CN117720669A - 真核细胞表达制备重组胱抑素c的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了真核细胞表达制备重组胱抑素C的方法，具体地本发明采用了基因工程293F细胞表达重组融合Cys C蛋白，该Cys C重组蛋白能够在293F细胞表达系统进行高效率表达，且蛋白的稳定性高，并具备极佳的抗原活性。

Description

真核细胞表达制备重组胱抑素C的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种真核细胞表达制备重组胱抑素C的方法。

背景技术

胱抑素C(Cystatin C或简称Cys C)又称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。它的分子量为13.3kD，是由122个氨基酸组成的低分子量蛋白质，是一种理想的反映肾小球滤过率(GFR)变化的内源性标志物，目前国内外都把胱抑素C作为公认的肾功能检测指标。制备胱抑素C诊断试剂盒需要特异性强和灵敏性高的抗Cys C单克隆抗体，而要得到该单克隆抗体就必须得到高纯度的胱抑素C蛋白。

传统方法从胎盘、尿液等组织中提取天然胱抑素的方法存在效率低、纯度低、纯化成本高等问题，而且存在未知的潜在风险。同时纯化步骤复杂，要得到高纯度蛋白难度很大，用这种天然蛋白免疫制备的多抗血清，和人血清中其他组分的交叉也比较严重，这给产品性能优化带来较大困难。目前，已有实验室用大肠杆菌表达系统对人Cys C的表达进行了研究，但由于人Cys C在大肠杆菌中的表达属于异源性表达，报道为包涵体形式。包涵体形式的表达产物，必须经过复杂的变性，复性处理才能恢复其生物学活性。

因此本领域技术人员致力于开发表达效率高、易于纯化、蛋白活性高的胱抑素C蛋白制备工艺。

发明内容

本发明提供了一种真核细胞表达制备重组胱抑素C的方法。

本发明的第一方面，提供了一种胱抑素C融合蛋白，所述胱抑素C融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列≥90％同源性(优选地，≥95％的同源性；等优选地≥96％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽保持有SEQ IDNO.1所示多肽的活性；

(C)将SEQ ID NO.1中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保持有SEQ ID NO.1所示多肽的活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白为分离的。

在另一优选例中，所述胱抑素C融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二方面，提供了一种分离的经密码子优化的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述表达载体为pcDNA3.4表达载体。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，优选地所述宿主细胞为293F细胞(人胚肾细胞)。

本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示不同密码子表达产物纯化后电泳图。

具体实施方式

本发明采用了基因工程真核细胞表达Cys C蛋白，表达的Cys C不需要融合标签，表达量提高到了216mg/L，而且目的蛋白具有极佳的抗原活性。本发明的方法表达的蛋白具有稳定性高、活性高的优点；而且该方法生产周期短、表达产物容易纯化、成本较低，可实现高活性Cys C蛋白的大量生产。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

融合蛋白及其制备

在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或其衍生序列的蛋白。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的融合蛋白”是指融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

本发明融合蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以为真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等；也可以为原核细胞，如大肠杆菌。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中获得的蛋白质，如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本发明一个优选地实施方式中，本发明所述的Cys C的氨基酸序列和基因序列如下：

碱基序列：

ATMKWVTFISLLFLFSSAYSSSPGKPPRLVGGPMDASVEEEGVRRALDFAVGEYNKASNDMYHSRALQVVRARKQIVAGVNYFLDVELGRTTCTKTQPNLDNCPFHDQPHLKRKAFCSFQIYAVPWQGTMTLSKSTCQDAHHHHHH(SEQ ID NO.1)

大肠杆菌同义密码子偏好性优化的碱基序列:

GCCACCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGCTCTAGCCCTGGCAAGCCTCCAAGACTGGTGGGCGGACCTATGGACGCTTCTGTGGAAGAGGAAGGCGTGCGGAGAGCTCTGGATTTCGCCGTGGGCGAGTACAACAAGGCCAGCAACGACATGTACCACAGCAGAGCCCTGCAAGTGGTGCGGGCCAGAAAACAGATCGTGGCCGGCGTGAACTATTTCCTGGACGTGGAGCTGGGAAGAACCACCTGTACAAAGACCCAGCCTAATCTGGACAACTGCCCTTTCCACGATCAGCCCCACCTGAAGCGGAAAGCCTTCTGCAGCTTTCAGATCTACGCCGTCCCCTGGCAGGGCACCATGACCCTGAGCAAGTCCACATGCCAGGACGCCCACCACCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO.3)。

基因工程细胞

本发明提供了一种基因工程细胞(宿主细胞)，所述基因工程细胞为真核细胞(优选为293F细胞)，并且所述细胞的基因组中整合有本发明融合蛋白的表达盒；或者所述细胞中含有表达载体，所述表达载体含有本发明融合蛋白的表达盒。

在一优选例中，本发明融合蛋白的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、融合蛋白的ORF序列和终止密码子。

本发明中，术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的重组Cys C在真核细胞中表达，抗原活性更高。

(2)本发明优化的重组Cys C编码基因不仅极大地促进了蛋白可溶性表达效率，而且增强了蛋白稳定性。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1.重组蛋白的表达和纯化

1)以NCBI提供的人Cys C的基因为参考，结合本发明的试验设计要求，进行人源同义密码子偏好性优化，在N端连接Albumin(白蛋白)信号肽基因，载体为pcDNA3.4，C端具有(His)6标签，委托南京金斯瑞进行合成。

优化密码子1(SEQ ID NO.2):

GCCACCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCCTACAGCAGCAGCCCCGGCAAGCCCCCCCGCCTGGTGGGCGGCCCCATGGACGCCAGCGTGGAGGAGGAGGGCGTGCGCCGCGCCCTGGACTTCGCCGTGGGCGAGTACAACAAGGCCAGCAACGACATGTACCACAGCCGCGCCCTGCAGGTGGTGCGCGCCCGCAAGCAGATCGTGGCCGGCGTGAACTACTTCCTGGACGTGGAGCTGGGCCGCACCACCTGCACCAAGACCCAGCCCAACCTGGACAACTGCCCCTTCCACGACCAGCCCCACCTGAAGCGCAAGGCCTTCTGCAGCTTCCAGATCTACGCCGTGCCCTGGCAGGGCACCATGACCCTGAGCAAGAGCACCTGCCAGGACGCCCACCACCACCACCACCACTAA

优化密码子2(SEQ ID NO.3):

GCCACCGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCT

ACAGCTCTAGCCCTGGCAAGCCTCCAAGACTGGTGGGCGGACCTATGGACGCTTCTGTGGAAGAGGAAGGCGTGCGGAGAGCTCTGGATTTCGCCGTGGGCGAGTACAACAAGGCCAGCAACGACATGTACCACAGCAGAGCCCTGCAAGTGGTGCGGGCCAGAAAACAGATCGTGGCCGGCGTGAACTATTTCCTGGACGTGGAGCTGGGAAGAACCACCTGTACAAAGACCCAGCCTAATCTGGACAACTGCCCTTTCCACGATCAGCCCCACCTGAAGCGGAAAGCCTTCTGCAGCTTTCAGATCTACGCCGTCCCCTGGCAGGGCACCATGACCCTGAGCAAGTCCACATGCCAGGACGCCCACCACCACCACCACCACTAA

优化密码子3(SEQ ID NO.4):

GCCACCGCGACCATGAAGTGGGTCACTTTTATCTCCCTGCTGTTCCTTTTCTCTAGCGCTT

ACTCTTCCTCACCGGGCAAACCGCCACGGCTGGTCGGGGGTCCCATGGATGCGTCTGTCGAAGAAGAAGGTGTGAGAAGGGCACTCGATTTCGCGGTAGGGGAATACAATAAGGCTTCTAATGACATGTACCATAGTCGCGCTCTGCAAGTCGTCAGAGCACGGAAGCAAATTGTCGCAGGTGTAAACTACTTCCTGGACGTAGAGCTTGGACGGACTACCTGTACGAAGACTCAGCCTAACCTGGATAATTGCCCGTTTCACGACCAGCCTCACTTGAAACGCAAAGCATTCTGTTCCTTCCAAATCTACGCCGTTCCGTGGCAAGGGACAATGACCCTGTCCAAATCCACTTGTCAGGACGCTCACCACCACCACCACCACTAA

