JPH11506302A

JPH11506302A - 組織特異的低酸素で調節される治療用構築物

Info

Publication number: JPH11506302A
Application number: JP8520315A
Authority: JP
Inventors: エイ．ウェブスター，キース; エイチ．ビショップリック，ナネッテ; マーフィー，ブライアン; アール．レイドルート，キース; ジェイ．グリーン，クリストファー
Original assignee: SRI International Inc
Current assignee: SRI International Inc
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 1999-06-08
Also published as: WO1996020276A1; US6218179B1; EP0799308A1; CA2208599A1; US5834306A

Abstract

(57)【要約】（i）組織特異的プロモーターおよび（ii）低酸素応答エンハンサーエレメント（これらは両方とも、レポーター遺伝子、治療用遺伝子（例えば、bcl-2、NOS、カタラーゼ、およびSOD）または有害遺伝子のような選択した遺伝子に作動可能に連結されている）を含有するキメラ遺伝子に関する方法および組成物を開示する。選択した遺伝子の発現は、低酸素条件（例えば、虚血および再灌流のエピソードの間に陥る病的状態）の下の標的組織において増強される。本方法および本組成物は、治療法および/または診断法として使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】組織特異的低酸素で調節される治療用構築物発明の分野本発明は、その発現が組織特異的エレメントおよび低酸素応答エンハンサーエレメントの制御下にある治療用遺伝子を含むキメラ遺伝子（例えば、発現ベクターで運ばれる）に関する。参考文献発明の背景毎年50万人を超える米国人が心臓発作で死ぬ。いっそう多くの人々（700,000 人近く）が致死的でない心臓発作を有する。これらの生存者は通常、心臓の一部が修復不能に傷つく。心筋梗塞と呼ばれるこのような心臓組織の細胞死は、その大部分が虚血および/または虚血とそれに続く再灌流により引き起こされる組織損傷による。同様の虚血性損傷は、組織に対する血液供給が減少または中断された場合、多くの他の組織でも起こり得る。卒中、深静脈血栓症、肺塞栓症および腎不全がその例である。心臓発作のように虚血エピソードの生存者は、虚血後のエピソードのより大きな危険性が実質的にあり、その虚血後エピソードは多くの場合、衰弱または致死的結末となる。したがって、心臓発作およびその他のタイプの虚血性発作の生存者が、再発性虚血/再灌流エピソードによる組織損傷の危険を低くし得る、治療法および治療用組成物を有することが望ましい。発明の要旨１つの局面では、本発明は、低酸素条件に曝された細胞に対する虚血性損傷を減少させる方法を含む。この方法は、キメラ遺伝子（これは、低酸素応答エレメント、治療用遺伝子、および細胞内でこの治療用遺伝子の転写を制御するためにこの治療用遺伝子に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含み、ここでこのエレメントはこの治療用遺伝子の発現を調節するのに有効である）を細胞に導入することを含む。この細胞を低酸素条件に曝すことにより、遺伝子の発現が増強され、そして遺伝子の発現は、その細胞への虚血性損傷を減少させるのに有効である。この方法は、例えば、心臓特異的プロモーターを用いて心臓細胞に、腎臓特異的プロモーターを用いて腎細胞に、脳特異的プロモーターを用いて脳細胞に、そして血管内皮特異的プロモーターを用いて血管内皮細胞に適用され得る。低酸素応答エレメントは、例えば、エリスロポエチンHREエレメント（HREE1 ）、筋ピルビン酸キナーゼ（PKM）HREエレメント、β-エノラーゼ（エノラーゼ３；ENO3）HREエレメント、エンドセリン-1（ET-1）HREエレメント、およびメタロチオネインII（MTII）HREエレメントから選択され得る。治療用遺伝子は、例えば、酸化窒素シンターゼ（NOS）、Ｂ細胞白血病/リンパ腫２（bcl-2）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、およびカタラーゼから選択され得る。好ましい実施態様では、プロモーターはこのエレメントに対して異種である。別の局面では、本発明は、低酸素応答エレメント、このエレメントに対して異種の組織特異的プロモーター、および治療用遺伝子を含有するキメラ遺伝子を含む。プロモーターは治療用遺伝子に作動可能に連結され、そしてエレメントは治療用遺伝子の発現を調節するのに有効である。この方法は、例えば上記で確認したような様々な細胞タイプおよび対応するプロモーターで使用され得る。適切な心臓特異的プロモーターには、α-MHC_5.5プロモーター、α-MHC₈₆プロモーター、およびヒトの心臓アクチンプロモーターが含まれる。適切な腎臓特異的プロモーターにはレニンプロモーターが含まれる。適切な脳特異的プロモーターには、アルドラーゼＣプロモーターおよびチロシンヒドロキシラーゼプロモーターが含まれる。適切な血管内皮特異的プロモーターには、Et-1プロモーターおよびフォン・ビルブラント因子プロモーターが含まれる。この方法で有用な低酸素応答エンハンサーエレメントには、HREE1、PKM HREエレメント、ENO3 HREエレメント、およびET-1 HREエレメントが含まれる。この方法で有用な代表的な治療用遺伝子には、NOS、Bcl-2、SOD、およびカタラーゼが含まれる。本発明の別の局面には、発現ベクター中で運ばれる上記のキメラ遺伝子が含まれる。発現ベクターは、プラスミド、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどであり得る。さらに別の局面では、本発明は、低酸素応答エレメント、このエレメントに対して異種の組織特異的プロモーター、および有害遺伝子を含有するキメラ遺伝子を含む。プロモーターは有害遺伝子に作動可能に連結されており、そしてこのエレメントは有害遺伝子の発現を調節するのに有効である。適切なプロモーターには、アルファフェトプロテイン（AFP）プロモーターのような腫瘍特異的プロモーターが含まれる。適切な低酸素応答エレメントは前記の通りである。この局面において有用な有害遺伝子には、ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（tk；例えば、単純疱疹ウイルス（HSV）tk）および腫瘍壊死因子（TNF）が含まれる。関連する局面では、本発明は、低酸素条件に曝された細胞に損傷をもたらす方法を含む。この方法には、低酸素応答エレメント、有害遺伝子、およびこの遺伝子に作動可能に連結されており細胞内でその遺伝子の転写を制御し得る組織特異的プロモーターを含有するベクターを、細胞に導入することが含まれる。この細胞を低酸素条件に曝すことにより、この遺伝子の発現が増強され、そしてこの遺伝子の発現はこの細胞に損傷をもたらすのに有効である。この方法で有用なプロモーターには、AFPプロモーターのような腫瘍特異的プロモーターが含まれる。この方法で有用な特定の低酸素応答エレメントおよび有害遺伝子も上記の通りである。本発明はまた、メタロチオネインIIプロモーターから単離された低酸素応答エレメント（例えば、配列番号35で示される配列を有するフラグメントに含まれる HRE）、プロモーター、および異種遺伝子を含有するキメラ遺伝子を含む。ある一般的な実施態様では、異種遺伝子は上記のような治療用遺伝子である。別の一般的な実施態様では、異種遺伝子は上記のような有害遺伝子（例えば、腫瘍壊死因子をコードするDNA配列）である。本発明は、低酸素条件に曝された細胞に損傷をもたらす方法をさらに含む。この方法は、メタロチオネインIIプロモーターから単離された低酸素応答エレメント（例えば、配列番号35で示される配列を有するフラグメントに含まれるHRE）、プロモーター、および有害遺伝子（例えば、TNF）を含有するベクターを、細胞に導入することを含む。この細胞を低酸素条件に曝すことにより、この有害遺伝子の発現が増強され、そしてこの遺伝子の発現は、その細胞に損傷をもたらすのに有効である。本発明は、筋ピルビン酸キナーゼ遺伝子の制御領域に存在する低酸素応答エンハンサーエレメント（HREE）に対応する配列を有する実質的に単離されたポリヌクレオチドをさらに包含する。このエレメントはプロモーター領域、5'非翻訳領域、または3'非翻訳領域に由来し得る。関連する局面では、本発明は、筋ピルビン酸キナーゼ遺伝子に由来するHREエレメントを含む。本発明はまた、エンドセリン-1遺伝子の制御領域に存在する低酸素応答エレメントに対応する配列を有する実質的に単離されたポリヌクレオチドを含む。このエレメントは、プロモーター領域、5'非翻訳領域、または3'非翻訳領域に由来し得る。関連する局面では、本発明はエンドセリン-1遺伝子に由来するHREエレメントを含む。本発明の別の局面は、エノラーゼ３（ENO3）遺伝子の制御領域に存在する低酸素応答エレメントに対応する配列を有する実質的に単離されたポリヌクレオチドを含む。このエレメントは、プロモーター領域、5'非翻訳領域、または3'非翻訳領域に由来し得る。関連する局面では、本発明は、ENO3遺伝子に由来するHREエレメントを含む。別の関連する局面では、本発明は、配列番号35に対応するメタロチオネインII（MTAII）プロモーターの領域に含まれる低酸素応答エレメント（HRE）を包含する。好ましい実施態様では、HREエレメントは配列番号35に由来する配列からなる。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と共に読めば、より完全に明らかになる。図面の簡単な説明図1Aおよび1Bは、プラスミドpGL2PV（図1A）からのプラスミドpGLHRE（図1B）の構築の模式図を示す。図2A、2B、2C、および2Dは、プラスミドpGLHRE（図2A）からのプラスミドpGLH SA-150HRE（図2B）、pGLαMHC₈₆-HRE（図2C）、およびpGLHCA₁₁₈HRE（図2D）の構築の模式図を示す。図3Aおよび3Bは、プラスミドpGLHRE（図3A）からのプラスミドpGLαMHC_1.2HRE （図3B）の構築の模式図を示す。図4Aおよび4Bは、プラスミドpGLαMHC_1.2HRE（図4A）からのプラスミドpGLαM HC_1.2HRE-NOS（図4B）の構築の模式図を示す。図5Aおよび5Bは、プラスミドpSFFV-Bcl-2（図5A）からのプラスミドpαMHC_1.2 -HRE-Bcl-2（図5B）の構築の模式図を示す。図6A、6B、6C、6D、および6Eは、プラスミドpGL2BV（図6B）およびPKMプロモーターのフラグメント（図6A；配列番号７）からのプラスミドpGLPKM₄₆₀（図6C ）、pGLPKM_D（図6D）、およびPGLPKM₂₈₅（図6E）の構築の模式図を示す。図7A、7B、および7Cは、プラスミドpGL2BV（図7B）およびET-1プロモーターのフラグメント（図7A；配列番号８）からのプラスミドpGLET-1₇₀₀（図7C）の構築の模式図を示す。配列の簡単な説明配列番号１は、GATA4エンハンサーエレメントの正鎖のヌクレオチド配列である（Molkentinら,1984）。配列番号２は、筋ピルビン酸キナーゼ（PKM）の正鎖プライマーFのヌクレオチド配列である。配列番号３は、PKMの逆鎖プライマーRのヌクレオチド配列である。配列番号４は、エンドセリン-1（Et-1）の正鎖プライマーFのヌクレオチド配列である。配列番号５は、Et-1の逆鎖プライマーRのヌクレオチド配列である。配列番号６は、エリスロポエチン（EPO）遺伝子（SemenzaおよびWang）に由来し、そして４つのタンデムなコピーの低酸素応答エンハンサー（HRE）配列およびクローニングリンカーを含む、低酸素応答エンハンサーエレメント１（HREE1 ）のヌクレオチド配列である。配列番号７は、ラットの筋ピルビン酸キナーゼ（PKM）プロモーター領域のヌクレオチド配列である（Takenakaら）。配列番号８は、ヒトのEt-1プロモーター領域のヌクレオチド配列である（Inou eら）。配列番号９は、ヒトの心臓アクチンプロモーター領域のヌクレオチド配列である（MintyおよびKedes）。配列番号10は、ラットの心臓α-ミオシン重鎖プロモーター領域の一部を含有するヌクレオチド配列である（Mahdaviら；GenBank Accession #K01464）。配列番号11は、マウスの心臓α-ミオシン重鎖プロモーター領域の一部を含有するヌクレオチド配列である（Gulick，J.ら；GenBank Accession #M62404）。配列番号12は、ヒトのＢ細胞白血病/リンパ腫２（bcl-2）遺伝子のヌクレオチド配列である（Tsujimotoら；GenBank Accession #M13994）。配列番号13は、配列番号12からの推定アミノ酸配列である。配列番号14は、ラットの酸化窒素シンセターゼ（bNOS）遺伝子のヌクレオチド配列である（Bredtら；EMBL Accession #X59949）。配列番号15は、配列番号14からの推定アミノ酸配列である。配列番号16は、ヒトのbcl-2融合遺伝子のヌクレオチド配列である（Setoら；E MBL Accession #X06487）。配列番号17は、配列番号16からの推定アミノ酸配列である。配列番号18は、ヒトのNOS-1遺伝子のヌクレオチド配列である（Fujisawaら；D DBJ Accession #D16408；NCBI Seq ID 506339）。配列番号19は、配列番号18からの推定アミノ酸配列である。