CN116926034A - 重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用 - Google Patents
重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116926034A CN116926034A CN202210335017.7A CN202210335017A CN116926034A CN 116926034 A CN116926034 A CN 116926034A CN 202210335017 A CN202210335017 A CN 202210335017A CN 116926034 A CN116926034 A CN 116926034A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polynucleotide
- host cell
- application
- expression vector
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 73
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 24
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 32
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100022785 Creatine kinase B-type Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001047117 Homo sapiens Creatine kinase B-type Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 2
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KWKQGHSSNHPGOW-BQBZGAKWSA-N Arg-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O KWKQGHSSNHPGOW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VBFJESQBIWCWRL-DCAQKATOSA-N Arg-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VBFJESQBIWCWRL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ASQYTJJWAMDISW-BPUTZDHNSA-N Arg-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N ASQYTJJWAMDISW-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N Arg-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N Arg-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- URAUIUGLHBRPMF-NAKRPEOUSA-N Arg-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O URAUIUGLHBRPMF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZCKYZTGLXIEOKS-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZCKYZTGLXIEOKS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CLUMZOKVGUWUFD-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CLUMZOKVGUWUFD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KFAFUJMGHVVYRC-DCAQKATOSA-N Asp-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KFAFUJMGHVVYRC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N Asp-Leu-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MVRGBQGZSDJBSM-GMOBBJLQSA-N Asp-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(=O)O)N MVRGBQGZSDJBSM-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- UXRVDHVARNBOIO-QSFUFRPTSA-N Asp-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N UXRVDHVARNBOIO-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N Cys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- FCXJJTRGVAZDER-FXQIFTODSA-N Cys-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FCXJJTRGVAZDER-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- CLPQUWHBWXFJOX-BQBZGAKWSA-N Gln-Gly-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CLPQUWHBWXFJOX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PSERKXGRRADTKA-MNXVOIDGSA-N Gln-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O PSERKXGRRADTKA-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- SXGMGNZEHFORAV-IUCAKERBSA-N Gln-Lys-Gly Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N SXGMGNZEHFORAV-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ININBLZFFVOQIO-JHEQGTHGSA-N Gln-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O ININBLZFFVOQIO-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XHWLNISLUFEWNS-CIUDSAMLSA-N