CN117233367B

CN117233367B - 妊娠期高血压风险评估的代谢标志物

Info

Publication number: CN117233367B
Application number: CN202311524383.8A
Authority: CN
Inventors: 李琰; 刘丽; 文赫; 崔惠娜; 于书棋; 王娇娇; 胡隽源
Original assignee: Metanotitia Inc
Current assignee: Metanotitia Inc
Priority date: 2023-11-16
Filing date: 2023-11-16
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2043-11-16
Also published as: CN117233367A

Abstract

本发明提供了妊娠期高血压风险评估的代谢标志物。本发明基于代谢组学方法，对妊娠期高血压患者样本的质谱分析，筛选获得了与妊娠期高血压风险评估相关的代谢标志物，筛选的标志物包括：磷脂酰肌醇38:5，甘油三酯58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺38:4，甘油三酯56:6，神经酰胺d40:0，鞘磷脂d36:5，神经酰胺d41:1，磷脂酰肌醇34:1，甘油三酯52:6，磷脂酰乙醇胺38:7e。所述代谢标志物，在ROC多变量分析中AUC值达到0.977，从其中选择4种或7种代谢标志物也具有较好的诊断效果，在妊娠期高血压患者疾病诊断模型中具有高度的特异性，可作为妊娠期高血压疾病风险评估的代谢标志物应用。

Description

妊娠期高血压风险评估的代谢标志物

技术领域

本发明涉及代谢标志物分析及检测领域，具体涉及妊娠期高血压风险评估的代谢标志物及其应用。

背景技术

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders pregnancy，HDP)是妊娠与血压升高并存的一组妊娠期代谢性疾病，通常指产妇在妊娠20周后出现高血压、蛋白尿、水肿等显著症状，是导致孕产妇和新生儿死亡的重要原因之一。据相关研究表明，我国妊娠期高血压疾病发病率约为5%~12%，国外妊娠高血压疾病发病率约为10%~12%。近年来，随着计划生育“二胎”政策的实施，我国孕妇年龄显著升高，妊娠期高血压患病率呈现逐年升高趋势。美国妇产科医师学会将妊娠期高血压疾病分为4类，包括妊娠期高血压、子痫前期/子痫、妊娠合并慢性高血压、慢性高血压伴发子痫前期。其中，子痫前期/子痫是引起胎儿早产死亡率升高最主要的原因之一，全球每年约有7万多名孕妇和50多万胎儿死于子痫前期/子痫疾病。

妊娠期高血压疾病作为一种全身性多系统疾病，其发病背景复杂，尤其是子痫前期/子痫发病存在多因素发病异源性、多发病机制和多通路致病的异质性。妊娠期高血压发病机制到目前未有确切的病因，但已确定其发生相关的风险因素，包括高龄怀孕、肥胖、高血压家族史、多胎妊娠和早前的高血压。近年来，基于现有国内外专家学者们的病理生理学研究，表明妊娠期高血压疾病发生机制涉及以下4个方面：(1)免疫学说；妊娠期高血压是一种半同种移植现象，其与母体的免疫耐受性密切相关。若其耐受性异常，则可能会出现妊娠期高血压。(2)胎盘或滋养细胞缺血学说；妊娠过程中可能出现子宫螺旋形小动脉生理重铸不足，导致胎盘或滋养细胞缺血，从而引起血压升高以及其他生理异常现象。(3)氧化应激学说；妊娠期间孕妇胎盘出现缺血/再灌注会诱发氧化应激反应的发生，该效应会释放多种蛋白酶，并产生大量氧化中间产物，进而导致细胞损伤。(4)遗传学说；妊娠期高血压存在家族遗传倾向，其表现为母系遗传。相关研究报道，该病一级亲属和二级亲属的发病率远高于无家族遗传史的孕妇，表明妊娠期高血压具有较高的遗传性。患有妊高症的孕妇易发生心血管疾病和肾病，如果未得到及时治疗，孕妇可能会患上终身慢性高血压，并且会造成新生儿缺陷。

目前，妊娠期高血压疾病的诊断主要依靠临床症状和实验室检测指标。然而，这些方法存在一定的局限性，无法对早期妊娠进行准确诊断。为提高妊娠期高血压疾病风险的评估，特异性生物标志物在疾病早期诊断中发挥着重要的作用。因此，在临床研究中急需建立一组高特异性和高灵敏度的生物标志物用于妊娠期高血压疾病的早期诊断。

