CN116396751B - 对pH和GSSG双响应的荧光探针、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对pH和GSSG双响应的荧光探针、其制备方法及应用，其制备方法包括以下步骤：S1、将4‑溴邻苯二胺溶解于无水乙醇中，超声，得到混合溶液；S2、加入盐酸，得到前驱液；S3、加入反应釜中，加热下反应，反应结束后冷却至室温，得到R‑CDs溶液；S4、通过柱层析进行纯化，洗脱液洗脱，旋转干燥，得到荧光探针。该荧光探针可用于体外环境或细胞内的pH检测，或者用于GSSG浓度的检测。本发明提供了一种可以在体外、细胞内及生物体水平上进行pH值检测的新型纳米荧光探针，且该探针可在体外检测GSSG含量，其还具有细胞毒性低、水溶性好、光学性能优异、生物成像能力良好等优点。

Description

对pH和GSSG双响应的荧光探针、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种对pH和GSSG双响应的荧光探针、其制备方法及应用。

背景技术

pH在食品、环境、医药等各个领域中均有重要生理意义。pH值与果蔬、肉类的新鲜程度有强相关性，pH可作为食品质量和新鲜程度的一项参考指标。环境中水质、土壤pH的变化可作为衡量环境污染程度的重要参考依据。细胞内pH是细胞生理功能和酶活性的一项重要因素。机体中肿瘤微环境与正常组织相比，常表现出如pH降低、谷胱甘肽等物质增加等生理特性的改变。GSSG是还原型谷胱甘肽(GSH)经氧化后形成的二聚体化合物，含有活性基团巯基(-SH)，可通过谷胱甘肽还原酶与GSH相互转化氧化型谷胱甘肽(GSSG)对维持人体免疫系统的正常运作有重要作用，是生物体内的一种氧化应激指标，并有抗肿瘤、抗氧化等生理功能。

近年来，直观快捷检测环境中pH的方法包括pH试纸、pH计等，已有研究报道，借助pH敏感的荧光探针可实现高灵敏度、高空间分辨率、快速地监控或细胞内的pH变化。检测GSSG的方法有试剂盒法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)和荧光分光光度法等检测方法，但与荧光分光光度法相比，其他检测方法存在分析成本较高、分析时间较长等缺点。已有研究报道pH/GSSG双响应的荧光探针，用于荧光成像，实现肿瘤的可视化追踪。因此，开发一种具有红色发射的荧光探针用来检测细胞内pH和GSSG的具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种对pH和GSSG双响应的荧光探针、其制备方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种对pH和GSSG双响应的荧光探针，其制备方法包括以下步骤：