Glu-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XHWLNISLUFEWNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LZEUDRYSAZAJIO-AUTRQRHGSA-N Glu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LZEUDRYSAZAJIO-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- FMVLWTYYODVFRG-BQBZGAKWSA-N Gly-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN FMVLWTYYODVFRG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N Gly-Asp-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N Gly-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)CN)C(=O)O YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N Gly-Met-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N His-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asn Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N AVQOSMRPITVTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JCOSMKPAOYDKRO-AVGNSLFASA-N His-Glu-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N JCOSMKPAOYDKRO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N His-Gly-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 FDQYIRHBVVUTJF-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- SKYULSWNBYAQMG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SKYULSWNBYAQMG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N His-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BKOVCRUIXDIWFV-IXOXFDKPSA-N His-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 BKOVCRUIXDIWFV-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- YVCGJPIKRMGNPA-LSJOCFKGSA-N His-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YVCGJPIKRMGNPA-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- KIMHKBDJQQYLHU-PEFMBERDSA-N Ile-Glu-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N KIMHKBDJQQYLHU-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- PNDMHTTXXPUQJH-RWRJDSDZSA-N Ile-Glu-Thr Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)O PNDMHTTXXPUQJH-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WGNOPSQMIQERPK-UHFFFAOYSA-N Leu-Asn-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(=O)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O WGNOPSQMIQERPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZAVCJRJOQKIOJW-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZAVCJRJOQKIOJW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N Lys-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N Lys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- DYJOORGDQIGZAS-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)N DYJOORGDQIGZAS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MQASRXPTQJJNFM-JYJNAYRXSA-N Met-Pro-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MQASRXPTQJJNFM-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- PSBJZLMFFTULDX-IXOXFDKPSA-N Phe-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O PSBJZLMFFTULDX-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- INHMISZWLJZQGH-ULQDDVLXSA-N Phe-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 INHMISZWLJZQGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- AAERWTUHZKLDLC-IHRRRGAJSA-N Phe-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O AAERWTUHZKLDLC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N Phe-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- AJLVKXCNXIJHDV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ala-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O