2)重组质粒导入宿主大肠杆菌

挑取实施例1步骤(1)中制备的质粒，将质粒转化DH5α感受态细胞(天根)，挑取单菌落鉴定。取测序结果正确的菌液到100ml LB培养基中，37℃过夜培养，收取菌液按照质粒提取试剂盒(凯杰)说明书提取质粒。去除内毒素，测定浓度、260/280、检测内毒素为阴性,并电泳检测条带。

使用PEI MW25000转染试剂(翌圣)，依据说明书进行转染293F细胞(人胚肾细胞)100ml，24小时左右加入辅料。温度36.5℃，转速95rpm，8％CO₂培养4天后，4℃13500rpm离心30min收集上清。

3)表达产物纯化

取100ml Albumin信号肽的Cys C载体瞬转的细胞上清，过Ni-柱亲和层析，用50mMTris-HCl，50mM NaCl，200mM咪唑，pH7.0洗脱的蛋白即为目的蛋白。电泳图如图1所示，分子量大小接近14.17KD，与理论值相同，其中泳道1为野生型基因，泳道2为优化密码子1，泳道3为优化密码子2，泳道4为优化密码子3。

优化密码子2的表达量最高，用BCA法检测浓度，标准曲线R²＝0.998，蛋白总量为21.6mg，纯度达到95％以上。优化密码子2目的蛋白Cys C在293F细胞上清中的表达为216.0mg/L。

实施例2.重组蛋白的性能研究

4)Elisa鉴定免疫学活性

取步骤(3)纯化后的目的蛋白，分别加入0.2μg/孔到酶标板进行4℃包被过夜。包被结束后用洗板机洗涤3次，加入脱脂奶粉37℃恒温培养箱中封闭1h。然后加入用PBS稀释不同1K、2K、4K、8K、16K倍数的人Cys C蛋白多抗(购自广州市达瑞生物技术股份有限公司)，37℃恒温培养箱中孵育2h，结束后洗板3次。

加入二抗(购自生工)37℃孵育30min，洗涤5次轻拍干溶液，加入TMB显色液室温避光显色时间10min，至肉眼可见浅蓝色。

加入终止液50μL/孔，在酶标仪上450nm/630nm测OD值。

结果如表1所示，本发明表达的Cys C蛋白与抗体结合能力更高,活性极佳。

表1

5)蛋白稳定性试验

将获得的目的蛋白分别稀释成6个不同浓度于EP管中，用封口膜封好。每批次2支，其中1支置于4℃作为对照，另一支置于37℃做加速一周试验，于7天取样进行鉴定，用日立7180生化仪检测蛋白的活性浓度，结果显示重组Cys C蛋白梯度稀释的线性关系良好，在37℃放置7天后稳定性较好，与4℃放置活性下降的相对偏差控制在5％以内。

表2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种胱抑素C融合蛋白，其特征在于，所述胱抑素C融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列≥90％同源性(优选地，≥95％的同源性；等优选地≥96％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽，且所述多肽保持有SEQ ID NO.1所示多肽的活性；

(C)将SEQ ID NO.1中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保持有SEQ ID NO.1所示多肽的活性的衍生多肽。

2.如权利要求1所示的胱抑素C融合蛋白，其特征在于，所述胱抑素C融合蛋白为分离的。

3.如权利要求1所示的胱抑素C融合蛋白，其特征在于，所述胱抑素C融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种分离的经密码子优化的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)与(a)-(b)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。

9.一种制备胱抑素C蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和分离所述胱抑素C蛋白。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求4所述的多核苷酸或者权利要求6所述的表达载体或者权利要求7所述的宿主细胞。