CN116606874A - 胱硫醚-β-合成酶的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种胱硫醚‑β‑合成酶的制备方法和应用。本申请中开发了基于原核表达体系的胱硫醚‑β‑合成酶表达方法，制备所得的胱硫醚‑β‑合成酶可溶性表达量大，适宜工业化生产，产物稳定性好，活性高。

Description

胱硫醚-β-合成酶的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及胱硫醚-β-合成酶的制备方法和应用。
背景技术
胱硫醚-β-合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)定位于胞浆，由四个相同的亚基构成同源四聚体，相对分子量为63kDa，是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖酶。CBS活性中心由第37位的谷氨酸(Glu)到第413位精氨酸(Arg)的多肽构成，该序列高度保守。CBS活性中心除了具有结合同型半胱氨酸(homocystein，Hcy)和丝氨酸等底物位点外，还包含PLP、S-腺苷蛋氨酸和亚铁血红素(heme)3个配基结合位点。
在维生素B6的催化下，胱硫醚-β-合成酶能使丝氨酸与同型半胱氨酸(HCY)合成胱硫醚。作为影响Hcy水平的一种关键酶,胱硫醚-β-合成酶在Hcy转变成胱硫醚的转硫酸路径中起着举足轻重的作用。同型半胱氨酸血浆浓度的升高已被认为是血管疾病，包括脑血管疾病，冠心病和血栓形成的独立危险因素。胱硫醚-β-合成酶被广泛应用于血液中同型半胱氨酸的检测，以预测血管类疾病的发生。然而胱硫醚-β-合成酶天然状态含量很低，分离获得大量天然产物比较困难，合成多肽成本高，限制了其应用前景。部分研究者也尝试开发基于基因工程的胱硫醚-β-合成酶制备方法，但大多都产量偏低，且为包涵体表达，使得实用性很差，不利于工业生产。因此，本领域尚需开发一种基于基因工程的胱硫醚-β-合成酶制备方法，提高产率和可溶性表达含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胱硫醚-β-合成酶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供编码胱硫醚-β-合成酶的多核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供与编码胱硫醚-β-合成酶的多核苷酸序列适配的载体。
本发明的另一目的在于提供含有编码胱硫醚-β-合成酶的多核苷酸序列的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码胱硫醚-β-合成酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)如SEQ ID NO.1-8所示序列的多核苷酸；
(ii)与如SEQ ID NO.1-8所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述胱硫醚-β-合成酶为酿酒酵母源或人源。
本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。
本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
本发明第四方面提供了一种制备胱硫醚-β-合成酶的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述胱硫醚-β-合成酶；
在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
在一些优选的方案中，用SB、TB、LB、SOC培养基培养所述的宿主细胞，更优选为用TB、和LB培养基培养所述的宿主细胞，最优选为用TB培养基培养所述的宿主细胞。
在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。
在一些优选的方案中，在温度为16至19℃下或35至39℃下培养所述宿主细胞。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至OD600在0.6至0.8，后使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：
将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。
在一些优选的方案中，所述层析柱为Ni-柱亲和层析柱(Ni-NTA)。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者
如本发明第二方面提供的表达载体；或者
如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者
或者根据本发明第四方面所述的方法制备的胱硫醚-β-合成酶。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
本发明中提供了基于原核表达体系的胱硫醚-β-合成酶表达方法，制备所得的胱硫醚-β-合成酶可溶性表达量大，适宜工业化生产，产物稳定性好，活性高；
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中酿酒酵母来源的胱硫醚-β-合成酶小量表达SDS-PAGE鉴定结果；
图2是根据本发明实施例中酿酒酵母来源的胱硫醚-β-合成酶另一小量表达SDS-PAGE鉴定结果；
图3根据本发明实施例中蜜蜂源的胱硫醚-β-合成酶小量表达SDS-PAGE鉴定结果；
图4是根据本发明实施例中人源的胱硫醚-β-合成酶小量表达SDS-PAGE鉴定结果；
图5是根据本发明实施例中酿酒酵母来源的胱硫醚-β-合成酶电泳图；
图6是根据本发明实施例中人来源的胱硫醚-β-合成酶镍柱电泳图；
图7是根据本发明实施例中胱硫醚-β-合成酶标准曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，筛选获得了在大肠杆菌中存在大量可溶表达的优化密码子序列本发明中还开发了基于原核系统的胱硫醚-β-合成酶的表达体系，所表达的胱硫醚-β-合成酶活性高，稳定性好。
本发明从大量含胱硫醚-β-合成酶的来源菌中获得目的蛋白序列，并根据目的蛋白序列分析得到编码目的蛋白的多核苷酸序列/基因序列，分别所得的若干多核苷酸序列/基因序列进行不同方式的同义密码子偏好性优化，得到若干优化密码子。利用这些优化密码子构建载体，并导入宿主细胞，诱导表达得到重组的目的蛋白。
获取目的基因/获取目的蛋白有关的核酸序列
本发明中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
