CN114544924A - 甘油酯在疾病预测中的应用 - Google Patents

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CN114544924A CN202011345243.0A CN202011345243A CN114544924A CN 114544924 A CN114544924 A CN 114544924A CN 202011345243 A CN202011345243 A CN 202011345243A CN 114544924 A CN114544924 A CN 114544924A
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孙亮
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Abstract

本发明提供检测一种或多种甘油酯的试剂在制备用于预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝的试剂盒中的用途。所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合。

Description

甘油酯在疾病预测中的应用
技术领域
本发明涉及疾病预测和诊断领域，更具体地涉及甘油酯在预测疾病例如2型糖尿病或脂肪肝的发病风险中的应用。
背景技术
血脂异常是2型糖尿病的重要危险因素。随着脂质组技术的发展，人们已经认识到每类脂质包含大量不同的分子物种。甘油酯是人体最大的能量储存物质和主要的一种脂类，由甘油一酯(Monoacylglycerols,MAGs)、甘油二酯(Diacylglycerols,DAGs)和甘油三酯(Triacylglycerols,TAGs)组成(图1)。其中，细胞内DAGs是一种生物活性脂质，可作为诱导胰岛素抵抗的第二信使；而现有证据也支持TAGs在脂肪酸氧化和脂质合成中起到重要的调节作用。
与其他脂类相比，TAGs通常被认为是相对惰性的分子，而血液循环中的DAGs最有可能是TAGs分解的中间产物，这使得它们成为很大程度上未被探索的脂类。在现有的观察性研究中发现，根据所含脂肪酸的不同，不同甘油酯分子与2型糖尿病之间的关系有明显的差异。有关甘油酯与糖尿病的前瞻性研究也较为缺乏，目前的研究主要在西方人群中进行，因此在亚洲人群中进行相关研究将有助于发现针对性的代谢疾病的早期生物标志物。
肝脏是调节脂质代谢的重要器官。肝脏过多地生成脂质会增加血液中的血脂水平，而脂质从头合成途径(de novo lipogenesis,DNL)的激活则会增加含SFAs和MUFAs的TAGs丰度，如果此过程持续下去，会导致肝脏脂肪累积和脂肪变性，从而增加2型糖尿病发病风险。DAGs和带有SFAs和MUFAs的TAGs已显示与肝脏脂肪累积水平高度相关。然而，脂肪肝是否或在多大程度上可以解释甘油酯与糖尿病的关系，仍然是个未知数。因此，阐述不同种类甘油酯与糖尿病和脂肪肝的关系非常重要。
发明内容
本发明通过筛选104种血浆甘油酯，发现9种甘油酯可作为2型糖尿病和脂肪肝发展的早期生物标志物，肝脏脂肪指数和/或肝脏脂肪指数的变化与糖尿病呈正相关。本发明的目的是提供一种预测、诊断(尤其是早期辅助诊断)2型糖尿病和/或脂肪肝、检测肝脏脂肪积累水平的方法或检测试剂盒；本发明的另一目的是提供一种新的治疗2型糖尿病和/或脂肪肝方法。
在本发明的第一方面，提供了一种或多种甘油酯和/或其检测试剂的用途，用于制备预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝的试剂或试剂盒。
在一个或多个实施方案中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数。例如，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数为14-24，优选为16-22，更优选为16-20。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯选自以下一种或多种：DAG(14:0/18:2)、DAG(16:0/18:1)、DAG(16:0/18:2)、DAG(16:1/18:2)、DAG(16:0/18:3)、DAG(16:1/18:3)、DAG(18:0/18:1)、DAG(18:1/18:1)、DAG(18:0/18:2)、DAG(18:1/18:2)、DAG(16:0/20:3)、DAG(16:0/20:4)、DAG(18:2/18:3)、DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:3)、DAG(18:1/20:4)、DAG(16:0/22:5)、DAG(18:2/20:4)、DAG(18:1/20:5)、DAG(16:0/22:6)、DAG(18:2/20:5)、DAG(18:1/22:5)、DAG(18:2/22:5)、DAG(18:1/22:6)、DAG(18:2/22:6)。
优选地，所述甘油二酯选自以下的一种或多种：DAG(16:0/18:1)、DAG(16:1/18:2)、DAG(16:0/18:3)、DAG(18:0/18:1)、DAG(18:1/18:1)、DAG(16:0/20:3)、DAG(16:0/20:4)、DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:3)、DAG(18:1/20:4)、DAG(16:0/22:5)、DAG(18:2/20:4)、DAG(18:1/20:5)、DAG(16:0/22:6)、DAG(18:2/20:5)、DAG(18:1/22:6)。
更优选地，所述甘油二酯是DAG(16:1/20:4)和/或DAG(18:2/20:5)。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数大于或等于40。例如，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为44-60，较佳地为46-60，更佳地为46-52。优选地，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为偶数。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(44:3)、TAG(46:0)、TAG(46:1)、TAG(46:2)、TAG(46:3)、TAG(47:2)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(48:2)、TAG(48:3)、TAG(48:4)、TAG(48:5)、TAG(49:1)、TAG(49:2)、TAG(49:3)、TAG(50:0)、TAG(50:1)、TAG(50:2)、TAG(50:3)、TAG(50:4)、TAG(50:5)、TAG(50:6)、TAG(51:1)、TAG(51:2)、TAG(51:3)、TAG(51:4)、TAG(52:0)、TAG(52:1)、TAG(52:2)、TAG(52:3)、TAG(52:4)、TAG(52:5)、TAG(52:6)、TAG(52:7)、TAG(52:8)、TAG(53:0)、TAG(53:1)、TAG(53:2)、TAG(53:3)、TAG(53:5)、TAG(53:6)、TAG(54:1)、TAG(54:2)、TAG(54:3)、TAG(54:4)、TAG(54:5)、TAG(54:6)、TAG(54:7)、TAG(54:8)、TAG(55:1)、TAG(55:2)、TAG(55:3)、TAG(55:5)、TAG(55:7)、TAG(56:1)、TAG(56:2)、TAG(56:4)、TAG(56:5)、TAG(56:6)、TAG(56:7)、TAG(56:8)、TAG(56:9)、TAG(56:10)、TAG(57:2)、TAG(57:3)、TAG(58:5)、TAG(58:6)、TAG(58:7)、TAG(58:8)、TAG(58:9)、TAG(58:10)、TAG(60:10)、TAG(60:11)、TAG(60:12)。