AJLVKXCNXIJHDV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MLQVJYMFASXBGZ-IHRRRGAJSA-N Pro-Asn-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O MLQVJYMFASXBGZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- UTAUEDINXUMHLG-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 UTAUEDINXUMHLG-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XVAUJOAYHWWNQF-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XVAUJOAYHWWNQF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZSDXEKUKQAKZFE-XAVMHZPKSA-N Ser-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O ZSDXEKUKQAKZFE-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- QYBRQMLZDDJBSW-AVGNSLFASA-N Ser-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QYBRQMLZDDJBSW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N Thr-Cys-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N Thr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- QNTBGBCOEYNAPV-CWRNSKLLSA-N Trp-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O QNTBGBCOEYNAPV-CWRNSKLLSA-N 0.000 description 1
- AWEGFIJXYWGBCA-XIRDDKMYSA-N Trp-His-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N AWEGFIJXYWGBCA-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- XKTWZYNTLXITCY-QRTARXTBSA-N Trp-Val-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 XKTWZYNTLXITCY-QRTARXTBSA-N 0.000 description 1
- IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- HDSKHCBAVVWPCQ-FHWLQOOXSA-N Tyr-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HDSKHCBAVVWPCQ-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- HVPPEXXUDXAPOM-MGHWNKPDSA-N Tyr-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HVPPEXXUDXAPOM-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- HFJJDMOFTCQGEI-STECZYCISA-N Tyr-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N HFJJDMOFTCQGEI-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- KGSDLCMCDFETHU-YESZJQIVSA-N Tyr-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O KGSDLCMCDFETHU-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- MWUYSCVVPVITMW-IGNZVWTISA-N Tyr-Tyr-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 MWUYSCVVPVITMW-IGNZVWTISA-N 0.000 description 1
- CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N Val-Gly-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DLMNFMXSNGTSNJ-PYJNHQTQSA-N Val-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N DLMNFMXSNGTSNJ-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- OVBMCNDKCWAXMZ-NAKRPEOUSA-N Val-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N OVBMCNDKCWAXMZ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WMRWZYSRQUORHJ-YDHLFZDLSA-N Val-Phe-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N WMRWZYSRQUORHJ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- MHHAWNPHDLCPLF-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=CC=C1 MHHAWNPHDLCPLF-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N Val-Ser-Pro Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-O azetidin-1-ium Chemical compound C1C[NH2+]C1 HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010073628 glutamyl-valyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059898 glycyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 208000037891 myocardial injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 108010064486 phenylalanyl-leucyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 108010025488 pinealon Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1223—Phosphotransferases with a nitrogenous group as acceptor (2.7.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/03—Phosphotransferases with a nitrogenous group as acceptor (2.7.3)
