CN101294190A - 大肠菌群复合快速显色诊检试剂及其研发工艺流程 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及大肠杆菌复合快速显色诊检试剂研发工艺流程，其特征在于：1.首先通过大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的活化及生化鉴定确定质控手段；2.根据目的菌株的需要筛选基本营养成分；3.通过生长谱法验证：微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、矿物质、微量元素、生长因子等等都为微生物生长所必需，缺少其中任意一种，微生物就不能正常生长、代谢、繁殖；4.显示剂、掩蔽剂及增效剂的遴选；5.复合遴选；6.通过快速显色培养基各项指标测试验证试验，其包括特异性试验、灵敏度试验、实际样品检验、假阴性、假阳性菌株鉴定、稳定性试验、可重复性试验、竞争菌株及杂菌干扰试验、检出时间、检出率的试验验证复合遴选配方的可行性；7.通过因素水平正交组合试验遴选出最适配方。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全快速诊检试剂，具体涉及一种大肠菌群复合快速显色诊检试剂及其研发工艺流程。
背景技术
由德国科学家科赫所创立的微生物纯培养方法因其费用低廉、灵敏度高，能够对微生物进行定性、定量的特异鉴定，因此时至今日仍为世界微生物学界所普遍接受为甄别微生物的权威方法。但纯培养的缺点也十分明显，从制备培养基、培养微生物、直到形成肉眼可辨的生长特征以及对微生物进行确证其种属特征的生理生化指标的检测，这一系列过程不仅浪费资源，耗时超长，且由于人员对仪器的操作使用以及操作手法的异同都可能造成结果的误判，因此开发一项既能快速准确的鉴别微生物的种属特性、又可以降低成本、同时减少检测迟滞的微生物快速诊检试剂早已经成为国内外微生物检测领域科研人员的迫切愿望，而今各种快速检测试剂盒、纸片、旋转平板法等皿膜法，电阻抗法，生物荧光法，免疫学法，基因探针，分子杂交，基因芯片方法等等层出不穷。但纵观国内外快速诊检技术领域的发展情态，可以看出，无论是传统的以纯培养方法为主的检测技术，还是实时检测技术，国外都已经有了比较成熟的发展模式，以美国的3M、BD公司和法国的科玛嘉、梅里埃公司为代表的一批企业，在快速诊检技术领域的探索方面已经走在了世界的前列。
但是从这类公司购买快速检测试剂价格昂贵，应用成本过高，我国难以承受普及型应用，仅一些科研院所、高校、及有实力的大型企业可以尝试，普通中小型企业、工商业者难以接受，而结合仪器进行实时检测的方法国内落后的步伐更大，购买一台普通的快速检测设备动辄几十万美金。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种满足食品药品安全快速显色诊检试剂。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
大肠菌群复合快速显色诊检试剂研发工艺流程：
1、首先通过大肠菌群、质控菌株(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)的活化及生化鉴定确定质控手段；
2、根据目的菌株的需要筛选基本营养成分；
3、通过生长谱法验证：微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、矿物质、微量元素、生长因子等等都为微生物生长所必需，缺少其中任意一种，微生物就不能正常生长、代谢、繁殖；
5、显示剂、掩蔽剂及增效剂的遴选；
6、复合遴选；
7、通过快速显色培养基各项指标测试验证试验，其包括特异性试验、灵敏度试验、实际样品检验、假阴性、假阳性菌株鉴定、稳定性试验、可重复性试验、竞争菌株及杂菌干扰试验、检出时间、检出率的试验验证复合遴选配方的可行性；
8、通过因素水平正交组合试验遴选出最适配方。
大肠菌群复合快速显色诊检试剂，其快速显色鉴别培养基各项成分的筛选配方为：
快速显色鉴别培养基各项成分：
1、碳源
乳糖；
2、氮源
蛋白胨；
3、矿物质
氯化钠、磷酸氢二钾；
4、掩蔽剂(需遴选)
牛胆盐、煌绿、龙胆紫、孔雀绿、十二烷基磺酸钠；
5、指示剂(需遴选)
氯化三苯四氮唑、伊红、玫红酸、中性红；
6、增效剂
溴甲酚紫、羧甲基纤维素钠
外界条件对菌体生长的影响：
一、PH值：A＝600nm
由上表可以看出大肠菌群的最适PH值范围在6.7～7.5。
当培养时长为12小时时PH值＝6.9时菌种启动生长速度最快；
当培养时长为24小时时PH值＝7.3时大肠菌群菌体浓度最高。
原因：