S1、将4-溴邻苯二胺溶解于无水乙醇中，超声，得到混合溶液；

S2、在所述混合溶液中加入盐酸，得到前驱液；

S3、将所述前驱液加入反应釜中，加热下反应，反应结束后冷却至室温，得到R-CDs溶液；

S4、通过柱层析对R-CDs溶液进行纯化，采用洗脱液洗脱，所得溶液旋转干燥，得到R-CDs粉末，即所述荧光探针。

优选的是，所述步骤S4中的洗脱液由二氯甲烷和甲醇按体积比10：1混合得到。

优选的是，所述的对pH和GSSG双响应的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

S1、将4-溴邻苯二胺溶解于无水乙醇中，超声，得到混合溶液；

S2、在所述混合溶液中加入盐酸，得到前驱液；

S3、将所述前驱液加入特氟龙为内衬的不锈钢高压反应釜中，180℃下反应8h，反应结束后冷却至室温，得到R-CDs溶液；

S4、通过柱层析对R-CDs溶液进行纯化，采用洗脱液洗脱，所得溶液旋转干燥，得到R-CDs粉末，即所述荧光探针。

优选的是，所述的对pH和GSSG双响应的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

S1、将2mM的4-溴邻苯二胺溶解于20ml无水乙醇中，超声，得到混合溶液；

S2、在所述混合溶液中加入10ml质量分数为5％的盐酸，得到前驱液；

S3、将所述前驱液加入100ml的特氟龙为内衬的不锈钢高压反应釜中，180℃下反应8h，反应结束后冷却至室温，得到R-CDs溶液；

S4、通过柱层析对R-CDs溶液进行纯化，采用洗脱液洗脱，所得溶液旋转干燥，得到R-CDs粉末，即所述荧光探针。

本发明还提供一种如上所述的荧光探针的应用，其用于体外环境或细胞内的pH检测，或者用于GSSG浓度的检测。

优选的是，所述的荧光探针的应用，其用于体外环境pH检测的方法为：

1)制备一系列不同pH的缓冲溶液，作为pH标准溶液；

2)利用pH标准溶液与荧光探针构建用于检测体外环境pH的标准曲线f1，该标准曲线能表征体系的pH值与荧光强度的关系；

3)对待测样品1进行体外环境的pH值检测：将待测样品1加入由荧光探针制备的已知浓度的荧光探针溶液中，检测所得混合液在580nm激发下662nm位置处的荧光强度，然后对照标准曲线f1，计算待测样品1的pH值。

优选的是，所述标准曲线f1通过以下方法构建得到：

将荧光探针加入去离子水中，制备成已知浓度的荧光探针溶液，均分为若干份；

配制pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的一系列缓冲溶液，作为pH标准溶液，向每份pH标准溶液中加入1份荧光探针溶液，混合均匀后在580nm激发条件下，测试每份溶液在662nm处的荧光强度；

最后，将测得的荧光强度作为y轴，对应的pH值作为x轴，拟合得到标准曲线f1。

优选的是，所述的荧光探针的应用，其用于细胞内的pH检测的方法为：

1)构建用于检测细胞内pH值的标准曲线f2，该标准曲线能表征体系的细胞内的pH值与荧光强度的关系；

2)对待测细胞样品2进行细胞内的pH检测：

2-1)将已知浓度的荧光探针溶液与待测细胞样品2加入培养基共孵育，移除培养液，用PBS溶液洗涤待测细胞；

2-2)将含尼日利亚菌素的含钾缓冲溶液加入培养基，与待测细胞共孵育，使得待测细胞样品2内外达到pH平衡，移除培养液，用PBS溶液洗涤待测细胞，用多聚甲醛固定待测细胞，然后检测待测细胞在580nm激发下662nm位置处的荧光强度，最后对照标准曲线f2，计算待测细胞样品2的细胞内pH值。

优选的是，所述标准曲线f2通过以下方法构建得到：

1-1)将荧光探针加入去离子水中，制备成已知浓度的荧光探针溶液，然后将荧光探针溶液与Hela细胞加入培养基共孵育，移除培养液，用PBS溶液洗涤Hela细胞；

1-2)将含尼日利亚菌素的含钾缓冲溶液加入培养基，与Hela细胞共孵育，使得Hela细胞内外达到pH平衡，移除培养液，用PBS溶液洗涤Hela细胞；

1-3)将不同pH值的缓冲液加入培养基中与Hela细胞共孵育，移除培养基，用PBS溶液洗涤Hela细胞，用多聚甲醛固定Hela细胞，然后检测Hela细胞在580nm激发下662nm位置处的荧光强度；

1-4)将测得的荧光强度作为y轴，对应的pH值作为x轴，拟合得到标准曲线f2。

优选的是，所述的荧光探针的应用，其用于GSSG浓度检测的方法为：

1)制备一系列含不同浓度GSSG的GSSG标准溶液；

2)利用GSSG标准溶液与荧光探针构建用于检测GSSG浓度的标准曲线f3，该标准曲线能表征体系中加入的GSSG的浓度与体系的荧光强度的变化量之间的关系：

利用荧光探针制备成已知浓度的荧光探针溶液，在580nm激发条件下，测试每份混合液在662nm处的荧光强度F₀，然后均分为若干份，按一定的浓度梯度分别加入相同体积、不同浓度的GSSG标准溶液，得到混合液；然后在580nm激发条件下，测试每份混合液在662nm处的荧光强度F；最后，将F/F₀-1的值作为y轴，对应的GSSG浓度作为x轴，拟合得到标准曲线f3；