配列番号20は、ヒトのNOS-SN遺伝子のヌクレオチド配列である（Nakaneら；Ge nBank Accession #L02881）。配列番号21は、配列番号20からの推定アミノ酸配列である。配列番号22は、256塩基対（bp）の3'EPO-1低酸素応答エンハンサーエレメントのヌクレオチド配列である（SemenzaおよびWang）。配列番号23は、42bpの3'EPO-1低酸素応答エンハンサーエレメントのヌクレオチド配列である（Madanら）。配列番号24は、86bpのラットのαMHCプロモーター領域のヌクレオチド配列である。配列番号25は、マウスのカタラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列である（Reimer ら；GenBank #L25069）。配列番号26は、配列番号25からの推定アミノ酸配列である。配列番号27は、ヒトのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）遺伝子のヌクレオチド配列である（Clairら；EMBL＃X59445）。配列番号28は、配列番号27からの推定アミノ酸配列である。配列番号29は、ヒトのβ-エノラーゼ（ENO3）遺伝子（Giallongoら；EMBL#X56 832）のヌクレオチド−628から＋63の間のヌクレオチド配列である。配列番号30は、配列番号29からの推定アミノ酸配列である。配列番号31は、PKMプロモーターおよびENO3プロモーターの両方に存在する領域のコンセンサス配列である。配列番号32は、ヒトのメタロチオネインIIA（hMTAIIa）プロモーターの−760 フラグメントのDNA配列である。配列番号33は、hMTAIIaプロモーターの−345フラグメントのDNA配列である。配列番号34は、hMTAIIaプロモーターの−163フラグメントのDNA配列である。配列番号35は、hMTAIIaプロモーターの−90フラグメントのDNA配列である。配列番号36は、ヒトの腫瘍壊死因子（hTNF；EMBL Accession #X01394；Pennic aら、Shiraiら）をコードするcDNA配列である。配列番号37は、配列番号36からの推定アミノ酸配列である。発明の詳細な説明定義「虚血」は、特定の器官または組織に対する不十分な血液の供給として定義される。減少した血液供給の結果は、その器官または組織に対する不十分な酸素の供給（低酸素）である。長期の低酸素により、影響を受けた器官または組織に損傷が起こり得る。「無酸素」は、器官または組織に実質上完全に酸素が存在しないことをいい、これが長引くと、その器官または組織の死が起こり得る。「低酸素条件」は、特定の器官または組織が不十分な酸素の供給を受ける条件として定義される。「無酸素条件」は、特定の器官または組織に対する酸素の供給が中断される条件をいう。「再灌流」は、ある期間の虚血後の組織における血流の再開をいう。「虚血性損傷」は、ある期間の虚血および／または虚血とそれに続く再灌流の結果として起こる、器官または組織に対する細胞性および／または分子性の損傷をいう。核酸構築物の文脈で使用する場合、「エレメント」は、明確な機能を有する構築物の一領域または核酸フラグメントをいう。例えば、低酸素応答エンハンサーエレメントは、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子に結合した場合に、その遺伝子の転写を低酸素条件下で増強するDNA領域である。本明細書で使用するように、用語「作動可能に連結された」は、調節領域（典型的にはプロモーターエレメントであるが、エンハンサーエレメントも含まれ得る）と遺伝子のコード領域との間の関係を表し、ここでコード領域の転写は該調節領域の制御下にある。２つの核酸エレメントが２つの異なる遺伝子に由来するか、あるいは２つの異なる種に由来する場合は、その２つの核酸エレメントを「異種」であるという。例えば、ヒトのエリスロポエチン遺伝子由来の低酸素応答エンハンサーエレメントは、ヒトのミオシン遺伝子由来のプロモーターに対して異種である。同様に、ヒトのエリスロポエチン遺伝子由来の低酸素応答エンハンサーエレメントは、例えばマウスのエリスロポエチン遺伝子由来のプロモーターに対して異種である。「制御領域」は、真核生物遺伝子の5'および3'末端にあって転写または翻訳のいずれかの制御に関与し得る特定の配列をいう。例えば、ほとんどの真核生物遺伝子は、転写開始部位である部位から約25〜30塩基上流に位置するATリッチ領域を有する。同様に、ほとんどの真核生物遺伝子は、転写開始の70〜80塩基上流に CXCAAT領域（Xは任意のヌクレオチドであり得る）を有する。ほとんどの真核生物遺伝子の3'末端にはAATAAA配列があり、これは転写されたmRNAの3'末端へのポリアデニル化テールの付加のシグナルであり得る。「キメラ遺伝子」は、治療用遺伝子に作動可能に連結したプロモーターおよびエンハンサーエレメントのような、異種DNA配列を含有するポリヌクレオチドをいう。例えば、ヒトのbcl-2遺伝子に作動可能に連結したヒトのα-ミオシン重鎖（α-MHC）プロモーターフラグメントを含み、そしてヒトのエリスロポエチン遺伝子の低酸素応答エレメントとを含む構築物は、典型的なキメラ遺伝子を含む。Ｉ．発明の概観本発明は、少なくとも３つの機能的エレメント：（i）治療用遺伝子、（ii）組織特異的プロモーター、および（iii）低酸素応答エンハンサー（HRE）エレメントを有するキメラ遺伝子に関する。HREエレメントと組み合わせた組織特異的プロモーターは、低酸素条件下で選択した組織における治療用遺伝子の発現を導く。この遺伝子は、好ましくは、薬学的に受容可能なビヒクル中で完全な発現ベクターの一部として、標的組織への直接投与（例えば、標的組織への注射）または全身性投与（例えば、静脈内注射）のいずれかによって、標的組織に導入される。後者の場合、例えば選択した（または標的にした）組織の細胞上に選択的に発現されるレセプターに結合するように設計された改変エンベロープタンパク質を発現するビリオンにこの遺伝子を組込むことによって、この遺伝子を選択した組織に標的化し得る。送達手段にかかわらず、標的組織以外の組織内、および低酸素または無酸素以外の条件でのこの遺伝子の発現は、好ましくは最小限である。後述のように、種々の治療用遺伝子、プロモーター、HREエレメント、および遺伝子送達手段が、本発明の実施に使用され得る。 II．組織特異的プロモーター本明細書の文脈において、プロモーターは、そのプロモーターの下流（3'）に隣接する遺伝子の転写を調節し得るポリヌクレオチドエレメントをいう。プロモーターは、それが由来する遺伝子の完全な5'調節配列のすべて、または一部のみを含み得る。プロモーター領域の配列は、代表的にRNA合成を開始するRNAポリメラーゼ分子によって認識される。プロモーターは、様々な組織のタイプおよび数種類の異なる生物種において機能的であり得るか、またはその機能は、特定の種および/または特定の組織に限定され得る。さらに、プロモーターは、構成的に活性であり得るか、あるいはプロモーターは、特定の物質（例えば、組織特異的因子）によって、特定の条件（例えば、低酸素またはそのプロモーターを含むキメラ遺伝子におけるエンハンサーエレメントの存在）の下で、あるいはその生物の特定の発生段階の間（例えば、胎児においては活性、成体ではサイレント）に、選択的に活性化され得る。本発明の実施に有用なプロモーターは、好ましくは組織特異的である。つまり、プロモーターは、ある組織中では遺伝子の転写を駆動し得るが、一方他の組織のタイプではほとんど「サイレント」のままである。しかし、組織特異的プロモーターは、それらがサイレントな組織においても検出可能な量の「バックグラウンド」または「基礎」活性を有し得ることが理解される。標的組織中でプロモーターが選択的に活性化される程度は、選択性比（標的組織における活性／コントロール組織における活性）として表され得る。これに関していえば、本発明の実施に有用な組織特異的プロモーターは、代表的には約５より大きい選択性比を有する。好ましくは、選択性比は約15より大きい。特定のプロモーターが、一つの組織タイプに活性が限定されるわけではないが、それにもかかわらず、ある組織群では活性であり、そして別の組織群ではそれより活性が弱いかまたはサイレントであり得るような選択性を示し得ることがさらに理解される。このようなプロモーターはまた、「組織特異的」と呼ばれ、そして本発明での使用が意図される。例えば、種々の中枢神経系（CNS）ニューロンにおいて活性なプロモーターは、多数の異なる脳の領域のいずれにも影響を与え得る卒中による損傷から保護する際に、治療的に有用であり得る。組織特異的プロモーターは、例えば、異なる組織中で差別的に発現される遺伝子のプロモーター領域に由来し得る。例えば、心臓組織における発現をアップレギュレートするために適切である種々のプロモーターが同定されている。それらには心臓α-ミオシン重鎖（αMHC）プロモーターおよび心臓α-アクチンプロモーターが含まれる。本発明で有用なプロモーターのさらに望ましい特徴は、たとえ標的組織内であっても、活性化された低酸素調節エンハンサーエレメントの不在下では、比較的低い活性を有するということである。これを達成する一つの手段は、成体組織内で比較的低い代謝回転速度を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター（例えば、本明細書に記載のアクチンプロモーターおよびα-MHCプロモーター）を選択することである。別の手段は、低酸素でないときの選択したプロモーターの活性を抑制する「サイレンサー」エレメントを使用することである。特定のプロモーターの制御下にある遺伝子の発現レベルは、プロモーター領域を操作することによって調節され得る。例えば、あるプロモーター領域内の異なるドメインは、異なる遺伝子調節活性を有し得る。これらの異なる領域の役割は、代表的には、特定の領域が欠失したプロモーターの異なる変異体を含むベクター構築物を用いて評価される（すなわち欠失分析）。このような実験に用いられるベクターは、代表的には、異なる条件下で各プロモーター変異体の活性を決定するために使用されるレポーター遺伝子を含有する。このような欠失分析の適用により、所望の活性を含むプロモーター配列の同定が可能となる。このアプローチは、例えば、組織特異性を与え得る最小の領域、または低酸素感受性を与え得る最小の領域を同定するために用いられ得る。下記の多くの組織特異的プロモーターは、本発明の実施においてとりわけ有利であり得る。ほとんどの例において、これらのプロモーターは、選択したベクターへのクローン化に適切な簡便な制限消化フラグメントとして単離され得る。あるいは、プロモーターフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Mulli s、Mullisら）を用いて単離され得る。増幅したフラグメントのクローン化は、プライマーの5'末端に制限部位を組込むことにより容易にされ得る。心臓特的発現に適切なプロモーターには、マウスの心臓α-ミオシン重鎖遺伝子由来のプロモーターが含まれる。この遺伝子は、5.5kbpのプロモーター領域を含み、この領域はマウスのαMHC遺伝子から5.5kbpのSacI/SalIフラグメントとして得られ得る（Subramaniamら，1991）。この5.5kbpのαMHCプロモーターを利用するレポーター遺伝子構築物は、（HREEが存在するか否かにかかわらず）心臓組織中で選択的に比較的高レベルで発現され、そしてトランスジェニック動物中に存在する場合は、内因性遺伝子と同様の様式で調節される（Subramaniamら,1991 ）。ラットのα-MHCプロモーターのこれより小さいフラグメントは、1.2kbpのEcoR I/HindIIIフラグメントとして得られ得る（Gustafsonら）。下記の実施例１および表１に示すように、この1.2kbpのラットαMHCプロモーターを利用する構築物は、HREEの非存在下では低レベルで発現され、そしてHREEの存在下では中間レベルで発現される。これらの結果は、αMHC_1.2プロモーターが、本発明のキメラ遺伝子の発現を心臓組織に標的化するための典型的なプロモーターであることを示す。このプロモーターフラグメントの制御下にある遺伝子の発現は、正常な酸素化条件下の心臓細胞では極めて低いが、しかしその構築物がHREE1を含む場合は、低酸素条件下で約４倍増大する。心臓細胞以外の細胞での発現は、バックグラウンドレベルである。ラットαMHCプロモーターの86bpのフラグメント（本明細書中では配列番号24 として示す）は、レポーター遺伝子の発現を心臓および骨格筋に制限する（すなわち、いくつかの組織選択性を失っている）。さらなる心臓特異性は、塩基対− 86のすぐ上流に心臓特異的GATA4エンハンサーエレメント（Molkentinら,1984）を含有する36マーのオリゴヌクレオチド（配列番号１）を連結（例えば、平滑末端連結）することによって、このフラグメントに与えられ得る。このプロモーターフラグメントはまた、HREエレメントのようなさらなるエンハンサーの非存在下において、低レベルの発現をもたらす。この86bpフラグメントによって誘導される基礎発現が低レベルであること、およびこの発現の基礎レベルを低酸素応答エンハンサーエレメントを用いてアップレギュレートする能力は、本発明で使用するプロモーターとして有用な特性である。ラットおよびマウスのαMHC遺伝子に由来する典型的な心臓特異的プロモーター領域の配列を、本明細書中にそれぞれ配列番号10および配列番号11として記載する。どちらの配列も、それぞれの遺伝子のATG開始コドンのすぐ上流で終わっている。他の心臓特異的プロモーターには、心臓α-アクチンプロモーターおよびミオシン軽鎖-２（MLC-2）プロモーターが含まれる。