- C12Y207/03002—Creatine kinase (2.7.3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请公开了一种重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用。本申请中，编码所述肌酸激酶同工酶的多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.3所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.3所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。本申请在大肠杆菌载体中表达效率高的序列，提高了表达量，纯化和后处理简单，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，特别涉及重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用。
背景技术
肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK)是一种二聚体酶，分子量大小为 81-82KDa，是由M和B两个亚基组成，主要分为同工酶CK-MB、CK-MM及CK-BB，其中CK-MB多分布于心肌中；CK-MM多分布于骨骼肌及心肌中；而CK－BB在脑中的含量较多。目前肌酸激酶同工酶(CK-MB)是临床上常用的心肌酶学检测指标。CK-MB通常分为MB1与MB2两个异型，在心肌细胞中，CK-MB主要以MB2的形式存在，一旦心肌细胞发生损伤就会释放MB2，使血清中的CK-MB水平在短时间内迅速升高，其升高时间通常于发病6h内，且在24小时内达到峰值，并于72小时后逐渐降低，直至恢复正常水平。CK-MB在心肌中具有较高含量，一旦心肌细胞发生损伤将增加血液中的CK-MB水平，并且对临床诊断的指导意义重大。
目前CK-MB常用的检测方法有免疫抑制法、酶质量法、电泳法。且CK-MB的诊断原料以及试剂大多都是依赖于进口，昂贵的成本导致医院检测价格居高不下，同时也严重阻碍了基于CK-MB诊断产品的开发。然而由于CK-MB同工酶的空间结构复杂，体外重组表达困难。目前国内常用的天然提取纯化法来提取CK-MB同工酶，但是天然的CK-MB同工酶取自心肌组织，不仅来源困难、提取步骤繁琐，而且产物质量和活性不稳定。发明人发现，现有技术中，也曾使用基因工程制备CK-MB同工酶，主要为在N端设计TrxA标签表达蛋白，虽然提高目的蛋白的表达量和稳定性，但后续切除标签和纯化的工艺繁琐，不利于蛋白的大量工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组肌酸激酶同工酶。
本发明的另一目的在于提供一种编码上述重组肌酸激酶同工酶的多核苷酸。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述多核苷酸的表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述表达载体的宿主细胞。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述重组肌酸激酶同工酶的方法。
本发明的另一目的在于，提供一种含有上述重组肌酸激酶同工酶的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种编码重组肌酸激酶同工酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.3所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.3所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明第二方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达(His)6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的碳端连接有表达(His)6标签的多核苷酸序列。
在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。
本发明第三方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株。
本发明第四方面提供了一种制备肌酸激酶同工酶的方法，所述方法包括步骤：
培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述肌酸激酶同工酶；
其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
本发明培养宿主细胞的培养基，不做限定，按照本领域常规的配方即可，例如，培养所述的宿主细胞所用的培养基可以为TB培养基，或SOC培养基，发明人发现，使用TB培养基培养所述宿主细胞时，表达量明显高于其他培养基。
在一些优选的方案中，所述培养基为TB培养基。所述TB培养基市售可得，但更优选地，所述TB培养基的配方如下：
按照表格称量各组分，然后加水溶解，定容至500mL，两种溶液分别在121℃高温高压灭菌30min，灭菌后合并，冷却后4℃冰箱保存备用。在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，当所述宿主细胞培养至OD600为0.6至0.8时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，使用亲和层析法分离所述目的蛋白，优选为Ni-柱亲和层析法。
在一些优选的方案中，所述亲和层析法所用的流动相包括Tris-HCl、NaCl和咪唑。
在一些更优选的方案中，所述流动相中所述Tris-HCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述NaCl的浓度为40至60mM，例如50mM；和，所述咪唑的浓度为180至220mM，例如200mM。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者
如本发明第二方面提供的表达载体；或者
如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者
根据本发明第四方面所述的方法制备的肌酸激酶同工酶。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明通过对肌酸激酶同工酶的碱基序列进行同义密码子偏好性优化，获得了适宜在大肠杆菌载体中表达效率高的序列，提高了表达量，收率达294.01mg/L，并降低了生产成本；