3)对待测样品3进行GSSG浓度检测：将待测样品3加入由荧光探针制备的已知浓度的荧光探针溶液中，检测得到的混合液在580nm激发下662nm位置处的荧光强度，然后对照标准曲线f3，计算待测样品3中GSSG的浓度。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种可以在体外、细胞内及生物体水平上进行pH值检测的新型纳米荧光探针，且该探针可在体外检测GSSG含量；本发明提供的荧光探针是一种具有pH/GSSG双响应的红色荧光发射碳点，通过碳点表面基团的质子化与非质子化，引起碳点在不同pH缓冲液中电位的正负变化，表现为碳点荧光强度随pH的减小而增大，且能有效在细胞内及斑马鱼幼体内实现pH传感；且该荧光探针具有细胞毒性低、水溶性好、光学性能优异、生物成像能力良好等优点。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光探针的荧光光谱；

图2为荧光探针的吸收光谱；

图3为荧光探针在不同pH的缓冲溶液中(2.0-8.0)的荧光发射光谱；

图4为荧光探针的荧光强度与pH的幂函数相关性；

图5为荧光探针在pH 2.0和pH 8.0的可逆性研究结果；

图6为荧光探针对不同浓度GSSG的响应；

图7为荧光强度与GSSG浓度的线性关系；

图8为荧光探针在不同pH环境中对Hela细胞的荧光成像结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种对pH和GSSG双响应的荧光探针，其制备方法包括以下步骤：

S1、将2mM的4-溴邻苯二胺溶解于20ml无水乙醇中，超声后得到清澈的混合溶液；

S2、在混合溶液中加入10ml质量分数为5％的盐酸，得到前驱液；

S3、将前驱液加入100ml的特氟龙为内衬的不锈钢高压反应釜中，180℃下反应8h，反应结束后冷却至室温，得到深绿色的R-CDs溶液；

S4、通过柱层析对R-CDs溶液进行分离纯化，采用洗脱液(二氯甲烷和甲醇按体积比10：1混合得到)洗脱，所得鲜红色溶液用旋转蒸发器干燥，得到红色R-CDs碳点粉末，即荧光探针。在4℃的黑暗环境下保存，备用。

参照图1，为实施例1制备的荧光探针(碳点)的荧光光谱，如图所示，碳点在662nm处有最强发射光，最大激发波长为580nm。

图2为荧光探针的吸收光谱，插图显示了在日光和蓝光下的R-CDs，表明R-CDs发出了明亮的红色荧光。如图所示，202nm处的强吸收带归因于C-NH键的n-π*跃迁，在287nm处的强吸收峰归因于π-π*跃迁。C-N键和C-O键的n-π*跃迁对应于500～650nm处的吸收峰。

图3为荧光探针在不同pH的缓冲溶液中(2.0-8.0)的荧光发射光谱，可以看出，当pH从8.0减小至2.0，R-CDs的发射峰位置没有明显变化，荧光强度逐渐升高。

图4为荧光探针的荧光强度与pH的幂函数相关性，可以看出，pH在2.0～6.0内具有幂函数相关性(y＝3825.6655x^-1.0113，R²＝0.9923)；

图5为荧光探针在pH 2.0和pH 8.0的可逆性研究结果，通过2mol/l HCl溶液和2mol/l NaOH溶液在pH＝2.0和pH＝8.0之间反复调节5次溶液的pH，荧光强度仍能恢复至起始强度，说明该碳点对pH的响应有良好的可逆性。因此，该碳点可作为一种用于pH鉴定的新型荧光纳米探针。

图6为荧光探针对不同浓度GSSG的响应，在碳点溶液中加入不同浓度的GSSG溶液，随着GSSG浓度的增加，碳点的荧光强度逐渐增强。

图7为荧光强度与GSSG浓度的线性关系，可以看出在8～200μM呈现出良好的线性关系，符合线性方程y＝-0.0151x+0.0038，检出限为4.57μM，相关系数R²达到0.9908，说明碳点可应用于溶液中GSSG浓度的检测。其中，F表示混合溶液的荧光强度，F₀表示空白碳点溶液的荧光强度。

图8为荧光探针在不同pH环境中对Hela细胞的荧光成像结果，其中，图8a是R-CDs(25μg/ml)在不同pH(2.0～8.0)的1640完全培养基中孵育Hela细胞的激光共聚焦显微镜荧光图像，图8b是细胞荧光定量分析结果，图8c是通过pH成像的平均荧光强度构建的细胞内pH校准曲线。