优选地，所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(54:5)、TAG(48:3)、TAG(50:5)、TAG(52:4)、TAG(53:6)、TAG(55:2)、TAG(52:5)、TAG(58:10)、TAG(55:7)、TAG(58:9)、TAG(57:2)、TAG(52:8)、TAG(46:2)、TAG(47:2)、TAG(51:4)、TAG(54:4)、TAG(54:2)、TAG(60:12)、TAG(49:2)、TAG(51:2)、TAG(56:5)、TAG(53:1)、TAG(54:1)、TAG(56:9)、TAG(50:6)、TAG(58:8)、TAG(53:5)、TAG(50:3)、TAG(52:1)、TAG(52:7)、TAG(58:7)、TAG(52:3)、TAG(56:7)、TAG(56:8)、TAG(48:2)、TAG(56:6)、TAG(58:6)、TAG(55:1)、TAG(53:0)、TAG(60:11)、TAG(49:1)、TAG(51:1)、TAG(52:0)、TAG(52:2)、TAG(46:0)、TAG(46:1)、TAG(50:2)、TAG(60:10)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
更优选地，所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(50:6)、TAG(58:7)、TAG(50:3)、TAG(53:5)、TAG(52:7)、TAG(56:8)、TAG(52:3)、TAG(51:4)、TAG(56:7)、TAG(48:2)、TAG(56:6)、TAG(58:6)、TAG(55:1)、TAG(53:0)、TAG(60:11)、TAG(52:0)、TAG(46:0)、TAG(60:10)、TAG(49:1)、TAG(46:1)、TAG(51:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
进一步优选地，所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
在一个或多个实施方案中，所述甘油酯选自以下一种或多种：DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:5)、TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。优选地，所述甘油酯包含(1)DAG(16:1/20:4)和/或DAG(18:2/20:5)，和任选的(2)选自以下一种或多种：TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
在一个或多个实施方案中，所述的甘油酯是存在于哺乳动物(如人)血液中的甘油酯或在哺乳动物(如人)血液可检测的甘油酯。
在一个或多个实施方案中，所述的检测为血液检测、血浆检测、或血清检测。
在一个或多个实施方案中，所述的检测针对的检测样品包括血液样品、血浆样品、或血清样品。
在一个或多个实施方案中，所述检测的方法选自以下的一种或多种：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振。优选地，所述检测的方法为靶向或非靶向液相色谱-质谱法、流动注射技术-质谱法、鸟枪法、核磁共振法。
在一个或多个实施方案中，所述试剂是检测血液中所述甘油酯的试剂。优选地，所述试剂是选自以下一种或多种方法检测甘油酯所用的试剂：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振。
在一个或多个实施方案中，所述试剂选自：丁醇、甲醇、异丙醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、氯仿、乙酸、1,2-双十二烷酰-sn-丙三氧基-3-磷酸胆碱(1,2-didodecanoyl-sn-glycero3-phosphocholine)、甲酸、乙腈、乙酸铵、甲醇。
在一个或多个实施方案中，所述试剂是使用液相色谱-质谱检测甘油酯所用的试剂。例如：用于甘油酯提取的甲醇、甲基叔丁基醚，用作标准品的同位素标记的dDAG(16:0/18:1)、dTAG(50:1)-FA(16:0)、用于溶解脂质的二氯甲烷、甲醇、乙酸铵，用于色谱的流动相(如乙酸铵、乙腈)，用于色谱的固定相(如全多孔型担体)。
在一个或多个实施方案中，所述2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险是6年内患2型糖尿病和/或脂肪肝的风险。
在一个或多个实施方案中，所述肝脏脂肪累积水平由肝脏脂肪指数(FLI)或其变化指示。其中，FLI≥30，指示肝脏脂肪累积水平高，FLI≥60，指示脂肪肝。
在一个或多个实施方案中，所述的检测包括辅助检测和/或早期检测。
在一个或多个实施方案中，所述检测是将来自对象的样品的甘油酯含量(A1)与正常人群的相应甘油酯含量(A0)相比较，若A1显著高于A0，则说明对象的2型糖尿病和/或脂肪肝的发病风险较高、肝脏脂肪累积水平高。
在一个或多个实施方案中，所述“显著高于”指A1/A0≥1.1，优选为A1/A0≥1.3，更优选为A1/A0≥1.5。
在一个或多个实施方案中，所述的正常人群的数量为至少100人，较佳地至少300人，更佳地至少500人，最佳地至少1000人。
在本发明的第二方面，提供了一种用于预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝的试剂或试剂盒，包括：
(1)用于检测样品中一种或多种甘油酯含量的试剂，其中所述样品选自血液样品、血浆样品、或血清样品；
(2)任选的甘油酯标准品；
(3)任选的使用说明书，
其中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数。例如，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数为14-24，优选为16-22，更优选为16-20。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数大于或等于40。例如，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为44-60，较佳地为46-60，更佳地为46-52。优选地，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为偶数。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2。
在一个或多个实施方案中，所述甘油酯如本文第一方面中所述。
在一个或多个实施方案中，所述使用说明书中记载了本发明第三方面所述的方法。
在本发明的第三方面，提供了一种用于预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平的方法，包括以下步骤：
(1)检测对象的样品中一种或多种甘油酯的含量，和
(2)根据所测甘油酯的含量确定2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝，
其中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数。例如，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数为14-24，优选为16-22，更优选为16-20。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数大于或等于40。例如，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为44-60，较佳地为46-60，更佳地为46-52。优选地，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为偶数。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2。
在一个或多个实施方案中，所述甘油酯如本文第一方面中所述。
在一个或多个实施方案中，所述甘油酯选自以下一种或多种：DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:5)、TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。优选地，所述甘油酯包含(1)DAG(16:1/20:4)和/或DAG(18:2/20:5)，和任选的(2)选自以下一种或多种：TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：