当培养基内PH值过低时大肠菌群乳糖操纵子容易受到信息反馈抑制，菌体能量供应不足，导致迟缓期增加，对数生长期延后并缩短；
当培养基内PH值过高时，菌体内源蛋白合成受到抑制，诱导酶与合成酶的合成受阻。
因此我们选择PH＝6.9做为快速检测试剂的理想PH值。
二、温度为37℃
本发明的目的为快速显色检测大肠菌群，大肠菌群的的最适生长温度为37℃，因此我们选定37℃为检测温度。
培养基主要成分对菌体生长的影响：
我们根据微生物的特异种属特征，分别就快速显色检测试剂的显色剂、掩蔽剂以及增效剂这三个主要方面进行针对性遴选：
1、选择四种显色剂进行配伍，进行灵敏度和准确度试验并以生长谱法做为初筛根据；
2、选择四种掩蔽剂进行配伍，以质控菌株为标准做杂菌干扰试验；
3、复合配伍显色剂及掩蔽剂，做因素水平正交试验，缩短反映时间、提高灵敏度、降低伪现概率，最终求得优化配比配方。
培养基检测所需主要成分对检测效果的影响
一、掩蔽剂
掩蔽剂为快速检测试剂屏蔽杂菌干扰，凸现目标菌群的关键因素，我们遴选的原则是：
(1)能够特异的彻底抑制非目标菌株的生长；
(2)不影响目标菌株的生长；
备选成分：牛胆盐、煌绿、龙胆紫、猪胆盐
备选理由：
因大肠菌群为一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。因此遴选合适掩蔽剂的原则是能够完全抑制革兰氏阳性菌的生长，并且不会影响革兰氏阴性细菌的生长的物质做为培养基的屏蔽基础。
作用机理及结果与讨论
1、龙胆紫：
龙胆紫即甲紫，又名晶紫，是一种碱性染料。是氯化四甲基对玫瑰苯胺、氯化五甲基对玫瑰苯胺、氯化六甲基对玫瑰苯胺的混合物。抑菌机理是以氯化五甲基对玫瑰苯胺为主，在水中溶解后呈紫色溶液，龙胆紫储存过久容易变质。它的阳离子能与细菌蛋白质的羟基相结合，影响其代谢而起到抑菌作用，对革兰氏阳性菌有选择作用，特别是葡萄球菌、白喉杆菌等，对白色念珠菌也有较好的抗菌作用。
即配即用质控检验：
| 浓度 | 0.2％ | 0.4％ | 0.6％ | 0.8％ | 1.0％ | 1.2％ | 1.4％ |
| 金葡 | 1.65×104 | ＜1000 | - | - | - | - | - |
| 大肠菌群 | 9.50×107 | 8.76×107 | 8.31×107 | 8.45×107 | 8.47×107 | 8.12×107 | 8.61×107 |
室温密闭储藏15天后质控检验
| 浓度 | 0.2％ | 0.4％ | 0.6％ | 0.8％ | 1.0％ | 1.2％ | 1.4％ |
| 金葡 | 5.78×106 | 4.96×104 | 5.01×104 | 4.75×104 | 4.98×104 | 4.88×104 | 4.39×104 |
| 大肠菌群 | 7.31×107 | 7.01×107 | 7.95×107 | 6.85×107 | 7.37×107 | 7.12×107 | 7.50×107 |
通过以上表格可以看出，龙胆紫在刚刚配制即时使用效果很好，但是当储藏时间超过15天之后，龙胆紫的抑菌效果大大降低。
2、牛胆盐：
牛胆盐的抑菌机理：破坏革兰氏阳性细菌菌体细胞外壁膜，致使菌体内物质泄漏，从而杀死细菌。
牛胆盐与人胆盐的成分十分相似，我们的目标菌群恰恰来源于人类，因此我们选择牛胆盐做为掩蔽剂的主屏蔽材料，大肠菌群为条件致病菌，正常情况下健康人体内的胆盐浓度在0.03％～0.3％之间，在这一浓度范围内大肠菌群能够被较好的抑制。因此我们选择如上表所示胆盐浓度，以大肠菌群、金黄色葡萄球菌为质控菌遴选出较为合适的浓度梯度做为复配参考参数。
| 浓度 | 0.05％ | 0.1％ | 0.15％ | 0.2％ | 0.25％ | 0.3％ | 0.35％ |
| 金葡 | 2.37×103 | ＜1000 | - | - | - | - | - |
| 大肠菌群 | 5.86×107 | 5.74×107 | 5.68×107 | 6.01×107 | 5.95×107 | 6.21×107 | 5.90×107 |
从上表可以看出，牛胆盐的抑菌效果很好，在达到一定浓度的条件下可以杀灭几乎所有革兰氏阳性菌株。而对大肠菌群的影响几乎没有，因此我们将其做为优选配方中的主掩蔽剂。
3、猪胆盐：
猪胆盐的作用机理与牛胆盐相似，不同之处在于猪胆盐中含有杂质较多，抑菌效能难以比肩牛胆盐，猪胆盐的市场价格相对牛胆盐要低一些。
| 浓度 | 0.2％ | 0.4％ | 0.6％ | 0.8％ | 1％ | 1.2％ | 1.4％ |
| 金葡 | 3.17×103 | 3.13×103 | 2.65×103 | 2.22×103 | 1.87×103 | 1.78×103 | 1.79×103 |