可以看出，随着培养基的pH从8.0减小到2.0，R-CDs在Hela细胞中的荧光强度显著增强，且从pH＝7.0减小至pH＝2.0，R-CDs的荧光强度增大300％，而从pH＝7.0增大至pH＝8.0，R-CDs的荧光强度减少75％，说明R-CDs在或细胞内有良好的pH响应性。且pH在2.0～6.0范围内具有良好的线性关系，符合线性方程为y＝235.9989x-27.6693，相关系数R²＝0.9912。通过计算得到细胞中R-CDs的pKa为6.0±0.78，与溶液中R-CDs的pKa一致，故能良好靶向溶酶体。结果表明，CDs可以在pH 2.0～8.0范围内监测活细胞中pH的变化。

实施例2

本实施例提供实施例1制备的荧光探针的应用，其用于体外环境pH检测，具体方法为：

1)构建用于检测体外环境pH的标准曲线f1，该标准曲线能表征体系的pH值与荧光强度的关系：

将荧光探针加入去离子水中，制备成浓度为100μg/ml的荧光探针溶液，均分为若干份；

将不同体积的0.2mol/L的磷酸氢二钠(DHP)和0.1mol/L的柠檬酸(CA)溶液按照一定比例混合，制备成pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的一系列DHP-CA缓冲溶液，作为pH标准溶液；

使用不同pH的DHP-CA缓冲溶液(pH 2.0～8.0)将荧光探针溶液稀释至50μg/ml，得到不同pH的50μg/ml荧光探针缓冲液，测试每份荧光探针缓冲液于580nm激发条件下、在662nm处的荧光强度；

最后，将测得的荧光强度作为y轴，对应的pH值作为x轴，拟合得到标准曲线f1。

2)对待测样品1进行体外环境的pH值检测：将待测样品1加入由荧光探针制备的已知浓度的荧光探针溶液中，检测所得混合液在580nm激发下662nm位置处的荧光强度，然后对照标准曲线f1，计算待测样品1的pH值。

实施例3

本实施例提供实施例1制备的荧光探针的应用，其用于细胞内的pH检测，具体方法为：

1)构建用于检测细胞内pH值的标准曲线f2，该标准曲线能表征体系的细胞内的pH值与荧光强度的关系：

1-1)Hela细胞铺板：

使用1640培养基+10％胎牛血清+1％青霉素链霉素制成1640完全培养基，使用完全培养基配制密度为1×10⁵cells/mL的Hela细胞悬液，并接种于玻底培养皿中，每皿2mL，在37℃、5％CO₂气氛下培养24h。取出培养皿，移除培养基，用PBS(pH＝7.4)洗涤细胞三次；

将2ml的25μg/mL的荧光探针溶液与Hela细胞加入培养基共孵育1h，移除培养液，用PBS(pH＝7.4)溶液洗涤Hela细胞三次；

1-2)将1mL的含10uM尼日利亚菌素的高钾缓冲溶液加入培养基，与Hela细胞共孵育10min，交换细胞内外K⁺和H⁺，使得Hela细胞内外达到pH平衡，移除培养液，用PBS(pH＝7.4)洗涤Hela细胞三次；

1-3)将1mL不同pH值(2.0～8.0)的缓冲液加入培养基中与Hela细胞共孵育10min，移除培养基，用PBS(pH＝7.4)溶液洗涤Hela细胞三次，用多聚甲醛固定Hela细胞10min，然后检测Hela细胞在580nm激发下662nm位置处的荧光强度；

1-4)将测得的荧光强度作为y轴，对应的pH值作为x轴，拟合得到标准曲线f2；

2)对待测细胞样品2进行细胞内的pH检测：

2-1)将已知浓度的荧光探针溶液与待测细胞样品2加入培养基共孵育，移除培养液，用PBS溶液洗涤待测细胞；

2-2)将含尼日利亚菌素的含钾缓冲溶液加入培养基，与待测细胞共孵育，使得待测细胞样品2内外达到pH平衡，移除培养液，用PBS溶液洗涤待测细胞，用多聚甲醛固定待测细胞，然后检测待测细胞在580nm激发下662nm位置处的荧光强度，最后对照标准曲线f2，计算待测细胞样品2的细胞内pH值。