ヒトの心臓α-アクチン（HCA）プロモーター由来の118bpのフラグメント（配列番号９）を利用する本明細書中に記載の構築物は、比較的低レベルの心臓特異的発現をもたらし、その発現レベルはその発現構築物にHREEを含有させることによって増大し得る（実施例１、表１）。心臓特異的ミオシン軽鎖-２プロモーターは、ラットの心臓ミオシン軽鎖-２（MLC-2）遺伝子から2.1kbpのKpnI/EcoRIフラグメントとして得られ得る（Franzら）。前立腺特異的プロモーターには、ヒトの腺カリクレイン-１（hKLK2）遺伝子および前立腺特異的抗原（hKLK3；PSA）遺伝子の5'隣接領域が含まれる（Murthaら；Lukeら）。レニンプロモーターは腎臓特異的発現を指向するのに適切である（ Fukamizuら）が、一方、アルドラーゼ-Ｃプロモーター（Vibertら）またはチロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Sasaokaら）は脳での発現を指向するために使用され得る。血管内皮細胞に特異的なプロモーターには、Et-1プロモーター（Inoueら）およびフォン・ビルブラント因子（JahrondiおよびLynch）プロモーターが含まれる。腫瘍特異的プロモーターには、マウスのα-フェトプロテイン（AFP）遺伝子の 5'隣接DNAの7.6kbpフラグメントに含まれるAFPプロモーターが含まれる（Marci ら）。このプロモーターは、通常胎児肝臓におけるAFP遺伝子の発現を指向し、そして成体組織では転写的にサイレントである。しかし、肝細胞癌腫（HCC）では異常に再活性化されて、成体組織において腫瘍特異的発現を与え得る（Marci ら）。上記のプロモーターは、本発明で使用される典型的なプロモーターである。本発明での使用に適切な他のプロモーターは、本明細書の手引きに従って、当業者により選択され得る。 III．低酸素応答エンハンサーエレメント本発明の構築物に含まれる治療用遺伝子は、好ましくは、正常な酸素化（いかなる副作用も最小限にする）条件下では、発現されるとしても低レベルで発現される。しかし、低酸素条件下では、その遺伝子の発現は増大し、標的組織に対して保護を与える。低酸素条件下で上昇する発現は、１以上の低酸素応答エンハンサー（HRE）エレメントの存在によって付与される。 HREエレメントは、プロモーターおよび/または治療用遺伝子の上流（5'）または下流（3'）のいずれかに位置し得るポリヌクレオチド配列を含有する。HREエレメント（HREE）は典型的には、プロモーターに作用してそのプロモーターの制御下の遺伝子の転写を増大させる、通常約10〜300bp長のシス作用性エレメントである。好ましくは、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントは、それらのエレメントによって調節される遺伝子の発現が、健全な酸素供給の存在下では最小であり、低酸素または無酸素条件下ではアップレギュレートされるように選択される。低酸素応答エンハンサーエレメントは、エリスロポエチン（EPO）遺伝子を含む多くの遺伝子に関連して見出される。EPO遺伝子に由来する例示的なHREエレメントを本明細書中で配列番号６、配列番号22および配列番号23として示す。配列番号22として示される配列を有するエレメントは、低酸素条件下でレポーター遺伝子発現を約５倍に誘導し（SemenzaおよびWang）、一方、配列番号23として示される配列を有するエレメントは、低酸素条件下で活性が約17倍増大する（Mada nら）。本発明を支持するために行った実験（例えば、実施例１）は、HREE1（配列番号６）を含む構築物の発現が低酸素条件下に応答して約５〜７倍増大することを立証する。これらの結果は、HREE1エレメントが、筋および心臓特異的プロモーターと融合した場合、十分に機能的であること、ならびに筋および心臓細胞が、これらのプロモーターの調節に関し、低酸素に対して十分に応答性であることを示す。エノラーゼ３（ENO3）遺伝子の制御領域に由来するフラグメント（配列番号29 ）を含有する構築物の発現は、C2C12細胞および心筋細胞において、低酸素によってそれぞれ約５倍〜８倍誘導された（表１を参照せよ）。これらの結果は、EN O3プロモーターフラグメント中のHREEが、心筋または骨格筋プロモーターなどの組織特異的プロモーターを含有する構築物における低酸素誘導について、特に効果的なHREEであり得ることを示唆する。本発明によれば、例示的な低酸素応答エンハンサーエレメントはまた、筋解糖酵素ピルビン酸キナーゼ（PKM）遺伝子（Takenakaら）（ヒト筋特異的β-エノラーゼ遺伝子（ENO3；PeshavariaおよびDay））およびエンドセリン-１（ET-1）遺伝子（Inoueら）の両方の調節領域から単離され得る。本発明を支持するために行った実験（材料および方法、実施例４および５を参照せよ）において同定された、PKM遺伝子およびET-1遺伝子のHRE領域を、それぞれ、配列番号７および配列番号８として本明細書中で示される。実施例４は、トランスフェクトされたC2C12筋管および新生児心筋細胞におけるpGLPKM（PKM遺伝子のHREエレメントを含有するプラスミド）の発現が、低酸素雰囲気下でのその細胞のインキュベーションにより、いずれの細胞タイプでも６ ±２（n=4）倍増大したことを立証する。SmaIで消化して内部SmaI部位で切断することにより得られるこのHREエレメントの一部分は、低酸素応答配列が200bpフラグメントに特定された。HREPKM₂₈₅と命名したこのフラグメントは、C2C12筋管および心筋細胞において、HREE1（配列番号６）を用いて得られるものと少なくとも等価な低酸素誘導性発現を付与する。 PKMプロモーターおよびENO3プロモーターは共に、転写開始部位からそれぞれ −88bpおよび−70bpだけ5'側に位置する共通配列エレメント（配列番号31）を含む。この配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明の構築物に低酸素応答特性を付与するに十分であり得る。実施例５に示されるデータは、トランスフェクトされたヒト動脈内皮細胞におけるpGLET-1₇₀₀（これはヒトET-1遺伝子プロモーターの700bp（配列番号８）を含有する）の発現が、低酸素雰囲気下でのこれらの細胞のインキュベーションによって、約５倍増大したことを示す。他の細胞タイプ（HeLa細胞、C2C12細胞および心筋細胞を含む）では、pGLET-1₇₀₀発現の低酸素誘導性増大は認められなかった。従って、この700bpフラグメントは、低酸素で調節される遺伝子を血管内皮細胞に対して特異的に標的付けるために使用され得る。なぜならば、このフラグメントは、組織特異性を付与するエレメント（すなわち、発現を血管内皮に対して排他的に標的付けるに効果的なエレメント）、および低酸素条件の間、そのフラグメントの制御下の遺伝子の転写をアップレギュレートするに効果的なHRE エレメントとを含有するからである。実施例６に示されたデータは、低酸素ストレスが、hMTIIa近位プロモーターのフラグメントを含有する構築物からの転写を増大させ得ることを示す。有酸素コントロールに対するCAT活性の増大が、８時間の低酸素でも14時間の低酸素でも観察された。誘導のレベル（２〜３倍）は、塩化カドミウム処理したポジティブコントロールで認められたレベルと同じ範囲内であった。−760構築物（配列番号32）の低酸素応答性は、−345構築物（配列番号33）の低酸素応答性と同様であった。実施例７に記載の欠失分析は、−163フラグメント（配列番号34）および−90 フラグメント（配列番号35）を含む構築物でトランスフェクトされた細胞の抽出物が、低酸素条件下でレポーター活性（ルシフェラーゼ活性）の顕著なアップレギュレーションを示し、誘導レベル（約3.0倍）は実施例６で観察されたレベルと同様であったことを示す。これらの結果は、hMTIIaプロモーターの近位90bpフラグメント（配列番号35）に、少なくとも１つのHREエレメントが含まれることを示唆する。このようなHREエレメントは本発明の方法および構築物に利用され得る。実施例７に記述するような欠失分析は、−90フラグメント（配列番号35）中に存在する、なお低酸素感受性または誘導性を付与する最小の配列を同定するために使用され得ること、および、より短いこの配列は、本発明の組成物および方法においてHREエレメントとして使用され得ることは理解される。さらに、本発明が上に明記しなかったHREエレメントの使用を包含することも理解される。別のHREエレメントは、例えば、実施例４および５に詳述するように同定され得る。さらに、プロモーター欠失および変異分析（例えば、前記ならびにWebsterおよびKedesに記載されるような）を用いて、他の低酸素応答性遺伝子中のこのようなエレメントを同定してもよい。多くのこのような応答性標的遺伝子は、細胞がインビトロで低酸素に曝される場合に誘導されることが示されている（例えば、HeakockおよびSutherland）。さらに特定の状況では、１つの遺伝子に由来する連続ポリヌクレオチド配列から、本発明の組織特異的プロモーターおよび低酸素応答エンハンサーエレメントを誘導し得る（例えば、HREエレメントを含有し、内皮細胞特異的発現をも伝達するET-1プロモーター領域について上に示したように）ことも理解される。 IV．治療用遺伝子本発明は、虚血による低酸素および/または無酸素条件がもたらす多くの疾患状態を緩和するために使用され得る。ここで、細胞および組織の損傷は虚血および虚血とそれに続く再灌流から生じる。本発明は、被験者が、特定の組織に虚血エピソードの危険があると診断される場合に、とりわけ適している。例えば、生存している心臓発作の犠牲者は事実上全員、心筋虚血の再発性エピソードの危険がかなり増大していると認識される。続く虚血エピソードの間の心臓組織に対する傷害の危険性を減少させるため、治療用遺伝子を発現し得る構築物をその心臓組織に導入することにより、このような被験体は恩恵を得る。このような構築物は、例えば、心臓および血管内皮組織を虚血性損傷から保護し、それによって心臓疾患の進行を防止するように役立ち得る。再発性の虚血と再灌流は代表的には、酸化還元交換(redox switching)の間に生成する反応性酸素種（フリーラジカル）、例えば、過酸化物による細胞に対する酸化的損傷をもたらす（Frei）。新鮮な血液と損傷を受けたまたは死亡した細胞との接触は、そうでなければ回復したであろう心臓細胞を殺す好中球や膿細胞の流入を誘発する。好中球が引き起こす損傷のほとんどはスーパーオキシドイオンに起因するとされている。スーパーオキシドアニオンは数種類の方法で組織を損傷し得る。スーパーオキシドアニオンと過酸化水素との相互作用は、潜在的に毒性でほとんどの有機分子と迅速に反応するヒドロキシルラジカルの生成を導く。脂質、タンパク質および核酸はすべて、このような酸化的損傷の一次的標的であり得る。損傷の程度およびタイプは、低酸素ストレスの重篤度および性質に依存する。例えば、このストレスは、細胞性の損傷を引き起こして、好中球攻撃による炎症性応答とそれに続く組織壊死を開始し得る。また、このストレスは、アポトーシス（プログラムされた細胞死）を開始して損傷した細胞を除去し得る。組織死が起こる機構（壊死またはアポトーシス）にかかわらず、虚血−再灌流エピソードが引き起こす損傷は、典型的には、酸化還元反応の結果であり、虚血の重篤度および持続時間に量的に関係する。例えば、心筋の場合、重篤な心臓発作は甚大な損傷（例えば、左心室の30％〜40％の梗塞）を生じ得るが、一方、中程度のアンギナおよび無症状の反復性虚血は各エピソードの間に比較的軽症の損傷を生じ得る。組織における虚血の病理は複雑であり、このことは、治療的介入の複数の潜在的標的をもたらすが、いくつかのクラスの標的は、本発明の教示に従う治療的介入にとりわけ適している。これらには、細胞内の酸化還元反応部位に直ちに介入して損傷を最小にし得る抗酸化因子系、および傷つき易い組織への血流を増大させることによって虚血の重篤度を最小にし得る血管拡張因子系が含まれる。本発明での使用に適した抗酸化タンパク質には、Bcl-2遺伝子、カタラーゼ遺伝子およびスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）遺伝子の遺伝子産物が含まれ、一方、血管拡張特性を有するタンパク質には、血管拡張因子である一酸化窒素（NO）を産生する一酸化窒素シンターゼ（NOS）が含まれる。相対分子質量が約25kDaの膜内在性ミトコンドリア内膜タンパク質であるBcl-2 は、抗酸化因子として作用する（Hockenberyら,1993）ことによって、特定の細胞をアポトーシスから保護することが示されている（Hockenberyら,1990）。アポトーシスは、酸化的ストレスに対する心臓を含む多くの組織の共通の応答であり得る（WilliamsおよびSmith；Gottliebら）ので、Bcl-2は虚血エピソードの間の組織に対する損傷を減少させるための有効な治療用遺伝子であり得る。酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）は、スーパーオキシドアニオンの過酸化物への分解を触媒する。酵素（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、フリーラジカル捕捉剤、または好中球の流入を防止する因子は、心筋細胞の救出を増大させ得る。酵素カタラーゼは、次いで、過酸化物の水への変換を触媒する。SOD遺伝子およびカタラーゼ遺伝子の典型的配列を、それぞれ配列番号27および配列番号25として本明細書中に記載する。本明細書中で配列番号27として示される配列は、比較的長い半減期を有するマンガンSODをコードする。ヒトCu/Zn SODの関連する配列はGorechiらに見出され得る。Cu/Zn SODはマンガンSODより短い半減期を有する。