不同生物来源的同种蛋白具有不同的氨基酸序列，以不同来源的目的蛋白为基础获得的基因序列，其重组表达产物通常具有不可预知的功能活性。在本发明的一个实施方式中，通过NCBI数据库对不同来源的目的蛋白的氨基酸序列进行分析，获得不同来源的目的基因序列信息。一些实施例中，通过NCBI数据库对酿酒酵母、蜜蜂和人源的胱硫醚-β-合成酶进行分析，获取酿酒酵母、蜜蜂和人源的胱硫醚-β-合成酶基因序列信息。
同义密码子偏好性优化
为克服在大肠杆菌中表达异源蛋白时产量降低的潜在问题，本发明涉及经同义密码子偏好性优化的多核苷酸序列。对获取的目的基因序列进行同义密码子偏好性优化，经同义密码子偏好性优化的不同来源的目的基因序列可表达与目的蛋白相同的氨基酸序列。本发明中获取了大量不同来源的胱硫醚-β-合成酶基因序列。在本发明的一些实施方式中，通过对酿酒酵母的胱硫醚-β-合成酶基因序列进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，获得了如SEQ IDNO:1所示的密码子。在另一实施方式中，通过对酿酒酵母源的胱硫醚-β-合成酶基因序列进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，获得若干优化密码子，示例性地如SEQ IDNO:1所示的优化密码子Ⅰ、如SEQ ID NO:4所示的优化密码子Ⅳ、如SEQ ID NO:5所示的优化密码子Ⅴ、和如SEQ ID NO:6所示的优化密码子Ⅵ。在另一实施方式中，通过对蜜蜂源的胱硫醚-β-合成酶基因序列进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，获得若干优化密码子，示例性地如SEQ IDNO:2所示的优化密码子Ⅱ和如SEQ ID NO:7所示的优化密码子Ⅶ。在另一实施方式中，通过对人源的胱硫醚-β-合成酶的基因序列进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，获得若干优化密码子，示例性地如SEQ ID NO:3所示的优化密码子Ⅲ。
同源目的蛋白，经不同方式同义密码子偏好性优化获得若干密码子，通常地，这些密码子虽可表达活性相当的目的蛋白，但不同密码子导入大肠杆菌的表达量，尤其是可溶性表达量差异明显。在本发明的一些实施方式中，优化密码子Ⅰ和优化密码子Ⅲ均存在可溶性表达，但其他优化密码子则均为包涵体表达，例如优化密码子Ⅱ。
本发明还涉及与SEQ ID NO:1-8所示序列的同源性大于80％，优选大于85％，更优选大于90％，更优选大于91％，更优选大于95％的多核苷酸；和与SEQ ID NO:1-8所示序列互补的多核苷酸。
目的基因的载体
本发明中还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。本发明中“载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的蛋白的片段，所述目的蛋白可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。本发明的一个实施例中选择pET-28a(+)作为载体，以获取更高效的表达效率。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。示例性地，使用DNA内切酶将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，然后将经密码子优化的目的基因片段连接于载体，可选用单酶切位点的黏端连接、双酶切片段的定向克隆、不同限制酶切位点的黏端连接、平端连接、人工接头连接或同寡核苷酸末端连接实现外源DNA片段的插入。
含有目的基因的载体转化宿主细胞
本发明还涉及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。含有经密码子优化的目的基因的载体可以通过已知的方法插入、转染或以其他方式转化到宿主细胞中，从而获得含有本发明经密码子优化的目的基因并能够表达目的蛋白的转化体。本发明中“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞，宿主细胞优选是细菌，并且优选是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌ROSETTA(DE3)菌种(Escherichia coli Rosetta(DE3)strain)。
制备目的蛋白的方法
本发明还涉及制备目的蛋白的方法，可利用本发明的多核苷酸序列表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
其中，步骤(1)含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的常规技术进行，当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，优选为SB、TB、LB或SOC培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。为促进目的蛋白的表达并提升可溶蛋白的表达量，本发明的一个优选的实施方式，使用TB或LB培养基培养的宿主细胞，且所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
为进一步促进目的蛋白的可溶性表达，在本发明的一个优选的实施方式中，培养宿主细胞至OD600在0.6-0.8之间后，采用IPTG进行诱导，并在17至19℃下或35至39℃下继续培养约8至12小时。当使用TB培养基在17至19℃下培养含有本发明中的多核苷酸的宿主细胞时，表达产物上清表达含量最高，产物上清表达占比高于使用LB培养基在17至19℃下培养、使用TB培养基在35至39℃下培养或使用LB培养基在35至39℃下培养。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。因此本发明中，在成功培养得到目的蛋白后，还涉及对其进行分离和纯化的步骤，例如步骤(3)中，从培养基中分离和纯化蛋白质以获得高纯度的目的蛋白。虽纯化目的蛋白的方法可是本领域技术人员熟知的常规手段，包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的优选的实施方式中提供了分离目的蛋白的方法，步骤包括：将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液；流动相包括BufferA、BufferB和/或BufferC；其中，BufferA包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl溶液(浓度1M)；BufferB包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、NaCl溶液(浓度1M)和咪唑(Imidazole)；BufferB包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl溶液(浓度1M)。