代谢组学是继基因组学、蛋白质组学后发展起来的一门学科，通过对生物体内特定的小分子代谢物进行定性和定量分析，研究代谢产物与疾病生理、病理变化之间的相互关系，可为代谢性疾病的发病机制提供直接证据。代谢物是基因、蛋白质的下游产物，反映机体当前的生理状态。与基因组学和蛋白质组学相比，代谢组学在妊娠期高血压疾病早期诊断、分型鉴别和发病机制方面的研究价值更高。因此，基于代谢组学技术研究妊娠期高血压患者体内的差异代谢物，从中发现一组灵敏度高、特异性强的生物标志物成为当前研究的热点，可为实际临床转化研究提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的缺陷与不足，本发明目的在于找出妊娠期高血压风险评估的代谢标志物，旨在解决目前缺少妊娠期高血压疾病风险评估代谢标志物的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明公开了妊娠期高血压风险评估的代谢标志物，所述代谢标志物包括：磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5。

优选的，所述代谢标志物包括：磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5，甘油三酯 56:6，神经酰胺d40:0，甘油三酯 52:6。

本发明公开了妊娠期高血压风险评估的代谢标志物，所述代谢标志物包括：磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，甘油三酯 56:6，神经酰胺 d40:0，鞘磷脂 d36:5，神经酰胺 d41:1，磷脂酰肌醇 34:1，甘油三酯 52:6，磷脂酰乙醇胺38:7e。

本发明公开了所述代谢标志物在制备评估妊娠期高血压风险的试剂中的用途。

优选的，所述评估过程中采用的样本选自血清、血浆或血液。

本发明公开了所述的代谢标志物在制备评估妊娠期高血压风险的试剂盒中的用途。

本发明公开了一种评估妊娠期高血压风险的试剂盒，所述试剂盒包括任一所述的代谢标志物。

优选的，所述试剂盒还包括质控品和标准品。

妊娠期高血压属于一种代谢性疾病，血液中脂质成分与代谢性疾病之间存在密切的联系。目前，关于仅对妊娠期高血压患者血液中脂质成分进行研究相关的报道较少，通过对疾病患者血浆样本中脂质成分进行检测分析，研究疾病与非疾病患者之间代谢差异，筛选出一组特异性代谢物，可作为妊娠期高血压疾病风险评估的代谢标志物。

附图说明

图1.基于10个代谢标志物的妊娠期高血压疾病诊断模型ROC分析结果，AUC值为0.977。

图2.基于7个代谢标志物的妊娠期高血压疾病诊断模型ROC分析结果，AUC值为0.963。

图3.基于4个代谢标志物的妊娠期高血压疾病诊断模型ROC分析结果，AUC值为0.947。

图4.基于10个代谢标志物的非妊娠期高血压疾病诊断模型ROC分析结果，AUC值为0.590。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1 检测对象及样品信息

1.检测对象：所有受试者在接受研究前均获得书面知情同意。

健康对照组（HC）：平均年龄在32.45岁的未孕健康女性；

非妊娠期高血压（NHDP）：平均年龄在32.33岁的健康孕妇；

妊娠期高血压（HDP）：平均年龄在31.75岁的妊娠期高血压患者；

妊娠期高血压患者均通过随访至分娩后12周的血压检测数据和临床医生诊断后入组的。具体指标是妊娠20周后首次出现高血压，收缩压≧140mm Hg和/或舒张压≧90mmHg,在产后12周内回复正常。

排除标准：受试者符合下列任意一项，就从项目中排除出去

①多胎妊娠；

②已知的严重胎儿畸形；

③合并有已知的严重系统性疾病，如心脏疾病、肝脏及肾脏疾病等；

④合并妊娠期糖尿病；

2.样本信息：如下表1。

表1：健康与妊娠期高血压疾病样本信息

	人数
		健康对照组（HC）	37
妊娠期高血压（HDP）	19
		非妊娠期高血压（NHDP）	9
总计	65

实施例2代谢标志物的筛选

试剂：质谱级别纯度的甲醇、乙腈、水、乙酸、异丙醇，色谱级别纯度(HPLC)的甲酸、乙酸和甲基叔丁基醚均购于美国Sigma-Aldrich公司。

（1）样品制备：取100μL的血浆，置于预冷（甲基叔丁基醚:甲醇，体积比3:1）溶液1000μL，涡旋混匀提取的血液样品，获得的样品提取液；向样品提取液中加入（甲醇:水，体积比3:1）溶液500μL，超声、静置，涡旋并离心分层；样品分层后，取上层500μL至离心管中，经干燥后，加入（乙腈:异丙醇，体积比3:1）200μL，并在室温下孵化15分钟；孵化后，将离心管涡旋混匀，超声辅助处理5分钟，再将离心管在室温下离心5分钟（12000 rpm）；从离心管中取180µl上清液至2 mL玻璃进样小瓶中，上机（LC-MS）检测；