内皮由来の一酸化窒素（NO）は、血管内皮による血管収縮因子および成長因子の発現を調節する（Kourembanasら）。低酸素下では、内皮細胞が、代表的には、強力な血管収縮因子であるエンドセリン-1（ET-1）の発現および分泌を増大させる。発現のこの増大はNOへの曝露によって減少または防止され得る（Kouremba nasら）。ET-1が誘導する血管収縮の効果の一つは、冒された器官または組織に対する血流の減少であり、これは虚血による低酸素損傷を悪化させ得る。本発明によれば、血管上皮または心臓特異的プロモーターおよび低酸素応答エンハンサーエレメントの制御下でのNOS遺伝子の発現を介して、冒された組織にNOを提供することにより、そのような損傷を減少させ得る。本発明の治療用遺伝子は、好ましくは、本発明の方法および組成物を適用される種と同じ種または関連する種に由来し得る。例えば、イヌの治療的処置には、イヌからクローン化された治療用遺伝子を含む構築物を使用することが望ましいことであり得る。同様に、ヒトの病的状態の処置には、ヒト由来の核酸からクローン化された治療用遺伝子を使用することが望ましいことであり得る。前記のタンパク質をコードする遺伝子は、本発明の実施に有用な例示的な治療用遺伝子を表す。しかし、当業者は、本明細書の教示と手引きにしたがって、低酸素または虚血による細胞損傷を減少させるに有効な他の治療用遺伝子を選択し得ること、およびそのような遺伝子の使用が本発明の範囲内であると見なされることを理解する。Ｖ．有害遺伝子別の局面では、本発明は、治療用遺伝子よりむしろ有害遺伝子を含有する構築物を包含する。この有害遺伝子の発現は、有害な組織（例えば、悪性腫瘍）またはその他の望ましくない組織に標的付けられる。プロモーターおよび低酸素応答エレメントは前記のように選択され得る。本発明のこの局面に有用なプロモーターは、好ましくは、発現を望ましくない組織のみに制限する。例えば、前記のように、AFPプロモーターは肝細胞ガン（HCC）において活性化され、成体組織において腫瘍特異的発現を付与し得る（Marciら）。有害遺伝子には、ウイルス性チミジンキナーゼ遺伝子（tk）（例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）tk）が含まれる。この遺伝子はそれ自体が有害なわけではないが、発現すると、ウイルス性TKがガンシクロビル（GCV）をリン酸化し、G CVを細胞傷害性化合物に変換し得る。腫瘍細胞は代表的には低酸素であるため、ウイルス性tkおよびHREEに作動可能に連結された腫瘍特異的プロモーターを有する構築物は、GCVと併用されて、腫瘍細胞を選択的に殺傷し得る。別の例示的有害遺伝子は腫瘍壊死因子（TNF）である。TNFは、プログラムされた細胞死またはアポトーシスを迅速に誘導する成長因子である（ClevelandおよびIhle,1995）。 VI．発現ベクター本発明のキメラ遺伝子は、好ましくは、選択された真核生物宿主細胞（すなわち、標的組織）中で治療用遺伝子産物を発現し得る発現ベクター中に組込まれる。そのような発現ベクターは、キメラ遺伝子に加えて、選択された組織における治療用遺伝子の効果的な発現に有用な他の様々な配列をも含み得る。そのような配列には、例えば、転写の終結に必要な配列が含まれ得る。これらの配列は、所望の治療用タンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化セグメントとして転写される。3'非翻訳領域もまた転写終結部位を含み得る。発現ベクターの構築に有用な分子技術および方法は、当該分野において周知である（例えば、Ausubelら；Sambrookら）。本発明を支持するために作製されたベクター構築物は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）または治療用遺伝子（例えば、Bcl-2またはNOS）のいずれかを発現するように設計される。治療用遺伝子の発現は遍在性プロモーター（例えば、SV40）または組織特異的プロモーター（例えば、横紋筋または心臓特異的プロモーター）のいずれかの制御下にある。低酸素または無酸素による発現のさらなる調節は、低酸素応答エンハンサー（HRE）エレメント（例えば、エリスロポエチン（EPO）遺伝子、筋特異的ピルビン酸キナーゼ（PKM）遺伝子、エノラーゼ３（ENO3）遺伝子または内皮細胞エンドセリン-１（Et-1）遺伝子に由来）の含有によって提供される。例示的構築物の作製は、下記の材料および方法）のセクションにおいて記述される。HREE1および組織特異的プロモーターを有する構築物の性能を評価するためのインビトロ実験の結果を、実施例１および表１に示す。遺伝子発現の相対量は、治療用遺伝子の代わりにレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を用いて測定した。表１に示すデータは、適合性プロモーターと共に低酸素応答エンハンサーエレメント（例えば、HREE1）を有する構築物を含有する細胞が、低酸素条件下で有酸素条件下より５〜７倍大きいレベルのレポーターを発現すること、およびHREE 1が異なる細胞中で同等に活性であり、プロモーターには依存しないことを立証している。このデータはまた、α-MHCプロモーターを含有する構築物の発現が心臓特異的であること、ならびにα-MHC_1.2プロモーターおよびHCAプロモーターからの基礎（有酸素）的発現が比較的低いことを立証している。さらに、このデータは、筋および心臓細胞が、これらのプロモーターの調節に関して、低酸素に対して十分に応答性であることを示している。プラスミドpGLHREおよびpGLHCA₁₁₈HREを用いて行なったインビボ実験（実施例２、表２）は、これらのプラスミドを注射され、かつ虚血に曝されたラットの心臓における遺伝子発現が、（虚血に曝されなかった）コントロール動物の心臓における発現より約２倍高かったことを立証している。これらの結果は、インビボでの心臓組織への本発明の治療用構築物の直接注射が、これらのプラスミドによって運ばれる遺伝子の発現を生じるために効果的であることを示している。さらに、これらの結果は、本発明のキメラ遺伝子を保有する発現ベクターが、インビボでの虚血によって引き起こされる低酸素に応答して、かなり増大したレベルの発現を生じるために効果的であることを示している。短時間（20分）の虚血エピソードの20時間後に発現を測定したので、（i）低酸素誘導性発現が20時間よりかなり早くピークに達し得ること、および（ii）反復虚血エピソードが本明細書中で用いた１回の実験的エピソード以上に発現をアップレギュレートし得ることが理解される。したがって、２倍誘導は、虚血が引き起こす転写/発現の増強レベルの過小評価であり得る。前記の実験は心臓組織で行なわれたが、本明細書の恩恵を有する当業者は同様の操作を、虚血および/または虚血/再灌流傷害を受ける他の組織で行い得ること、およびそのような手順は本発明の範囲内にあることは理解される。インビトロ実験（実施例３）は、レポーター構築物（pGLHRE、pGLHCA₁₁₈HRE、 pGLαMHC_1.2HRE）および治療用構築物（pSFFV-Bcl-2およびpNOS-HRE）でトランスフェクトされた細胞が正常に見え、そして予想通り刺激に対して応答することを立証している。レポーターでトランスフェクトされた細胞は正常に分化し、そしてレポーターの予想される誘導で低酸素に応答する。一方、NOSでトランスフェクトされた細胞およびbcl-2でトランスフェクトされた細胞は、低酸素の間もそれに続く再酸素化の間も正常に見える。これらの結果は、HREエレメントの含有、Bcl-2の過剰発現およびNOSの低酸素誘導性過剰発現が、インビトロで筋細胞に対して毒性または有害でないことを示唆している。これらの結果はまた、本発明の治療用遺伝子を保有する発現ベクターが、虚血性損傷から組織を保護するのに効果的であり得ることも示唆している。このような保護効果は、例えば、本発明のキメラ遺伝子を含有する発現ベクター（例えば、実施例２に記述するような治療用遺伝子（例えば、Bcl-2またはSOD）、心臓特異的プロモーターおよびHREエレメントを発現するアデノウイルスベクター）に心筋組織を感染させることによって、動物モデルにおいてアッセイされ得る。感染後、動物は、反復虚血エピソード（例えば、30分〜１時間）とそれに続く再灌流（例えば、１〜８時間）に曝され得る。最後の再灌流後、動物は、屠殺され得、そして心筋の虚血領域は、梗塞の存在および程度について、例えば、Thor ntonらが記述しているように試験され、そしてアポトーシスの存在について、例えば、Gottliebらが記述しているように試験され得る。試料生検はまた、ノーザンブロットによって、治療用遺伝子の発現についてアッセイされ得る。同様の実験が、他の組織（例えば、脳、腎臓および血管内皮）に（例えば、適切なプロモーターを介して）向けられた構築物を用いて実施され得る。実施例８および９は、hMTIIaプロモーター由来のHREエレメントおよび有害遺伝子（TNF）を含有する例示的構築物を記述している。これらの実施例は、そのような構築物のインビトロ試験（実施例８）およびインビボ試験（実施例９）の両方を記述している。 VII．細胞および組織への構築物の送達当業者に公知の種々の方法のうちの任意の方法が、選択された標的組織細胞に本発明のキメラ遺伝子を導入するために使用され得る。例えば、心臓組織の遺伝子療法には、リポフェクション、レトロウイルスおよびアデノウイルス媒介遺伝子移入、ならびに血管内皮または心臓組織への裸(naked)のDNAの直接注射が含まれている（Nabelら；Linら；Leclereら；Flugelmanら）。これらの方法および他の方法は、以下のセクションでさらに十分に議論される。ウイルス媒介遺伝子移入宿主細胞は、ハイブリッドベクター（キメラ遺伝子と選択したウイルス配列）を含有する成熟ビリオンでの感染によって、本発明のキメラ遺伝子でトランスフェクトされ得る。宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるビリオンは、好ましくは、ウイルスが宿主細胞中で複製し得ないように、複製欠損である。ビリオンは、培養宿主細胞をヘルパーウイルスで同時感染させることによって作製され得る。同時感染後、ビリオンは、（例えば、塩化セシウム遠心分離によって）単離され、そして残存する一切のヘルパーウイルスは、（例えば、加熱によって）不活化される。得られる成熟ビリオンは、本発明のキメラ遺伝子を含有し、ヘルパーウイルスの非存在下で宿主細胞を感染させるために用いられ得る。別法として、ヘルパーウイルスを含まない高力価の複製欠損組換えウイルスは、ウイルスが欠損性であるための成分を含有する細胞株をパッケージングする際に作製され得る（Miller）。数タイプのウイルス（レトロウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびいくつかのRNAウイルス）は、本発明のキメラ遺伝子構築物を含むベクターとしての使用になじみやすくあり得る。各タイプのウイルスは、当業者によって認識される特異的な利点と欠点を有する。ウイルスベクターを操作する方法もまた当該分野において公知である（例えば、Gr unhausおよびHorowitz；HertzおよびGerard；ならびにRosenfeldら）。レトロウイルスは、アデノ関連ウイルスと同様に、そのDNAを標的細胞の染色体DNAに安定に組込む。しかしアデノ関連ウイルスとは異なり、レトロウイルスは代表的には、プロウイルス組込み(proviral integration)が起こるためには、標的細胞の複製を必要とする。したがって、レトロウイルスベクターによる遺伝子移入の成功は、標的細胞の増殖を少なくとも一時的に誘導する能力に依存する。レトロウイルスベクターは、トランスフェクションの効率に一部起因して魅力的である。すなわち、いくつかのベクターは標的細胞の100％近くを安定に形質導入し得る。インビボでの遺伝子療法にレトロウイルスベクターを使用することは、適切なウイルスレセプターを標的細胞上に要求することにより、一部制限されている。ほとんどのレトロウイルスレセプターの正体は未知であるので、異なる細胞タイプ中でのレセプターの分布を決定することは不可能である。したがって、レトロウイルスベクターで特定の細胞タイプを標的にすることは、多くの場合、問題の多いことがわかっている。この難点は、標的細胞上に発現する既知の内因性レセプター（必ずしもウイルスレセプターである必要はない）に対するリガンドを含有するように、レトロウイルスのエンベロープタンパク質を改変することによって回避され得る。この技術の応用はKasaharaらが詳細に記述している。好ましくは、ウイルスはまた、細胞侵入を容易にするための非改変エンベロープタンパク質を含有する。多くのレセプター（例えば、デスミン、E−セレクチンおよびA-CAM）は、心臓細胞上に優先的に発現され、このアプローチになじみ易くあり得る（例えば、Hansenおよび Stawaski；Leferら；Youkerら）。アデノ関連ウイルスは、非分裂細胞に効率よく感染し、そして大量の遺伝子産物を発現し得る。さらに、そのウイルス粒子は比較的安定で、精製および濃縮になじみ易い。ウイルスゲノムのE1領域の一部を欠く複製欠損アデノウイルスは、 E1遺伝子を発現するように操作された細胞における増殖によって伝幡させられ得る（JonesおよびShenk；Berkner；GrahamおよびPrevea）。現在使用されているアデノウイルスベクターのほとんどは、そのウイルスゲノムのE1A〜E1BおよびE3 領域に欠失を保有する。アデノウイルスベクターを用いる多くの前臨床研究によって、このベクターがインビボでのかなりの割合の細胞の形質転換に効率的であること、およびベクターによって媒介される遺伝子発現がかなりの期間持続し得ることが立証されている（Rosenfeldら；Quantinら；Stratford-Perricaudetら，1992a；Rosenfeldら；L.D．