(2.1)将步骤(1)的一种或多种甘油酯的含量(A1)与正常人群样品的相应甘油酯含量(A0)相比，若A1显著高于A0，则说明对象患2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险高、肝脏脂肪累积水平高，优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.1，优选为A1/A0≥1.3，更优选为A1/A0≥1.5；或
(2.2)若所述甘油酯的含量如下所述，则对象处于患2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险中、肝脏脂肪累积水平高：
DAG(16:1/20:4)大于或等于0.07mg/L，
DAG(18:2/20:5)大于或等于0.18mg/L，
TAG(46:1)大于或等于25.2mg/L，
TAG(48:0)大于或等于128mg/L，
TAG(48:1)大于或等于208mg/L，
TAG(50:0)大于或等于29.5mg/L，
TAG(50:1)大于或等于958mg/L，
TAG(50:2)大于或等于81.5mg/L，
TAG(52:2)大于或等于108mg/L。
在一个或多个实施方案中，所述样品包括血液样品、血浆样品、血清样品。
在一个或多个实施方案中，所述2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险是6年内患2型糖尿病和/或脂肪肝的风险。
在一个或多个实施方案中，所述肝脏脂肪累积水平由肝脏脂肪指数(FLI)或其变化指示。优选地，FLI≥60指示肝脏脂肪累积水平高。
本发明还提供，检测肝脏脂肪指数(FLI)的工具在制备预测2型糖尿病发病风险或诊断2型糖尿病中的试剂盒中的用途。
在一个或多个实施方案中，肝脏脂肪指数或其变化指示2型糖尿病发病风险，其中，
(1)将来自测试对象的基线肝脏脂肪指数B1与正常人群的相应肝脏脂肪指数B0相比较，若B1显著高于B0，则说明对象2型糖尿病的发病风险较高；较佳地，所述“显著高于”指B1/B0≥1.4，较佳地B1/B0≥1.7，更佳地B1/B0≥2；
(2)若所述基线肝脏脂肪指数(FLI)大于等于约36，例如大于等于约36.04，则对象处于患2型糖尿病发病风险中，
(3)若肝脏脂肪指数增加值大于等于约7，例如大于等于7.72，则对象处于患2型糖尿病发病风险中。
在一个或多个实施方案中，所述2型糖尿病发病风险是6年内患2型糖尿病脂肪肝的风险。
在一个或多个实施方案中，检测肝脏脂肪指数(FLI)的工具是检测γ-谷氨酰转移酶、总甘油三酯的试剂和测量腰围、体质指数(BMI)的工具。
在一个或多个实施方案中，检测γ-谷氨酰转移酶、总甘油三酯的试剂是使用全酶催化反应法或比色法检测γ-谷氨酰转移酶、总甘油三酯的试剂。
在本发明的第四方面，提供了一种检测甘油酯的水平的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：
(1)检测对象的样品中一种或多种甘油酯的含量，和
(2)根据所测甘油酯的含量确定2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝，
其中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合；
或者，本发明提供了一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述存储介质上存储有计算机程序，当所述计算机程序被处理器执行时，实现下述步骤：
(1)检测对象的样品中一种或多种甘油酯的含量，和
(2)根据所测甘油酯的含量确定2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝，
其中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数。例如，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数为14-24，优选为16-22，更优选为16-20。
在一个或多个实施方案中，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5。
在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数大于或等于40。例如，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为44-60，较佳地为46-60，更佳地为46-52。优选地，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数为偶数。在一个或多个实施方案中，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2。
在一个或多个实施方案中，所述甘油酯如本文第一方面中所述。
在一个或多个实施方案中，所述甘油酯选自以下一种或多种：DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:5)、TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。优选地，所述甘油酯包含(1)DAG(16:1/20:4)和/或DAG(18:2/20:5)，和任选的(2)选自以下一种或多种：TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
在一个或多个实施方案中，所述装置或计算机可读存储介质的其他特征如本文第三方面的方法中的特征所述。
本发明还提供一种或多种甘油酯的抑制剂在制备用于预防或治疗2型糖尿病和/或脂肪肝、防止或减缓肝脏脂肪累积的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述抑制剂选自氯苯丁酯、烟酸。
附图说明
图1是示例性甘油酯化学结构特征。
图2是2型糖尿病新发病例与对照组的基线甘油酯浓度比较。
图3显示甘油酯之间的相关性。
图4显示甘油酯与代谢指标的相关性。其中，数据为控制了年龄、性别、南北、城乡后计算的Spearman回归系数；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图5显示甘油酯与2型糖尿病发病风险的关系。其中，横坐标为碳原子数，纵坐标为双键数，圆圈大小代谢显著性，深浅代表效应值。a：77个甘油酯(包括25个DAGs和52个TAGs)与新发2型糖尿病显著关联。当进一步矫正了腰围、高血压、总甘油三酯和HDL-C后，有42个甘油酯保持显著正相关性，包括16个至少含有一个不饱和脂肪酸的DAGs及26个TAGs；另外还有一种奇数链TAG(51:4)与2型糖尿病风险显著负相关。b：当进一步校正了HbA1c和HOMA-IR后，甘油酯与糖尿病之间的关联性减弱，但依然有2个DAGs(16:1/20:4,18:2/20:5)和7个TAGs(46:1,48:0,48:1,50:0,50:1,50:2,52:2)与2型糖尿病显著正相关。c：当在年龄、性别、地区和城乡后直接进一步矫正FLI时，甘油酯与糖尿病的关联性消失。
图6显示甘油酯与新发eFLI风险的关系。模型1：校正年龄、性别、地区、城乡、受教育程度、目前吸烟、目前饮酒、体力活动、糖尿病家族史、总能量摄入和BMI；模型2：进一步校正总甘油三酯、HDL-C和HOAM-IR。
具体实施方式
发明人通过应用高通量靶向脂质组学定量检测血浆甘油酯，发现2种DAG(16:1/20:4,18:2/20:5)和7种TAG(C46:1,C48:0,C48:1,C50:0,C50:1,C50:2,C52:2)显著增加6年新发2型糖尿病的风险。还发现了肝脏脂肪在甘油酯和2型糖尿病之间起重要的中介作用。
甘油酯
本文所述“甘油酯”包括甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，它们分别为甘油分子中的三个羟基中一个、两个和全部三个被脂肪酸脱水缩合成的单酯、二酯、三酯化合物。示例性甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯如图1中所示。