| 大肠菌群 | 8.76×107 | 8.84×107 | 8.58×107 | 8.92×107 | 8.74×107 | 9.01×107 | 8.79×107 |
从上表可以看出猪胆盐的抑菌效果相对牛胆盐有很大差距，尽管我们将猪胆盐的量提高几倍甚至是十几倍，但是还是难于达到牛胆盐的效果。
4、煌绿：
煌绿的抑菌机理与牛胆盐相似，但煌绿不仅能够抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性细菌也有一定的杀灭作用，且对沙门氏菌和志贺氏菌有一定的增菌作用，我们以大肠菌群和金黄色葡萄球菌为质控菌株做检出限及检出率试验。
| 浓度 | 0.005‰ | 0.01‰ | 0.02‰ | 0.04‰ | 0.06‰ | 0.08‰ | 0.1‰ |
| 金葡 | 3.17×105 | 5.13×103 | ＜1000 | ＜1000 | ＜1000 | ＜1000 | ＜1000 |
| 大肠菌群 | 8.76×107 | 9.57×107 | 8.58×106 | 4.92×106 | 2.31×104 | 9.01×103 | 8.79×103 |
从上表可以看出，煌绿在杀灭革兰氏阳性菌的同时，对革兰氏阴性杆菌也有一定的抑制作用，而且煌绿本身并不能够完全屏蔽革兰氏阳性菌的生长。
综合以上试验结果，我们拣选所选掩蔽剂中的牛胆盐为我们的主掩蔽剂。
二、显色剂
显色剂是快速检测试剂读取结果的关键，遴选的原则是：
(1)变色范围与目标菌株特异反应的发生数量与发生程度相一致；
(2)不影响目标菌株的代谢、生长、繁殖；；
(3)能够在一定程度上辅助主掩蔽剂杀灭非目标菌。
备选试剂：氯化三苯四氮唑、伊红、玫红酸、中性红
1、氯化三苯四氮唑(TTC)
TTC是一种氧化还原能力很强的物质，能够在接受氢(被还原)后形成非水溶性的红色三苯甲酯，完成呼吸过程。
| 浓度 | 0.02‰ | 0.04‰ | 0.06‰ | 0.08‰ | 0.1‰ | 0.12‰ | 0.14‰ |
| 金葡 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | - | - | - |
| 大肠菌群 | 5.21×104 | 5.27×104 | 7.16×105 | 7.98×105 | 3.12×104 | 2.18×103 | 1.07×103 |
| 沙门氏菌 | 出现菌落 | 出现菌落 | - | - | - | - | - |
| 志贺氏菌 | 较多菌落 | 较多菌落 | 出现菌落 | - | - | - | - |
通过上表我们可以看出，TTC过量则大肠菌群生长受到抑制，过少则灵敏度降低。
2、伊红钠盐
伊红钠盐含有一个(-COOH)助色基团，在水中电离时放出氢离子，本身带负电荷，当溶液中氢离子浓度增高到一定范围后，伊红即与氢离子相结合并显示明艳的亮红色。
| 浓度 | 0.01‰ | 0.02‰ | 0.03‰ | 0.04‰ | 0.05‰ | 0.06‰ | 0.07‰ |
| 金葡 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | - | - | - | - |
| 大肠菌群 | 4.21×105 | 4.18×105 | 3.98×105 | 4.67×105 | 4.66×105 | 4.77×105 | 4.52×105 |
| 沙门氏菌 | 出现菌落 | 出现菌落 | - | - | - | - | - |
| 志贺氏菌 | 较多菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | - | - | - |
伊红对微生物的影响较小，无选择作用。
3、玫红酸
玫红酸在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中呈淡红色，玫红酸的变色范围为6.8(黄)～8.2(红)，且变色程度随着PH值的变化而规律性的按照红～橙～黄的方式发生变化。
| 浓度 | 0.02 | 0.04‰ | 0.06‰ | 0.08‰ | 0.10‰ | 0.12‰ | 0.14‰ |
| 金葡 | - | - | - | - | - | - | - |
| 大肠菌群 | 7.86×105 | 7.93×105 | 7.88×105 | 7.86×105 | 7.68×105 | 7.66×105 | 7.71×105 |
| 沙门氏菌 | - | - | - | - | - | - | - |