作为流动相中各组分之间配比的优选方案，例如BufferA中三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl溶液(浓度1M)的体积比为1:1；BufferB中，三羟甲基氨基甲烷(Tris)、NaCl溶液(浓度1M)和咪唑(Imidazole)的体积比为1:1:10；BufferA中三羟甲基氨基甲烷(Tris)和NaCl溶液(浓度1M)的体积比为1:1；BufferB中。
优选地，洗脱步骤中，所述洗脱的程序包括第一阶段、第二阶段；所述第一阶段中，使用的流动相为BufferA；所述第二阶段中，使用的流动相为BufferA和BufferB的混合物，其中，BufferA的体积百分含量从100％逐渐降低至40％，BufferB的体积百分含量从0％逐渐增加至60％。
更优选地，所述洗脱的程序还包括第三阶段，所述第三阶段中，使用的流动相为BufferB。
将洗脱纯化后的目的蛋白产品进行透析，并收集透析样品。透析样品可通过BCA法测量浓度，计算产量。
在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞(例如，“”)只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。
如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致或不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。
本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。
如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在(如果有的话)通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。
如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。
如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。例如，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。
如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。
如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1
本实施例中，合成了含有酿酒酵母菌属、蜜蜂源和人源的编码胱硫醚-β-合成酶的优化密码子的质粒，并将其导入大肠杆菌培养获得单克隆。
(1)构建胱硫醚-β-合成酶质粒
获取酿酒酵母菌属胱硫醚-β-合成酶的基因序列，并对其进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到若干优化后的密码子，示例性地如优化密码子Ⅰ(SEQ ID NO.1)、优化密码子Ⅳ(SEQ ID NO.4)、优化密码子Ⅴ(SEQ ID NO.5)、优化密码子Ⅵ(SEQ ID NO.6)，分别连接到pET-28a(+)载体，并委托苏州金维智生物科技有限公司合成。
获取蜜蜂来源的胱硫醚-β-合成酶的基因序列，并对其进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到若干优化后的密码子，示例性地如优化密码子Ⅱ(SEQ ID NO.2)、优化密码子Ⅶ(SEQ ID NO.7)。连接到pET-28a(+)载体，并委托苏州金维智生物科技有限公司合成。
获取人来源的胱硫醚-β-合成酶，并对其进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到若干优化后的密码子，示例性地如优化密码子Ⅲ(SEQ ID NO.3)。连接到pET-28a(+)载体，并委托苏州金维智生物科技有限公司合成。
获取人来源的胱硫醚-β-合成酶(氨基酸序列为SEQ ID NO.9)，分析得到编码其的基因序列，并对其进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化，得到若干优化后的密码子，示例性地如优化密码子Ⅷ(SEQ ID NO.8)。连接到pET-28a(+)载体，并委托苏州金维智生物科技有限公司合成。
(2)重组质粒导入宿主大肠杆菌
取上述步骤(1)中制备的表达质粒1μL，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，冰浴放置30min，42℃水浴45s，立刻冰上放置2min，加入400μL不含抗生素的SOC培养基，37℃、230rpm振荡培养45min。取100μL菌液均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。
SEQ ID NO.1
ATGACTAAATCCGAACAGCAGGCTGACTCTCGTCACAACGTCATCGATCTGGTTGGCAACACCCCGCTGATCGCGCTGAA
AAAACTGCCGAAAGCGCTGGGCATCAAGCCGCAAATCTATGCCAAACTGGAACTGTATAACCCGGGTGGCAGCATTAAAG
ACCGCATCGCAAAAAGCATGGTCGAGGAAGCGGAAGCGTCTGGCCGCATTCACCCGTCCCGTAGCACCCTGATCGAGCCG
ACCTCTGGTAACACTGGCATCGGTCTGGCGCTGATCGGTGCGATCAAAGGCTACCGTACTATCATCACGCTGCCGGAAAA
AATGTCTAACGAGAAAGTGTCCGTACTGAAAGCGCTGGGTGCCGAAATCATCCGTACCCCGACCGCGGCTGCCTGGGACT
CTCCGGAAAGCCATATCGGTGTGGCTAAAAAACTGGAGAAAGAAATCCCGGGCGCCGTGATCCTGGACCAGTACAACAAC
ATGATGAACCCGGAAGCGCATTACTTCGGTACCGGTCGTGAGATCCAACGTCAGCTGGAGGACCTGAACCTGTTCGACAA
CCTGCGTGCGGTAGTGGCAGGCGCGGGCACCGGTGGCACTATCTCTGGCATCTCCAAATACCTGAAAGAACAAAACGATA
AAATCCAGATTGTTGGTGCCGACCCGTTCGGCTCTATTCTGGCACAGCCGGAAAACCTGAACAAAACTGACATCACTGAC
TACAAAGTAGAGGGCATCGGTTACGATTTTGTGCCTCAGGTTCTGGACCGTAAACTGATTGACGTTTGGTACAAAACCGA
