CN107084907A - 血液细菌培养检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种血液细菌培养检测方法及其应用，涉及血液细菌检测技术领域，通过测定盛放有血液和培养基的血液培养瓶中的气体压强是否发生变化，判定血液中是否存在细菌，缓解了现有的非侵入式血液细菌培养检测方法采用间接的方式检测二氧化碳的存在，导致检测步骤繁杂、检测成本高、误差来源增加，结果的特异性差的技术问题，达到了不仅不需要在血液培养瓶中添加其它物质，减少了误差来源，同时简化了检测步骤，降低了检测成本，保证了检测结果的特异性，能够显著提高检测效率和检测结果的准确性的技术效果。

Description

血液细菌培养检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及血液细菌检测技术领域，尤其是涉及一种血液细菌培养检测方法及其应用。

背景技术

败血症是指致病菌侵入血液循环，并在血液中生长繁殖，产生毒素而引发的急性全身性感染。在临床上，败血症属于感染性疾病的危重阶段。因此，如何快速准确的对血液进行细菌检测对于临床的抢救治疗具有重要意义。

目前血培养检测的方法分为侵入式和非侵入式两种，由于侵入式检测方法对操作者专业技术要求高、工作量大、耗时长、采样点少，容易导致杂菌干扰，影响检测结果的效率和特异性，导致其应用受到了限制；非侵入式检测方法是利用细菌在血液中代谢产生二氧化碳作为有无细菌的判断依据，常用的检测方法有均质荧光增强检测方法、显色检测方法(二氧化碳感受器)以及放射标记检测方法等，这些检测方法利用二氧化碳与荧光物质或显色物质的相互作用进行标记，间接检测二氧化碳的浓度变化，进而判断血液中是否存在细菌，然而这些利用荧光、显色或放射标记的检测方法由于均是采用间接的方式检测二氧化碳的浓度变化，导致检测步骤繁杂、检测成本高、误差来源增加，结果的特异性差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种血液细菌培养检测方法，以解决现有的非侵入式血液细菌培养检测方法采用间接的方式检测二氧化碳的浓度变化，导致检测步骤繁杂、检测成本高、误差来源增加，结果的特异性差的技术问题。

本发明提供的血液细菌培养检测方法，通过测定血液培养瓶中的气体压强是否发生变化，判定血液中是否存在细菌，其中血液培养瓶中盛放有血液和培养基。

进一步的，所述血液细菌培养检测方法包括如下步骤：

(a)将血液注入盛放有培养基的血液培养瓶中混合均匀，立即测定血液培养瓶中气体空间的初始气体压强P₀；

(b)进行血液细菌培养，并持续测定血液培养瓶中实时气体压强P_t，当P_t﹥P₀时，则判定血液中存在细菌。

进一步的，所述血液培养瓶的上部存留有气体空间，所述气体空间占血液培养瓶体积的1/3-1/2，优选为1/3。

进一步的，在步骤(a)中，测定血液培养瓶中气体空间的初始气体压强P₀，包括如下步骤：

(s)采用激光器照射血液培养瓶上部的气体空间；

(m)通过探测器探测穿过气体空间的激光强度；

(n)将激光强度进行数据转换，得到气体空间的初始气体压强P₀。

进一步的，在步骤(n)中，先将激光强度通过数据转换成二氧化碳吸收谱线的线宽，再将二氧化碳吸收谱线的线宽通过数据转换为气体空间的初始压强P₀。

进一步的，在步骤(b)中，当P_t﹥P₀+δ时，判定血液中存在细菌，其中δ为测量方差。

进一步的，在步骤(b)中，进行血培养的温度为35-40℃，优选为37℃。

进一步的，在步骤(b)中，实时气体压强P_t的测试周期为1-20min/次，优选为2-5min/次。

本发明的目的之二在于提供一种血液细菌培养检测方法的应用，以解决现有的非侵入式血液细菌培养检测方法采用间接的方式检测二氧化碳的浓度变化，导致检测步骤繁杂、检测成本高、误差来源增加，结果的特异性差的技术问题。