| 志贺氏菌 | - | - | - | - | - | - | - |
由上表可以看出，玫红酸还能抑制革兰氏阳性菌的生长，并且有助于缩短革兰氏阴性细菌的迟缓期，并维持较长时间的对数生长期，因此可以加快菌体生长速度，有助于快速显色。
4、中性红
中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水(溶解度4％)和酒精(溶解度1.8％)。它在碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色变色范围为6.8(红)～8.0(黄)。
| 浓度 | 0.01‰ | 0.02‰ | 0.03‰ | 0.04‰ | 0.05‰ | 0.06‰ | 0.07‰ |
| 金葡 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 |
| 大肠菌群 | 2.89×105 | 2.76×105 | 3.10×105 | 1.98×105 | 2.98×105 | 1.73×105 | 1.55×105 |
| 沙门氏菌 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | - | - | - | - |
| 志贺氏菌 | 较多菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | 出现菌落 | - | - |
从上表可以看出，中性红基本无选择能力。
三、增效剂
1、溴甲酚紫：
溴甲酚紫为一种生物适应性良好的指示剂，变色范围为PH＝6.8时显示紫红色，当PH值降至5.2时显示黄色，同玫红酸的显色方式相同，因此可以辅助玫红酸实现快速、准确、特异的甄别环境中的专属微生物族群。
2、羧甲基纤维素钠：
羧甲基纤维素钠是用途很广的一种工业原料，它具备超强的保水能力，并能够形成完整，致密的凝胶，加快培养基对样品混悬液的吸收，利于菌体的固定。
复合遴选的配方通过快速显色培养基各项指标测试验证试验：五因素四水平正交因子表：
| 乳糖 | 蛋白胨 | 显色剂 | 牛胆盐 | 增效一 | 盐一 | 盐一 | 琼脂 | 增效二 | |
| 1 | 20 | 10 | 0.04 | 1 | 0.02 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 2 | 20 | 15 | 0.08 | 2 | 0.04 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 3 | 20 | 20 | 0.12 | 3 | 0.06 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 4 | 20 | 25 | 0.16 | 4 | 0.08 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 5 | 25 | 10 | 0.08 | 3 | 0.08 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 6 | 25 | 15 | 0.04 | 4 | 0.06 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 7 | 25 | 20 | 0.16 | 1 | 0.04 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 8 | 25 | 25 | 0.12 | 2 | 0.02 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 9 | 30 | 10 | 0.12 | 4 | 0.04 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 10 | 30 | 15 | 0.16 | 3 | 0.02 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 11 | 30 | 20 | 0.04 | 2 | 0.08 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 12 | 30 | 25 | 0.08 | 1 | 0.06 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 13 | 35 | 10 | 0.16 | 2 | 0.06 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 14 | 35 | 15 | 0.12 | 1 | 0.08 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 15 | 35 | 20 | 0.08 | 4 | 0.02 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