Stratford-Perricaudetら、1992b；Jaffeら）。いくつかの研究が、心筋細胞へのアデノウイルス媒介遺伝子移入の有効性を記述している（Kass-Eislerら；Kirshenbaumら）。ヘルペスウイルスベクター（BreakefieldおよびDeLuca；Freeseら）は、成熟した有糸分裂後のニューロンに効率的に感染し得るので、このベクターは中枢神経系（CNS）の細胞における外来DNAの送達および発現に特に十分に適している。このベクターを操作する方法およびCNS細胞をトランスフェクトする方法は周知である（例えば、KennedyおよびSteiner；Yungを参照せよ）。多くの研究が、遺伝子的に改変された細胞を脳の異なる領域に移植する方法を記述している（Mali mら；RossiおよびSarver；Sullengerら；Morganら；Chatterjeeら；Malinら；Ho peら）。CNS組織へのベクターの直接注射を用いる研究も行われている（例えば、Zhangら）。裸のDNAの注射本発明のキメラ遺伝子を保有するプラスミドは、ラット心臓組織について実施例２に例示するように精製され、そして標的組織中に直接注射され得る。実施例２で議論するデータは、食塩水緩衝液に懸濁したプラスミドの心臓注射が、心臓細胞におけるそのプラスミドの発現をもたらすために効果的であることを示す。他の研究者は、同様なアプローチを用いて、例えば齧歯動物の心臓および骨格筋中で外因性遺伝子を発現させることに成功している（Wolfら；Ascadiら,1991a； Ascadiら,1991b；Linら；Kitsisら）。リポソーム媒介遺伝子移入リポソームは、当該分野で公知の方法を使用して、標的組織に遺伝子を送達するために用いられ得る。リポソームは、適切な組織への送達を容易にするため、その表面上に標的付ける部分またはリガンド（例えば、抗原、抗体またはウイルス）を含有するように構築され得る。例えば、紫外線（UV）不活化日本血球凝集ウイルス（HVJ）を用いて調製されたリポソームは、選択された組織にDNAを送達するために使用され得る（Morishitaら）。リポソームはまた、血液循環時間を延長し、血流を介するより多くの標的付けを可能にするため、例えば、リン脂質-ポリエチレングリコール結合体の組込みによって、表面コーティングされ得る。このタイプのリポソームは周知である。レセプター媒介遺伝子移入 DNAの取り込みに関するレセプター媒介エンドサイトーシス経路は、インビボにおいて特定の細胞タイプに標的付けられた遺伝子の送達を可能にし得る。レセプターを媒介する遺伝子移入の方法には、プラスミドDNAと細胞表面のレセプターによって認識され得る特異的ポリペプチドリガンド（Wu）との間の複合体の作製が含まれる。遺伝子送達のためのレセプター媒介取り込みに伴う問題点の一つは、このプロセスの間に形成されるエンドサイトーシス小胞がリソソームまで輸送され得、そこでエンドソームの内容物が分解されるということである。この輸送の過程の間にDNAのエンドソームからの脱出を容易にする方法が開発されている。例えば、アデノウイルス全体（Wagnerら,1992a；Christianoら）またはインフルエンザHA遺伝子産物の融合誘導性ペプチド（Wagnerら,1992b）のいずれかが、DNA含有エンドソームの効率的な破壊を誘導するために使用され得る。構築物の投与上に概論したような、ベクターが特定の細胞集団を選択的にトランスフェクトするために標的付けされ得る場合は、局所投与（例えば、標的組織への注射によって達成され得る）に加えて、ベクターは、生物学的に適合する溶液または薬学的に受容可能な送達ビヒクル中で、全身的に（例えば、静脈内に）投与され得る。この方法で投与されたベクター構築物は、標的組織に選択的に感染し得る。本発明によれば、構築物に標的組織特異的プロモーターを存在させることによって、治療用遺伝子の発現を制限する独立した手段が提供される。 VIII．応用Ａ．治療的応用本発明の組成物および方法は、種々の組織において、虚血および/またはそれに続く再灌流による組織損傷および/または死を防止するために有用であり得る。前記のように、例示的応用は、心臓発作後の再発性心筋虚血による損傷の減少にある。心臓発作の犠牲者の心臓組織における治療用遺伝子の発現は、続く何らかの虚血エピソードの間の組織に対する傷害の危険性を減少させ得る。同様に、一過性脳虚血、血餅または他の卒中危険因子を有すると診断された被験者は、低酸素誘導性脳特異的構築物の使用によって恩恵を受け得る。急性または慢性腎不全と診断された被験者は、腎臓へのさらなる虚血性損傷の危険性がより高い（例えば、RosenbergおよびPaller）。このような被験者は、腎臓特異的プロモーターの制御下の治療用遺伝子（その発現は低酸素条件によって増強される）の恩恵を受け得る。本明細書の恩恵を有する当業者により理解されるように、虚血の「危険がある」と診断された他の種々の組織も同様に保護され得る。前記の有用性に加えて、本発明の組成物（例えば、本発明のキメラ遺伝子を含有する発現ベクター）および方法はまた、獣医学において多くの応用を有する。動物は通常、古典的なアテローム性動脈硬化症を発症しないが、心筋症は極めて一般的である。多くの種は、細胞および組織（特に、血管壁および心筋組織）に直接的な酸化還元損傷を生じる虚血関連症候群（動脈炎、脈管炎および関連する血管症を含む）を発症する。このような病的状態は、本発明のキメラ遺伝子の投与によって軽減され得る。ウマおよびポニーにおいて一般的で重い病的状態には、通常は絞扼閉塞によって引き起こされる上行結腸虚血が含まれる（Dabareinerら；Sullivanら；Wilson およびStick）。イヌにおける関連する疾患は胃拡張−腸捻転と呼ばれる（Lantz ら）。これらの異常の処置は、代表的には、閉塞の外科的な除去を含む。このような手術後の再灌流は、再灌流した組織にかなりの傷害を生じ、そして典型的には進行性組織壊死を伴う炎症応答を誘発し得る。再灌流はまた、心原性ショックによる動物の死をもたらし得る。本発明の組成物および方法は、このような病的状態を処置し、上記症候群の処置の間に傷つき易い組織（心臓および血管内皮を含む）に保護を提供するために治療的に使用し得る。本発明の別の有用性は、イヌおよびネコにおける心臓疾患の処置である（Mill erら）。様々な形態の心血管疾患がイヌおよびネコの両方において記述されており、それらには拡張心筋症、左心室肥大および甲状腺機能亢進が含まれる（Fox ら；Atkinsら）。ヒトのアテローム性動脈硬化症に（プラーク形成および内膜増殖に関して）似た病的状態である全身壊死性脈管炎がビーグル犬において記述されている（Scott-Moncrieffら）。これらの各病的状態には、心臓および血管組織に対する虚血および再灌流酸化還元傷害が含まれる。それらは、本発明の方法および組成物を用いて処置され得る。Ｂ．診断応用のためのレポーター構築物本発明はまた、低酸素または無酸素の部位を特定することが望ましい場合、診断応用に使用され得る。本発明のこの局面によれば、治療用遺伝子は、レポーター遺伝子、例えば、本発明を支持するために行なった実験で使用したレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）に置き換えられる。選択されたプロモーターの制御下のレポーター遺伝子と低酸素応答エレメントとを含有するキメラ遺伝子は、低酸素の部位を特定することが望ましい組織に導入される。低酸素は、レポーター遺伝子の発現の増大によって特定される。以下の実施例は本発明を例示するものであるが、決して本発明を限定しようとするものではない。材料および方法他に示さない限り、化学品および試薬をSigma Chemical Company（St.Louis， MO）またはMallinckrodt Specialty Chemicals（Chesterfield，MO）から入手し、制限エンドヌクレアーゼをNew England Biolabs（Beverly，MA）から入手した。他の修飾酵素および生化学品をPharmacia Biotech（Piscataway，NJ）、Boehr inger Mannheim（Indianapolis，IN）またはPromega Corporation（Madison，WI ）から入手した。細胞培養用の培地のための物質をGibco/BRL（Gaithersburg，M D）またはDIFCO（Detroit，MI）から入手した。他に示さない限り、細胞、細菌および核酸の操作を標準的な方法およびプロトコール（例えば、Titus；Sambroo kら；Ausubelら）を用いて行なった。Ａ．定義「形質転換」とは、DNAを、そのDNAが染色体外エレメントとしてか、または染色体組込みによってかのいずれかで、複製可能であるように生物に導入することを意味する。当該分野ではいくつかの形質転換法が一般的に使用されており、これらの方法は、例えば、AusubelらおよびSambrookらに見出され得る。「トランスフェクション」とは、何らかのコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。当業者には、数多くのトランスフェクション法（例えば、CaPO₄およびエレクトロポレーション）が公知である。その発現ベクターの操作の何らかの徴候がその宿主細胞内で生じる場合、一般に、トランスフェクションの成功が認識される。「プラスミド」は、小文字pならびにこれに先行および／または後続する大文字および/または数字によって指定される。本明細書における出発プラスミドは市販されているか、無制限に公に利用できるか、もしくは公開された手順に従って入手できるプラスミドから構築され得るかのいずれかである。DNAの「消化」とは、そのDNA中の特定の配列（制限部位）でのみ作用する制限酵素によるDNAの触媒的切断をいう。本明細書中で使用する種々の制限酵素は市販されており（例えば、New England Bioiabs，Beverly，MA）、そしてそれらの反応条件は当業者に公知である。分析のためには、代表的に１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約20μlの緩衝溶液中の約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築用のDNAフラグメントを単離するには、代表的に５〜10μgのDNAを、より大きな容量中の約20〜40単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適切な緩衝液および基質量は、製造者により指定される。通常は37℃で約１時間のインキュベーション時間が用いられるが、これは供給者の指示にしたがって変化し得る。消化後、反応生成物をゲル（例えば、アガロース）上で泳動して、所望のフラグメントを単離する。「連結」とは、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう（例えば、Sambrookら）。他に注記しない限り、連結は、0.5μgの連結しようとするほぼ等モル量のDNAフラグメントあたり10単位のT4 DNAリガーゼを用いて、公知の緩衝液と条件を使用して達成され得る。「フィリング」または「平滑化」とは、制限酵素で切断された核酸の付着末端中の一本鎖末端を二本鎖に変換する手順をいう。これは付着末端を除去して、平滑末端を形成する。このプロセスは、１つまたは数種類の他の制限酵素のみによって生成する末端と付着性であり得る制限切断末端を、任意の平滑切断制限エンドヌクレアーセまたは他のフィリングされた付着末端と適合する末端に変換するための汎用ツールである。代表的には、平滑化は、10mM MgCl₂、１mMジチオスレイトール、50mM NaCl、10mM Tris（pH7.5）を含む緩衝液中で２〜15μgの標的DN Aを、DNAポリメラーゼIの８単位のクレノウフラグメント（Boehringer Mannheim ，Indianapolis，IN）およびそれぞれ250μMの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（Boehringer Mannheim）の存在下で、約37℃にてインキュベートすることによって達成される。一般的にはこのインキュベーションを約30分後に終了する。反応生成物を、標準的なフェノールおよびクロロホルム抽出法とそれに続くエタノール沈澱を用いて精製し得る。「ノーザン」ブロッティングは、既知の標識されたオリゴヌクレオチド、DNA またはRNAフラグメントへのハイブリダイゼーションによって、細胞mRNAの存在を確認する方法である。本明細書の目的のために、他にことわらない限り、ノーザン分析とは、Sambrookらが記述しているように、RNA（典型的にはmRNA）を変性剤（例えば、７％ホルムアルデヒド）の存在下でアガロース（例えば、１％）上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンに移し、標識したフラグメントにハイブリダイゼーションさせ、洗浄し、そして標識されたフラグメントを検出することを意味する。Ｂ．細胞および培地 HeLa細胞、Hep G2細胞およびC2C12筋芽細胞をAmerican Type Culture Collect ion（ATCC；Rockville，MD）から入手した。ヒト動脈内皮細胞をClonetics Corp .（San Diego，CA）から入手した。他に示さない限り、10％ウシ胎児血清（Gibc o/BRL）を含むMEMまたはDMEM培地（Gibco/BRL）中で、５または10％CO₂下、37℃ にて細胞を増殖させた。心筋細胞を既に記述されているように（Bishopricら；WebsterおよびBisphopr ic,1992）単離し、そして培養した。