PL191586B1 - Gen chimeryczny, środek farmaceutyczny go zawierający, zastosowanie genu chimerycznego oraz sposób konstruowania genu chimerycznego - Google Patents
Gen chimeryczny, środek farmaceutyczny go zawierający, zastosowanie genu chimerycznego oraz sposób konstruowania genu chimerycznegoInfo
- Publication number
- PL191586B1 PL191586B1 PL335409A PL33540998A PL191586B1 PL 191586 B1 PL191586 B1 PL 191586B1 PL 335409 A PL335409 A PL 335409A PL 33540998 A PL33540998 A PL 33540998A PL 191586 B1 PL191586 B1 PL 191586B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- promoter
- tnf
- caspase
- apoptosis
- Prior art date
Links
- 230000007820 inflammatory cell apoptotic process Effects 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 183
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 64
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 51
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 41
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 22
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 21
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 20
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 20
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 claims description 19
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 102100025597 Caspase-4 Human genes 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 101710090338 Caspase-4 Proteins 0.000 claims description 12
- 102100038916 Caspase-5 Human genes 0.000 claims description 12
- 101710090333 Caspase-5 Proteins 0.000 claims description 12
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 claims description 12
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 12
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 claims description 11
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 claims description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 11
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 8
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims description 7
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 claims description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 claims description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 claims description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000425 Caspase 6 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004018 Caspase 6 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000572 Caspase-10 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004068 Caspase-10 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000552 Caspase-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims description 2
- 101100519159 Arabidopsis thaliana PCR3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000004046 Caspase-2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 66
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 63
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 19
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 10
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 101000793880 Homo sapiens Caspase-3 Proteins 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 6
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 6
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 4
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 101150101459 tx gene Proteins 0.000 description 4
- -1 variants Substances 0.000 description 4
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100032616 Caspase-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 102100022584 3-keto-steroid reductase/17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 7 Human genes 0.000 description 2
- 101710135980 3-keto-steroid reductase/17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 7 Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 2
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 241001111421 Pannus Species 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010822 cell death assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 206010051728 Bone erosion Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000015212 Fas Ligand Protein Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 101100273284 Homo sapiens CASP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000973997 Homo sapiens Nucleosome assembly protein 1-like 4 Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 1
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100441533 Mus musculus Cxcl9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 1
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100022396 Nucleosome assembly protein 1-like 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000033464 Reiter syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010006886 Vitrogen Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000008355 cartilage degradation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 101150055276 ced-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000018276 interleukin-1 production Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000012977 invasive surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical class ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 101150115039 mig gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008409 synovial inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 231100000462 teratogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003439 teratogenic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
Abstract
1. Gen chimeryczny, znamienny tym, ze obejmuje co najmniej jedna sekwencje wzmacnia- jaca promotor TNFa, oznaczona numerem identyfikacyjnym 10 lub 11, lub jej funkcjonalny frag- ment, polaczona z funkcjonalna kopia minimalnego promotora TNFa, posiadajacego sekwencje wybrana sposród grupy obejmujacej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 1, 2, 3 lub ich funkcjo- nalne fragmenty i polaczona ponadto z co najmniej jedna kopia genu indukujacego apoptoze, któ- rego ekspresja kieruje promotor TNFa. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest gen chimeryczny do terapeutycznego indukowania apoptozy w komórkach zapalnych, środek farmaceutyczny go zawierający, zastosowanie genu chimerycznego oraz sposób konstruowania genu chimerycznego.