CGATAAACCAAGCTTCAAATACGCACGTCAACTGATTTCCAACGAGGGTGTACTGGTCGGTGGCTCTTCCGGCAGCGCCT
TCACCGCTGTTGTAAAATACTGTGAAGATCACCCGGAGCTGACCGAAGATGATGTTATCGTGGCAATCTTTCCGGACTCT
ATCCGTTCTTACCTGACTAAATTCGTCGATGATGAGTGGCTGAAAAAAAATAACCTGTGGGACGACGATGTCCTGGCTCG
TTTCGATTCCAGCAAACTGGAGGCTTCCACTACCAAATACGCGGACGTATTCGGCAATGCGACGGTCAAAGATCTGCATC
TGAAACCTGTAGTGTCTGTGAAAGAAACCGCGAAAGTAACGGACGTGATTAAAATCCTGAAAGACAACGGTTTTGACCAG
CTGCCGGTGCTGACCGAAGATGGCAAGCTGAGCGGTCTGGTTACGCTGTCCGAACTGCTGCGCAAACTGTCCATCAACAA
CTCCAACAATGACAACACTATTAAAGGTAAATACCTGGATTTCAAGAAACTGAACAACTTTAACGATGTTTCTTCCTATA
ACGAAAACAAATCTGGTAAAAAAAAGTTCATCAAATTCGATGAAAACAGCAAACTGTCCGATCTGAACCGTTTCTTCGAA
AAAAACTCTTCTGCAGTTATCACCGACGGCCTGAAGCCGATCCACATCGTCACTAAAATGGATCTGCTGTCTTACCTGGC
G
SEQ ID NO.2
ATGGAATTCAAACAGCCGAACCGTCCGTCTTATTGCACTTGGGAACTGAACGCCACTAACTCCCCGCACACCTGTCGTAC
TAAAAACGGTGACTACACCAAGATCATGCCTGACATCCTGACCGCGATCGGCCAGACTCCGCTGATTAAACTGAATAATA
TCCCAAAAAGCTACGGCATCAAATGCGAAATCTACGCGAAATGCGAGTTCCTGAACCCAGGTGGTTCTGTCAAGGACCGC
ATCGCGTATCGTATGATCCAGGATGCGGAGGACAAAGGCCTGCTGAAACCTGGCTGTACCATCATTGAACCTACCTCTGG
CAACACTGGCATCGGTCTGGCAATGGCTGCTGCTGTTCGTGGTTACAAATGCATTATCGTGATGCCGGAAAAAATGTCTG
ACGAAAAAATTTCCACCCTGTATGCGCTGGGTGCGAAGATCATCCGCACTCCGACCGAAGCTTCTTGGCACTCTCCTGAA
GCGCATATTAGCGTAGCTCAGAAACTGCAGAAAGAAATCCCGAACTCTATCATCCTGGATCAGTACACCAACCCGGGCAA
CCCACTGGCACATTACGACCAGACTGCTATCGAAATTTGGAAACAGTGCGAGGGTAAGATCGATTACCTGGTTGCAGGCG
CTGGTACCGGCGGTACCATTAGCGGCATTGGTCGTAAACTGAAAGAACTGTCCCCGAACATCAAAATCATCGCCGTGGAT
CCGAAAGGTTCTATCCTGGACCCGTCCTCTGATTCTCAGAACGAAGTGGGTTTCTACGAAGTAGAGGGTATCGGTTACGA
TTTCATTCCGACTGTTCTGGATCGCAACGTAATCGATAAATGGATCAAAACCGAAGATAACGAATCTCTGAACGCGGCTC
GCATGCTGATCCGCCAGGAAGGCCTGCTGTGTGGCGGTTCTTCCGGCGCCGCGCTGATTGCAGCTCTGAAGATTGCGAAA
GACATCCCGGAAGAAAAGCGTATGGTGATTATCCTGCCGGATGGTATCCGTAACTATCTGACCAAATTCGTGAGCGAATA
CTGGATGGAAACCCGTGGTTTCCTGCAGCCGGTGTGTCAGAACGAAATGAACAAATGGTGGTGGAACATGAAAATTAGCA
ATCTGTCCTTTGACAAACAGTCTCTGCTGAAAGAAAACACCGTCACCTGCCAGGAAGCCATGCACATGCTGAAGAACGCG
GACTCTCAGCTGCTGGTAATCAGCGACGACAACATTCACATCAAAGGTGTTATCTCCCTGAACAAGCTGACTTCTTACGT
TATCTCCGGCATCGTTAAATGCACCGATTTTGTTGATAAAGCCATGGTGAAACAGTATGTAAAAGTTAAACACTCCGCGA
CCCTGGGCTACATCTCTCGCGTGCTGGAAAAAGAACCGTACGTGATCATTCTGGATGACGAACACGATGACGCGTTCATT
GGTATTGTTAATCAATTTCACATTCTGCAATTCATTACCAAAAATGGTACTTCTAACAACTACCTGATCAACSEQ ID NO.3
ATGCCATCCGAAACTCCTCAGGCTGAAGTAGGTCCAACTGGTTGCCCGCACCGTTCTGGTCCACACTCTGCTAAGGGCAG
CCTGGAAAAAGGCTCTCCGGAGGACAAAGAGGCGAAAGAACCGCTGTGGATTCGTCCGGATGCGCCTAGCCGTTGTACCT
GGCAGCTGGGTCGTCCGGCTTCTGAATCTCCACATCACCATACCGCTCCAGCTAAGTCCCCGAAAATTCTGCCGGATATC
CTGAAAAAAATCGGTGACACCCCGATGGTCCGTATCAACAAAATCGGCAAAAAGTTTGGTCTGAAATGCGAACTGCTGGC
GAAATGCGAATTCTTCAATGCAGGTGGCTCTGTTAAAGACCGTATTTCCCTGCGTATGATTGAAGACGCAGAACGTGACG
GTACTCTGAAACCGGGTGATACTATTATTGAGCCTACTTCTGGTAATACTGGTATTGGTCTGGCTCTGGCTGCTGCTGTT
CGTGGCTACCGCTGTATCATCGTTATGCCGGAAAAAATGTCCTCCGAAAAAGTTGACGTACTGCGTGCTCTGGGCGCTGA
GATTGTTCGCACCCCGACCAACGCACGCTTCGATTCTCCGGAATCCCACGTTGGTGTAGCTTGGCGCCTGAAAAACGAAA
TTCCGAACTCCCATATTCTGGATCAGTACCGCAACGCCTCCAACCCGCTGGCTCACTATGACACTACCGCGGATGAAATC
