において、容積分析で定められた分量のガスは検出装置２２に送られるが、これについては後述する。

従って、少なくとも1つのステップは、試験管１２に存在するヘッドスペース１８から気体サンプルを採取することである。

他の実施形態では、検出装置２２は、ＧＣ分析を実行するガスクロマトグラフ又はマイクロ・ガスクロマトグラフ２２である。

小型化され、移行容積（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｌｋ）を最低限まで低減するよう最適に構成される、マイクロ・ガスクロマトグラフ２２は、ストッパー１６を穿孔する装置も備える。

実施例において、ヘッドスペース１８内部から気体サンプルを採取するために、試験管１２のストッパー１６を穿孔し、その内部にバクテリアにより発生するガスが存在する、生体試料１４の上部で所望量のガス質量を吸い上げる針装置２０を使用する。

その後気体サンプルは、ＣＯ_２、Ｈ_２及び／又はＯ_２の存在及び／又は量を検出するために、マイクロ・ガスクロマトグラフ２２によって分析される。

特に、マイクロ・ガスクロマトグラフ２２は、制御及び命令装置２８を提供する。

可能な実施例によれば、マイクロ・ガスクロマトグラフ２２は、１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍの範囲で、生体試料のバクテリアの存在に関連する無機物（例えばＣＯ_２、Ｈ_２及び／又はＯ_２）を同定するように構成される。

制御及び命令装置２８はＣＯ_２３０の検出パターンを処理することができる。すなわち、ヘッドスペース１８で生じ、存在するガス状異化作用物質の検出パターンである。

さらにまた、別の方法としてか、ＣＯ_２の測定に加えて、制御及び命令装置２８は、検出パターンＯ_２３２を処理することができる。

同時にＣＯ_２又はＯ_２のような２種類以上の無機ガス状物質の時間的変化を同時に測定できることで、それぞれのパターンを関連付けて、正確で信頼性が高くかつ完全な結果を得ることができる。

さらに測定は、ヘッドスペースにガスを測定毎に再導入することによって行われる。その結果、順番に測定が行われ、各物質の時間的進化、そしてそれ故に、関連付けられたバクテリアの活動の時間的な進化を得ることができる。

特に、除去と、続く再導入手順では、測定時間０（Ｔ０）で、試験管内部全ての気体成分を取り除くことができる。吸引の前にすでに物質すべてを吸い込んでしまうため、時間Ｔ１の同じ試験管の第２の読み取りでは、真空（別名：陰圧）となる。

従って、吸い込まれた物質の同じ試験管への再導入により、時間Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３．．．の、２、３、又は４回目の読み込みで、バクテリアの検出の成分対象の測定評価が可能となる。

従って、時間Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３．．．の時間的及び再分割された測定において、無機成分が時間とともに増加又は安定するどうか検出することができる。実施例において針装置２０は、ヘッドスペース１８から気体サンプルを採取するために針２４を備える。

試験管１２の陽圧により、気体サンプルの採取が可能となり、気体サンプルがマイクロ・ガスクロマトグラフ２２内に入ることができる。

実施例において、試験管１２内部の圧力が大気又は負圧に等しい場合、存在するガス種及び検討されるガス種が低濃度であるためにも、ヘッドスペース１８内部でのガス種の測定を促進するために、針装置２０の回路に組み込まれ、針２４に接続する吸引部材２９による吸引を用いて、試験管１２から気体サンプル気体を採取することができる。

他の実施形態では、針装置２０は、２本の針２４を備える。特に２本目の針２４は、試験管１２内部でヘッドスペース１８から採取されるガスを再導入するのに適している。

２本目の針２４は、試験管１２内にある量の気体サンプル（を導入するため）の導入部材３３に接続され得る。

２本の針２４があるので、試験管１２内部でガスを再循環させることができ、従来技術において前述されるような、ヘッドスペース１８にＣＯ_２を放出するための待ち時間が生じないようにする。

さらにまた、バクテリアの代謝が促進されるにつれて、一定間隔で測定されるＣＯ _２ 及びＯ _２ （の量）は増加する。そして、Ｏ_２ の定期的な測定も容易になる。
ヘッドスペースの定期的な測定（１つ又は複数の定義された時間間隔で実施される）は、存在するバクテリア量の関数として、動的な測定、すなわち時間との相関を与える。
時間に対して検出されるガス状物質の増加（おそらくグラフにより表される）を得るように、マイクロ・ガスクロマトグラフ２２を用いることにより、検出及び測定される、増大するガス状物質を検出できるようになる。

実施例において、生体試料１４は、培養液の入った試験管１２内部に接種され導入され得る。

生体試料１４は培地又は培養液と共に、潜伏期間を待った後に、バクテリア培養２６を形成する。

他の実施形態では、本方法は、発育を良好にする培養液を用いることなく、そのままの生体試料１４を試験管１２内部へ導入することを備える。

他の実施形態では、補助物質を試験管１２内部に導入することができ、これにより、生体試料１４におそらく存在する菌種の代謝プロセスを加速することが可能である。

例えば、補助物質については、ガス状物質（例えばメタン、エタン、プロパン、又はその他ガス）、液体、又は固体物質を意味する。

他の実施形態では、赤血球内部のバクテリアを解放するために、生体試料１４又はバクテリア培養２６内部に溶解物質を導入することができる。

例えば、単離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）物質については、抗生物質治療開始後に試料に存在する抗生物質に対して単離作用を及ぼすことが可能な炭素又は樹脂、又はその他の物質を意味する。