W wielu stanach zapalnych dochodzi do nadmiernego wytwarzania cytokin, takich jak IL-1, IL-10, GM-CSF i TNFa, w wyniku wysokiej agregacji i akumulacji komórek zapalnych (Brennan F.M. i in., British Medical Bulletin 1995, 51/2, 368-384). Regulacja prowadząca do powstawania nadmiernej ilości i/lub zaburzona regulacja wytwarzania cytokin w tkance objętej stanem zapalnym może być bezpośrednio lub pośrednio odpowiedzialna za zaostrzanie przewlekłych chorób zapalnych. Na przykład, w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RA), najbardziej znacząca patologia występuje w miejscu zapalenia (tj. w stawach maziówkowych). Dlatego też, prawdopodobne jest, że cytokiny wytwarzane w stawach maziówkowych u pacjentów z RA odgrywają ważną rolę w procesie chorobowym. Spośród tych cytokin, IL-1 i TNFa uważa się za odpowiedzialne za dewastujące niszczenie chrząstki i nadżerki kostne, które są charakterystyczne dla RA (Dayer J.M. i in., J. Exp. Med., 1985, 162, 1208-1215; Gowen M. i in., Nature, 1983, 306, 378- 380). Wykazano, że obecność nadmiernych ilości IL-1 i TNFa w stawach maziówkowych przyspiesza rozwój indukowanego kolagenem zapalenia stawów u gryzoni (Brennan F. M. i in., Clin. Expt. Immunol., 1994, 97/1, 1-3). Nadmierne ilości TNFa i IL-1 wytwarzają w tkance maziówkowej różne rodzaje komórek w miejscu połączenia chrząstki z łuszczką łącznotkankową, obejmujące komórki linii makrofagowej, synowiocyty makrofagopodobne, aktywowane komórki T i, być może, fibroblastopodobne synowiocyty (Chu C.Q. i in., Arthritis & Rheumatism, 1991, 34, 1125-1132; Deleuran B.W.i in., Arthritis & Rheumatism, 1992, 35, 1170-1178).
Oprócz opisanych powyżej wpływów występujących w stanach zapalnych, TNFa odgrywa powszechną i kluczową rolę w rozmaitych zdarzeniach prozapalnych, takich jak indukcja aktywności IL-1 w monocytach. Rzeczywiście, wykazano, że neutralizujące przeciwciała skierowane przeciw TNFa zmniejszają całkowite wytwarzanie IL-1 (Portillo i in., Immunol., 1989, 66, 170-175; Brennan F.M. i in., British Medical Bulletin, 1995, 51/2, 368-384). A zatem, dodatkową korzyścią, poza blokowaniem wpływu cytokiny zapalnej TNFa, jest obniżenie wytwarzania równie niszczącego mediatora prozapalnego, IL-1. Co więcej, wiadomo dobrze, iż TNFa jest aktywatorem transkrypcji innych genów związanych z procesem zapalnym. Na przykład, obecność TNFa stymuluje wytwarzanie innych cytokin (takich jak GM-CSF) i powierzchniowych receptorów komórkowych, włącznie z antygenami HLA klasy II i cząsteczkami adhezyjnymi (Alvaro-Garcia J.M. i in., J. Exp. Med., 1989, 146, 865-875), czego wynikiem jest ciągła rekrutacja aktywowanych komórek T i granulocytów obojętnochłonnych, w wyniku czego dochodzi do zapalenia i rozrostu maziówki, a ostatecznie do zwiększającego się niszczenia chrząstki i kości (Allen J.B., J. Exp. Med., 1990, 171, 231).
Konwencjonalne leczenie zaburzeń zapalnych jest zazwyczaj ukierunkowane wobec zapalenia objawowego. Takie terapie zapewniają jedynie czasowe usunięcie dolegliwości, bez znaczącego opóźnienia postępu choroby. W przeciwieństwie, terapie ukierunkowane na TNFa i inne czynniki indukowane podczas procesu zapalnego są prawdopodobnie bardziej obiecujące. Na przykład, w modelach zwierzęcych indukowanego kolagenem zapalenia stawów, przeciwciała skierowane przeciw TNFa i rozpuszczalne białko chimeryczne receptor TNFa-IgG skutecznie zmniejszały obrzęk łap, zmniejszyły zajęcie stawów oraz zniszczenie chrząstek i kości (Williams R.O. i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89, 9784-9788). W próbach klinicznych z zastosowaniem zarówno humanizowanych przeciwciał skierowanych przeciw TNFa, jak i cząsteczek chimerycznych receptor TNFa-IgG, uzyskano dramatyczne wyniki (Elliott M. J. i in., Arthritis and Rheumatism, 1993, 36, 1681-1690; Elliott M.J. i in., Lancet, 343, 1105-1110). Chociaż leczenie tymi antagonistami TNFa okazało się być dobrze tolerowane, to prowadzi również do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciw zrekombinowanym białkom. A zatem, terapie te mogą nie być odpowiednie do długotrwałego leczenia i nie zmniejszą rzeczywistego nasilenia objawów choroby. W celu rzeczywistej zmiany postępu choroby, leczenie musi być w ciągły sposób ukierunkowane na TNFa przez zastosowanie terapii specyficznych wobec TNFa. Stosowanie takiego protokołu leczenia jest niepraktyczne przy wykorzystaniu tych czynników biologicznych, a ich długotrwałe podawanie byłoby trudne.