簡単に述べると、約30から得た心臓（3リットル）を細かく切断し、連続的なトリプシン消化にかけて単一細胞を遊離させた。最後の消化後、細胞を洗浄し、５％ウシ胎児血清（FCS；Gibco/BRL）を含む最小必須培地（MEM；Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）中で0.5時間、予備プレートした。非接着細胞を60mm Falconディッシュ（Becton Dickinson Labware，Linco ln Park，NJ）において、５％ウシ胎児血清、2.0g/lグルコースおよび10mM HEPE Sを含むMEM中、約2.5×10⁶細胞/ディッシュの密度で再びプレートし、５または1 0％CO₂下で37℃にて増殖させた。Ｃ．DNA １．治療用遺伝子 Bcl-2 cDNAを、Stanley Korsemeyer博士（ワシントン大学、St．Louis，MO；H ockenberyら,1990）からの発現ベクターpSFFV-Bcl-2中で入手した。一酸化窒素シンターゼ（bNOS）cDNAを、Solomon Snyder博士から、ベクターpNOS（ジョンズ・ホプキンス大学、Baltimore，MD；Bredtら,1991）中で入手した。２．プロモーター（i）心臓特異的クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子に連結したマウスα-ミオシン重鎖（αMHC）プロモーターの5'側の5.5キロ塩基（Kb）を含むpαMHC_5.5CATを、Jeffrey Robbins博士（シンシナティ大学医学部、Cincinnat i，Ohio；Subramaniamら）から入手した。 CAT遺伝子に連結したラットαMHCプロモーターの2.0Kbを含むpαMHC_2.0CATを、Thomas Gustafson博士（メリーランド大学、Baltimore，MD；Gustafsonら）から入手した。 CAT遺伝子に連結したラットαMHCプロモーターの86塩基対（bp）を含むpαMHC₈₆ CATを、Bruce Markham博士（ウィスコンシン医科大学、Milwaukee，Wisconsin ）から入手した。この構築物を、pαMHC2.0CATの5'短縮およびCAT遺伝子への平滑末端連結によって作製した。この86bpプロモーターフラグメントの配列を配列番号24として本明細書中に提供する。 CAT遺伝子に連結したヒト心臓α-アクチンプロモーターの5'側の118bpの領域を含むpHCA₁₁₈CATも、Larry Kedes博士から入手した（MintyおよびKedes）。（i）骨格筋特異的 CAT遺伝子に連結したヒト骨格筋α-アクチンプロモーターの150bpを含むpHSA- 150CATを、Larry Kedes博士（南カリフォルニア大学、Los Angeles，CA；Muscat およびKedes）から入手した。３．低酸素応答エレメント pGEM-4Z（Promega Corp.，Madison，WI）のBamHI部位にクローニングされたエリスロポエチン遺伝子3'低酸索誘導性エンハンサーエレメントの４つの縦列コピーを含む構築物を、Greg Semenza博士（ジョンズ・ホプキンス大学医学部、Balt imore MD；SemenzaおよびWang,1992）から入手した。本明細書でHREE1（配列番号６）と呼ぶこのエンハンサーエレメントフラグメントを、pGEMベクターからSm aIおよびHincIIでの切断により切り出し、本発明の構築物に平滑末端サブクローニングした（後述）。 β-エノラーゼ（ENO3）遺伝子の691bp（−628〜＋63）を含有する構築物を、C harlotte Peterson博士（Veterans Administration Medical Center，Universit y of Arkansas，Little Rock，Arkansas）から入手した。この領域を含む配列を、配列番号29として本明細書中で示す。４．本発明のキメラ遺伝子および発現ベクター下記プラスミドのほとんどを構築するための基礎ベクターとして、ベクターpG L2PV（プラスミド-遺伝子-光-プロモーター-ベクター；Promega Corp.，Madison ，WI）を用いた。pGL2PVは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にSV40初期プロモーターを含有する真核生物発現ベクターである。このベクターの多重クローニング（ MCS）部位はSV40プロモーターのすぐ上流にあり、エンハンサー配列を含むDNAフラグメントの挿入用に設計されている。pGL2BV（Promega Corp.）はpGL2PVと類似するが、これはSV40初期プロモーターを含有しない。（i）異なる組織特異的プロモーターを有するHREE1/lus構築物 240bpのHREE1フラグメント（配列番号６）をpGL2PV（図1A）のMCSのSmaI部位に平滑連結することによって、プラスミドpGLHRE（図1B、2A、3A）を作製した。 pGLHREをHindIIIおよびSmaIで消化してSV40プロモーターを抜き、そしてヒト骨格アクチン（HSA）プロモーターのフラグメントを含むpHSA-150CAT由来の150b pのHindIII-SmaIフラグメントでそれを置換することにより、プラスミドpGLHSA- 150HRE （図２Ｂ）を作製した。 pGLHREをHindIIIおよびSmaIで消化してSV40プロモーターを抜き、そしてヒト α-ミオシン重鎖（α-MHC）プロモーターの86bp（配列番号24）を含むpαMHC₈₆C AT由来の120bpのHindIII-EcoRIフラグメントでそれを置換することにより、プラスミドpGL αMHC₈₆HRE（図2C）を作製した。ベクターのSmaI部位への平滑末端連結に先立ち、上記120bpフラグメントのEcoRI末端を標準的な方法（Sambrookら）を用いてDNAポリメラーゼIでフィルインした。二連のGATA4ボックスを含む36bpオリゴヌクレオチド（配列番号１；上記）を、プラスミドpGLαMHC₈₆HREのHindIII部位（ポリメラーゼでフィルインした；86bp プロモーターフラグメントの上流）にクローン化することにより、プラスミドpG L αMHC₈₆-GATA-HRE を作製した。 pGLHREをHindIIIおよびSmaIで消化してSV40プロモーターを抜き、そしてヒト心臓アクチン（HCA）プロモーターの118bp＋アクチンエキソン1の70bpを含むpHC A₁₁₈CAT由来の188bpのHindIII-EcoRIフラグメントでそれを置換することにより、プラスミドpGLHCA₁₁₈HRE（図2D）を作製した。ベクターのSmaI部位への平滑末端連結に先立ち、上記188bpフラグメントのEcoRI末端を、上記のようにDNAポリメラーゼIでフィルインした。 pGLHREをHindIIIおよびSmaIで消化してSV40プロモーターを抜き、そしてヒト α-MHCプロモーターの1.2kbを含むpαMHC_2.0CAT由来の1.2kbのHindIII-EcoRIフラグメントでそれを置換することにより、プラスミドpGL αMHC_1.2HRE（図3B）を作製した。クローン化に先立って、上記のように1.2kbフラグメントのEcoRI末端をフィルインした。（ii）PKM プロモーター/luc構築物ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、ラット筋特異的ピルビン酸キナーゼ（PKM）遺伝子プロモーターの460bpおよびPKMコード配列の140bp（配列番号７）を含むプラスミドpGLPKM₄₆₀ を以下のように作製した。その5'末端近くにエンドヌクレアーゼ制限部位を含むPKM特異的プライマーを、PKM遺伝子のヌクレオチド配列（Takenakaら,1989）に基づいて設計した。PKMプライマーF（配列番号２）はKpnI部位を含み、PKMプライマーR（配列番号３）はXhoI部位を含んだ。上記のプライマーおよび鋳型としての１μgのラット心臓ゲノムDNAを用いて、標準的な手順およびPerkin-Elmer（Norwalk，CT）DNAサーマルサイクラーを用いて、PCR を25サイクル行なった。そのPCR産物（図6A）をアガロースゲル電気泳動により精製し、KpnIおよびXhoIで切断し、そしてKpnI/XhoI切断pGL2BV（図6B；Promega Corp.,Madison，WI）にクローン化して、pGLPKM₄₆₀（図6C）を得た。 pGLPKM₄₆₀をSmaIで消化してプロモーターの−460から−285までの部分を抜き、そしてベクターを再連結することにより、プラスミドpGLPKM₂₈₅ （図6E）を生成した。pGLPKM₄₆₀をSmaIで消化してプロモーターの−460から−285までの部分を単離し、そしてそのフラグメントをSmaIで切断しておいたpGL2PV（Promega Corp. ）にクローン化することにより、pGLPKM_D （図6D）を生成した。（iii）Et-1 プロモーター/luc構築物ヒトET-1遺伝子プロモーターの700bp（配列番号８）を含有するプラスミドpGL ET-1₇₀₀ （図7C）を、上記のようにHeLa細胞ゲノムDNAを増幅するPCRを用いて作製した。ET-1特異的プライマーをET-1遺伝子のプロモーター配列（Inoueら,1989 ）に基づいて設計した。正方向プライマー（配列番号４）はPstI部位およびKpnI 部位を含み、逆方向プライマー（配列番号５）はHindIII部位およびXbaI部位を含んだ。そのPCR産物（図7A）をゲル電気泳動により精製し、KpnIおよびHindIII で切断し、そしてKpnI/HindIII切断pGL2BV（図７Ｂ；Promega Corp.）にクローン化した。（iv）ENO3 プロモーター/Iuc構築物ラムダgt10ヒトゲノムライブラリーから単離したENO3プロモーターフラグメント（−628から＋63まで；配列番号29）を含む平滑末端化ゲノムDNAを、pGL2BVの SmaI部位にクローン化することにより、プラスミドpGLENO₆₂₈ を構築した。（v）治療用遺伝子構築物プラスミドpGLαMHC_1.2HRE（図4A）をHindIIIおよびEcoRVで消化してルシフェラーゼcDNAを抜き、そして全長NOS cDNAを含むpNOS由来のHindIII/XbaIフラグメントでそれを置換することにより、プラスミドp αMHC_1.2HRE-NOS（図4B）を作製した。 pSFFV-Bcl-2をSalIで消化し、そのベクターを上記のように平滑化し、EcoRI消化で直鎖状ベクターからSFFVプロモーターを除去し、そして240bpのHREE1および 1.2kbαMHCプロモーターを含むpgLαMHC_1.2HREE由来のSmaI/EcoRIフラグメントでそのSFFVプロモーターを置換することにより、プラスミドp αMHC_1.2HRE-Bcl-2 （図5B）を作製した。（vi）他のプラスミド構築物 pαMHC_5.5CATのαMHCプロモーターのすぐ5'側に240bp HREE1を挿入することにより、プラスミドpαMHC_5.5HRE-CATを作製した。（vi）アデノウイルス構築物標準的な方法（例えば、Friedmanら,1986；HertzおよびGerard,1993）を用いて、下記のようにアデノウイルス構築物を作製する。 pαMHC1.2-Bcl-2由来の3.34KbのEcoRI/HindIIIフラグメント（α-MHCプロモーターの1.2Kb、1.9KbのBcl-2 cDNAおよび240bpのHREE1を含む）を、EcoRIおよびH indIIIで消化してCMVプロモーターおよびCAT遺伝子を抜いたpAPLCMVに挿入することによって、構築物Ad αMHC1.2Bcl2HREEを作製する。pAPLCMV（Larry Kedes博士（University of Southern California，Los Angeles，CA；Kass-Eislerら,19 93）から入手し得る）は、塩基複製欠損アデノウイルス発現ベクターである。組換え用骨格アデノウイルスベクターであるp9M17もLarry Kedes博士から入手し得る。組換えpAPLCMV（pAdαMHC1.2bcl-2HRE）およびp9M17を用いて293細胞（ATCC）を同時トランスフェクトして、アデノウイルスを増殖させる。実施例１インビトロにおける組織特異的低酸素誘導性発現構築物pGLHRE、pGLHSA-150HRE，pαMHC_5.5HRE-CAT、pGLαMHC_1.2HRE、pGLHCA₁ ₁₈ HREおよびpGL-Eno₆₂₈を、HeLa細胞、Hep G2細胞、分化したC2C12筋肉筋管、および心筋細胞における組織特異的発現および低酸素誘導性について試験した。Ａ．緩衝液および溶液 HEPES 緩衝化生理食塩水（HeBS；2×溶液） PBS 緩衝液再構成ルシフェラーゼアッセイ試薬（LAR）細胞培養溶解試薬（CCLR；1×溶液）Ａ．細胞トランスフェクション HeLa細胞、C2C12筋細胞および心筋細胞を、標準的リン酸カルシウム手順（Aus ubelら）によって示したプラスミドDNAでトランスフェクトした。簡単に述べると、10⁵の細胞を10cm組織培養ディッシュにプレートし、そして３日間増殖させた。プラスミドDNAを適用する１日前に、細胞を10mlの培地中に1 ：10に分割した。20μgのプラスミドDNAを含むエタノール沈澱ペレットを450μl のddH₂O中に再懸濁し、そして50μlの2.5mM CaCl₂を加えることにより、トランスフェクション用DNAを調製した。 500μlの2×HeBSを15ml円錐遠心管に加え、自動ピペッター（Drummond Instru ments，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）に装着した10mlピペットで空気を泡立たせることによって、その溶液を曝気した。