本发明甘油酯具有式(I)的结构：
Figure BDA0002799632820000091
Figure BDA0002799632820000101
对于甘油一酯来说，R1、R2和R3中有两个是OH，另一个是脂肪酸缩合后的残基RCOO，其中R是C10-C30烷基或C10-C30烯基(例如C12-C26烷基或C12-C26烯基，或C16-C22烷基或C16-C22烯基)。
对于甘油二酯来说，R1、R2和R3中有一个是OH，另两个是脂肪酸缩合后的残基RCOO，其中R是C10-C30烷基或C10-C30烯基(例如C12-C26烷基或C12-C26烯基，或C16-C22烷基或C16-C22烯基)。如DAG(a:b/c:d)所示的甘油二酯中，a和b分别表示其中一个脂肪酸残基(RCOO)的碳原子数和不饱和度(双键数)，c和d表示另一个脂肪酸残基(RCOO)的碳原子数和不饱和度。例如，DAG(18:2/20:5)所示的甘油二脂中，一个脂肪酸残基具有18个碳原子和2个双键，另一个脂肪酸残基具有20个碳原子和5个双键。在一个或多个实施方案中，本文所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数；所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5。
对于甘油三酯来说，R1、R2和R3均是RCOO，其中R是C10-C30烷基或C10-C30烯基(例如C12-C26烷基或C12-C26烯基，或C16-C22烷基或C16-C22烯基)。如TAG(a:b)所示的甘油三酯中，a和b分别表示该甘油三酯的三个脂肪酸残基的总碳数和总不饱和度(双键数)。例如，TAG(50:1)表示该甘油三酯的三个脂肪酸残基共具有50个碳原子和1个双键。在一个或多个实施方案中，本文所述甘油三酯为碳原子数≥40的甘油三酯；所述甘油三酯的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2。
发明人发现，检测以下一种或多种甘油酯的血液水平可以检测2型糖尿病发病风险或诊断2型糖尿病：甘油二酯DAG(14:0/18:2)、DAG(16:0/18:1)、DAG(16:0/18:2)、DAG(16:1/18:2)、DAG(16:0/18:3)、DAG(16:1/18:3)、DAG(18:0/18:1)、DAG(18:1/18:1)、DAG(18:0/18:2)、DAG(18:1/18:2)、DAG(16:0/20:3)、DAG(16:0/20:4)、DAG(18:2/18:3)、DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:3)、DAG(18:1/20:4)、DAG(16:0/22:5)、DAG(18:2/20:4)、DAG(18:1/20:5)、DAG(16:0/22:6)、DAG(18:2/20:5)、DAG(18:1/22:5)、DAG(18:2/22:5)、DAG(18:1/22:6)、DAG(18:2/22:6)，甘油三酯TAG(44:3)、TAG(46:0)、TAG(46:1)、TAG(46:2)、TAG(46:3)、TAG(47:2)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(48:2)、TAG(48:3)、TAG(48:4)、TAG(48:5)、TAG(49:1)、TAG(49:2)、TAG(49:3)、TAG(50:0)、TAG(50:1)、TAG(50:2)、TAG(50:3)、TAG(50:4)、TAG(50:5)、TAG(50:6)、TAG(51:1)、TAG(51:2)、TAG(51:3)、TAG(51:4)、TAG(52:0)、TAG(52:1)、TAG(52:2)、TAG(52:3)、TAG(52:4)、TAG(52:5)、TAG(52:6)、TAG(52:7)、TAG(52:8)、TAG(53:0)、TAG(53:1)、TAG(53:2)、TAG(53:3)、TAG(53:5)、TAG(53:6)、TAG(54:1)、TAG(54:2)、TAG(54:3)、TAG(54:4)、TAG(54:5)、TAG(54:6)、TAG(54:7)、TAG(54:8)、TAG(55:1)、TAG(55:2)、TAG(55:3)、TAG(55:5)、TAG(55:7)、TAG(56:1)、TAG(56:2)、TAG(56:4)、TAG(56:5)、TAG(56:6)、TAG(56:7)、TAG(56:8)、TAG(56:9)、TAG(56:10)、TAG(57:2)、TAG(57:3)、TAG(58:5)、TAG(58:6)、TAG(58:7)、TAG(58:8)、TAG(58:9)、TAG(58:10)、TAG(60:10)、TAG(60:11)、TAG(60:12)。
发明人还发现，血液甘油酯水平与肝脏脂肪指数相关。因此，检测本文所述甘油酯的血液水平可以预测脂肪肝风险或诊断脂肪肝、鉴定肝脏脂肪累积水平。本文汇总，“肝脏脂肪指数或FLI”标志一种经验证的非侵入性脂肪肝替代指标，由下列公式计算得到：FLI＝(e0.953*ln(TG*88.545)+0.139*BMI+0.718*ln(GGT)+0.053*waistline–15.745)/(1+e0.953 *ln(TG*88.545)+0.139*BMI+0.718*ln(GGT)+0.053*waistline–15.745)*100(GGT单位：U/l，TG单位：mmol/l，WC单位：cm，BMI单位：kg/m2)。通常，当FLI≥60时定义为FLI升高(eFLI)，肝脏脂肪累积水平较高。
本文所述预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝、鉴定肝脏脂肪累积水平的方法包括以下步骤：(1)检测对象的样品中一种或多种甘油酯的含量，和(2)根据所测甘油酯的含量确定2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝，其中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合。所述甘油酯如上所述。在具体实施方案中，所述甘油酯选自以下一种或多种：DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:5)、TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。优选地，所述甘油酯包含(1)DAG(16:1/20:4)和/或DAG(18:2/20:5)，和任选的(2)选自以下一种或多种：TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：(2.1)将步骤(1)的一种或多种甘油酯的含量(A1)与正常人群样品的相应甘油酯含量(A0)相比，若A1显著高于A0，则说明对象患2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险高、肝脏脂肪累积水平高，优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.1，优选为A1/A0≥1.3，更优选为A1/A0≥1.5；或(2.2)若所述甘油酯的含量如下所述，则对象处于患2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险中、肝脏脂肪累积水平高：DAG(16:1/20:4)大于或等于0.07mg/L，DAG(18:2/20:5)大于或等于0.18mg/L，TAG(46:1)大于或等于25.2mg/L，TAG(48:0)大于或等于128mg/L，TAG(48:1)大于或等于208mg/L，TAG(50:0)大于或等于29.5mg/L，TAG(50:1)大于或等于958mg/L，TAG(50:2)大于或等于81.5mg/L，TAG(52:2)大于或等于108mg/L。