(2)本发明提供的表达载体中，仅C端有(His)6标签，无须再进行切除标签和二次纯化等步骤，一步法获得高活性和热稳定性的重组肌酸激酶同工酶，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂原料，为急性心肌梗死等心脏疾病的快速诊断试剂盒的制备奠定了基础；
(3)本发明通过对培养基种类和成分含量的优化，进一步提高了重组肌酸激酶同工酶的表达量。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中载体A-3和载体B-6的SDS-PAGE鉴定结果图；
图2是根据本发明实施例中目的蛋白电泳图。
具体实施方式
现有技术中，重组肌酸激酶同工酶生产产量低，产物稳定性差，纯化工艺繁琐，本发明人通过实验研究，开发基于基因工程的重组肌酸激酶生产方法，所用碱基序列进行同义密码子偏好性优化，使之在大肠杆菌载体中表达效率提高。本发明的一些实施方式提供了一种编码重组肌酸激酶同工酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.3所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.3所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明的另一些实施方式中，还提供了包含上述多核苷酸的表达载体，优选为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。
在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达(His)6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的碳端连接有表达(His)6标签的多核苷酸序列。
本发明仅在大肠杆菌表达载体碳端设有(His)6标签，不包含切除标签，也无须二次纯化。
本发明的另一些实施方式中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株；大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株被认为是本发明所述的多核苷酸最适宜的表达系统。
本发明的另一些实施方式中，提供了一种制备肌酸激酶同工酶的方法，所述方法包括步骤：
培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述肌酸激酶同工酶；
其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
本发明培养宿主细胞的培养基，不做限定，按照本领域常规的配方即可，例如，培养所述的宿主细胞所用的培养基可以为TB培养基，或SOC培养基，发明人发现，使用TB培养基培养所述宿主细胞时，表达量明显高于其他培养基。
在一些优选的方案中，所述培养基为TB培养基。所述TB培养基市售可得，所述TB培养基的一种配方为：
| 名称 | 称取量 |
| Tryphone | 6g |
| Yeast Eextrat | 12g |
| Glycerol | 2.5mL |
| KH2PO4 | 1.155g |
| K2HPOa | 6.27g |
按照表格称量各组分，然后加水溶解，定容至500mL，两种溶液分别在121℃高温高压灭菌30min，灭菌后合并，冷却后4℃冰箱保存备用。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，当所述宿主细胞培养至OD600为0.6至0.8时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，使用亲和层析法分离所述目的蛋白，优选为Ni-柱亲和层析法。
在一些优选的方案中，所述亲和层析法所用的流动相包括Tris-HCl、NaCl和咪唑。
在一些更优选的方案中，所述流动相中所述Tris-HCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述NaCl的浓度为40至60mM，例如50mM；和，所述咪唑的浓度为180至220mM，例如200mM。
本发明的另一些实施方式中提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者
如本发明第二方面提供的表达载体；或者
如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者
根据本发明第四方面所述的方法制备的肌酸激酶同工酶。
本发明通过双抗体夹心法对表达的目的蛋白进行活性检测，并与市售CKMB抗原进行对比，无论是-20℃低温存储还是37℃高温存储，使用本发明的方法制备的目的蛋白(重组肌酸激酶同工酶)均更稳定，发光值下降远小于市售CKMB抗原。
在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞(例如，“”) 只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。
如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致或不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。
本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。
如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在 (如果有的话)通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。
如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。
如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异) 或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。例如，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。
如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。
如本文中所用的，术语“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞是真核宿主细胞或原核宿主细胞。优选为原核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞。
如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。
如本文中所用的，术语“表达载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的多肽的片段，所述目的多肽可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。表达载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。表达载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。