实施例4

本实施例提供实施例1制备的荧光探针的应用，其用于GSSG浓度检测，具体方法为：

1)制备一系列含不同浓度GSSG的GSSG标准溶液；

2)利用GSSG标准溶液与荧光探针构建用于检测GSSG浓度的标准曲线f3，该标准曲线能表征体系中加入的GSSG的浓度与体系的荧光强度的变化量之间的关系：

利用荧光探针制备成已知浓度的荧光探针溶液，在580nm激发条件下，测试每份混合液在662nm处的荧光强度F₀，然后均分为若干份，按一定的浓度梯度分别加入相同体积、不同浓度的GSSG标准溶液，得到混合液；然后在580nm激发条件下，测试每份混合液在662nm处的荧光强度F；最后，将F/F₀-1的值作为y轴，对应的GSSG浓度作为x轴，拟合得到标准曲线f3；

3)对待测样品3进行GSSG浓度检测：将待测样品3加入由荧光探针制备的已知浓度的荧光探针溶液中，检测得到的混合液在580nm激发下662nm位置处的荧光强度，然后对照标准曲线f3，计算待测样品3中GSSG的浓度。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (4)

1.一种荧光探针的应用，其特征在于，其用于GSSG浓度的检测，该荧光探针用于GSSG浓度检测的方法为：

1）制备一系列含不同浓度GSSG的GSSG标准溶液；

2）利用GSSG标准溶液与荧光探针构建用于检测GSSG浓度的标准曲线f3，该标准曲线能表征体系中加入的GSSG的浓度与体系的荧光强度的变化量之间的关系：

利用荧光探针制备成已知浓度的荧光探针溶液，在580nm激发条件下，测试每份混合液在662nm处的荧光强度F₀，然后均分为若干份，按一定的浓度梯度分别加入相同体积、不同浓度的GSSG标准溶液，得到混合液；然后在580nm激发条件下，测试每份混合液在662nm处的荧光强度F；最后，将F/F₀-1的值作为y轴，对应的GSSG浓度作为x轴，拟合得到标准曲线f3；

3）对待测样品3进行GSSG浓度检测：将待测样品3加入由荧光探针制备的已知浓度的荧光探针溶液中，检测得到的混合液在580nm激发下662nm位置处的荧光强度，然后对照标准曲线f3，计算待测样品3中GSSG的浓度；

该荧光探针的制备方法包括以下步骤：

S1、将4-溴邻苯二胺溶解于无水乙醇中，超声，得到混合溶液；

S2、在所述混合溶液中加入盐酸，得到前驱液；

S3、将所述前驱液加入反应釜中，加热下反应，反应结束后冷却至室温，得到R-CDs溶液；

S4、通过柱层析对R-CDs溶液进行纯化，采用洗脱液洗脱，所得溶液旋转干燥，得到R-CDs粉末，即所述荧光探针。

2.根据权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于，所述步骤S4中的洗脱液由二氯甲烷和甲醇按体积比10：1混合得到。

3.根据权利要求2所述的荧光探针的应用，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

S1、将4-溴邻苯二胺溶解于无水乙醇中，超声，得到混合溶液；

S2、在所述混合溶液中加入盐酸，得到前驱液；

S3、将所述前驱液加入特氟龙为内衬的不锈钢高压反应釜中，180℃下反应8h，反应结束后冷却至室温，得到R-CDs溶液；

S4、通过柱层析对R-CDs溶液进行纯化，采用洗脱液洗脱，所得溶液旋转干燥，得到R-CDs粉末，即所述荧光探针。

4.根据权利要求3所述的荧光探针的应用，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

S1、将2mM的4-溴邻苯二胺溶解于20ml无水乙醇中，超声，得到混合溶液；

S2、在所述混合溶液中加入10ml质量分数为5%的盐酸，得到前驱液；

S3、将所述前驱液加入100ml的特氟龙为内衬的不锈钢高压反应釜中，180℃下反应8h，反应结束后冷却至室温，得到R-CDs溶液；

S4、通过柱层析对R-CDs溶液进行纯化，采用洗脱液洗脱，所得溶液旋转干燥，得到R-CDs粉末，即所述荧光探针。