发明人还发现肝脏脂肪指数(FLI)与2型糖尿病发病风险的关系，因此，本发明还提供检测肝脏脂肪指数(FLI)的工具在制备预测2型糖尿病发病风险或诊断2型糖尿病中的试剂盒中的用途，和通过检测肝脏脂肪指数(FLI)或其变化来预测2型糖尿病发病风险或诊断2型糖尿病的方法。所述肝脏脂肪指数或其变化指示2型糖尿病发病风险，其中，(1)将来自测试对象的基线肝脏脂肪指数B1与正常人群的相应肝脏脂肪指数B0相比较，若B1显著高于B0，则说明对象2型糖尿病的发病风险较高；较佳地，所述“显著高于”指B1/B0≥1.4，较佳地B1/B0≥1.7，更佳地B1/B0≥2；(2)若所述基线肝脏脂肪指数(FLI)大于等于约36，例如大于等于约36.04，则对象处于患2型糖尿病发病风险中，(3)若肝脏脂肪指数增加值大于等于约7，例如大于等于7.72，则对象处于患2型糖尿病发病风险中。在一个或多个实施方案中，检测肝脏脂肪指数(FLI)的工具是检测γ-谷氨酰转移酶、总甘油三酯的试剂和测量腰围、体质指数(BMI)的工具。
本领域知晓检测γ-谷氨酰转移酶的常规方法以及所用试剂。例如在酶比色法中，试剂包括TRIS、双甘氨肽(glycylglcine)，L-gamma-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺、醋酸酯。例如在重氮比色法中，试剂包括萘酚、GGT分析缓冲液、GGT显色剂、显色剂稀释液等。
此外，本领域知晓检测总甘油三酯的常规方法以及所用试剂，例如在酶显色法中，试剂包括甘油-3-磷酸氧化酶(GPO)，N-(3-磺丙基)-3-甲氧基-5-甲基苯胺(HMMPS)，4-氨基安替比林等；在酶催化反应法中，试剂包括脂蛋白酯酶、甘油磷酸氧化酶、过氧化物酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、甘油激酶、4-氨基安替比林、ATP、Tris缓冲液；例如在比色法中，试剂包括PIPES缓冲液、Mg2+、胆酸钠、ATP、4-氨基安替比林、4-氯酚、脂蛋白酯酶、甘油磷酸氧化酶、甘油激酶、过氧化物酶。测量腰围、体质指数(BMI)的工具可以是腰围尺、身高仪和体重仪。
此外，本发明还揭示了存储计算机程序的计算机可读存储介质，存储介质上所存储的计算机程序运行后执行本文所述的预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝、鉴定肝脏脂肪累积水平的方法。结合本文中公开的实施方案描述的方法或算法的步骤可直接在硬件中、在由处理器执行的软件模块中、或在这两者的组合中体现。如果在软件中实现为计算机程序产品，则各功能可以作为一条或更多条指令或代码存储在计算机可读介质上或由其进行传送。计算机可读介质包括计算机存储介质和通信介质两者，其包括促成计算机程序从一地向另一地转移的任何介质。存储介质可以是能被计算机访问的任何可用介质。作为示例而非限定，这样的计算机可读介质可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盘存储、磁盘存储或其它磁存储设备、或能被用来携带或存储指令或数据结构形式的合意程序代码且能被计算机访问的任何其它介质。示例性存储介质耦合到处理器以使得该处理器能从/向该存储介质读取和写入信息。在替换方案中，存储介质可以被整合到处理器。处理器和存储介质可驻留在ASIC中。ASIC可驻留在用户终端中。在替换方案中，处理器和存储介质可作为分立组件驻留在用户终端中。
检测试剂及检测方法
本发明涉及定量和定性检测人体血液甘油酯水平，检测甘油酯的血液水平可使用本领域已知的任何方法，例如高效靶向液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)。示例性的检测步骤包括：收集血浆，提取脂质(例如采用甲基叔丁基醚方法)，萃取，离心，干燥后溶解，高效液相色谱(例如ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱)分离，质谱检测(例如电喷雾电离、正负模式、多反应监测模式)。检测结果可使用常规数据分析方法(例如Analyst 1.6.3软件和MultiQuant3.0软件)进行定量计算。所有脂质均根据内标进行数据校正。此外，所述方法还可以是其他本领域常用的检测甘油酯的方法，例如流动注射技术-质谱法、鸟枪法、核磁共振法。
本文所述“试剂”是检测血液本文所述一种或多种甘油酯的试剂。本文所述检测甘油酯的试剂包括甘油酯检测过程中所涉的任何试剂，例如用于从样品(例如血液)中提取甘油酯的试剂(例如甲基叔丁基醚方法中所用的试剂)；用于纯化甘油酯的试剂(例如色谱中的流动相、固定相、缓冲液等)；用于质谱检测甘油酯的试剂(例如电喷雾串联质谱所用的雾化气、辅助气、碰撞气等)；用作标准品的同位素标记的dDAG(16:0/18:1)、dTAG(50:1)-FA(16:0)。示例性地，所述试剂是使用液相色谱-质谱检测甘油酯所用的试剂。例如：氯仿、甲醇、丁醇、异丙醇、甲酸、乙酸、乙腈、乙酸乙酯、乙酸铵、甲基叔丁基醚、用于色谱的流动相(如乙酸铵、乙腈)、用于色谱的固定相(如全多孔型担体)。此外，所述试剂还包括本领域常用的检测甘油酯的方法中所用试剂，例如用于脂质提取的丁醇/甲醇、异丙醇、甲基叔丁基醚/甲醇/异丙醇、异丙醇/乙酸乙酯、氯仿/甲醇/乙酸，用于脂质溶解的甲醇/异丙醇、氯仿/甲醇，用作流动相的甲酸/乙腈/异丙醇、乙酸铵/甲酸、甲醇/乙酸、乙酸铵/甲醇/乙酸。在一个或多个实施方案中，所述试剂是检测血液中所述甘油酯的试剂。例如：用于甘油酯提取的甲醇和/或甲基叔丁基醚，用于溶解脂质的50％二氯甲烷-甲醇/乙酸铵50％(v:v)，用于色谱的流动相(如10mM的乙酸铵/纯乙腈)，用于色谱的固定相(如全多孔型担体)。
试剂盒
本发明还提供了一种预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝、鉴定肝脏脂肪累积水平的试剂盒。可用于本发明的试剂盒通常包括检测试剂、甘油酯标准品和/或说明书。其中，所述的说明书中记载了检测方法以及根据不同样品测定值A1判断个体2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险的方法。
一种判断个体2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险方法如下：(1)检测对象的样品中甘油酯的含量；(2)根据所测甘油酯的含量确定2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝、确定肝脏脂肪累积水平。将步骤(1)的甘油酯含量(A1)与正常人群样品的甘油酯含量(A0)相比，若A1显著高于A0，则说明测试组2型糖尿病和/或脂肪肝的发病风险较高。本文中，所述“显著高于”指A1/A0≥1.1，较佳地A1/A0≥1.3，更佳地A1/A0≥1.5。通常，所述的正常人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。正常人群取自200-2000人的人群。一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人血液样品、血浆样品或血清样品。其中，所述的血液、血浆或血清样品可来自于外周血。
药物组合物
抑制本发明发现的甘油酯有望预防或治疗2型糖尿病和/或脂肪肝，防止或减缓肝脏囤积脂肪。因此，本发明还提供本文所述甘油酯的抑制剂在制备用于预防或治疗2型糖尿病和/或脂肪肝、防止或减缓肝脏脂肪累积的药物中的应用，以及用所述抑制剂预防或治疗2型糖尿病和/或脂肪肝、防止或减缓肝脏脂肪累积的方法。本领域知晓本文所述甘油酯的常规抑制剂，例如氯苯丁酯(抑制甘油三酯的从头合成)、烟酸(抑制甘油三酯合成酶的活性)。
本发明的药物组合物包含本文甘油酯的抑制剂和药学上可接受的辅料。本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的抑制剂传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包括本领域周知的治疗中常用于递送康生物的各种类型的载体或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的辅料可以是本领域常用于转座系统或含有其的细胞给药的辅料。辅料的示例包括各种乳糖、甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如PiggyBacS、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含本文所述甘油酯的抑制剂的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