| 16 | 35 | 25 | 0.04 | 3 | 0.04 | 3 | 4 | 15 | 0.02 |
从上述测试验证试验得大肠菌群复合快速显色诊检试剂的配方为：乳糖、蛋白胨、牛胆盐、琼脂、显色剂为玫红酸、溴甲酚紫、羧甲基纤维素钠、氯化钠、磷酸氢二钾；
优选配比为：(g/L)
乳糖25、蛋白胨15、牛胆盐1.5、琼脂15、显色剂0.02、增效一0.02、增效二0.08、盐一3、盐二4；
其中：增效一为溴甲酚紫；
增效二为羧甲基纤维素钠；
盐一为氯化钠；
盐二为磷酸氢二钾；
显色剂为玫红酸。
四验证试验：
1、特异性试验
将金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌置脑心浸液琼脂培养基中培养24小时；将大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌分置营养琼脂或其他专用培养基上培养24小时，之后划线接种于各专属培养基质及显色培养基中，37℃培养12小时，观察并记录菌落形态特征；
| 专属培养基 | 快速显色培养基 | |
| 金黄色葡萄球菌 | 3.78×106cfu | - |
| 大肠菌群 | 1.92×106cfu | 1.88×106cfu(黄色晕环，紫色背景) |
| 沙门氏菌 | 5.62×105cfu | - |
| 志贺氏菌 | 3.55×104cfu | - |
| 腊样芽孢杆菌 | 3.12×105cfu | - |
| 单增李斯特菌 | 1.65×104cfu | - |
由上表可以判断：本显色培养基能够有效屏蔽杂菌，抑制其生长，保护目标菌群快速生长繁殖，并特异显色。
2、灵敏度试验
挑取适量大肠菌群接入到10毫升0.85％的生理盐水中振摇均匀，制成母体菌悬液。接下来取1毫升母体菌悬液置含有9毫升0.85％生理盐水中制成10-1稀释液，依此类推进行10倍梯度浓度稀释至10-9止，取各浓度稀释液各0.1毫升均匀涂布于营养琼脂平板及显色剂平板；
| 大肠菌群 | 平均数 | 灵敏度显示 |
| 10-1 | 多不可计 | |
| 10-2 | 多不可计 | |
| 10-3 | 多不可计 | |
| 10-4 | 多不可计 | |
| 10-5 | 3.7×107cfu | |
| 10-6 | 1.2×108cfu | 灵敏度可以达到1.2×10-5 |
| 10-7 | - | - |
| 10-8 | - | - |
| 10-9 | - | - |
3、抗干扰试验
取各稀释度已知浓度的大肠菌群菌悬液2毫升，分别接入已知浓度的金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌各2毫升，振摇均匀，取0.1毫升混合菌悬液分别涂布于各专属培养基质，营养琼脂及显色培养基上。取各稀释度纯菌悬液分别涂布于各专属培养基，营养琼脂和显色培养基上，37℃培养6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时计数大肠菌群菌落数，比较目标菌株在受到强干扰的条件下显色培养基的灵敏度；
由上表可以判读：显色培养基对大肠菌群的显色灵敏度十分精确，可以达到2.66×10-5cfu。
4实际样品检验
来源1、市场购买；
2、餐饮业主的用餐环境实地抽取样品；
3、阴沟、马桶提取。
制备：分别制取各稀释度菌悬液于无菌状态下取其0.1毫升混悬液涂布接种于伊红美蓝平板、营养琼脂、显色培养基上，37℃培养培养6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时计数大肠菌群菌落数，检验大肠菌群检出限及检出率；
| EMB | NA | 浸液 | |
| 6 | - | - | - |
| 12 | - | - | 1.78×105cfu |
| 18 | 1.66×104cfu | 8.74×104cfu | 5.53×T06cfu |
| 24 | 3.84×106cfu | 4.18×106cfu | 6.76×107cfu |
| 36 | 8.34×107cfu | 7.13×107cfu | 3.14×107cfu |