如本文中所用的，术语“表达系统”包括含有宿主和目的基因的载体，并且使能够达到宿主中目的基因表达目的的系统，具体地，通过含有编码目标蛋白质的外来基因的载体，筛选成功转染的重组宿主细胞。表达系统分为真核生物表达系统和原核生物表达系统，本文的一个优选例中选择原核生物表达系统。原核生物的表达系统具有宿主细菌的快速增殖，简单的培养，方便的操作，廉价的价格，明确的遗传背景，安全的遗传基因，高蛋白质的表达水平等特征。然而，原核生物的表达系统无法控制表达时间和表达水平。另外，在原核生物的表达系统中，由于表达产物有可能作为封入体存在，因此生物活性较低，翻译后处理及修饰系统不完整(例如，不能进行糖基化修饰)。
【目的蛋白的制备】
本发明中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/ 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、同义密码子偏好性优化
本实施例中用到的宿主大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株(购自天根公司)、pET-28a(+)表达载体(购自金斯瑞公司)、CK-MB同工酶蛋白活性鉴定试剂盒(化学发光法，试剂盒购自达瑞公司)。
以NCBI提供的人CK-MB-2同工酶蛋白的基因SEQ ID NO:2为参考，经氨基酸序列分析后对SEQ ID NO:1所示的序列进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，优化后的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。将其克隆至载体pET-28a(+)，C端(His)6标签。
CK-MB同工酶氨基酸序列SEQ ID NO:1：
CK-MB同工酶碱基序列SEQ ID NO:2：
经密码子优化后的CK-MB同工酶碱基序列SEQ ID NO:3：
实施例2、重组质粒的构建和目的基因的表达
取1μL表达质粒，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态Rosetta(DE3)中，冰浴放置20分钟，热激90秒，立刻冰上放置2分钟，加入400μL不含抗生素的SOC培养基， 37℃、220rpm振荡培养50分钟。取100μL菌液分别均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的 LB平板和SOC平板上，37℃培养箱培养过夜。
挑取上述制备的单克隆，无菌操作分别接种于含100μg/mL卡那抗性的TB培养基和SOC 培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导，放置于18℃振荡培养过夜。取等量两种不同质粒的菌液进行超声破碎进行SDS-PAGE鉴定，结果如下，以未诱导的菌液为对照，结合预测分子量42.64KD，结果见图1，显示优化后密码子载体A-3表达量明显高于未优化密码子的载体，且接种于TB培养基的表达量明显高于SOC培养基培养。
1-2列：密码子未优化的载体B-6导入大肠杆菌、TB培养基表达破碎的沉淀、上清；
3-4列：密码子优化后的载体A-3导入大肠杆菌、TB培养基表达破碎的沉淀、上清；
5-6列：密码子未优化的载体B-6导入大肠杆菌、SOC培养基表达破碎的沉淀、上清；
7-8列：密码子优化后的载体A-3导入大肠杆菌、SOC培养基表达破碎的沉淀、上清。
实施例3、表达产物的纯化
筛选出的高表达重组细胞株A-3以TB和SOC为培养基摇瓶培养1.5L菌液，离心收集菌体湿重分别为：34.24g和31.50g。取称取约4g菌体，加入20ml Lysis Buffer在冰上重悬。超声破碎后离心，20000rpm，4℃离心30分钟，取上清，0.22μm针式过滤器过滤得到过滤后菌液。滤后过Ni-柱亲和层析，用50mM Tris-HCl，50mM NaCl，200mM咪唑，pH7.0洗脱的蛋白即为目的蛋白，电泳图2如图所示。
经计TB培养基目的蛋白表达含量为294.01mg/L发酵液，纯度达到95％，该表达量较高；
SOC培养基目的蛋白表达含量为155.30mg/L发酵液，纯度达到95％。
实施例4、化学发光法鉴定表达产物的活性
根据达瑞试剂盒说明书，采用双抗体夹心法进行活性检测：
(1)制备抗原抗体夹心复合物
将A-3在TB表达的样本、包被的CK-MB蛋白单克隆抗体的磁珠混合，经过洗涤后，加入吖碇盐标记的另外一株Mb单克隆抗体在温育条件下反应，抗体捕获样本中的抗原，形成抗原抗体夹心复合物。
(2)检测读数
温育结束后，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，加入两种激发液，使复合物产生化学发光信号，测量发光强度。采用化学发光法检测，菌株A-8的检测结果由表1可知，CK-MB-2同工酶蛋白的发光值最高可达到774万，说明该抗原性能较好。浓度与RLU值的线性回归方程为：y＝6078.9x+267808，R2＝0.9852，说明线性良好(R2＞0.98)。
表1
实施例5、化学发光法鉴定表达产物的稳定性
检测前，将A-3在TB表达的样品分别为在-20℃保存3天、在37℃保存三天。并且采用 A公司生产的CKMB抗原作为阳性对照。根据达瑞试剂盒说明书，采用双抗体夹心法进行活性检测：
1.制备抗原抗体夹心复合物
样本、包被的CKMB单克隆抗体的磁珠混合，经过洗涤后，加入吖碇盐标记的另外一株 CKMB-2单克隆抗体在温育条件下反应，抗体捕获样本中的抗原，形成抗原抗体夹心复合物。
2.检测读数：
温育结束后，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，加入两种激发液，使复合物产生化学发光信号，测量发光强度。
采用化学发光法结果由表2可知，CK-MB-2同工酶蛋白原料在-20℃放3天整体发光值的相对偏差在±20％内。两者抗原原料置37℃的发光值大幅度降低，但用本发明优化后的 CK-MB-2同工酶蛋白样品企标下降幅度比A公司的小。说明，本发明产品比目前市面上的部分产品稳定性要好。
表2
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用
<130> P220008-1CNCNA9
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atgcccttct ccaacagcca caacgcactg aagctgcgct tcccggccga ggacgagttc 60
cccgacctga gcgcccacaa caaccacatg gccaaggtgc tgacccccga gctgtacgcg 120
gagctgcgcg ccaagagcac gccgagcggc ttcacgctgg acgacgtcat ccagacaggc 180
gtggacaacc cgggccaccc gtacatcatg accgtgggct gcgtggcggg cgacgaggag 240
tcctacgaag tgttcaagga tctcttcgac cccatcatcg aggaccggca cggcggctac 300
aagcccagcg atgagcacaa gaccgacctc aaccccgaca acctgcaggg cggcgacgac 360
ctggacccca actacgtgct gagctcgcgg gtgcgcacgg gccgcagcat ccgtggcttc 420
tgcctccccc cgcactgcag ccgcggggag cgccgcgcca tcgagaagct cgcggtggaa 480