（2）小分子代谢物检测：

- 有机相使用Waters ACQUTTY UPLC ® BEH C8 1.7µm 2.1*100mm column柱子进行小分子分离；

- 液相色谱和质谱仪使用ACQUITY UPLC I-Class液相色谱系统（沃特世）和Q-Exactive质谱系统（赛默飞世尔科技）；

- 流动相参数如下：

流动相A 为含0.1%乙酸和0.1%乙酸铵的水溶液；流动相B 为含0.1%乙酸和1%乙酸铵的乙腈-异丙醇（7:3 v/v）溶液，分离洗脱梯度如下：0-12 分钟为55%-89%流动相B，12-19.5 分钟为100%流动相B；

- 质谱参数如下：

质谱数据以Full MS和Full MS/dd-MS2的方式（各含正负两种模式）进行采集，QExactive 所用参数如下：Full MS模式分辨率为7 万，扫描范围为100-1500m/z， AGC 为3E+6，Maximum IT为200 毫秒；Full MS/dd-MS2模式中，二级质谱的分辨率为1.75 万，四极杆窗口为1.5m/z，AGC 为1E+5，离子最大注入时间为50 ms，HCD 相对碰撞能量为30eV；

（3）代谢组学数据处理：首先从所有质谱数据中提取检测峰，然后应用基线校正去除噪音，保留原始信号峰值；原始数据转换为中心离散数据；然后，在单个样品中的峰值与色谱中的保留时间比对，进行匹配；数据集，进一步去除同位素峰后，得到最终的质谱矩阵数据；为了减小样品间代谢物浓度的差异，使数据分布更加对称，利用NormalizationAutoencoder (NormAE)进行均一化处理；

（4）代谢产物的鉴定：利用人类代谢物数据库(HMDB；www.hmdb.ca)、代谢组学数据库(Metlin；https://metlin.scripps.edu)、质谱数据库(http://www.massbank.jp/)，脂质数据库(https://www.lipidmaps.org/ )等公共数据库，以及标准品在同款色谱柱下分离时的保留时间、一级、二级质谱信息进行代谢物定性；保留时间在0.1min差异内，以及质荷比小于10ppm的条件下，均鉴定为与数据库同等代谢物；

（5）代谢组学数据分析：第一步，首先，筛选出健康对照组（HC）和妊娠期高血压疾病（HDP）组之间显著差异物；其次，筛选出健康对照组（HC）和非妊娠期高血压疾病（NHDP）组之间非显著差异代谢物；取上述两组代谢物交集，用于构建妊娠期高血压疾病诊断模型；第二步，为了验证，我们所筛选出的这些代谢标志物的诊断效果，利用上述交集代谢标志物在妊娠期高血压疾病诊断模型中，进行多变量ROC曲线分析；第三步，为了进一步验证交集代谢标志物，在妊娠期高血压疾病诊断模型上的特异性，在非妊娠期高血压疾病患者模型上，进行了多变量ROC曲线分析作了比较；

（6）结果分析：通过与数据库和标准品进行匹配，我们成功鉴定出了总计225个脂质代谢物。为从这225个脂质中，筛选出能够有效区分HC与HDP之间的重要脂质成分；首先，利用P-value＜0.05，筛选出HC vs HDP组之间显著差异代谢物；其次，利用P-value＞0.05，筛选出HC vs NHDP组之间非显著差异物，将两组筛选出的变量取交集，共有10个代谢标志物（表2），用于构建妊娠期高血压疾病的诊断模型。该筛选方法优点在于，从HC vs HDP组之间筛选出显著差异代谢物，剔除了HC vs NHDP组之间显著差异代谢物，进而保留了HC vsHDP组之间特异性代谢差异物。

表2：妊娠期高血压疾病诊断10个代谢标志物

	代谢标志物-英文	代谢标志物-中文
			1	PI 38:5	磷脂酰肌醇 38:5
2	TAG 58:8	甘油三酯 58:8
			3	dMePE 38:4	二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4
4	TAG 56:6	甘油三酯 56:6
			5	Cer d40:0	神经酰胺 d40:0
6	SM d36:5	鞘磷脂 d36:5
			7	Cer d41:1	神经酰胺 d41:1
8	PI 34:1	磷脂酰肌醇 34:1
			9	TAG 52:6	甘油三酯 52:6
10	PE 38:7e	磷脂酰乙醇胺38:7e