本发明提供的血液细菌培养检测方法的应用，用于测定血液中是否存在厌氧菌、需氧菌及兼性厌氧菌。

进一步的，厌氧菌包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沃式葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、杀鲑气单胞菌、科氏葡萄球科氏亚种和阴沟肠杆菌种的一种或至少两种；需氧菌及兼性厌氧菌包括大肠杆菌、棒球菌、链球菌和葡萄球菌种的一种或至少两种。

本发明提供的血液细菌培养检测方法，通过持续测定血液培养瓶中实时气体压强，若气体压强发生变化，则直接判定血液中存在细菌，不仅不需要在血液培养瓶中添加其它物质，减少了误差来源，同时简化了检测步骤，降低了检测成本，保证了检测结果的特异性，能够显著提高检测效率和检测结果的准确性。

本发明提供的血液细菌培养检测方法的应用，能够通过本发明提供的血液细菌培养检测方法测定血液中需氧菌、厌氧菌及兼性厌氧菌的有无，不仅不需要在血液培养瓶中添加其它物质，减少了误差来源，同时简化了检测步骤，降低了检测成本，保证了检测结果的特异性，能够显著提高检测效率和检测结果的准确性。

附图说明

图1为验证例1中大肠杆菌培养时间与气体空间压强的关系图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种血液细菌培养检测方法，通过测定血液培养瓶中的气体压强是否发生变化，判定血液中是否存在细菌，其中血液培养瓶中盛放有血液和培养基。

血培养过程中，如果血液中存在细菌，细菌代谢会产生二氧化碳。现在医疗检测机构均采用显色物质与二氧化碳进行反应，以间接测定二氧化碳的浓度变化，进而判断血液中细菌的有无。现有的检测方法需要在血液培养瓶制作的过程中添加其它物质，如荧光物质、显色物质或放射性标记物质，这些一次性检测物质在使用后的处理过程中极易造成环境污染。另外，由于这些检测方法均是采用其它物质间接反应二氧化碳的浓度变化，导致检测步骤繁杂、检测成本高、误差来源增加，结果的特异性差，影响临床的及时治疗和抢救。

本发明提供的血液细菌培养检测方法，通过测定血液培养瓶中的气体压强是否发生变化，直接判定血液中是否存在细菌，不仅不需要在血液培养瓶中添加其它物质，减少了误差来源，同时简化了检测步骤，降低了检测成本，保证了检测结果的特异性，能够显著提高检测效率和检测结果的准确性。

另外，本发明提供的血液细菌检测方法，无需在培养瓶中添加放射性物质或荧光物质，也无需频繁更换二氧化碳感受器，大大减少了环境污染。

本发明提供的血液细菌培养检测方法的原理为：在培养瓶中进行血培养时，如血液中存在细菌，细菌在营养充足的情况下会迅速繁殖，进行代谢产生二氧化碳气体，从而导致血液培养瓶中的气体压强发生变化，若气体压强增大，则说明血液培养瓶中气体总量增加，即可判定血液中存在细菌，若血液培养瓶中气体压强不变，则说明血液培养瓶中的气体总量没有发生变化，则判定血液中不存在细菌。

需要说明的是，在本发明中所提到的血液培养瓶均为密闭式血液培养瓶。

在本发明的优选实施方式中，血液细菌培养检测方法包括如下步骤：

(a)将血液注入盛放有培养基的血液培养瓶中混合均匀，立即测定血液培养瓶中气体空间的初始气体压强P₀；

(b)进行血液细菌培养，并持续测定血液培养瓶中实时气体压强P_t，当P_t﹥P₀时，则判定血液中存在细菌。

在本发明的优选实施方式中，血液为新鲜离体血液，培养基根据所需测定的细菌种类的不同可选择不同种类的培养基。

在本发明的优选实施方式中，当血液注入盛放有培养基的血液培养瓶中后，立即测定血液培养瓶中气体空间的初始气体压强值P₀；若血液中存在细菌，细菌代谢产生二氧化碳，血液培养瓶中的气体增多，气体压强增大，从而使得实时监测的气体压强P_t﹥P₀，即可判定血液中有细菌生长。若血液中不存在细菌，则血液培养瓶中的气体总量保持不变，实时气体压强也保持不变，则继续监测，若直至监测周期(一般为7天)结束，实时气体压强P_t仍与初始气体压强P₀相同，则判定血液中没有细菌生长。