| 48 | 8.34×107cfu | 7.13×107cfu | 3.14×106cfu |
从上表可以判读：显色培养基可以明显缩短检测时长，并且高度灵敏的反映实际样品带菌状态。
5、假阴性、假阳性菌株鉴定
将可疑菌落分离纯化，结合传统生理生化方法进行种属间鉴定，试验结果证表明，假阴性概率为0.014％，假阳性概率为0。
6、稳定性试验
检验包装成型产品在37℃条件下和2～4℃冰箱中的保藏期限；
7、可重复性试验
选取不同试验人员，不同实验室进行结果再现试验。
附图说明
图1为大肠菌群复合快速显色诊检试剂研发工艺流程图；
图2为PH值对目标微生物启动生长速度以及菌体累计数量的影响。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
参照图1所示：
1、首先通过大肠菌群、质控菌株即沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的活化及生化鉴定确定质控手段；
2、根据目的菌株的需要筛选基本营养成分；
3、通过生长谱法验证：微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源为乳糖，氮源为蛋白胨，矿物质为氯化钠、磷酸氢二钾，微量元素，生长因子为微生物生长所必需，缺少其中任意一种，微生物就不能正常生长、代谢、繁殖；
5、显示剂：氯化三苯四氮唑、伊红、玫红酸、中性红，掩蔽剂：牛胆盐、煌绿、龙胆紫、猪胆盐，增效剂：溴甲酚紫、羧甲基纤维素钠，上述显示剂、掩蔽剂及增效剂的遴选；
6、复合遴选；
7、通过快速显色培养基各项指标测试验证试验，其包括特异性试验、灵敏度试验、实际样品检验、假阴性、假阳性菌株鉴定、稳定性试验、可重复性试验、竞争菌株及杂菌干扰试验、检出时间、检出率的试验验证复合遴选配方的可行性；
8、通过因素水平正交组合试验遴选出最适配方。
大肠杆菌复合快速显色诊检试剂的配方为：乳糖、蛋白胨、牛胆盐、琼脂、溴甲酚紫、羧甲基纤维素钠、氯化钠、磷酸氢二钾、显色剂为玫红酸；优选配比为：(g/L)
乳糖25、蛋白胨15、牛胆盐1.5、琼脂15、显色剂0.02、溴甲酚紫0.02、羧甲基纤维素钠0.08、氯化钠3、磷酸氢二钾4；
如图2所示，由上表可以看出大肠菌群的最适PH值范围在6.7～7.5。
当培养时长为12小时时PH值＝6.9时菌种启动生长速度最快；
当培养时长为24小时时PH值＝7.3时大肠菌群菌体浓度最高。
原因：
当培养基内PH值过低时大肠菌群乳糖操纵子容易受到信息反馈抑制，菌体能量供应不足，导致迟缓期增加，对数生长期延后并缩短；
当培养基内PH值过高时，菌体内源蛋白合成受到抑制，诱导酶与合成酶的合成受阻。
因此我们选择PH＝6.9做为快速检测试剂的理想PH值。
最后，应当指出，以上实例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1、大肠杆菌复合快速显色诊检试剂研发工艺流程，其特征在于：该流程为：
1、首先通过大肠菌群、质控菌株(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)的活化及生化鉴定确定质控手段；
2、根据目的菌株的需要筛选基本营养成分；
3、通过生长谱法验证：微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、矿物质、微量元素、生长因子等等都为微生物生长所必需，缺少其中任意一种，微生物就不能正常生长、代谢、繁殖；
5、显示剂、掩蔽剂及增效剂的遴选；
6、复合遴选；
7、通过快速显色培养基各项指标测试验证试验，其包括特异性试验、灵敏度试验、实际样品检验、假阴性、假阳性菌株鉴定、稳定性试验、可重复性试验、竞争菌株及杂菌干扰试验、检出时间、检出率的试验验证复合遴选配方的可行性；
8、通过因素水平正交组合试验遴选出最适配方。
2、根据权利要求1所述的大肠杆菌复合快速显色诊检试剂，其特征在于：大肠杆菌复合快速显色诊检试剂的配方为：乳糖、蛋白胨、牛胆盐、琼脂、溴甲酚紫、羧甲基纤维素钠、氯化钠、磷酸氢二钾、显色剂为玫红酸；优选配比为：(g/L)
乳糖25、蛋白胨15、牛胆盐1.5、琼脂15、显色剂0.02、溴甲酚紫0.02、羧甲基纤维素钠0.08、氯化钠3、磷酸氢二钾4。
3、根据权利要求二所述的大肠杆菌复合快速显色诊检试剂，其特征在于：显色剂为玫红酸、溴甲酚紫、掩蔽剂为牛胆盐、玫红酸，增效剂为羧甲基纤维素钠、溴甲酚紫及与基本成分的相关配比。
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