CTGCAGCAGTGCGATGGTAAACTGGACATGCTGGTTGCAAGCGTTGGTACCGGCGGTACTATCACCGGCATCGCACGTAA
ACTGAAGGAAAAATGTCCGGGTTGTCGTATCATTGGTGTCGATCCGGAAGGTTCTATCCTGGCCGAACCAGAAGAACTGA
ACCAGACGGAACAGACCACGTATGAGGTGGAGGGCATCGGCTACGACTTTATCCCGACTGTACTGGACCGTACCGTTGTG
GATAAATGGTTCAAAAGCAACGATGAAGAAGCGTTCACGTTTGCACGCATGCTGATCGCTCAAGAGGGTCTGCTGTGTGG
TGGTTCCGCAGGTTCTACCGTAGCAGTAGCAGTGAAAGCCGCTCAGGAGCTGCAAGAAGGCCAGCGTTGTGTGGTTATCC
TGCCGGATAGCGTGCGCAACTACATGACCAAATTCCTGTCCGACCGCTGGATGCTGCAGAAAGGCTTCCTGAAGGAAGAA
GACCTGACCGAGAAGAAACCGTGGTGGTGGCACCTGCGTGTTCAGGAACTGGGTCTGTCTGCACCGCTGACTGTTCTGCC
GACTATCACCTGTGGCCATACCATCGAGATCCTGCGTGAAAAAGGTTTCGACCAAGCGCCGGTGGTAGACGAAGCAGGTG
TTATCCTGGGCATGGTTACCCTGGGCAACATGCTGTCTTCCCTGCTGGCGGGCAAAGTTCAGCCGTCTGATCAGGTAGGC
AAAGTAATCTATAAACAGTTCAAACAGATCCGCCTGACCGATACTCTGGGCCGTCTGAGCCATATTCTGGAAATGGATCA
TTTCGCGCTGGTTGTTCACGAACAGATCCAGTACCATTCCACCGGCAAATCCTCTCAGCGTCAGATGGTTTTTGGTGTTG
TTACCGCCATCGACCTGCTGAACTTTGTGGCGGCTCAGGAACGTGATCAGAAA
SEQ ID NO.4：
ATGACAAAATCCGAACAGCAGGCCGATTCTCGGCATAACGTTATTGACCTCGTAGGGAACACGCCGCTTATTGCACTTAA
AAAATTGCCAAAGGCCTTGGGCATCAAACCGCAAATCTATGCGAAACTTGAACTTTATAACCCGGGAGGTAGTATTAAAG
ATCGAATTGCAAAATCGATGGTCGAAGAAGCGGAAGCCTCAGGCCGAATCCATCCGTCTAGAAGCACGCTCATTGAACCA
ACCTCCGGTAATACGGGAATTGGACTGGCGCTGATTGGAGCCATCAAGGGCTATAGAACAATTATTACATTGCCGGAAAA
AATGTCAAATGAAAAAGTTAGTGTTCTTAAAGCCTTAGGGGCGGAAATCATAAGAACACCGACTGCTGCGGCATGGGACT
CCCCTGAATCTCACATTGGTGTCGCCAAAAAGCTGGAAAAAGAAATTCCAGGAGCCGTCATTCTTGATCAGTATAACAAT
ATGATGAACCCGGAAGCACATTATTTTGGTACGGGCCGCGAAATCCAACGCCAACTCGAAGACCTTAACTTATTTGACAA
TCTCCGGGCGGTCGTCGCTGGAGCTGGAACCGGCGGGACGATCTCTGGTATTTCTAAATACCTGAAAGAACAGAATGATA
AAATTCAAATTGTTGGTGCAGACCCGTTTGGATCCATTCTCGCGCAGCCGGAAAATCTGAACAAGACTGATATTACAGAT
TATAAAGTCGAAGGCATCGGTTATGATTTCGTCCCGCAGGTTTTAGATCGTAAACTTATTGATGTATGGTATAAGACAGA
TGACAAGCCGTCATTTAAATACGCTCGTCAGCTTATTAGCAACGAAGGAGTCCTTGTGGGCGGCTCCTCTGGAAGCGCAT
TCACGGCGGTTGTCAAGTATTGCGAAGATCATCCTGAACTGACAGAGGATGATGTTATTGTTGCTATTTTTCCGGACAGC
ATTCGGTCTTACTTAACTAAGTTTGTAGATGATGAATGGCTGAAAAAAAATAATCTTTGGGACGATGACGTGCTCGCCAG
ATTCGATTCGTCAAAATTAGAAGCTTCCACAACCAAATATGCAGATGTTTTTGGCAACGCAACAGTGAAAGATCTTCATC
TCAAACCTGTCGTCTCGGTGAAAGAAACGGCTAAAGTTACAGACGTAATTAAAATACTTAAAGATAATGGCTTTGATCAA
TTACCAGTGTTAACCGAGGACGGGAAATTGTCGGGGTTAGTTACGCTGAGCGAACTGTTGCGTAAACTTTCGATAAACAA
CTCTAATAATGATAACACCATTAAGGGCAAATATTTGGACTTTAAAAAACTTAATAATTTTAACGACGTATCTTCATACA
ATGAGAATAAAAGCGGCAAAAAGAAATTCATCAAATTTGATGAGAATTCAAAATTGAGCGATCTGAATAGATTTTTTGAA
AAGAACAGCTCTGCTGTTATTACAGATGGACTTAAACCGATCCATATAGTCACTAAAATGGACCTGCTGTCTTATTTGGC
A
SEQ ID NO.5：
ATGACCAAATCAGAGCAACAGGCTGATTCCAGGCACAACGTGATAGATTTAGTTGGAAATACACCCTTGATAGCCTTAAA
GAAACTGCCAAAAGCTCTTGGTATCAAGCCTCAAATTTACGCCAAGTTGGAGTTATACAATCCCGGTGGATCTATCAAGG
ATAGGATCGCCAAGTCCATGGTAGAAGAAGCCGAAGCCTCCGGTCGAATTCATCCATCTAGATCCACTTTGATTGAGCCA
ACAAGTGGAAACACAGGTATTGGTCTGGCATTGATTGGTGCTATTAAGGGATATAGAACCATTATTACCTTGCCCGAAAA
GATGTCTAACGAAAAGGTTTCTGTTTTGAAAGCTTTGGGTGCTGAAATCATCAGAACCCCAACCGCTGCCGCCTGGGACT
CCCCAGAATCCCACATTGGTGTGGCTAAGAAGCTGGAGAAAGAGATCCCAGGAGCCGTAATCTTGGACCAATACAATAAC
ATGATGAACCCTGAGGCACATTACTTTGGAACTGGTAGAGAGATCCAAAGACAATTGGAAGATTTGAACTTGTTCGACAA