DNA/CaCl₂溶液を滴下し、そして得られた混合物を５秒間ボルテックスし、次いで室温で20分間静置して沈澱を形成させた。細胞を含むディッシュに沈澱物を加え、そしてそのディッシュを終夜インキュベートした。細胞を５mlのPBSで２回洗浄し、そして細胞に10mlの完全培地を供給した。次に細胞を24時間回復させた後、1.0％O₂、５％CO₂、94％N₂の雰囲気下でさらに20 時間インキュベートした。Ｂ．低酸素条件への曝露トランスフェクションの２〜３日後、Nikon TMS顕微鏡および連続読み取り酸素電極（Controls Katharobic，Philadelphia，PA，USA）を装着した環境チャンバー（Anaerobic Systems，San Jose，CA，USA）中で、細胞を大気酸素（約21％ O₂、５％CO₂、バランスN₂；pO₂＝約160mmHg）、または低酸素条件（約0.5〜2.0 ％O₂、５％CO₂、バランスN₂；pO₂＝約4〜8mmHg）に曝した。特に示さない限り、細胞をチャンバー中に１日間保持した後、ルシフェラーゼ発現についてアッセイした。Ｃ．ルシフェラーゼ発現上記のようにトランスフェクトし、そして処理した細胞を、標準的反応プロトコル（Titus）を用いて、ルシフェラーゼ酵素の発現についてアッセイした。簡単に述べると、１mlのCCLRおよび１mlのLARを室温で平衡化させた。アッセイされるべき細胞を含むディッシュ中の培養培地を除去し、そして細胞をPBS緩衝液で２回リンスした。細胞を含むディッシュに約300μlの室温のCCLRを加え、そしてこのディッシュを室温で10〜15分間インキュベートした。次に細胞を培養ディッシュの底から掻き取り、そして細胞を含む溶液をマイクロ遠心管に移した。その遠心管を卓上マイクロ遠心分離機で短時間（約５秒）遠心分離して大きい残渣をペレット化した。上清（細胞抽出物）の20μlを室温で100μlのLARと混合し、そしてモデル#125 0LKBルミノメーター（BioOrbit，Gaithersburg，MD）を用いて、生成する光を、混合の約５秒後から開始して、５分間測定した。Ｄ．結果 HeLa、C2C12および心臓細胞から得たデータを下記表１に記載する。任意単位( arbitrary unit)で表した値は、各条件について３回以上の実験の平均を表している。表に示すデータは以下を実証している。（i）試験した組織特異的プロモーターを有する構築物はすべて、正常条件下および低酸素条件下のいずれにおいても、繊維芽細胞由来のHeLa細胞中でバックグラウンド以上に発現されない；（ii） HREE1および適合性プロモーター（SV40プロモーターおよび組織特異的プロモーターを含む）を有する構築物を含む細胞は、低酸素条件下において好気条件下より約５〜約７倍高いレベルでレポーターを発現する；（iii）HREE1エレメントは異なる細胞中で同等に活性であり、そしてプロモーターに依存しない；（iv）α -MHC_1.2プロモーターは心臓において発現するが、骨格または繊維芽細胞由来細胞においては発現せず、HCA₁₁₈プロモーターは心臓および骨格筋細胞の両方において発現するが、繊維芽細胞由来細胞では発現せず、そしてHSA₁₅₀プロモーターは骨格筋および心筋の両方において発現し、骨格筋における発現がより強い；および（v）α-MHC_1.2HCA₁₁₈、およびHSA₁₅₀プロモーターからの基底（好気的）発現は弱い。これらの結果は、筋および心臓特異的プロモーターに融合された場合に、HREE 1エレメントが完全に機能的であること、ならびに筋および心臓細胞がこれらのプロモーターの調節に関して完全に低酸素に対して応答性であることを示しており、このことはαMHC_1.2プロモーターが、心臓特異的発現のレベルを調節するための例示的プロモーターであることを示唆している。このデータはまた、ENO3プロモーター中に存在するHREEおよびHREE1の両方が、SV40プロモーターを有する構築物中に存在する場合、骨格筋細胞において匹敵するレベルの低酸素誘導を生じることも示している。しかし、心臓細胞においては、ENO3 HREEを含有する構築物は、HREE1を含有する構築物よりかなり高いレベルで発現される。さらに、低酸素は、心臓細胞におけるENO3 HREE含有構築物の発現レベルを７倍以上に増大させるが、これに比較して骨格筋細胞においては５倍未満である。プラスミドpGLENO₆₂₃はC2C12筋管および心筋細胞において、少なくともこれらの細胞における４コピーのエリスロポエチンHRE（HREE1）と等価の誘導性発現を付与する。これらの結果は、ENO3プロモーターフラグメント中のHR EEが、心臓または骨格筋細胞に組織特異的プロモーターを用いて標的化される構築物における低酸素誘導用HREEとして、とりわけ効果的であり得ることを示唆している。実施例２標的動物組織中への構築物の注射後のインビボにおける組織特異的低酸素誘導性発現 Buttrickら（1992）およびButtrickら（1993）に記載されている技術を用いて、本発明の構築物を心臓組織に直接注射した。簡単に述べると、成体雌Wisterラットを抱水クロラール（0.7ml/100gの４％溶液）の腹腔内注射で麻酔した。側方開胸術によって心尖に直接的に心臓注射を行った後、心臓を胸部に戻し、ラットを短時間換気亢進させ、そして切開部を閉じた。20％スクロースおよび２％エバンスブルー中の２μg/μlのpGLHREまたはpGLHCA₁₁₈HREを含むDNA溶液50μlを、2 7ゲージ針を通して注射した。注射後、Smithら（1988）により記載されているように、冠状動脈のカニューレ挿入によってラットを20分間の虚血に供した。ベクター発現の低酸素誘導性を以下のようにアッセイした。誘導された虚血の約20時間後に心臓を摘出し、そしてその心室を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PB S）で洗浄した。20％スクロースを含む氷冷PBS １ml中に組織を懸濁し、そしてP olytron（Kinematica，Switzerland）で45秒間ホモジナイズした。10,000×gで1 0分間の遠心分離後、上清を上記のアッセイ法によりルシフェラーゼ発現について分析した。タンパク質をBioRadアッセイキット（BioRad Laboratories，Hercu les，CA）を用いて測定した。この実験の結果を下記表２に示す。pGLHREまたはpGLHCA₁₁₈HREを注射し、そして虚血に供したラット由来の心臓におけるルシフェラーゼ発現は、生理食塩水を注射したコントロール動物由来の心臓における発現より約２倍高かった（n=3）。上記のようにプラスミドをラット心臓に注射した。一群（３匹のラット）に20 分間の虚血を課し、そして他の群（１匹のコントロール）を擬似手術した。20時間後に組織サンプルを収集し、そしてルシフェラーゼ発現についてアッセイした。これらの結果は、本明細書の教示にしたがって作製されたプラスミドDNAの、生存哺乳動物の心臓への直接注射が、これらのプラスミドが保持する遺伝子の発現を生じるために有効であることを示している。さらにこれらの結果は、本発明のキメラ遺伝子を保持する発現ベクターが、インビボでの虚血によって引き起こされる低酸素に応答して、有意に増大した発現レベルを生じるために有効であることをも示している。実施例３インビトロにおける低酸素調節NOSおよびBcl-2遺伝子の安定発現標準的方法（MintyおよびKedes,1986）を用いて、pSV2Neo（MintyおよびKedes ）ならびに試験プラスミドを1：19の比率で（１μgのpSV2Neo＋19μgの試験プラスミド）10⁶のC2C12筋芽細胞を同時トランスフェクトした。試験プラスミドはpG LHRE、pGLHCA₁₁₈HRE、pGLαMHC_1.2HRE、pSFFV-Bcl-2、およびpNOS-HREであった。トランスフェクション後の２日目に、培養物を400μg/mlのネオマイシン薬物G 418（Gibco/BRL）で選択した。G418耐性細胞のコロニーが10〜14日後に出現した。耐性細胞をプールした。集団培養物をルシフェラーゼの発現について上記のようにアッセイするか、あるいはBcl-2またはNOS RNAの発現についてノーザンブロットアッセイ（Websterら,1993）によりアッセイした。安定な株はトランスフェクトした遺伝子の発現に関して陽性であった。集団培養物を低マイトジェン培地（２％ウマ血清を含むDMEM）にそれらを移すことによって分化条件に供し、そして筋管への分化について視覚的に分析した。トランスフェクションされた細胞とコントロール細胞との間には明確な相違はなかった。低マイトジェン培地中での24時間後に、細胞の約40％が多核筋管中に融合された。48時間後には、すべての培養物が約74％の筋管を含んだ。レポーター−トランスフェクトした細胞は正常に分化し、そして予想されたレポーターの誘導を有して低酸素に応答した。NOS−トランスフェクトした細胞は低酸素の間およびそれに続く再酸素化の間の両方で正常であるようであった。構成的にBcl-2を過剰発現するC2C12細胞の安定な株（HREE1を含まない）も上記のように構築し、そしてその細胞は正常な増殖および分化特性を示した。これらを総合すると、上に示すデータは、HREエレメントを含むこと、Bcl-2過剰発現、およびNOSの低酸素誘導性過剰発現がインビトロにおいて筋細胞にとって毒性でないことを示唆している。さらに、このデータは、治療用遺伝子の発現によって、細胞を低酸素の有害な影響から保護し得ることを示している。実施例４低酸素条件下におけるpGLPKMプラスミドの発現実施例１に記載のように、C2C12細胞および心筋細胞中にプラスミドpGLPKM₄₆₀ をトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。トランスフェクトされたC2C12筋管および新生児心筋細胞の両方におけるpGLPKMの発現は、実施例１に記載したように、0.5％O₂、５％CO₂、バランスN₂（低酸素条件）を含む雰囲気中での細胞インキュベーションによって、正常な条件と比較して、両方の細胞タイプにおいて６±２倍（n=4）に増大した。 SmaI消化して内部SmaI部位を切断することによって得られたこのHREエレメントの一部も、低酸素応答エンハンーエレメントとして有効である。HREPKM₂₈₅と命名したこのフラグメントは、C2C12筋管および心筋細胞において、pGLPKM₄₆₀で得られるものと類似の低酸素誘導性発現を付与する。この低酸素誘導のレベルは、少なくともHREE1（配列番号６）を用いて得られるものと等価である。これらの結果は、配列番号７として示される配列に含まれるPKMプロモーターフラグメントが、低酸素条件下でそのエレメントを含むキメラ遺伝子の発現を増強することにおいて有効であるHREエレメントを含有することを示している。 PKMプロモーター配列は、エリスロポエチンHREコンセンサス配列と有意な相同性を有さないが、ENO3プロモーターフラグメント（配列番号29）とはコンセンサス配列（配列番号31）を共有する。PKMの転写開始部位の約88bp上流、およびENO 3の転写開始部位の約70bp上流に位置するこのコンセンサス配列は、低酸素に応答した発現の増強を付与するための重要なエレメントであり得る。実施例５低酸素条件下におけるpGLET-1₇₀₀の発現実施例１に記載したように、ヒト動脈内皮細胞中にプラスミドpGLET-1₇₀₀をトランスフェクトした。これらの細胞におけるpGLET-1₇₀₀の発現は、上記の低酸素雰囲気における細胞のインキュベーションによって、５倍増大した。試験したすべての他の細胞タイプ（HeLa、C2C12および心筋細胞を含む）においては、pGLET -1₇₀₀の有意な誘導は観察されなかった。この700bpの配列に含まれるエレメントは、エリスロポエチンHREコンセンサス配列と有意な相同性を有さない。これらの結果は、配列番号８として本明細書に示される配列に対応するヒトET -1遺伝子プロモーターの700bpのフラグメントが、（i）その制御下にある遺伝子の発現を血管内皮に制限し、そして（ii）これらの遺伝子の発現に対して低酸素誘導性を付与することに有効であることを示している。したがって、このフラグメントを、治療用遺伝子またはレポーター遺伝子と共に、本発明の方法において使用して、選択された組織（血管内皮）に発現を標的化すること、および低酸素による発現の増強を付与することの両方をし得る。実施例６低酸素によるヒトメタロチオネインIIa（hMTIIa）プロモーターの調節ヒトMTIIa（hMTIIa）プロモーターに由来する３つのDNAフラグメントを、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）レポーター遺伝子アッセイにおいて、低酸素応答性について試験した。このプロモーター（転写開始部位の下流の最初の＋21bpを含む）の−760bp（配列番号32）および-345bp（配列番号33）を含むフラグメントを、pCAT Basicレポーターベクター（Promega，Madis on，WI，USA）中の細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（C AT）遺伝子のすぐ上流にクローン化して、それぞれベクターpCAT-760およびpCAT -345を生成した。次に、標準的リン酸カルシウム法（Ausubelら）を用いて、これらのベクターを用いてA431細胞（ATCC受託番号CRL-7907）をトランスフェクトした。トランスフェクションの約４日後、トランスフェクトされた細胞を、10％ウシ胎児血清を補充し、そして400μg/mlのG418を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）からなる選択培地に曝して、安定なクローンを選択した（pCAT BasicベクターはG417/ネオマイシン耐性遺伝子を含有する）。