在本发明的优选实施方式中，血液培养瓶的上部存留有气体空间，气体空间占血液培养瓶体积的1/3-1/2，优选为1/3。

为了增强检测结果的准确性，通过气体空间的激光应具有足够的照射空间，经多次试验验证，当气体空间占血液培养瓶体积的1/3-1/2时，既不会影响血培养中细菌的生长繁殖，又能够保证检测结果的准确性，更优选的，当气体空间占血液培养瓶体积的1/3时，其最有利于血液中细菌的生长繁殖和使检测结果的准确性最佳。

本发明优选实施方式采用激光谱线测定血液培养瓶中气体压强的测定原理为：在步骤(a)中，测定血液培养瓶中气体空间的初始气体压强P₀，包括如下步骤：

(s)采用激光器照射血液培养瓶上部的气体空间；

(m)通过探测器探测穿过气体空间的激光强度；

(n)将激光强度进行数据转换，得到气体空间的初始气体压强P₀。

在本实施例的优选实施方式中，在步骤(n)中，先将激光强度通过数据处理得到二氧化碳吸收谱线的线宽，再将二氧化碳吸收谱线的线宽转化为气体空间的初始压强P₀。

激光强度通过数据处理得到二氧化碳吸收谱线线宽的原理为：Beer-Lamber定律，该定律描述了当激光束穿过均匀介质时透射和入射光谱强度之间的关系：

其中，I₀(ν)[mW]为激光入射光强；I[mW]为激光穿过吸收介质后的透射光强；P[atm]为气体空间压强；X[％]为气体浓度；S[cm^-2/atm]为吸收谱线的线强，可根据HIRAN数据库获取；L[cm]为激光与气体介质的相互作用长度；φ(v)为吸收谱线面积归一化函数，因压力影响占主导地位，则φ(v)为Lorentz线型：

其中，v₀[cm-1]为吸收谱线的中心频率，v[cm-1]为激光输出的瞬时频率，Δv[cm-1]为吸收谱线的线宽(FWHM)，其与气体空间的压强正相关：

P＝Δv/β

其中，β为气体压强展宽系数。当气体空间压强增大，气体分子之间碰撞程度增加，继而造成气体吸收谱线线宽进一步增大。因此，能够通过二氧化碳吸收谱线的线宽经过公式计算得到气体空间压强。

需要说明的是，进行血液细菌培养时，血液培养瓶中气体空间实时气体压强P_t的测试方法及步骤与初始气体压强P₀的测试方法及步骤相同，在此不再赘述。

在本发明的优选实施方式中，通过探测穿过血液培养瓶上部的气体空间的激光强度得到实时气体压强P_t的原理为：

血液培养瓶中的气体压强发生变化，导致穿过血液培养瓶上部气体空间的激光强度发生变化，激光强度发生变化进行数据处理后得到二氧化碳吸收谱线的线宽变化，二氧化碳吸收谱线的线宽变化进行数据处理得到血液培养瓶气体空间压强变化，因此，可以通过探测穿过血液培养瓶气体空间的激光强度，经过数据处理，得到气体空间的实时气体压强P_t。

在本实施例的优选实施方式中，通过测量穿过血液培养瓶上部气体空间的激光强度转换得到气体空间压强，充分利用了光谱响应速度快和灵敏度高的特点，可在最短的时间内检测到最小量的细菌，提高检测结果的准确性。

在本发明的优选实施方式中，在步骤(b)中，当P_t﹥P₀+δ时，判定血液中存在细菌，其中δ为测量方差。

由于任何仪器均存在误差，因此，为了提高血培养检测的准确性，在本发明的优选实施方式中，当P_t﹥P₀+δ时，判定血液中存在细菌，以避免进行误报。

δ为测量方差，为进行血培养检测过程中所用到的所有仪器的测试误差之和。

在本发明的优选实施方式中，在步骤(b)中，进行血培养的温度为35-40℃，优选为37℃。

温度作为细菌生长的重要因素之一，温度的变化会对细菌的代谢产生重大影响，具体表现为：温度不仅能够影响微生物代谢产物的分泌和对营养成分的吸收，而且能够改变细胞膜的流动性，从而影响细胞物质的交换运输。当细菌处于最佳生长温度时，生长代谢速度最旺盛，代谢时长最短，当细菌的培养温度低于或高于临界生长温度时，可能会造成微生物的不生长甚至死亡。