gccctgtcca gcctggacgg cgacctggcg ggccgatact acgcgctcaa gagcatgacg 540
gaggcggagc agcagcagct catcgacgac cacttcctct tcgacaagcc cgtgtcgccc 600
ctgctgctgg cctcgggcat ggcccgcgac tggcccgacg cccgcggtat ctggcacaat 660
gacaataaga ccttcctggt gtgggtcaac gaggaggacc acctgcgggt catctccatg 720
cagaaggggg gcaacatgaa ggaggtgttc acccgcttct gcaccggcct cacccagatt 780
gaaactctct tcaagtctaa ggactatgag ttcatgtgga accctcacct gggctacatc 840
ctcacctgcc catccaacct gggcaccggg ctgcgggcag gtgtgcatat caagctgccc 900
aacctgggca agcatgagaa gttctcggag gtgcttaagc ggctgcgact tcagaagcga 960
ggcacaggcg gtgtggacac ggctgcggtg ggcggggtct tcgacgtctc caacgctgac 1020
cgcctgggct tctcagaggt ggagctggtg cagatggtgg tggacggagt gaagctgctc 1080
atcgagatgg agcagcggct ggagcagggc caggccatcg acgacctcat gcctgcccag 1140
aaatga 1146
<210> 2
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atgccgtttt ctaatagtca taatgcactg aaattacgct ttccggcaga agatgaattt 60
ccggatctga gcgcacataa taatcacatg gccaaagtgc tgaccccgga actgtatgcc 120
gaactgcgcg ccaaatcaac cccgtcaggc tttaccttag atgatgttat tcagaccggg 180
gtggataatc cgggccatcc gtatattatg accgttggtt gtgttgcagg cgatgaagaa 240
agctatgaag tttttaaaga cctgtttgat ccgattattg aagatcgtca tggtggctat 300
aaaccgagcg atgaacataa aaccgatctg aatccggata atttacaggg tggcgatgat 360
ttagatccga attatgtgct gtcttctcgc gttcgaacgg gccgtagtat tcgcggcttt 420
tgtctgccgc cgcattgtag tcgcggcgaa cgtcgtgcca ttgaaaaact ggcagtggaa 480
gccctgtcta gcttagatgg tgatttagca ggtcgctatt atgccttaaa atcaatgacc 540
gaagccgaac agcagcagtt aattgatgat cattttctgt ttgataaacc cgtgagtccg 600
ctgctgttag cctcaggcat ggcacgcgat tggccggatg cacgcggtat ttggcataat 660
gataataaaa cctttctggt ttgggttaat gaagaagatc atctgcgcgt tattagtatg 720
cagaaaggcg gcaatatgaa agaagtgttt acccgctttt gtaccgggct gacccagatt 780
gaaaccctgt ttaaaagcaa agattatgaa tttatgtgga atccgcatct gggctatatt 840
ctgacctgtc cgtctaattt agggactggc ttacgtgcag gtgttcatat taaactgccg 900
aatctgggca aacatgaaaa atttagcgaa gtgctgaaac gcctgcgctt acagaaacgt 960
gggactggcg gtgtggatac cgcagcagtt ggcggcgtgt ttgatgtgag caatgccgat 1020
cgcctgggct tttcagaagt ggaactggtt cagatggttg tggatggcgt taaattactg 1080
attgaaatgg aacagcgcct ggaacagggt caggccattg atgatttaat gccggcccag 1140
aaa 1143
<210> 3
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Met Pro Phe Ser Asn Ser His Asn Ala Leu Lys Leu Arg Phe Pro Ala
1 5 10 15
Glu Asp Glu Phe Pro Asp Leu Ser Ala His Asn Asn His Met Ala Lys
20 25 30
Val Leu Thr Pro Glu Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Ala Lys Ser Thr Pro
35 40 45
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Val Ile Gln Thr Gly Val Asp Asn Pro
50 55 60
Gly His Pro Tyr Ile Met Thr Val Gly Cys Val Ala Gly Asp Glu Glu
65 70 75 80
Ser Tyr Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Asp Pro Ile Ile Glu Asp Arg
85 90 95
His Gly Gly Tyr Lys Pro Ser Asp Glu His Lys Thr Asp Leu Asn Pro
100 105 110
Asp Asn Leu Gln Gly Gly Asp Asp Leu Asp Pro Asn Tyr Val Leu Ser
115 120 125
Ser Arg Val Arg Thr Gly Arg Ser Ile Arg Gly Phe Cys Leu Pro Pro
130 135 140
His Cys Ser Arg Gly Glu Arg Arg Ala Ile Glu Lys Leu Ala Val Glu
145 150 155 160
Ala Leu Ser Ser Leu Asp Gly Asp Leu Ala Gly Arg Tyr Tyr Ala Leu
165 170 175
Lys Ser Met Thr Glu Ala Glu Gln Gln Gln Leu Ile Asp Asp His Phe
180 185 190
Leu Phe Asp Lys Pro Val Ser Pro Leu Leu Leu Ala Ser Gly Met Ala
195 200 205