初期の継代（1〜10）のプールされた安定クローンを低酸素実験において用いた。低酸素に曝す３時間前に、培養物をバッチしている(batching)培地を交換した。37℃の水槽に沈め、そして真空ライン上の５％CO₂/N₂多岐管に接続した特別設計のアルミニウムチャンバー（Laderouteら,1992）の内側に、ディッシュを入れた。固定圧までの７サイクルのポンピングにより酸素を37℃で1.5時間かけて抜いた後５％CO₂/N₂で満たした。気相の最終O₂圧(tension)は大気O₂の約0.01％だった（pO₂＜0.08トル）。 37℃での示した時間（14時間まで）インキュベートした後、加湿嫌気性チャンバー（Anaerobic Systems，San Jose，CA）中の５％CO₂/N₂下でチャンバーを開いた。好気性コントロールを、37℃で５％CO₂/空気中で同じ時間インキュベートした。８または14時間の低酸素後に、Triton X-100法（Laderouteら,1992）を用いて、加湿嫌気性チャンバー中で、CATアッセイ用の全タンパク質を細胞溶解物として収集した。CATアッセイは、標準的方法（Ausubelら）を用いて行なった。簡単に述べると、Acyl CoAおよび¹⁴C標識したクロラムフェニコールを細胞溶解物に加え、そして修飾されたクロラムフェニコールの誘導体を薄層クロマトグラフィーを用いて出発物質から分離した。抽出物のCAT活性を以下の式を用いて定量した：下記表３は、−345bpフラグメントについてのCAT活性データを表す。数字は、低酸素に曝したトランスフェクト細胞由来の抽出物中のCAT活性の量を、酸素正常条件下のトランスフェクト細胞由来の抽出物中のCAT活性で割った量を表す。低酸素調節転写活性を、公知のhMTIIa転写のアクチベーターである（KarinおよびHerrlich,1989）塩化カドミウム（10μM）により引き起こされる転写活性と比較する。これらの結果は、低酸素ストレスがhMTIIa近位プロモーターからの転写を増大させ得ることを示している。好気性コントロールに比較してのCAT活性の増強は、８時間および14時間の低酸素の両方で観察された。誘導レベル（２〜３倍）は、塩化カドミウム処理ポジティブコントロールにおいて見出される範囲と同じ範囲にあった。760bp構築物の低酸素応答性は、345bp構築物の応答性と同様であった。実施例７ hMTIIa プロモーターの欠失分析 hMTIIaプロモーターをさらに特徴づけるため、−345bpの応答性フラグメントのPCR生成ネスト欠失フラグメントでマウスC2C12筋芽細胞を一過性にトランスフェクトした。hMTIIaプロモーターの−163bp（配列番号34）および−90bp（配列番号35）を含むフラグメント（転写開始部位の下流の最初の＋21bpを含む）を、 pGL2プラスミド（Promega，Madison，WI）のルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ上流に挿入して、それぞれpGL2-163およびpGL2-90を生成した。これらのプラスミドを用いて、上記のようにC2C12細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を低酸素処理に供し、そして細胞抽出物を上記のように作製した。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を、標準的アッセイ法（Ausu belら）を用いて測定した。簡単に述べると、ATPおよび基質であるルシフェリンをルミノメーター中の溶解物に加え、そして全光出力を測定した。光の量は、抽出物中に存在するルシフェラーゼの量に比例した。 pGL2-163およびpGL2-90でトランスフェクトされた細胞由来の抽出物の両方は、低酸素条件下でルシフェラーゼ活性の有意なアップレギュレーションを示し、その誘導のレベル（約3.0倍）は上記実施例６で観察されたレベルと同様であった。これらの結果は、hMTIIaプロモーターの近位90bpフラグメント（配列番号35 ）に、少なくとも１つのHREが含まれることを示唆している。実施例８インビトロにおけるhMTIIa HREによる毒性遺伝子の誘導 pGL3-Basicプロモーターベクター（Promega）中のルシフェラーゼコード配列を、NcoI/XbaIフラグメントとして切り出し、そしてヒト腫瘍壊死因子（hTNF）をコードする二本鎖PCR生成DNAフラグメント（配列番号37；Shiraiら）で置換する。TNFはプログラムされた細胞死またはアポトーシスを迅速に誘導する成長因子であり（ClevelandおよびIhle,1995）、低酸素ストレスによって誘導されることは知られていない。TNF遺伝子のすぐ上流に−90bpのhMTIIaフラグメント（配列番号35）を挿入して、構築物hMTIIa-HRE-TNFを得る。この構築物を用いて、上記のようにC2C12細胞（一過性トランスフェクション）およびA431細胞（安定トランスフェクション）をトランスフェクトする。次に、トランスフェクトされた細胞を、上記のように、８〜24時間の範囲の時間、酸素正常条件または低酸素条件のいずれかに供し、そしてTNFタンパク質の誘導された細胞傷害性を、標準的クローン原性アッセイ（例えばKowkおよびSutherland 、1989に記載されている）を用いて評価する。簡単に述べると、いくつかの希釈物（各希釈物につき３つの複製）を各時点用にプレートし、そして細胞を37℃の加湿インキュベーター中で10〜20日間静かにインキュベートする。細胞コロニーをメチレンブルーで染色し、そして30以上の細胞を有するコロニーを記録する。低酸素処理の直後にノーザン分析およびウェスタン分析を行なって、TNFの誘導を測定する。実施例９動物異種移植片モデルにおける低酸素媒介性TNF誘導および腫瘍制御腫瘍が実質的な低酸素部分を発達させる段階を決定するため、４〜５週齢の範囲ヌードマウス（Taconic，Germantown，NY，USA）に、右側の背の中に、約５× 10⁶個の対数増殖中の非トランスフェクトA431細胞を皮下（s.c.）片側注射する。2-ニトロイミダゾールエタニダゾールの誘導体、フッ素化生体還元性化合物2- (2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)-N-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル)アセトアミド（EF5；Cameron Koch博士（Department of Radiation and Oncology ，School of Medicine，University of Pennsylvania；Lordら,1993から得た）を用いて、低酸素領域を同定する。エタニダゾールは低酸素圧での生体還元後に、細胞高分子への共有結合を形成する（Lordら,1993）。これらの非生理学的付加物に対して惹起されたモノクローナル抗体（Lordら,1993）を用い、標準的な免疫組織化学を用いて、毎週２回収集する腫瘍由来の連続凍結切片（7μm）中の低酸素領域を画像化する。Ａ．インビボにおけるレポーター構築物の試験 hMTIIaプロモーター由来のHREの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター遺伝子構築物を、上記のように作製し、そしてそれを用いてA431細胞を安定にトランスフェクトする。３群のマウスを用いて実験を行い、3種類の細胞、すなわち1）非トランスフェクト細胞、2）空のpGL2ベクターを含む安定なトランスフェクタント、および3） hMTIIA-HRE-pGL2構築物を含有する安定なトランスフェクタントのうちの１つを各群に上記のように注射する。第１群および第２群を、ネガティブコントロールとして使用する。腫瘍を、それらが実質的な低酸素部分を含む段階（上記のように決定される）まで生育させる。次に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出し、そしてクリオスタット上で切断し、そして得られた凍結切片をルシフェラーゼ活性およびEF5染色について分析する。第３群のマウスにおけるルシフェラーゼ活性とEF5染色との間の重複の程度は、インビボにおける、腫瘍におけるこのようなHRE含有構築物の潜在的有効性に関係する。Ｂ．インビボにおける毒性構築物の試験これらの実験は、hMTIIa-HRE-TNF構築物または空のベクター（hMTIIa-HREおよびTNF cDNAの両方を欠く）でトランスフェクトされたA431細胞を使用する点以外は、上記のように行なう。「APOTAG」キット（Oncor，Gaitherburg，MD）を用いて、凍結切片をアポトーシスについて評価する。空のベクターを含む腫瘍と比較して、トランスフェクトされたhMTIIa-HRE-TNF構築物を含む腫瘍の低酸素領域におけるアポトーシスの増大によって、構築物の有効性を測定する。特定の方法および実施態様を参照して本発明を説明したが、本発明から逸脱することなく様々な改変および変更をなし得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マーフィー，ブライアンアメリカ合衆国カリフォルニア 94306, パロアルト，マタデロアベニュー 395 (72)発明者レイドルート，キースアール. アメリカ合衆国カリフォルニア 94025, メンロパーク，コールマンアベニュー 750，アパートメント 18 (72)発明者グリーン，クリストファージェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94945, ノバト，トパズドライブ 2737

Claims

【特許請求の範囲】１．低酸素応答エンハンサーエレメント、該エレメントとは異種の組織特異的プロモーター、および治療用遺伝子を含有するキメラ遺伝子であって、該プロモーターが該治療用遺伝子に作動可能に連結されており、そして該エレメントが該治療用遺伝子の発現を調節するのに有効である、キメラ遺伝子。２．前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、請求項１に記載のキメラ遺伝子。３．前記プロモーターが、α-MHC_5.5プロモーター、α-MHC₈₇プロモーター、およびヒト心臓アクチンプロモーターからなる群より選択される、請求項２に記載のキメラ遺伝子。４．前記プロモーターが、腎臓特異的プロモーターである、請求項１に記載のキメラ遺伝子。５．前記プロモーターが、レニンプロモーターである、請求項４に記載のキメラ遺伝子。６．前記プロモーターが、脳特異的プロモーターである、請求項１に記載のキメラ遺伝子。７．前記プロモーターが、アルドラーゼＣプロモーターおよびチロシンヒドロキシラーゼプロモーターからなる群より選択される、請求項６に記載のキメラ遺伝子。８．前記プロモーターが、血管内皮特異的プロモーターである、請求項１に記載のキメラ遺伝子。９．前記プロモーターが、Et-1プロモーターおよびフォン・ビルブラント因子プロモーターからなる群より選択される、請求項８に記載のキメラ遺伝子。１０．前記低酸素応答エンハンサーエレメントが、エリスロポエチンHREエレメント（HREE1）、ピルビン酸キナーゼ（PKM）HREエレメント、エノラーゼ３（ENO 3）HREエレメント、エンドセリン-１（ET-1）HREエレメント、およびメタロチオネインII（MTII）HREエレメントからなる群より選択される、請求項１に記載のキメラ遺伝子。１１．前記HREエレメントが、配列番号35に含まれる配列を有する、請求項１０に記載のキメラ遺伝子。１２．前記治療用遺伝子が、酸化窒素シンターゼ（NOS）、Bcl-2、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、およびカタラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載のキメラ遺伝子。１３．請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含有する、発現ベクター。１４．前記発現ベクターが、プラスミドである、請求項１３に記載の発現ベクター。１５．前記発現ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。１６．前記発現ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。１７．低酸素条件に曝される細胞の虚血性損傷を減少させる方法であって、該細胞に請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラ遺伝子を導入する工程を包含し、ここで該細胞を低酸素条件に曝すことにより該治療用遺伝子の発現が増大し、そしてここで該治療用遺伝子の発現が該細胞への虚血性損傷を減少させるのに有効である、方法。１８．前記細胞が、血管内皮細胞であり、そして前記プロモーターが血管内皮特異的プロモーターである、請求項１７に記載の方法。１９．低酸素条件に曝される細胞の虚血性損傷を減少させる方法であって、該細胞に低酸素応答エンハンサーエレメント、治療用遺伝子、および該治療用遺伝子に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含有するキメラ遺伝子を導入する工程を包含し、ここで該エレメントは該治療用遺伝子の発現を調節するのに有効であり、ここで該細胞を低酸素条件に曝すことにより該治療用遺伝子の発現が増大し、そしてここで該治療用遺伝子の発現が該細胞への虚血性損傷を減少させるのに有効である、方法。２０．配列番号35に由来する配列からなる低酸素応答エンハンサー（HRE）エレメント。