实施例3代谢标志物在测试集中的验证

为了验证，我们所筛选出的这些代谢标志物的诊断效果，利用上述交集代谢标志物在妊娠期高血压疾病诊断模型中，进行多变量ROC曲线分析；随机将妊娠期高血压疾病组及健康对照组样本数据的3/4作为训练集(training)，1/4作为测试集(test)。其中，训练集用于构建和训练机器学习分类模型，剩下的样本作为测试集用于验证训练后模型的判别能力，并使用SVM随机循环迭戈1000次，通过统计最终模型准确度的平均值的方法，构建了疾病风险评估模型，具体操作为：样本按照3/4(训练), 1/4(测试），随机分类；然后，在其中一种分类的状况下，用3/4的训练集结合机器学习，构建模型，再把剩余的1/4测试集，作为未知样本，放入上述训练集构建的模型，进行盲测，得出特异性和灵敏度值。结果发现ROC多变量分析中AUC值为0.977（特异性：1.0，灵敏度：0.919）（图1）。为了进一步观察不同数量的代谢标志物组合模型在妊娠期高血压疾病诊断上的性能。我们对这10个代谢标志物，选择其中7种和4种代谢标志物进行组合（表3-表4），再进行多变量ROC曲线分析。结果显示，7种和4种代谢标志物组合的测试集ROC结果分别是，AUC = 0.963 和AUC = 0.947（图2-图3）。表明我们所筛选出的10个代谢物组合诊断效果是最佳的，如果减少代谢标志物的组合数量，模型整体诊断性能会有所下降，但已经能够满足健康对照组和妊娠期高血压疾病之间的高效分类。

表3：妊娠期高血压疾病诊断7个代谢标志物组合

	代谢标志物-英文	代谢标志物-中文
			1	dMePE 38:4	二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4
2	TAG 58:8	甘油三酯 58:8
			3	SM d36:5	鞘磷脂 d36:5
4	PI 38:5	磷脂酰肌醇 38:5
			5	TAG 52:6	甘油三酯 52:6
6	Cer d40:0	神经酰胺 d40:0
			7	TAG 56:6	甘油三酯 56:6

表4：妊娠期高血压疾病诊断4个代谢标志物组合

	代谢标志物-英文	代谢标志物-中文
			1	dMePE 38:4	二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4
2	TAG 58:8	甘油三酯 58:8
			3	SM d36:5	鞘磷脂 d36:5
4	PI 38:5	磷脂酰肌醇 38:5

实施例4代谢标志物在不同检测样本中的特异性分析

为了进一步验证交集代谢标志物，在妊娠期高血压疾病诊断模型上的特异性，在非妊娠期高血压疾病患者模型上，进行了多变量ROC曲线分析。结果显示，AUC值为0.59（特异性：0.667，灵敏度：0.676）（图4），说明我们所筛选出的交集代谢标志物在妊娠期高血压疾病诊断中具有较高的准确性和区分能力，不适用于非妊娠期高血压疾病患者的诊断，表明了这10个代谢标志物在诊断妊娠期高血压疾病上具有较高的特异性。

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.代谢标志物组合在制备评估妊娠期高血压风险的试剂中的用途，所述代谢标志物组合为：磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4和鞘磷脂 d36:5；或磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5，甘油三酯 56:6，神经酰胺 d40:0和甘油三酯 52:6；或磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5，甘油三酯 56:6，神经酰胺 d40:0，甘油三酯 52:6，神经酰胺d41: 1，磷脂酰肌醇 34:1和磷脂酰乙醇胺38:7e。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，评估过程中采用的样本选自血清、血浆，血液或干血片。

3.代谢标志物组合在制备评估妊娠期高血压风险的试剂盒中的用途，所述代谢标志物组合为：磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4和鞘磷脂 d36:5；或磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5，甘油三酯56:6，神经酰胺 d40:0和甘油三酯 52:6；或磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5，甘油三酯 56:6，神经酰胺 d40:0，甘油三酯 52:6，神经酰胺 d41: 1，磷脂酰肌醇 34:1和磷脂酰乙醇胺38:7e。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，评估过程中采用的样本选自血清、血浆，血液或干血片。

5.一种评估妊娠期高血压风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括质控品和标准品，所述质控品为：磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4和鞘磷脂d36:5；或磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5，甘油三酯 56:6，神经酰胺 d40:0和甘油三酯 52:6；或磷脂酰肌醇 38:5，甘油三酯 58:8，二甲基磷脂酰乙醇胺 38:4，鞘磷脂 d36:5，甘油三酯 56:6，神经酰胺 d40:0，甘油三酯 52:6，神经酰胺 d41: 1，磷脂酰肌醇 34:1和磷脂酰乙醇胺38:7e。