通过多次试验证明，血培养的温度在35-40℃时，细菌生长代谢旺盛，代谢时长较短，当血培养的温度为37℃时，细菌的生长代谢最旺盛，代谢时长最短。

在本发明的优选实施方式中，在步骤(b)中，实时气体压强P_t的测试周期为1-20min/次，优选为2-5min/次。

为了及时准确的得到血液细菌检测结果，在本发明的优选实施方式中，将实时气体压强P_t的测试周期设置为1-20min/次，测量的准确度较高，特别是将实时气体压强P_t的测试周期设置为2-5min/次时，测试最及时，测试的准确度最高。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述血液细菌培养检测方法的应用，该血液细菌培养检测方法用于测定血液中是否存在厌氧菌、需氧及兼性厌氧菌。

需氧菌具有较完善的呼吸酶系统，需分子氧做受氢体，只能在有氧条件下生长繁殖；厌氧菌缺乏完善的呼吸酶系统，受氢体为有机物，只能在无氧条件下生长繁殖；兼性厌氧菌具有完善的呼吸酶系统，在有氧和无氧环境中都能生长。

在本发明的优选实施方式中，厌氧菌包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沃式葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、杀鲑气单胞菌、科氏葡萄球科氏亚种和阴沟肠杆菌种的一种或至少两种；需氧菌及兼性厌氧菌包括大肠杆菌、棒球菌、链球菌和葡萄球菌种的一种或至少两种。

本发明提供的血液细菌培养检测方法的应用，能够通过本发明提供的血液细菌培养检测方法测定血液中需氧菌、厌氧菌及兼性厌氧菌的有无，不仅不需要在血液培养瓶中添加其它物质，减少了误差来源，同时简化了检测步骤，降低了检测成本，保证了检测结果的特异性，能够显著提高检测效率和检测结果的准确性。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

本实施例提供了一种血液细菌培养检测方法，按照如下步骤进行：

(a)将血液注入盛放有培养基的血液培养瓶中混合均匀，并使血液和培养基的混合物占血液培养瓶的2/3，血液培养瓶的上部留存有1/3的气体空间，立即开启激光器，使激光照射血液培养瓶中气体空间，并由探测器探测穿过气体空间的激光强度，探测器将探测到的激光强度发送给计算机进行数据处理，转换成初始气体压强P₀；

(b)将血液培养瓶放入37℃的恒温培养箱中进行血培养，并每隔3min测定一次血液培养瓶中气体空间的实时气体压强P_t，实时气体压强P_t的测试方法同P₀，在此不再赘述；当P_t﹥P₀+δ时，判定血液中存在细菌，其中δ为测量方差，该测量方差指的是激光器、探测器及计算机的测量方差之和，当P₀＜P_t＜P₀+δ时，判定血液中不存在细菌。

在本实施例中，所采用的血液培养瓶为50ml培养瓶；所采用的培养基由聚茴香脑磺酸钠、甲萘醌、大豆酪蛋白消化液、脑心浸液、L-半膀氨酸、盐酸吡剁醇、血晶素和其他溶于纯净水的复合氨基酸和碳水化合物组成。

本实施例提供的血液细菌培养检测方法，采用密闭的血液培养瓶进行细菌培养，在检测过程中不需要在血液培养瓶中添加其它物质，简化了检测步骤，减少了误差来源，降低了检测成本；另外，本实施例提供的血液细菌培养检测方法，通过探测器探测血液培养瓶上部气体空间的激光强度，并通过数据处理得到气体空间压强，充分利用了光谱响应速度快和灵敏度高的特点，可在最短的时间内检测到最小量的细菌，提高了检测结果的特异性和准确性。