他の実施形態では、図面に示されないが、バクテリア培養２６を撹拌するために、磁性素子が試験管１２の一番下に導入される。

磁性素子は、バクテリア培養（液）２６を回転させる撹拌装置と相互作用するので、培地又は培養液に存在する代謝物質と、バクテリアとの接触を促す。そして、その増殖を促進させ、バクテリアが存在し得る赤血球を破壊するために溶解物質との混合が改良される。

マイクロ・ガスクロマトグラフ２２を用いた気体サンプルに存在するガス、特にＣＯ_２又はＯ_２の分析によると、非常に急速に、例えば５〜４０秒で結果を得ることができる。

実施例において、特定タイプの真空試験管１２で、この方法が適用されることもできる。

このようにして、患者から直接、例えば血液といった生物学的液体を採取するシステムから直接生体試料１４を取り出すことができる。

変形実施例によれば、必要となる場合、方法１０は、試験管１２内部の圧力を検出するステップを備える。このようにして、生体試料に存在するバクテリアのクラス又は種類を同定するために付加的なパラメータを検出することができる。

例えば、バクテリアの異化作用により生じるヘッドスペース１８に存在するガス種を測定し、検出し、そして同時に小型化されたセンサを用いて試験管１２の圧力の全変動を測定することができる。

ここまで述べた方法１０及び検出装置２２に対して、本発明の分野及び範囲から逸脱することなく各部の修正及び／又は追加を行うことができることは明らかである。
いくつかの具体例を参照して本発明を説明したが、当業者が方法１０及び検出装置２２の多くの他の同等の形状を達成することが確実に可能であることは明白でもあり、そして、請求項にて説明するような特徴を有しており、それ故、全てここに定められる保護範囲内となる。

Claims (14)

1. 生体試料中のバクテリアの活動を検出する方法であって、
   密封され殺菌された試験管に、前記生体試料を導入するステップと、
   前記試験管内部で、前記生体試料より上に、ガスの蓄積のためのヘッドスペースを定めるステップと、
   前記ヘッドスペースから気体サンプルを採取するステップと、
   前記生体試料において、バクテリアの代謝によって発生する無機物の存在を検出するのに適した流れで、マイクロ・ガスクロマトグラフを用いて、前記気体サンプルに存在する少なくともＣＯ_２及びＯ_２を含む無機ガス状物質を１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍの範囲で同定するステップと、
   前記無機物の前記検出は、増加するＣＯ_２と減少するＯ_２両方で測定される前記無機物に関する増加曲線を得るために、さまざまなサンプリング時間で連続流において実施されることを特徴とする方法。
2. 前記ヘッドスペースから気体サンプルを採取するステップと、
   同時にセンサを用いて前記試験管の圧力の全変動を測定するステップと、を備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ストッパーを介して前記試験管に針を導入することによって、前記ヘッドスペースから気体サンプルを採取するステップと、
   前記ヘッドスペースに存在するガス容積を再循環させるために、導入部材に接続される２本目の針を用いて、前記試験管から採取される量の前記気体サンプルを前記試験管に再導入するステップと、を備えることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
4. 前記ヘッドスペースに存在する個々の前記無機ガス状物質の増加曲線を得るために、前記マイクロ・ガスクロマトグラフによって、１つ以上の既定の時間間隔において、前記ヘッドスペースに存在する前記ガス状物質の動的測定を実施するステップを備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の方法。
5. 毎回、前記気体サンプルを採取した後に、前記ヘッドスペースに前記気体サンプルを再導入するステップと、
   時間の経過で、前記ヘッドスペースの有機成分が増加したか一定かを検出するために、順番に新しい測定を実行するステップとを備えることを特徴とする請求項３又は４記載の方法。
6. 前記試験管内部の前記生体試料と共に、培地又は培養液を導入するステップを備えることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
7. 何も添加しないそのままの生体試料のみを前記試験管内部に導入するステップを備えることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
8. 前記バクテリアの複製速度を上げるのに適した補助物質を前記試験管に導入するステップを備えることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項記載の方法。
9. 前記補助物質は、炭化水素であることを特徴とする請求項８記載の方法。
10. 前記生体試料におけるバクテリアの存在及び／又は検出能力を高めることが可能な溶解物質を使用するステップを備え、
    前記溶解物質は、赤血球内部でバクテリアの検出を促進させることが可能であることを特徴とする請求項８記載の方法。
11. 前記生体試料を撹拌するために磁性素子を導入するステップを備えることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項記載の方法。
12. 前記試験管に前記生体試料を導入するステップが真空下で実行されることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項記載の方法。
13. 見込まれる抗生物質の単離物質が、生体試料又はバクテリア培養の内部に導入されることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項記載の方法。
14. 前記試験管に存在する圧力を検出するステップを備えることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか一項記載の方法。

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