CTTGCGAGCCGTGGTTGCTGGAGCTGGCACCGGTGGTACAATTTCAGGTATTTCCAAATATTTGAAAGAGCAGAATGACA
AGATTCAGATCGTCGGAGCTGATCCATTCGGATCAATCCTGGCTCAACCAGAAAACTTGAACAAAACCGATATCACCGAT
TACAAGGTTGAAGGTATTGGTTACGATTTTGTTCCTCAAGTCTTGGACAGGAAGTTGATTGACGTTTGGTATAAAACAGA
CGATAAGCCAAGTTTTAAGTATGCACGTCAATTAATTTCTAATGAAGGCGTTTTGGTTGGTGGTTCTTCTGGATCAGCTT
TTACGGCCGTTGTTAAGTATTGTGAAGATCACCCTGAATTGACAGAAGATGACGTTATCGTTGCAATTTTCCCCGATTCA
ATCAGATCCTATCTTACCAAATTTGTCGATGATGAATGGTTGAAGAAGAACAACCTTTGGGACGATGATGTACTGGCTAG
ATTTGACTCCTCCAAGCTGGAGGCTAGTACTACAAAGTACGCTGACGTTTTTGGCAACGCTACGGTTAAAGATTTGCATC
TAAAACCCGTTGTCTCTGTCAAAGAGACAGCTAAGGTTACCGATGTAATAAAGATCTTGAAAGACAACGGTTTTGATCAA
CTGCCAGTTTTGACTGAGGACGGAAAATTGTCCGGCCTTGTTACTCTTTCTGAGTTGTTGCGAAAACTAAGTATCAACAA
TTCTAATAATGATAACACCATCAAGGGAAAATATCTAGATTTTAAGAAGCTAAACAATTTTAACGACGTCAGTTCCTACA
ACGAGAATAAATCTGGCAAGAAAAAATTTATAAAGTTCGATGAAAATAGTAAGTTATCAGATCTTAATCGATTTTTCGAG
AAAAATAGTTCCGCTGTCATTACAGATGGTTTGAAGCCAATTCATATTGTCACCAAAATGGACCTACTATCTTATCTTGC
T
SEQ ID NO.6：
ATGACCAAGTCAGAACAGCAAGCTGATTCTAGACACAATGTCATAGATCTGGTGGGAAATACCCCATTGATCGCTCTAAA
GAAATTGCCTAAGGCGTTGGGCATTAAACCACAAATATATGCTAAACTGGAACTATACAACCCAGGGGGTTCCATCAAGG
ATAGAATTGCTAAGTCCATGGTCGAAGAGGCGGAGGCGTCTGGAAGAATCCATCCATCTAGGTCCACACTAATTGAACCT
ACATCCGGTAATACTGGGATTGGTTTAGCCCTAATCGGTGCCATCAAAGGTTACAGAACTATTATTACCTTGCCAGAGAA
AATGAGTAATGAGAAAGTTTCTGTACTTAAGGCTCTAGGTGCCGAAATTATAAGAACTCCAACTGCAGCTGCTTGGGATT
CTCCAGAAAGCCATATCGGGGTTGCAAAGAAGCTAGAAAAAGAAATTCCTGGCGCAGTTATTCTTGACCAGTACAATAAT
ATGATGAATCCAGAGGCCCACTACTTCGGTACTGGCCGTGAAATTCAAAGACAATTAGAAGATTTGAACTTGTTTGACAA
CCTGCGTGCGGTTGTTGCTGGTGCAGGAACCGGAGGTACTATAAGCGGTATCAGCAAATATCTTAAAGAGCAGAACGATA
AAATACAGATTGTTGGTGCCGATCCATTTGGTTCAATACTTGCACAACCCGAAAACCTGAATAAGACTGATATTACTGAT
TACAAAGTCGAAGGAATTGGATACGACTTCGTTCCTCAGGTGCTTGATAGAAAATTAATAGACGTGTGGTATAAGACAGA
TGACAAGCCATCTTTCAAATATGCTAGGCAGTTGATTTCCAACGAAGGAGTGTTAGTGGGTGGATCTTCAGGATCTGCGT
TCACGGCAGTCGTGAAATATTGCGAAGACCATCCAGAATTGACAGAAGATGATGTTATAGTAGCTATTTTTCCAGACTCT
ATCCGTAGTTATTTAACTAAGTTTGTTGACGATGAATGGTTAAAGAAAAACAACTTGTGGGACGACGATGTACTTGCTAG
ATTTGACTCCAGCAAATTGGAAGCTTCTACTACCAAATATGCCGATGTTTTTGGTAATGCCACTGTCAAGGATCTGCATC
TAAAACCTGTGGTCTCAGTGAAGGAAACAGCGAAGGTCACTGATGTGATCAAAATTTTAAAAGATAATGGTTTTGATCAA
TTACCAGTTTTGACGGAGGATGGTAAGTTGTCCGGGCTTGTCACCTTGTCAGAACTACTTAGAAAATTATCTATTAATAA
CAGTAACAATGATAATACCATAAAAGGTAAGTATTTAGATTTTAAGAAACTGAATAATTTTAATGACGTCTCCTCTTATA
ACGAGAATAAATCTGGCAAAAAGAAGTTTATCAAATTTGATGAGAATTCTAAACTAAGCGATTTGAATAGATTTTTTGAA
AAGAACTCATCCGCTGTTATTACTGATGGTCTTAAACCTATACATATTGTGACGAAAATGGATTTATTGTCTTATCTGGC
A
SEQ ID NO.7：
ATGGAATTTAAGCAACCGAATCGTCCGTCTTACTGTACGTGGGAACTGAATGCAACCAACAGTCCACACACGTGCAGAAC
GAAGAATGGAGACTATACCAAAATTATGCCAGATATCCTTACAGCGATCGGACAGACCCCGTTGATTAAACTTAATAATA
TCCCGAAATCATACGGAATTAAGTGTGAGATCTATGCGAAGTGCGAATTTCTCAATCCGGGTGGGTCGGTCAAAGATCGA
ATAGCATACCGAATGATACAGGATGCGGAAGATAAAGGGCTTCTCAAGCCGGGTTGTACGATCATCGAACCAACAAGTGG
CAATACAGGAATCGGGCTGGCGATGGCGGCCGCAGTCCGCGGATATAAATGTATCATTGTTATGCCGGAAAAGATGTCAG
ACGAAAAAATTAGCACGCTTTATGCGCTGGGAGCTAAGATTATACGTACGCCTACAGAGGCATCGTGGCATTCACCGGAG