通常，组合物中含有治疗有效量的本文所述甘油酯的抑制剂。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。实现这些效果可以通过插入具有相应功能的外源基因实现的，所述相应功能的外源基因具有相应于具体用途的功能，例如治疗功能或者诱导功能。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合物含有按照重量比例为例如0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的本文所述的抑制剂。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的，可以被制成单位剂型的形式。剂型比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、散剂、丸剂、控速释剂、输液剂、混悬剂等等。根据本文所述的抑制剂所预防和治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。从易于制备和储存的立场看，优选的组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。本文所述的抑制剂或其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。本文所述的抑制剂或其组合物也可储存在适当的容器，并置于试剂盒或药盒中。
本发明的主要优点包括：
1.与之前研究相比，本研究检测出更多的血浆甘油酯种类，在控制了多个混杂因素后，发现了9种甘油酯增加2型糖尿病和脂肪肝的发病风险，进而提供了辅助诊断脂肪肝和2型糖尿病(或易感性)的方法和试剂盒。本发明可以为临床诊断(尤其是早期诊断)2型糖尿病和脂肪肝提供极为有价值的辅助性参考指标，从而有利于实现2型糖尿病和脂肪肝的早诊断、早预防。
2.首次发现肝脏脂肪指数介导了DAGs/TAGs与2型糖尿病的关系。亚洲人群碳水化合物摄入量较高，本发明发现大多数甘油酯与红细胞16:1n-7(DNL活性标记物)和6年随访期间肝脏脂肪指数的升高相关，提示特定的甘油酯是反映肝脏脂肪积累的早期生物标记物。
3.本发明发现肝脏脂肪指数和肝脏脂肪指数的6年变化与糖尿病发病呈正相关，控制了肝脏脂肪指数在很大程度上减弱了甘油酯和糖尿病的相关性。
实施例
实验方法与步骤
1.研究人群
本项目研究人群来自“中国老龄人口营养与健康状况调查”(Nutrition andHealth of Aging Population in China,NHAPC)，是一项基于人群的前瞻性队列研究。基线调查于2005年进行，研究样本通过分阶段整群抽样获得，最终在北京和上海招募到3289名年龄在50至70岁之间的居民(1458名男性和1831名女性)。2011年进行追踪随访调查，成功随访到2529名志愿者(77％)。在本研究中，排除了以下人群：1)缺乏甘油酯数据(n＝281)；2)基线时患有2型糖尿病(n＝274)；3)日均能量摄入不在合理范围内(男性<800或>4000kcal/天；女性<500或>3500kcal/天；n＝97)和4)服用降脂药物(n＝96)，最终共有1781名参与者被纳入最终分析。
2.伦理审查
本项研究已通过中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所伦理委员会审查，并遵循赫尔辛基宣言的原则。所有研究对象均被告知研究过程并签署了知情同意书。
3.数据收集
在基线和追踪随访阶段，人口学、健康状况、生活方式、疾病史、体力活动和膳食摄入等数据由受过专业培训的工作人员根据标准问卷进行面对面访谈收集。禁食过夜后，志愿者被邀请参加体检，体重、身高、腰围和血压同样由经过培训的医生和工作人员按照标准方案进行。体质指数(Body mass index,BMI)为体重(kg)除以身高(m)的平方。
4.实验室检测
在基线及随访调查时，空腹血样由含EDTA抗凝剂的真空管采集，在4℃低温离心机中保持3000rpm的转速离心15-20分钟，之后分离上层的血浆到冻存管中并保存在-80℃超低温冰箱，以备检测分析。血浆空腹血糖、总甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-densitylipoprotein cholesterol,LDL-C)、γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)通过日立7080全自动生化分析仪酶催化反应法或比色法进行检测(Hitachi 7080,Tokoy,Japan)，试剂盒为日本和光纯化公司提供(Wako Pure Chemical Industries,Osaka,Japan)。空腹胰岛素采用荧光免疫法测定(Linco Research,St.Charles,MO)。红细胞糖化血红蛋白(HbA1c)采用免疫比浊法在日立7080自动生化分析仪上测定，试剂盒来自罗氏公司(Tina-Quant Hemoglobin A1C II；Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)。红细胞脂肪酸用GC-FID法检测(Agilent 6890GC-5975B)。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)由Levy模型计算获得(http://www.dtu.ox.ac.uk/)。肝脏脂肪指数肝脏脂肪指数(FLI)由下列公式计算得到：
FLI＝(e0.953*ln(TG*88.545)+0.139*BMI+0.718*ln(GGT)+0.053*waistline–15.745)/(1+e0.953 *ln(TG*88.545)+0.139*BMI+0.718*ln(GGT)+0.053*waistline–15.745)*100(GGT为γ-谷氨酰转移酶，单位：U/l；TG为总甘油三酯，单位：mmol/l；WC为腰围，单位：cm；BMI为体质指数，单位：kg/m2)。
5.血浆甘油酯谱检测
血浆脂质组采用高效靶向液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)方法进行定量检测。脂质提取按照改良后的甲基叔丁基醚(MTBE)方案，色谱分离使用ACQUITY UPLCBEH HILIC色谱柱，质谱检测使用Nexera X2 LC-30AD系统(Shimadzu ScientificInstruments,Marlborough,MA)结合Sciex 5500QTRAP三重四极杆质谱仪(AppliedBiosystems/Sciex)。电喷雾电离以正负模式进行质谱分析，通过多反应监测(MRM)模式获取数据。Analyst 1.6.3软件(Sciex,Foster City,CA)用于特征对齐、信号检测和信号集成，MultiQuant3.0软件(Sciex,Foster City,CA)用于定量计算。不同的脂质根据其相应的稳定同位素标记内标进行定量。为保证检测的质量和稳定性，每检测10个样本加入一个质控样本。本研究中，排除缺失率>20％和/或批次内变异系数(CVs)>30％的脂类后，最终对104种甘油酯(25种DAGs和79种TAGs)进行了量化分析。DAGs命名用两个脂肪酰基组分表示，如DAG(14:0/18:2)，TAGs命名用酰基碳原子总数和双键总数表示，如TAG(50:1)。单个脂肪酰链的长度定义如下：短：C<16，长：16≤C<22，非常长：C≥22；单个脂肪酰链的饱和度分为：饱和：n(C＝C)＝0，单不饱和：n(C＝C)＝1，多不饱和：n(C＝C)≥2。
6.2型糖尿病定义
依据美国糖尿病协会诊断标准，满足下列3个条件之一的个体即被定义为患有2型糖尿病：1)已经诊断患有2型糖尿病；2)使用降糖药或胰岛素；3)空腹血糖≥7.0mmol/l。
7.统计学分析
通过Student’s t检验或Wilcoxon’s Signed Rank检验比较是否新发2型糖尿病组间基线特征的连续变量差异，通过卡方检验比较分类变量差异。甘油酯缺失值用原始数据中最小非零值的一半进行填补。所有血浆甘油脂质浓度(mg/l)在统计分析前进行自然对数转化。偏相关系数Spearman partial correlation coefficients(rs)用来衡量甘油酯与心血管代谢生物标记物的相关性，校正了性别(男或女)、年龄(年)、地区(南或北)和城乡；并在进一步校正BMI(kg/m2)和总甘油三酯(mmol/l)后评估各个甘油酯种类之间的相关性。