验证例1

本验证例以在血液中接种大肠杆菌为例，验证本发明提供的血液细菌培养检测方法的准确性，本验证例所采用的初始气体压强P₀和实时气体压强P_t的测试方法均与实施例1相同，在此不再赘述。

本验证例提供的血液细菌培养检测方法，按以下步骤进行：

(a)将大肠杆菌接种到50ml血液培养瓶中，血液培养瓶的上方留存有1/3气体空间，并使血液培养瓶中大肠杆菌的浓度为3×10⁴cfu/mL，立即测定气体空间的初始气体压强；

(b)将血液培养瓶放入37℃的恒温培养箱中进行培养，并实时监测血液培养瓶中气体空间压强，并按照细菌培养时间分别记录2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h和30h的气体空间压强，所测得的不同时段的气体压强值如表1所示：

表1不同培养时间气体空间压强数据表

根据表1中细菌培养时间与气体空间压强的关系，建立以培养时间为横坐标，以气体空间的压强为纵坐标的直角坐标系作图，得到图1，结合表1和图1可以看出，随着血液细菌培养时间的增长，血液培养瓶中的气体压强增加，这与血液中细菌随着培养时间的增长，所释放出的二氧化碳数量增多，血液培养瓶中的气体压强增大相吻合，这说明本发明验证例提供的血液细菌培养检测方法能够快速测定血液中压强是否变化，从而进行血液中细菌有无的判定，不仅不需要在血液培养瓶中添加其它物质，减少了误差来源，同时简化了检测步骤，降低了检测成本，保证了检测结果的特异性，能够显著提高检测效率和检测结果的准确性。

需要说明的是，本验证例所采用的培养基和血液培养瓶均同实施例1所采用的培养基和血液培养瓶，在此不再赘述。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种血液细菌培养检测方法，其特征在于，通过测定血液培养瓶中的气体压强是否发生变化，判定血液中是否存在细菌，其中血液培养瓶中盛放有血液和培养基。

2.根据权利要求1所述的血液细菌培养检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将血液注入盛放有培养基的血液培养瓶中混合均匀，立即测定血液培养瓶中气体空间的初始气体压强P₀；

(b)进行血液细菌培养，并持续测定血液培养瓶中实时气体压强P_t，当P_t﹥P₀时，则判定血液中存在细菌。

3.根据权利要求2所述的血液细菌培养检测方法，其特征在于，所述血液培养瓶的上部存留有气体空间，所述气体空间占血液培养瓶体积的1/3-1/2，优选为1/3。

4.根据权利要求3所述的血液细菌培养检测方法，其特征在于，在步骤(a)中，测定血液培养瓶中气体空间的初始气体压强P₀，包括如下步骤：

(s)采用激光器照射血液培养瓶上部的气体空间；

(m)通过探测器探测穿过气体空间的激光强度；

(n)将激光强度进行数据转换，得到气体空间的初始气体压强P₀。

5.根据权利要求4所述的血液细菌培养检测方法，其特征在于，在步骤(n)中，先将激光强度通过数据转换成二氧化碳吸收谱线的线宽，再将二氧化碳吸收谱线的线宽通过数据转换为气体空间的初始压强P₀。

6.根据权利要求2所述的血液细菌培养检测方法，其特征在于，在步骤(b)中，当P_t﹥P₀+δ时，判定血液中存在细菌，其中δ为测量方差。

7.根据权利要求2所述的血液细菌培养检测方法，其特征在于，在步骤(b)中，进行血培养的温度为35-40℃，优选为37℃。

8.根据权利要求2所述的血液细菌培养检测方法，其特征在于，在步骤(b)中，实时气体压强P_t的测试周期为1-20min/次，优选为2-5min/次。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的血液细菌培养检测方法的应用，其特征在于，用于测定血液中是否存在厌氧菌、需氧菌及兼性厌氧菌。

10.根据权利要求9所述的血液细菌培养检测方法的应用，其特征在于，厌氧菌包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沃式葡萄球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、杀鲑气单胞菌、科氏葡萄球科氏亚种和阴沟肠杆菌种的一种或至少两种；需氧菌及兼性厌氧菌包括大肠杆菌、棒球菌、链球菌和葡萄球菌种的一种或至少两种。