GCACATATCTCCGTTGCTCAAAAGCTTCAAAAAGAAATTCCGAATAGCATTATTCTCGATCAGTATACAAACCCGGGCAA
TCCTCTGGCTCATTATGATCAGACAGCTATCGAAATCTGGAAACAGTGTGAAGGTAAGATTGATTATCTTGTCGCTGGGG
CTGGTACAGGCGGGACAATCTCTGGTATTGGCCGTAAACTGAAAGAACTTTCCCCAAACATTAAGATTATCGCAGTGGAT
CCTAAAGGATCGATTCTTGATCCGAGCTCAGATAGCCAAAATGAAGTTGGCTTTTATGAAGTAGAAGGTATTGGATATGA
TTTTATTCCAACAGTGCTGGACAGAAACGTCATTGACAAGTGGATCAAAACTGAGGATAACGAAAGCTTAAATGCCGCTA
GAATGTTAATCCGCCAGGAGGGGCTGCTGTGCGGAGGATCGAGCGGGGCTGCGTTAATTGCGGCATTAAAAATTGCCAAA
GACATCCCGGAAGAAAAGCGTATGGTTATCATCTTACCTGACGGAATTCGTAATTATCTGACTAAATTCGTTTCTGAATA
TTGGATGGAGACACGTGGATTTTTGCAGCCAGTTTGCCAGAATGAGATGAACAAATGGTGGTGGAACATGAAGATCTCAA
ATTTGTCATTTGACAAACAAAGCCTCCTCAAAGAAAATACCGTCACGTGTCAGGAGGCGATGCACATGCTTAAAAATGCT
GATAGCCAGTTACTGGTAATCTCTGACGATAATATCCATATCAAAGGAGTTATTTCCTTAAACAAATTAACTAGCTATGT
CATCTCCGGCATTGTAAAGTGCACAGATTTTGTTGATAAAGCGATGGTAAAACAATATGTCAAAGTGAAACACTCTGCAA
CTCTTGGGTATATCAGCAGAGTCCTCGAAAAGGAACCTTATGTTATCATTTTAGATGATGAGCACGATGACGCGTTCATT
GGGATCGTCAATCAGTTTCATATTCTGCAATTTATCACAAAAAATGGCACGAGCAATAACTATTTAATTAATSEQ ID NO.8：
ATGCCGTCTGAAACCCCACAAGCTGAAGTGGGTCCTACTGGTTGTCCTCATCGTTCTGGCCCACACTCCGCCAAAGGCTC
TCTGGAAAAAGGTAGCCCGGAGGACAAAGAAGCTAAAGAACCGCTGTGGATCCGTCCGGATGCACCGTCTCGTTGCACTT
GGCAGCTGGGTCGTCCTGCGTCTGAATCTCCACACCACCACACCGCGCCAGCAAAGTCTCCGAAGATCCTGCCAGACATC
CTGAAGAAAATTGGTGATACCCCGATGGTTCGCATCAACAAAATCGGTAAAAAATTCGGTCTGAAATGCGAACTGCTGGC
AAAGTGTGAATTCTTCAACGCTGGCGGTTCTGTTAAAGATCGCATCTCTCTGCGTATGATCGAGGACGCTGAACGTGACG
GCACCCTGAAACCGGGCGACACTATTATTGAACCGACCTCCGGTAATACTGGTATCGGTCTGGCTCTGGCTGCCGCTGTA
CGTGGTTACCGTTGCATCATTGTAATGCCGGAAAAAATGTCTTCTGAAAAGGTCGACGTTCTGCGTGCACTGGGTGCAGA
GATCGTACGCACTCCGACCAACGCACGTTTCGATAGCCCGGAATCCCATGTTGGTGTGGCCTGGCGTCTGAAGAACGAAA
TTCCGAACAGCCACATCCTGGACCAGTACCGTAACGCGTCTAACCCACTGGCTCACTATGATACCACCGCGGACGAAATC
CTGCAGCAGTGCGATGGTAAACTGGACATGCTGGTAGCATCTGTGGGTACTGGTGGCACCATTACCGGTATCGCCCGTAA
ACTGAAAGAAAAATGCCCGGGTTGCCGTATTATCGGTGTTGATCCGGAAGGTTCTATCCTGGCGGAGCCGGAAGAACTGA
ACCAGACTGAGCAGACGACCTATGAAGTTGAAGGTATCGGTTATGACTTTATTCCGACCGTTCTGGACCGTACGGTTGTT
GACAAGTGGTTCAAATCCAACGATGAAGAAGCTTTCACCTTCGCGCGTATGCTGATCGCACAGGAAGGTCTGCTGTGCGG
TGGTTCTGCTGGTTCTACCGTGGCTGTTGCGGTTAAGGCGGCTCAAGAGCTGCAGGAAGGTCAGCGTTGTGTCGTTATTC
TGCCTGACAGCGTTCGCAACTATATGACGAAGTTCCTGTCCGACCGTTGGATGCTGCAGAAGGGTTTCCTGAAAGAAGAA
GACCTGACCGAAAAAAAACCGTGGTGGTGGCATCTGCGT
SEQ ID NO.9
MPSETPQAEVGPTGCPHRSGPHSAKGSLEKGSPEDKEAKEPLWIRPDAPSRCTWQLGRPASESPHHHTAPAKSPKILPDI
LKKIGDTPMVRINKIGKKFGLKCELLAKCEFFNAGGSVKDRISLRMIEDAERDGTLKPGDTIIEPTSGNTGIGLALAAAV
RGYRCIIVMPEKMSSEKVDVLRALGAEIVRTPTNARFDSPESHVGVAWRLKNEIPNSHILDQYRNASNPLAHYDTTADEI
LQQCDGKLDMLVASVGTGGTITGIARKLKEKCPGCRIIGVDPEGSILAEPEELNQTEQTTYEVEGIGYDFIPTVLDRTVV
DKWFKSNDEEAFTFARMLIAQEGLLCGGSAGSTVAVAVKAAQELQEGQRCVVILPDSVRNYMTKFLSDRWMLQKGFLKEE
DLTEKKPWWWHLR
实施例2
本实施例中，取实施例1中制备获得的三种不同的单克隆，无菌操作接种于含100μg/mL卡那抗性的LB培养基中，做两个重复，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导，分别放置于37℃和18℃振荡培养过夜。取样超声破碎进行SDS-PAGE鉴定。鉴定结果参考图1-4。3个来源的胱硫醚-β-合成酶小量表达测试的结果如下表1。
图1中，第3、5列为含有优化密码子Ⅰ的单克隆37℃培养表达结果，第6-7列为含有优化密码子Ⅰ的单克隆18℃培养表达结果，第10-11列为含有优化密码子Ⅳ的单克隆37℃培养表达结果,12-13列为含有优化密码子Ⅳ的单克隆18℃培养表达结果。
图2中，第4-5列为含有优化密码子Ⅴ的单克隆37℃培养表达结果，第6-7列为含有优化密码子Ⅴ的单克隆18℃培养表达结果，第10-11列为含有优化密码子Ⅵ的单克隆37℃培养表达结果,12-13列为含有优化密码子Ⅵ的单克隆18℃培养表达结果。
图3中，第3-4列为含有优化密码子Ⅱ的单克隆37℃培养表达结果，第5-6列为含有优化密码子Ⅱ的单克隆18℃培养表达结果，第9、11列为含有优化密码子Ⅶ的单克隆37℃培养表达结果,12-13列为含有优化密码子Ⅶ的单克隆18℃培养表达结果。
图4中，第3-4列为含有优化密码子Ⅲ的单克隆18℃培养表达结果，第6-7列为含有优化密码子Ⅷ的单克隆18℃培养表达结果。
表1
由表1可知，无论是18℃还是37℃下，酒酿酵母来源的胱硫醚-β-合成酶若干优化密码子均有可溶性表达，目的蛋白分子量约56kda。18℃下人源的胱硫醚-β-合成酶优化密码子有可溶性表达。无论是18℃还是37℃下，蜜蜂来源的胱硫醚-β-合成酶优化密码子均为包涵体表达。
实施例3
选择酿酒酵母和人来源的胱硫醚-β-合成酶单克隆进行扩大培养和纯化。分别称取约4g酿酒酵母和人来源的胱硫醚-β-合成酶的重组菌体，加入20ml Lysis Buffer在冰上使用分散机分散。超声破碎细胞：Ф10探头，功率10％，工作5.5s，停止9.9s，超声破碎30min。20000rpm，4℃离心30min，取上清，0.22μm膜过滤。用1ml Ni-NTA纯化，纯化所用试剂组成见表2。流动相流速为0.5ml/min，上完样使用20ml Lysis Buffer冲洗UV和电导至基线。洗脱程序包括：Step 1:0％B，10CV，1.5ml/min；Step 2:0—60％B，20CV，1.5ml/min；Step 3:100％B，15CV，1.5ml/min。
表2
对含有酿酒酵母源和人源优化密码子的菌体培养所得的重组胱硫醚-β-合成酶纯化产物进行收样电泳。酿酒酵母源重组胱硫醚-β-合成酶可以挂柱，100mM咪唑下洗脱。根据SDS结果收集洗脱液进行透析，收集样品，采用BCA测浓度，并计算收率。
含有优化密码子Ⅰ、优化密码子Ⅳ、优化密码子Ⅴ、优化密码子Ⅵ的重组菌体培养纯化产物收率统计见下表3。
表3
密码子 浓度/mg/ml 产量/mg 收率/mg/g菌
优化密码子Ⅰ 3.038 54.681 13.7
优化密码子Ⅳ 2.326 39.542 9.9
优化密码子Ⅴ 1.563 26.571 6.6
优化密码子Ⅵ 2.458 41.786 10.4
根据SDS结果选择洗脱液2D4-2E4进行透析，透析后得到的样品18ml。采用BCA测浓度，结果为：R2＝0.997，其浓度为3.038mg/ml，产量为54.681mg，得率为13.7mg/g菌。代表性电泳图谱见图5(图5为含有优化密码子Ⅰ菌体培养所得的重组胱硫醚电泳图)。
收集重组人源胱硫醚-β-合成酶纯化产产物，装入10KD的透析袋中放入1000ml的1XPBS中搅拌过夜透析，第二天样品全部析出沉淀，蛋白的胶体稳定性差。代表性电泳图见图6(同样6为含有优化密码子Ⅲ菌体培养所得的重组胱硫醚电泳图)。
实施例4
本实施例中，取纯化后的酿酒酵母来源的胱硫醚-β-合成酶进行后续的酶活检测实验。具体步骤如下：
(1)溶液配制
茚三酮溶液：准确称取1g茚三酮，用H2O定容至100ml。
0.1M丝氨酸溶液：准确称取0.105g丝氨酸，用H2O定容至10ml
12.5mM磷酸吡哆醛溶液(PLP)：准确称取0.03g磷酸吡哆醛，用H2O定容至10ml。
12.5mM S-腺苷基蛋氨酸：准确称取0.01865g S-腺苷基蛋氨酸，用H2O定容至10ml。
阳性酶(胱硫醚-β-合成酶)的配置：将1610U阳性酶溶于1mL PBS pH 7.4缓冲液中，制成1.6U/μL的酶液，按照梯度再逐步稀释，稀释液为PBS pH 7.4缓冲液。
(2)仪器检测
酶标仪预热30min，按照下表3配制50μL反应体系，空白对照不加酶，37℃孵育5min后，各管加入下表4的试剂。7℃孵育1h后，冰浴5min，各管加3mL茚三酮，沸水浴5min显色，冰浴5min终止反应，室温静置20min。酶标仪程序设定：空白管、测定管分别加入200μL检测工作液，在453nm处检测吸光值分别为A1、A2，计算样品与空白的OD差值A2-A1，标准曲线见图7。
表3
试剂 加入体积
100mM Tris-HCl(pH8.6) 2μL
0.1M丝氨酸 40μL
12.5mM PLP 4μL
12.5mM S-腺苷基蛋氨酸 4μL
胱硫醚-β-合成酶 5μL
表4
试剂 加入体积
0.2M同型半胱氨酸 20μL
1M DTT 0.5μL
dd H2O 127μL
将本发明中制备的酿酒酵母来源的胱硫醚-β-合成酶按照上述方法测吸光度，结果如下表5。
表5
经纯化的酿酒酵母来源的胱硫醚-β-合成酶原液浓度为3.038mg/mL，平均活力为0.79U/μL，则比活力为(0.79*1000)/3.038＝260U/mg。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.一种编码胱硫醚-β-合成酶的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)如SEQ ID NO.1-8所示的多核苷酸；
(ii)与如SEQ ID NO.1-8所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)与(i)或(ii)中所述的序列互补的多核苷酸。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达His×6标签的多核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求1所述的多核苷酸。
6.一种制备胱硫醚-β-合成酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
使含有如权利要求1所述的多核苷酸载体转化宿主细胞；
培养所述宿主细胞，以表达所述胱硫醚-β-合成酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用TB或LB培养基培养所述的宿主细胞；
和/或，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
和/或，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者
如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者
如权利要求5所述的宿主细胞；或者
根据权利要求6至7中任一项所述的方法所制备的胱硫醚-β-合成酶。
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