由于该人群的2型糖尿病发病率较高，使用对数泊松模型来衡量每个甘油酯与2型糖尿病的关系，校正了年龄、性别、地区、城乡、受教育程度(0-6年、7-9年或者≥10年)、目前吸烟(是或否)、目前饮酒(是或否)、体力活动(低强度、中强度或者高强度)、糖尿病家族史(是或否)、总能量摄入(kcal/天)、BMI、腰围、高血压(是或否)、总甘油三酯、HDL-C(mmol/l)、HOAM-IR、HbA1c(％)和FLI。
接下来，我们分析评估肝脏脂肪累积在甘油酯和糖尿病两者的关系中是否起中介作用。首先，当FLI≥60时定义为FLI升高(elevated FLI,eFLI)，排除基线时患eFLI的个体(n＝225)和随访时无FLI数据的个体(n＝4)后，分析基线甘油酯与6年后eFLI发病风险之间的关系。然后，使用多元对数泊松模型分析基线FLI、6年前后FLI变化与2型糖尿病发病的关系。随后，使用R程辑包“mediation”进行了因果中介分析，以估计FLI对观察到的甘油酯和2型糖尿病之间关系的贡献比例。
上述所有分析都在Stata 9.2(StataCorp LP,College Station,TX,USA)和R软件3.6.0(www.r-project.org)中进行。双侧P值<0.05被认为具有统计显著性。
实验结果
实施例1：血液甘油酯谱检测
本研究共检测到104种甘油酯，包括25种DAGs和79种TAGs，变异系数范围为6.81％-29.67％，24种甘油酯有缺失值，缺失率范围0.04％-2.14％(表1)。
表1，血浆甘油酯的LC-ESI-MS/MS检测参数
Figure BDA0002799632820000191
Figure BDA0002799632820000201
Figure BDA0002799632820000211
Figure BDA0002799632820000221
Figure BDA0002799632820000231
Figure BDA0002799632820000241
Figure BDA0002799632820000251
Figure BDA0002799632820000261
Figure BDA0002799632820000271
Figure BDA0002799632820000281
注：Q1表示母离子分子质量；Q3表示次级离子分子质量。
实施例2：基线特征
新发2型糖尿病患者与对照组的基线特征示于表2。经过六年的追踪共有新发2型糖尿病463例(26％)，调查对象的平均年龄为58岁，40％为男性。病例组中，北方居民、饮酒、有糖尿病家族史者较多，并且基线血压、BMI、腰围、空腹血糖、HbA1c、空腹胰岛素、HOMA-IR、总甘油三酯、LDL-C水平显著偏高，HDL-C显著偏低(P<0.05)。此外，病例组基线碳水化合物供能比低于非病例组。在所检测的、数据质量合格的104种代谢物中，共有25种DAGs和79种TAGs，病例组相比于非病例组有更高的基线DAGs和TAGs水平(图2)。新发2型糖尿病患者与对照组的9种甘油酯的中位数如表3所示。
表2.根据是否新发2型糖尿病分组的1781名调查对象的基线特征
Figure BDA0002799632820000282
Figure BDA0002799632820000291
注：数据为平均值±标准差，或中位数(四分位间距)，或数目(百分比)。因为四舍五入所以百分比之和有可能不是100％。
表3，新发2型糖尿病患者与对照组的甘油酯浓度比较
Figure BDA0002799632820000292
注：数据为中位数(四分位间距)。
实施例3：甘油酯之间的相关性
通过关联热图可见，在校正了年龄、性别、地区和城乡、BMI和血浆总甘油三酯后，相同类型、链长相近代谢物之间关联性较强，较短链TAGs(C46-C53)之间的关联性尤其明显(rs>0.5，P<0.05)(图3)。
实施例4：甘油酯与代谢特征的关联性
总的来说，在校正了年龄、性别、地区和城乡后，甘油酯与空腹血糖(rs＝0.07-0.33)、空腹胰岛素(rs＝0.08-0.32)、HOMA-IR(rs＝0.08-0.33)、BMI(rs＝0.10-0.36)、腰围(rs＝0.10-0.42)、血压(rs＝0.06-0.22)、总胆固醇(rs＝0.09-0.29)、LDL-C(rs＝0.07-0.24)、GGT(rs＝0.10-0.33)和红细胞16:1n-7(rs＝0.07-0.53；P<0.05)呈弱到中等的正相关性，与HDL-C(rs＝-0.07--0.47)呈负相关。值得注意的是，甘油脂与FLI(rs＝0.25-0.67)及TG(rs＝0.14-0.90；P<0.05)呈现出较强的相关性(图4)。
实施例5：甘油酯与2型糖尿病发病风险的关联关系
前瞻性分析发现在校正年龄、性别、地区、城乡、体力活动、生活方式、总能量摄入、BMI等混杂因素后，经过FDR多重矫正，有77个甘油酯(包括25个DAGs和52个TAGs)与新发2型糖尿病显著关联(图5，a)。当进一步矫正了腰围、高血压、总甘油三酯和HDL-C后，有42个甘油酯保持显著正相关性，包括16个至少含有一个不饱和脂肪酸的DAGs及26个TAGs；另外还有一种奇数链TAG(51:4)与2型糖尿病风险显著负相关。此外，我们观察到，低碳原子数(C46-C53)和低双键数目(n[C＝C]＝0-3)的TAGs普遍与糖尿病风险升高的关联性较强(表4)。当进一步校正了HbA1c和HOMA-IR后，甘油酯与糖尿病之间的关联性减弱，但依然有2个DAGs(16:1/20:4,18:2/20:5)和7个TAGs(46:1,48:0,48:1,50:0,50:1,50:2,52:2)与2型糖尿病显著正相关(图5，b)。值得注意的是，当额外校正了FLI后，甘油酯与糖尿病的关联性消失(表4)；并且当在年龄、性别、地区和城乡后直接进一步矫正FLI时，甘油酯与糖尿病的关联性依旧消失(图5，c)，提示肝脏脂肪累积可能解释了甘油酯和2型糖尿病之间的关系。

Claims (10)

1.一种或多种甘油酯和/或其检测试剂在制备用于预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝的试剂或试剂盒中的用途，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合，
优选地，所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数；所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5；
优选地，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数大于或等于40；所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述甘油二酯选自以下一种或多种：DAG(14:0/18:2)、DAG(16:0/18:1)、DAG(16:0/18:2)、DAG(16:1/18:2)、DAG(16:0/18:3)、DAG(16:1/18:3)、DAG(18:0/18:1)、DAG(18:1/18:1)、DAG(18:0/18:2)、DAG(18:1/18:2)、DAG(16:0/20:3)、DAG(16:0/20:4)、DAG(18:2/18:3)、DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:3)、DAG(18:1/20:4)、DAG(16:0/22:5)、DAG(18:2/20:4)、DAG(18:1/20:5)、DAG(16:0/22:6)、DAG(18:2/20:5)、DAG(18:1/22:5)、DAG(18:2/22:5)、DAG(18:1/22:6)、DAG(18:2/22:6)；优选地，所述甘油二酯选自以下的一种或多种：DAG(16:0/18:1)、DAG(16:1/18:2)、DAG(16:0/18:3)、DAG(18:0/18:1)、DAG(18:1/18:1)、DAG(16:0/20:3)、DAG(16:0/20:4)、DAG(16:1/20:4)、DAG(18:2/20:3)、DAG(18:1/20:4)、DAG(16:0/22:5)、DAG(18:2/20:4)、DAG(18:1/20:5)、DAG(16:0/22:6)、DAG(18:2/20:5)、DAG(18:1/22:6)；更优选地，所述甘油二酯是DAG(16:1/20:4)和/或DAG(18:2/20:5)，和/或
所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(44:3)、TAG(46:0)、TAG(46:1)、TAG(46:2)、TAG(46:3)、TAG(47:2)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(48:2)、TAG(48:3)、TAG(48:4)、TAG(48:5)、TAG(49:1)、TAG(49:2)、TAG(49:3)、TAG(50:0)、TAG(50:1)、TAG(50:2)、TAG(50:3)、TAG(50:4)、TAG(50:5)、TAG(50:6)、TAG(51:1)、TAG(51:2)、TAG(51:3)、TAG(51:4)、TAG(52:0)、TAG(52:1)、TAG(52:2)、TAG(52:3)、TAG(52:4)、TAG(52:5)、TAG(52:6)、TAG(52:7)、TAG(52:8)、TAG(53:0)、TAG(53:1)、TAG(53:2)、TAG(53:3)、TAG(53:5)、TAG(53:6)、TAG(54:1)、TAG(54:2)、TAG(54:3)、TAG(54:4)、TAG(54:5)、TAG(54:6)、TAG(54:7)、TAG(54:8)、TAG(55:1)、TAG(55:2)、TAG(55:3)、TAG(55:5)、TAG(55:7)、TAG(56:1)、TAG(56:2)、TAG(56:4)、TAG(56:5)、TAG(56:6)、TAG(56:7)、TAG(56:8)、TAG(56:9)、TAG(56:10)、TAG(57:2)、TAG(57:3)、TAG(58:5)、TAG(58:6)、TAG(58:7)、TAG(58:8)、TAG(58:9)、TAG(58:10)、TAG(60:10)、TAG(60:11)、TAG(60:12)；优选地，所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(54:5)、TAG(48:3)、TAG(50:5)、TAG(52:4)、TAG(53:6)、TAG(55:2)、TAG(52:5)、TAG(58:10)、TAG(55:7)、TAG(58:9)、TAG(57:2)、TAG(52:8)、TAG(46:2)、TAG(47:2)、TAG(51:4)、TAG(54:4)、TAG(54:2)、TAG(60:12)、TAG(49:2)、TAG(51:2)、TAG(56:5)、TAG(53:1)、TAG(54:1)、TAG(56:9)、TAG(50:6)、TAG(58:8)、TAG(53:5)、TAG(50:3)、TAG(52:1)、TAG(52:7)、TAG(58:7)、TAG(52:3)、TAG(56:7)、TAG(56:8)、TAG(48:2)、TAG(56:6)、TAG(58:6)、TAG(55:1)、TAG(53:0)、TAG(60:11)、TAG(49:1)、TAG(51:1)、TAG(52:0)、TAG(52:2)、TAG(46:0)、TAG(46:1)、TAG(50:2)、TAG(60:10)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)；更优选地，所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(50:6)、TAG(58:7)、TAG(50:3)、TAG(53:5)、TAG(52:7)、TAG(56:8)、TAG(52:3)、TAG(51:4)、TAG(56:7)、TAG(48:2)、TAG(56:6)、TAG(58:6)、TAG(55:1)、TAG(53:0)、TAG(60:11)、TAG(52:0)、TAG(46:0)、TAG(60:10)、TAG(49:1)、TAG(46:1)、TAG(51:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)，或所述甘油三酯选自以下一种或多种：TAG(46:1)、TAG(52:2)、TAG(50:2)、TAG(50:0)、TAG(48:0)、TAG(48:1)、TAG(50:1)。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，
所述检测针对的样品选自血液样品、血浆样品、或血清样品，和/或
所述检测包括辅助检测和/或早期检测，和/或
所述试剂是选自以下一种或多种方法检测甘油酯所用的试剂：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，
所述2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险是6年内患2型糖尿病和/或脂肪肝的风险，和/或
所述肝脏脂肪累积水平由肝脏脂肪指数(FLI)或其变化指示，其中，FLI≥30则指示肝脏脂肪累积水平高，FLI≥60则指示脂肪肝。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述检测是将来自对象的样品的甘油酯含量(A1)与正常人群的相应甘油酯含量(A0)相比较，若A1显著高于A0，则说明对象的2型糖尿病和/或脂肪肝的发病风险较高、肝脏脂肪累积水平高，
优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.1，优选为A1/A0≥1.3，更优选为A1/A0≥1.5。
6.一种用于预测2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝的试剂或试剂盒，包括：
(1)用于检测样品中一种或多种甘油酯含量的试剂，其中所述样品选自血液样品、血浆样品、或血清样品；
(2)任选的甘油酯标准品，
其中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，
所述甘油二酯的酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数；所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5，
所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数大于或等于40；所述甘油三酯的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2，
所述样品选自血液样品、血浆样品和血清样品，和/或
所述试剂是选自以下一种或多种方法检测鞘脂所用的试剂：液相色谱-质谱法、流动注射技术-质谱法、鸟枪法、核磁共振法。
8.检测肝脏脂肪指数(FLI)的工具在制备预测2型糖尿病发病风险或诊断2型糖尿病中的试剂盒中的用途，所述肝脏脂肪指数或其变化指示2型糖尿病发病风险，其中，
(1)将来自测试对象的基线肝脏脂肪指数B1与正常人群的相应肝脏脂肪指数B0相比较，若B1显著高于B0，则对象2型糖尿病的发病风险较高；较佳地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.4，较佳地A1/A0≥1.7，更佳地A1/A0≥2；
(2)若所述基线肝脏脂肪指数(FLI)大于等于约36，则对象2型糖尿病的发病风险较高，
(3)若肝脏脂肪指数增加值大于等于约7，则对象2型糖尿病的发病风险较高。
9.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述存储介质上存储有计算机程序，当所述计算机程序被处理器执行时，实现下述步骤：
(1)检测对象的样品中一种或多种甘油酯的含量，和
(2)根据所测甘油酯的含量确定2型糖尿病和/或脂肪肝发病风险、鉴定肝脏脂肪累积水平、诊断2型糖尿病和/或脂肪肝，
其中，所述甘油酯选自甘油二酯DAG、甘油三酯TAG、或其组合，
优选地，所述甘油二酯的酰基脂肪酸残基的碳原子数是大于或等于14的偶数；所述甘油二酯的各酰基脂肪酸残基的不饱和度各自独立为0-6，优选为1-5，
优选地，所述甘油三酯的三个酰基脂肪酸残基的总碳原子数大于或等于40；所述甘油三酯的总不饱和度为0-12，优选为0-11，更优选为0-2。
10.一种或多种甘油酯的抑制剂在制备用于预防或治疗2型糖尿病和/或脂肪肝、防止或减缓肝脏脂肪累积的药物中的应用，
优选地，所述抑制剂选自氯苯丁酯、烟酸。
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