Arg Asp Trp Pro Asp Ala Arg Gly Ile Trp His Asn Asp Asn Lys Thr
210 215 220
Phe Leu Val Trp Val Asn Glu Glu Asp His Leu Arg Val Ile Ser Met
225 230 235 240
Gln Lys Gly Gly Asn Met Lys Glu Val Phe Thr Arg Phe Cys Thr Gly
245 250 255
Leu Thr Gln Ile Glu Thr Leu Phe Lys Ser Lys Asp Tyr Glu Phe Met
260 265 270
Trp Asn Pro His Leu Gly Tyr Ile Leu Thr Cys Pro Ser Asn Leu Gly
275 280 285
Thr Gly Leu Arg Ala Gly Val His Ile Lys Leu Pro Asn Leu Gly Lys
290 295 300
His Glu Lys Phe Ser Glu Val Leu Lys Arg Leu Arg Leu Gln Lys Arg
305 310 315 320
Gly Thr Gly Gly Val Asp Thr Ala Ala Val Gly Gly Val Phe Asp Val
325 330 335
Ser Asn Ala Asp Arg Leu Gly Phe Ser Glu Val Glu Leu Val Gln Met
340 345 350
Val Val Asp Gly Val Lys Leu Leu Ile Glu Met Glu Gln Arg Leu Glu
355 360 365
Gln Gly Gln Ala Ile Asp Asp Leu Met Pro Ala Gln Lys
370 375 380
Claims (10)
1.一种编码肌酸激酶同工酶的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.3所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.3所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达His×6标签的多核苷酸序列。优选地，所述表达载体中，如权利要求1所述的多核苷酸的3碳端连接有表达His×6标签的多核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求1所述的多核苷酸。
6.一种制备肌酸激酶同工酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
培养如权利要求5所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述肌酸激酶同工酶；
其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，所用培养基为TB培养基。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者
如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者
如权利要求5所述的宿主细胞；或者
根据权利要求6至9中任一项所述的方法所制备的重组肌酸激酶同工酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210335017.7A CN116926034A (zh) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210335017.7A CN116926034A (zh) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116926034A true CN116926034A (zh) | 2023-10-24 |
Family
ID=88392837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210335017.7A Pending CN116926034A (zh) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116926034A (zh) |
-
2022
- 2022-03-31 CN CN202210335017.7A patent/CN116926034A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114262697B (zh) | 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌 | |
| KR20210084590A (ko) | 조작된 dna 중합효소 변이체 | |
| CN111499759A (zh) | 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用 | |
| CN112175980B (zh) | 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用 | |
| CN116926034A (zh) | 重组肌酸激酶同工酶及其制备方法和应用 | |
| CN116426546A (zh) | 重组胆固醇氧化酶及其制备方法和应用 | |
| CN112680431B (zh) | 基于片段化酶的dna文库制备方法 | |
| CN116063571A (zh) | 重组ssb抗原的制备方法和应用 | |
| CN117187210B (zh) | 一种突变型Bst DNA聚合酶大片段及其制备方法 | |
| CN115838437A (zh) | 人NT-proBNP融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN114409800B (zh) | 制备重组胱抑素c的方法 | |
| CN116083453A (zh) | 肌氨酸氧化酶的制备方法和应用 | |
| CN115960924A (zh) | 重组jo-1抗原的制备方法和应用 | |
| CN117587046A (zh) | 重组己糖激酶及其制备方法和应用 | |
| CN116121280A (zh) | 重组胱硫醚-β-裂解酶的制备方法和应用 | |
| CN116926091A (zh) | 门冬氨酸氨基转移酶及其制备方法和应用 | |
| CN116064563A (zh) | 白细胞介素-6截短体的制备方法和应用 | |
| CN116042662A (zh) | 酰基辅酶a合成酶的制备方法和应用 | |
| CN116410993A (zh) | 重组乳酸脱氢酶及其制备方法和应用 | |
| CN115820618A (zh) | Sc1-70抗原截短体、其制备方法和应用 | |
| CN116515781A (zh) | 磷酸甘油氧化酶及其突变体、制备方法和应用 | |
| CN116042588A (zh) | 重组肌酸酶的制备方法和应用 | |
| CN116606874A (zh) | 胱硫醚-β-合成酶的制备方法和应用 | |
| CN117720669A (zh) | 真核细胞表达制备重组胱抑素c的方法 | |
| CN115820677A (zh) | 重组slo抗原的制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |