CN116926091A - 门冬氨酸氨基转移酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种门冬氨酸氨基转移酶及其制备方法和应用。本申请中，提供一种编码门冬氨酸氨基转移酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。本申请提供的多核苷酸经过密码子优化，在大肠杆菌体系中在实现野猪门冬氨酸氨基转移酶大量可溶性表达，产物稳定性好、催化活性高，为后续其作为质控品以及试剂盒用酶提供了便捷的生产方法。
Description
技术领域
本发明设计基因工程领域，特别涉及门冬氨酸氨基转移酶及其制备方法和应用。
背景技术
门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)，旧称谷草转氨酶，是一种磷酸吡哆醛依赖型酶。酶由两个相同的亚基构成，亚基分子量在45kDa，含有413个氨基酸残基。门冬氨酸氨基转移酶催化L-天冬氨酸和α-酮戊二酸生成草酰乙酸和L-谷氨酸的可逆反应(Toney Michael D.Aspartate aminotransferase:An old dog teaches newtricks.Archives of Biochemistry and Biophysics,544,119-127.)在体内具有多种生理代谢功能。
在临床上，AST同样具有重要的诊断学意义(Giannini Edoardo,Risso Domenico,Botta Federica,Chiarbonello Bruno.Validity and Clinical Utility of theAspartate Aminotransferase-Alanine Aminotransferase Ratio in AssessingDisease.Severity and Prognosis in Patients With Hepatitis C Virus-RelatedChronic Liver Disease.Archives of Internal Medicine,2003,163(2)：218-224)，AST的活性广泛分布在人体组织中，其中心脏、肝脏、骨骼肌、肾脏和大脑的活性最高，AST在血液中的正常浓度为5～40U-1，当心肌细胞受到损伤，门冬氨酸氨基转移酶会大量释放到人体血液中，导致血液中门冬氨酸氨基转移酶升高；当肝细胞受到损伤时，同样会检测到血液中门冬氨酸氨基转移酶的值升高(Xing-Jiu Huang,Yang-Kyu Choi,Hyung-Soon Im,OktayYarimaga,Euisik Yoon and Hak-Sung Kim.Aspartate Aminotransferase(AST/GOT)andAlanine Aminotransferase(ALT/GPT)Detection Techniques.Sensors 2006,6,756-782)。由于血清中AST的含量直接关系到组织的受损程度以及肝脏的病变程度，对于肝硬化、肝纤维化、肝癌的检测非常准确。现有的制备门冬氨酸氨基转移酶的方法多存在产物稳定性不足、不利于纯化和批量生产等缺点，因此，本领域十分需要开发一种产物稳定、利于纯化和批量生产的门冬氨酸氨基转移酶的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种门冬氨酸氨基转移酶。
本发明的另一目的在于提供一种编码上述门冬氨酸氨基转移酶的多核苷酸。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述多核苷酸的表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述表达载体的宿主细胞。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述门冬氨酸氨基转移酶的方法。
本发明的另一目的在于，提供一种含有上述门冬氨酸氨基转移酶的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种编码门冬氨酸氨基转移酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明第二方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达(His)6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的碳端连接有表达(His)6标签的多核苷酸序列。
在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。
本发明第三方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
本发明第四方面提供了一种制备门冬氨酸氨基转移酶的方法，所述方法包括步骤：
培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述门冬氨酸氨基转移酶；
其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞的温度为18至37℃。
在一些优选的方案中，当所述宿主细胞培养至OD600为0.6至0.8时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，所述亲和层析法所用的流动相包括Tris-HCl、NaCl、甘油和咪唑。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者
如本发明第二方面提供的表达载体；或者
如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者
根据本发明第四方面所述的方法制备的门冬氨酸氨基转移酶。
本发明的第六方面提供了一种门冬氨酸氨基转移酶的纯化方法，所述纯化方法包括步骤：
使分离所得的门冬氨酸氨基转移酶通过Ni-亲和层析柱进行线性洗脱，洗脱所用流动相由Buffer A和Buffer B组成，按照buffer A和Buffer B总体积为100％计，所述流动相中Buffer B的体积百分含量由0％线性递增至100％，其中，Buffer A包括Tris-HCl、NaCl和甘油；Buffer B包括Tris-HCl、NaCl、甘油和咪唑。
在一些更优选的方案中，buffer A中所述Tris-HCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述NaCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述甘油的体积百分含量为3至7％，例如5％。
在一些更优选的方案中，buffer B中所述Tris-HCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述NaCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述甘油的体积百分含量为3至7％，例如5％；和，所述咪唑的浓度为400至600mM，例如500mM。
在一些优选的方案中，所述buffer A和buffer B的pH均为7.8至8.2，例如8.0。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明提供的多核苷酸经过密码子优化，在大肠杆菌体系中实现野猪门冬氨酸氨基转移酶大量可溶性表达，产物稳定性好、催化活性高，为后续其作为质控品以及试剂盒用酶提供了便捷的生产方法；
(2)本发明提供的纯化门冬氨酸氨基转移酶的方法纯化效率高，纯化所得产物活性维持好。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中目的蛋白SDS-PAGE鉴定结果图；
图2是根据本发明实施例中目的蛋白电泳图；
图3是根据本发明实施例中门冬氨酸氨基转移酶标准曲线图。
具体实施方式
现有技术中制备门冬氨酸氨基转移酶的方法多存在产物稳定性不足、不利于纯化和批量生产等缺点，本发明人通过详尽的实验研究，开发了一种基于基因工程的门冬氨酸氨基转移酶的生产方法，所用碱基序列进行同义密码子偏好性优化，优化后的多核苷酸在大肠杆菌表达系统中可以稳定高效的表达。
本发明的一些实施方式中提供了一种编码门冬氨酸氨基转移酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明的另一些实施方式中，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达(His)6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的碳端连接有表达(His)6标签的多核苷酸序列。
在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。
本发明的另一些实施方式中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
本发明的另一些实施方式中，提供了一种制备门冬氨酸氨基转移酶的方法，所述方法包括步骤：
培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述门冬氨酸氨基转移酶；
其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞的温度为18至37℃。
在一些优选的方案中，当所述宿主细胞培养至OD600为0.6至0.8时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，所述亲和层析法所用的流动相包括Tris-HCl、NaCl、甘油和咪唑。
本发明的另一些实施方式中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者
如本发明第二方面提供的表达载体；或者
如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者
根据本发明第四方面所述的方法制备的门冬氨酸氨基转移酶。
本发明的另一些实施方式中，提供了一种门冬氨酸氨基转移酶的纯化方法，所述纯化方法包括步骤：
使分离所得的门冬氨酸氨基转移酶通过Ni-亲和层析柱进行线性洗脱，洗脱所用流动相由Buffer A和Buffer B组成，按照buffer A和Buffer B总体积为100％计，所述流动相中Buffer B的体积百分含量由0％线性递增至100％，其中，Buffer A包括Tris-HCl、NaCl和甘油；Buffer B包括Tris-HCl、NaCl、甘油和咪唑。
在一些更优选的方案中，buffer A中所述Tris-HCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述NaCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述甘油的体积百分含量为3至7％，例如5％。
在一些更优选的方案中，buffer B中所述Tris-HCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述NaCl的浓度为40至60mM，例如50mM；所述甘油的体积百分含量为3至7％，例如5％；和，所述咪唑的浓度为400至600mM，例如500mM。
在一些优选的方案中，所述buffer A和buffer B的pH均为7.8至8.2，例如8.0。
本发明中采用门冬氨酸氨基转移酶活性检测试剂盒(sigma)对制备所得的重组门冬氨酸氨基转移酶进行活性检测，比活力为149.22U/mg，远高于现有技术的中生产方法制备的重组门冬氨酸氨基转移酶。
在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞(例如，“”)只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。
如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。
本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。
如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在(如果有的话)通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。
如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。
如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。举例来说，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。
如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。
如本文中所用的，术语“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞是真核宿主细胞或原核宿主细胞。优选为原核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞。
如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。
如本文中所用的，术语“表达载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的多肽的片段，所述目的多肽可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。表达载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。表达载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。
如本文中所用的，术语“表达系统”包括含有宿主和目的基因的载体，并且使能够达到宿主中目的基因表达目的的系统，具体地，通过含有编码目标蛋白质的外来基因的载体，筛选成功转染的重组宿主细胞。表达系统分为真核生物表达系统和原核生物表达系统，本文的一个优选例中选择原核生物表达系统。原核生物的表达系统具有宿主细菌的快速增殖，简单的培养，方便的操作，廉价的价格，明确的遗传背景，安全的遗传基因，高蛋白质的表达水平等特征。然而，原核生物的表达系统无法控制表达时间和表达水平。另外，在原核生物的表达系统中，由于表达产物有可能作为封入体存在，因此生物活性较低，翻译后处理及修饰系统不完整(例如，不能进行糖基化修饰)。
【目的蛋白的制备】
本发明中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、野猪门冬氨酸氨基转移酶质粒的构建
1)以NCBI提供的野猪来源的门冬氨酸氨基转移酶的蛋白序列(SEQ ID NO:2)为参考，结合本发明的试验设计要求，经大肠杆菌同义密码子偏好性优化后，连接载体为pET-28a(+)，C端融合表达(His)6标签,，由金唯智合成。
2)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
取1μL质粒，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，冰浴放置20min，42℃水浴热激45s，立刻冰上放置2min，加入400μL不含抗生素的SOC培养基，37℃、220rpm振荡培养50min。取100μL菌液均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。
门冬氨酸氨基转移酶经同义密码子偏好性优化后的碱基序列SEQ ID NO:1
门冬氨酸氨基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO:2
实施例2、目的蛋白表达
挑取实施例1中制备的单克隆，无菌操作接种于含100μg/mL卡那抗性的TB培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导(终浓度为0.1mM)，分别放置于37℃和18℃振荡培养过夜，不加IPTG组作为对照，37℃培养3h，每组实验重复一次。取样超声破碎进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果见图1。
图1中，M为Maker；NT为对照；S为上清液；P为沉淀。
根据图1，在37℃和18℃条件下，在TB培养基中即可在上清液中大量可溶性表达，蛋白分子量约为45-50kDa,与Expasy网站预测蛋白大小(46.5kDa)基本一致。
实施例3、门冬氨酸氨基转移酶的纯化
TB培养基摇瓶培养1.5L菌液，表达条件与实施例2中一致。离心收集菌体，湿重为：30g。取称取约4g菌体，加入35ml Lysis Buffer在冰上重悬。超声破碎后离心，20000rpm，4℃离心30min，取上清，0.22μm针式过滤器过滤得到上清液。上清液过Ni亲和层析，0～100％Buffer B进行线性洗脱，取洗脱主峰洗脱液进行透析，电泳图如图2所示。
图2中，M为Maker；S为上清液；FT亲和流穿(1-5～0-500mM咪唑线性洗脱液)。
计算目的蛋白表达含量为17.49mg/mL，蛋白产量很高。所用纯化试剂浓度如下所示：
Buffer A:50mM Tris、50mM NaCl、5％Glycerol，pH8.0
Buffer B:50mM Tris、50mM NaCl、500mM Imidazole、5％Glycerol，pH8.0
Lysis Buffer:50mM Tris、300mM NaCl、5％Glycerol，pH8.0
透析液：2x PBS加入等体积甘油，pH7.4。
实施例4、重组门冬氨酸氨基转移酶活性测定
利用门冬氨酸氨基转移酶活性检测试剂盒(sigma)对样品的活性进行测定。门冬氨酸氨基转移酶阳性酶购自sigma，活性为2.6U/μL，之后稀释成0.001～0.032U/μL，稀释液为PBS pH 7.4缓冲液。试剂盒试剂AST Substrate、AST Assay Buffer、AST Enzyme、ASTDeveloper按5:40:1:4的比例混合均匀，配成测活工作液现配现用。向酶标板中加入测活工作液100μL，以及各个浓度的阳性酶1μL，37℃反应5min，450nm处读取吸光值。以酶浓度为X轴，对应的吸光值为Y轴绘制标准曲线，使的R2≥0.95。取重组门冬氨酸氨基转移酶1μL，按照上述方法测定吸光值，实验重复3次，求平均值。若平均吸光值在标准曲线范围内，则带入线性回归方程计算酶活。若不在标准曲线范围内，建议将样品进行浓缩或者稀释再进行测定。所得门冬氨酸氨基转移酶标准曲线如图3。
将本发明制备的门冬氨酸氨基转移酶按照上述方法测吸光度，结果如下表1：
表1
| 酶浓度 | 平均OD450 | 酶活(U/μL) |
| 稀释300倍 | 0.344533333 | 2.61 |
测得该酶的活性为2.61U/μL，原液浓度为17.49mg/mL，因此比活力为(2.61×1000)/17.49＝149.22U/mg。
发明人按照文献(孟泽,史利宁,李勇.人红细胞门冬氨酸氨基转移酶的提纯及有关性质研究[J].临床检验杂志,2001(02):69-72.DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2001.02.001.)中记载的方式从人红细胞中提取了胞质型AST，检测其酶活为105U/mg，比本发明方法制备所得的门冬氨酸氨基转移酶活力低30％以上。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 门冬氨酸氨基转移酶及其制备方法和应用
<130> P220011-1CNCNA9
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gctagcatgg cgccgccgag cgtgtttgcg gaagtgccgc aagcgcagcc ggtgctggtg 60
tttaaactga ttgcggattt tcgcgaagat ccggatccgc gcaaagtgaa cctgggcgtg 120
ggcgcgtatc gcaccgatga ttgtcagccg tgggtgctgc cggtggtgcg caaagtggaa 180
cagcgcattg cgaacgatag cagcctgaac catgaatatc tgccgattct gggcctggcg 240
gaatttcgca cctgcgcgag ccgcctggcg ctgggcgatg atagcccggc cctgcaagaa 300
aaacgcgtgg gcggtgtgca gagcctgggc ggtaccggcg cgctgcgcat tggcgcggaa 360
tttctggcgc gctggtataa cggcaccaac aacaaagata ccccggtgta tgtgagcagc 420
ccgacctggg aaaaccataa cggcgtgttt accaccgcgg gctttaaaga tattcgcagc 480
tatcgctatt gggataccga aaaacgcggc ctggatctgc aaggctttct gagcgatctg 540
gaaaacgcgc cggaatttag catttttgtg ctgcatgcgt gcgcgcataa cccgaccggc 600
accgatccga ccccggaaca gtggaaacag attgcgagcg tgatgaaacg ccgctttctg 660
tttccgtttt ttgatagcgc gtatcaaggc tttgcgagcg gcaacctgga aaaagatgcg 720
tgggcgattc gctattttgt gagcgaaggc tttgaactgt tttgcgcgca gagctttagc 780
aaaaactttg gcctgtataa cgaacgcgtg ggcaacctga ccgtggtggc gaaagaaccg 840
gatagcattc tgcgcgtgct gagtcagatg gaaaaaattg tgcgcgtgac gtggagcaac 900
ccaccggcgc aaggcgcgcg cattgtggcg cgcaccctga gcgatccgga actgtttcat 960
gaatggaccg gcaacgtgaa aaccatggcg gatcgcattc tgagcatgcg cagcgaactg 1020
cgcgcgcgcc tggaagcgct gaaaaccccg ggcacctgga accatattac cgatcagatt 1080
ggcatgttta gctttaccgg cctgaacccg aaacaagtgg aatatctgat taacgaaaaa 1140
catatttatc tgctgccgag cggccgcatt aacatgtgcg gcctgaccac caaaaacctg 1200
gattatgtgg cgacgagcat tcatgaagcg gtgaccaaaa ttcagtaact cgag 1254
<210> 2
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Ala Pro Pro Ser Val Phe Ala Glu Val Pro Gln Ala Gln Pro Val
1 5 10 15
Leu Val Phe Lys Leu Ile Ala Asp Phe Arg Glu Asp Pro Asp Pro Arg
20 25 30
Lys Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Tyr Arg Thr Asp Asp Cys Gln Pro
35 40 45
Trp Val Leu Pro Val Val Arg Lys Val Glu Gln Arg Ile Ala Asn Asp
50 55 60
Ser Ser Leu Asn His Glu Tyr Leu Pro Ile Leu Gly Leu Ala Glu Phe
65 70 75 80
Arg Thr Cys Ala Ser Arg Leu Ala Leu Gly Asp Asp Ser Pro Ala Leu
85 90 95
Gln Glu Lys Arg Val Gly Gly Val Gln Ser Leu Gly Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Arg Ile Gly Ala Glu Phe Leu Ala Arg Trp Tyr Asn Gly Thr Asn
115 120 125
Asn Lys Asp Thr Pro Val Tyr Val Ser Ser Pro Thr Trp Glu Asn His
130 135 140
Asn Gly Val Phe Thr Thr Ala Gly Phe Lys Asp Ile Arg Ser Tyr Arg
145 150 155 160
Tyr Trp Asp Thr Glu Lys Arg Gly Leu Asp Leu Gln Gly Phe Leu Ser
165 170 175
Asp Leu Glu Asn Ala Pro Glu Phe Ser Ile Phe Val Leu His Ala Cys
180 185 190
Ala His Asn Pro Thr Gly Thr Asp Pro Thr Pro Glu Gln Trp Lys Gln
195 200 205
Ile Ala Ser Val Met Lys Arg Arg Phe Leu Phe Pro Phe Phe Asp Ser
210 215 220
Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Ser Gly Asn Leu Glu Lys Asp Ala Trp Ala
225 230 235 240
Ile Arg Tyr Phe Val Ser Glu Gly Phe Glu Leu Phe Cys Ala Gln Ser
245 250 255
Phe Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly Asn Leu Thr
260 265 270
Val Val Ala Lys Glu Pro Asp Ser Ile Leu Arg Val Leu Ser Gln Met
275 280 285
Glu Lys Ile Val Arg Val Thr Trp Ser Asn Pro Pro Ala Gln Gly Ala
290 295 300
Arg Ile Val Ala Arg Thr Leu Ser Asp Pro Glu Leu Phe His Glu Trp
305 310 315 320
Thr Gly Asn Val Lys Thr Met Ala Asp Arg Ile Leu Ser Met Arg Ser
325 330 335
Glu Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Thr Pro Gly Thr Trp Asn
340 345 350
His Ile Thr Asp Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Asn Pro
355 360 365
Lys Gln Val Glu Tyr Leu Ile Asn Glu Lys His Ile Tyr Leu Leu Pro
370 375 380
Ser Gly Arg Ile Asn Met Cys Gly Leu Thr Thr Lys Asn Leu Asp Tyr
385 390 395 400
Val Ala Thr Ser Ile His Glu Ala Val Thr Lys Ile Gln
405 410
Claims (10)
1.一种编码门冬氨酸氨基转移酶的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达His×6标签的多核苷酸序列。优选地，所述表达载体中，如权利要求1所述的多核苷酸的3碳端连接有表达His×6标签的多核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求1所述的多核苷酸。
6.一种制备门冬氨酸氨基转移酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
培养如权利要求5所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述门冬氨酸氨基转移酶；
其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者
如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者
如权利要求5所述的宿主细胞；或者
根据权利要求6至8中任一项所述的方法所制备的门冬氨酸氨基转移酶。
10.一种门冬氨酸氨基转移酶的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括步骤：
使分离所得的门冬氨酸氨基转移酶通过Ni-亲和层析柱进行线性洗脱，洗脱所用流动相由Buffer A和Buffer B组成，按照buffer A和Buffer B总体积为100％计，所述流动相中Buffer B的体积百分含量由0％线性递增至100％，其中，Buffer A包括Tris-HCl、NaCl和甘油；Buffer B包括Tris-HCl、NaCl、甘油和咪唑。
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