W alternatywnym wariancie leczenia, objętą procesem zapalnym błonę maziową można usunąć stosując synewektomię chirurgiczną (Herold N. i Schroder H.A., Acta Orthop. Scand., 1995, 66, 252-254; Ogilvie-Harris D.J. i Weisleder L., Arthroscopy, 1995, 11, 91-95), chemiczną (Cruz-Esteban C. i Wilke W.S., Bailliere's Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787- 801) lub indukowaną promieniowaniem
PL 191 586 B1 (Cruz-Esteban C. i Wilke W.S., Bailliere's Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787-801). Wyniki chirurgicznej synewektomii artroskopowej są dobre, wykazując poprawę stanu pooperacyjnego w stosunku do stanu przedoperacyjnego. Synewektomię niechirurgiczną prowadzi się stosując różne czynniki chemiczne, takie jak kwas osmowy, czynniki alkilujące, jak iperyt azotowy i tiotepa, metotreksat. Niestety, synewektomie niechirurgiczne (obejmujące prowadzone na drodze chemicznej i indukowane promieniowaniem) są skomplikowane proceduralnie, zapewniają tylko krótkotrwałe usunięcie dolegliwości i wykazują jedynie wyspową redukcję rozrostu maziówki. Ponadto, większość niechirurgicznych alternatyw stanowią potencjalne teratogeny. Dodatkowo, chemiczne uszkodzenie dotkniętej chorobą tkanki podczas niechirurgicznej synewektomii, jak również chirurgiczne uszkodzenie tkanki, często powodują jej odpowiedź zapalną. Ostatecznie, należy zauważyć, że te podejścia obarczone są ryzykiem i skutkami ubocznymi związanymi z konwencjonalnym leczeniem farmakologicznym i inwazyjnymi procedurami chirurgicznymi, włącznie z kosztami i niedogodnością hospitalizacji i rehabilitacji.
Zgodnie ztym, nadal istnieje potrzeba efektywnego podejścia terapeutycznego do leczenia zaburzeń zapalnych ogólnie, a reumatoidalnego zapalenia stawów w szczególności.
Wynalazek zapewnia nowe podejście lecznicze poprzez selektywną indukcję apoptozy wwytwarzających TNFa komórkach zapalnych, co powoduje niszczenie tych komórek bez towarzyszącej reakcji zapalnej.
Gen chimeryczny według wynalazku obejmuje co najmniej jedną sekwencję wzmacniającą promotor TNFa, oznaczoną numerem identyfikacyjnym 10 lub 11, lub jej funkcjonalny fragment, połączoną z funkcjonalną kopią minimalnego promotora TNFa, posiadającego sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 1, 2, 3 lub ich funkcjonalne fragmenty i połączoną ponadto z co najmniej jedną kopią genu indukującego apoptozę, którego ekspresją kieruje promotor TNFa. Połączenie sekwencji wzmacniającej z promotorem oraz promotora z genem indukującym apoptozę jest wybrane spośród grupy obejmującej połączenie bezpośrednie, połączenie dystalne, połączenie proksymalne oraz ich kombinacje. Korzystnie, gen zawiera dwie lub więcej kopii sekwencji wzmacniającej promotor TNFa.
Korzystnie, gen indukujący apoptozę wybiera się z grupy składającej się z kaspazy 1, kaspazy 2, kaspazy 3, kaspazy 4, kaspazy 5, kaspazy 6, kaspazy 7, kaspazy 8, kaspazy 10, granzymu A, granzymu B, ligandu Fas, oraz funkcjonalnych fragmentów i mieszanin któregokolwiek z nich, najkorzystniej gen indukujący apoptozę jest wybrany z grupy składającej się z kaspazy 3, kaspazy 4, kaspazy 5, granzymu B oraz funkcjonalnych fragmentów i mieszanin któregokolwiek z nich.
Gen chimeryczny korzystnie ma sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub ich funkcjonalne fragmenty, przy czym korzystnie
3'UTR genu TNFa jest zligowany za genem indukującym apoptozę.
Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny zawierający gen chimeryczny zdefiniowany powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie genu chimerycznego określonego powyżej do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia zaburzeń zapalnych u pacjenta przez indukowanie apoptozy wkomórkach zapalnych lub w komórkach wmiejscu stanu zapalnego u pacjenta przez wprowadzenie tego genu do komórek. Korzystnie, indukcja apoptozy nie indukuje odpowiedzi zapalnej u pacjenta. Korzystnie, komórką zapalną jest komórka wytwarzająca TNFa, a zaburzeniem zapalnym jest reumatoidalne zapalenie stawów.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest gen chimeryczny, który obejmuje od 2 do 10 kasetek sekwencji wzmacniającej promotor TNFa, oznaczonej numerem identyfikacyjnym 10 lub 11, lub jej funkcjonalnych fragmentów, połączonych zco najmniej jedną kopią minimalnego promotora TNFa, posiadającegosekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencjeonumerze identyfikacyjnym 1, 2, 3 lub ich funkcjonalne fragmenty, i połączonych ponadto co najmniej jedną kopią genu indukującego apoptozę wybranego zgrupy składającej się z kaspazy 3, kaspazy 4, kaspazy 5, granzymu B oraz funkcjonalnych fragmentów, wariantów i mieszanin któregokolwiek znich, przy czym ekspresją genu indukującego apoptozę kieruje promotor TNFa.
Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny zawierający gen określony powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie genu chimerycznego określonego powyżej do wytwarzania środka farmaceutycznego do indukowania apoptozy w wytwarzającej TNFa komórce zapalnej przez wprowadzenie tego genu do komórki.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie genu chimerycznego określonego powyżej do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia zaburzenia zapalnego u pacjenta przez indu4
PL 191 586 B1 kowanie apoptozy w komórkach zapalnych lub w komórkach w miejscu stanu zapalnego u pacjenta przez wprowadzenie tego genu do komórek bez indukowania odpowiedzi zapalnej u pacjenta.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób konstruowania genu chimerycznego zawierającego co najmniej jedną kopię sekwencji wzmacniającej promotor TNFa, oznaczoną numerem identyfikacyjnym 10 lub 11, lub jej funkcjonalny fragment, połączoną z funkcjonalną kopią minimalnego promotora TNFa, posiadającego sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 1, 2, 3 lub ich funkcjonalne fragmenty i połączoną ponadto zco najmniej jedną kopią genu indukującego apoptozę, którego ekspresją kieruje promotor TNFa, w którym (a) amplifikuje się promotor TNFa przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z zastosowaniem starterów obejmujących konstrukty delecyjne promotora TNFa;
(b) klonuje się otrzymane w etapie (a) geny zamplifikowane przez PCR przed genem reporterowym;
(c) testuje się konstrukty otrzymane w etapie (b) pod kątem ich konstytutywnej i indukowalnej ekspresji w co najmniej jednej linii komórek wytwarzających TNFa;
(d) przeprowadza się selekcję promotora TNFa odpowiedzialnego za indukowalną ekspresję genu reporterowego w linii komórkowej; i albo (e) amplifikuje się przez PCR regiony promotora TNFa, które wzmacniają ekspresję genu reporterowego otrzymując sekwencję wzmacniającą i liguje się co najmniej jedną kopię sekwencji wzmacniającej przed promotorem; albo (f) wstawia się co najmniej jedną kopię genu indukującego apoptozę z wydeletowaną prodomeną za promotorem TNFa poprzez zastępowanie genu reporterowego konstruktami delecyjnymi genu indukującego apoptozę otrzymując gen chimeryczny; albo (g) amplifikuje się przez PGR 3'UTR TNFa i liguje się go za genem reporterowym, albo przeprowadza się jakąkolwiek kombinację tych procedur.
Korzystnie, przed promotorem wstawia się dwie lub więcej kopii sekwencji wzmacniającej. Korzystnie, genem reporterowym jest lucyferaza.
Korzystnie, gen indukujący apoptozę z wydeletowaną prodomeną wybiera się z grupy składającej się z kaspazy 3, kaspazy 4, kaspazy 5, granzymu B oraz ich funkcjonalnych fragmentów i wariantów.
Korzystnie, wytwarza się gen o sekwencji wybranej spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 4, 5, 6, 7, 8, 9iich funkcjonalne fragmenty.
Korzystnie, linie komórkowe do testowania konstruktów wybiera się z grupy składającej się z linii limfoblastoidalnej T, mielomonocytarnej, monocytarnej, fibroblastowej i hodowanych ludzkich synowiocytów.
Wynalazek wykorzystuje apoptozę komórek zapalnych do celów terapeutycznych w niektórych chorobach zapalnych. Wynalazek szczególnie dotyczy apoptozy samoregulującej dzięki terapii genowej. Ogólnie mówiąc, w praktycznym zastosowaniu wynalazku, gen chimeryczny obejmujący co najmniej jedną sekwencję wzmacniającą promotor połączoną zco najmniej jedną funkcjonalną kopią minimalnego promotora, który pochodzi zgenu lub kombinacji genów aktywowanych w komórkach zapalnych lub w komórkach w miejscu zapalenia, połączony jest z co najmniej jedną kopią genu indukującego apoptozę (AIG), tak że ekspresja genu indukującego apoptozę jest kierowana przez promotor, a zatem ukierunkowana wobec komórek zapalnych. Przykłady promotorów indukowalnych genów aktywowanych w zapaleniu, obejmują, ale nie ograniczają się do cytokin, interleukin i ich receptorów, cząsteczek adhezji komórkowej i ich ligandów, chemokin i ich receptorów, enzymów uczestniczących w procesie zapalnym i podobnych. Geny chimeryczne według wynalazku obejmują elementy sekwencji wzmacniającej, promotora iAIG, połączone bezpośrednio, dystalnie lub proksymalnie, oraz ich kombinacje. Jak wspomniano powyżej i szczegółowo zostanie omówione poniżej, w kilku rozwiązaniach, dla uzyskania maksymalnej skuteczności, wykorzystuje się liczne kopie sekwencji wzmacniającej, promotora i/lub AIG.
Poniższy szczegółowy opis przedstawiono z naciskiem na geny chimeryczne obejmujące co najmniej jedną sekwencję wzmacniającą promotor, połączoną z co najmniej jedną funkcjonalną kopią minimalnego promotora TNFa i dalej połączoną z co najmniej jedną kopią AIG. Chociaż w opisanych poniżej przykładach także wykorzystuje się te rodzaje konstruktów, specjaliści będą wiedzieli, że podstawowe opisane tu konstrukty można zmieniać dla zapewnienia innych rozwiązań wykorzystujących produkty, procesy, sposoby, i kompozycje według wynalazku, z innymi promotorami obejmującymi indukowalne geny aktywowane w zapaleniu, takie jak rodzaje wymienione powyżej, posiadające podobne funkcje, które można stosować wobec komórek docelowych w miejscu infekcji.
PL 191 586 B1
Na przykład, cytokiny i interleukiny użyteczne jako promotory w konstruowaniu genów chimerycznych według wynalazku, obejmują, ale nie ograniczają się do TNFa, TNFe, IL-1a, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IL-9, GM-CSF, interferonu g i podobnych, oraz ich funkcjonalnych fragmentów i mieszanin. Cząsteczki adhezji komórekiich ligandy obejmują, ale nie ograniczają się do selektyn, integryn i przedstawicieli nadrodziny immunoglobulin, takich jak ICAM-1, VCAMipodobnych, oraz ich funkcjonalnych fragmentówiwariantów oraz mieszanin. Chemokinyiich receptory obejmują, ale nie ograniczają się do przedstawicieli rodzin C-X-C i C-C, takich jak MIP-1a, MIP-, MCP1-4, RANTES, Mig, NAP2, IP10, Groa-g ipodobnych, oraz ich funkcjonalnych fragmentów i wariantów oraz mieszanin. Enzymy biorące udział wprocesie zapalnym obejmują, ale nie ograniczają się do COX-2, iNOS, fosfolipaz, proteaz (włącznie z metaloproteazami macierzy) oraz podobnych i ich funkcjonalnych fragmentów i mieszanin.
Dla wyjaśnienia dyskutowanych poniżej przykładowych genów chimerycznych TNFp-AIG według tego wynalazku, zilustrowano poniższe sekwencje:
Sekwencja onumerze identyfikacyjnym: 1 jest sekwencją nukleotydową odpowiadającą sekwencji odniesienia ludzkiego promotora TNFa o pełnej długości, opublikowanej w (Takashiba S.iin., Gene, 1993, 131, 307-308). Zastosowane tutaj liczby, oznaczające pozycje nukleotydów, odnoszą się do numeracji tej sekwencji.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2 jest sekwencją natywnego promotora genu TNFα, którą zastosowano wtym wynalazku (-1077 nukleotydów od miejsca początku transkrypcji, TSS). Występuje kilka różnic pomiędzy sekwencją TNFp wsekwencji onumerze identyfikacyjnym: 1 i w sekwencjionumerze identyfikacyjnym: 2. O takich różnicach pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi promotora TNFa donoszonow(Takashiba S.iin., Gene, 1993, 131, 307-308).
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 3 jest sekwencją natywnego minimalnego promotora TNFa (nukleotydy od -120 do -TSS, które obejmują przynajmniej jeden element wzmacniający (miejsce kl; patrz: Pauli, U., Crit. Rev. in Eucaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344; Rhoades K.L.iin., J. Biol. Chem., 1992, 267, 22103-22107 oraz Takashiba S.iin., Gene, 1993, 131, 307-308).
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 4 jest genemchimerycznymTNFp120 AIG.1(obejmującym-120TNFpkontrolujący ekspresję wariantu genu CPP32zwydeletowaną prodomeną (kaspaza 3, opublikowana przez Tewari M.iin., Cell, 1995, 81(5), 801-809, ze zmianą V239A).
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 5 jest genemchimerycznym TNFp706 AIG.1(obejmującym -706 TNFp,kontrolującyekspresjęgenuCPP32zwydeletowanąprodomeną).
Sekwencja onumerze identyfikacyjnym: 6 jest TNFp1005 AIG.1 (obejmującym -1005 TNFp, kontrolujący ekspresję genu CPP 32 z wydeletowaną prodomeną).
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 7 jest genem chimerycznym TNFp706 AIG.2(obejmującym -706TNFp, kontrolujący ekspresję genu Ty/xzwydeletowaną prodomeną. (Sekwencje genów Ty (kaspaza 5)iTx (kaspaza 4) zostały opublikowanewodnośniku Faucheu, C.iin., Eur. J. Biochem., 236, 207-213, 1996; Faucheu, C.iin., EMBO J., 14, 1914-1922, 1995).
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 8 jest genem chimerycznym TNFp706 AIG.2(obejmującym-706TNFp,kontrolującyekspresjęgenuTy/xzwydeletowanąprodomeną).
Sekwencja onumerze identyfikacyjnym: 9 jest TNFp1005 AIG.1 (obejmującym -1005 TNFp, kontrolujący ekspresję genu Ty/x z wydeletowaną prodomeną).
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 10 jest regionem wzmacniającym 1(ER1) promotora TNFa, obejmującym nukleotydy od -1005 do -905.
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 11 jest regionem wzmacniającym 2 (ER2) promotora TNFa, obejmującym nukleotydy od -706 do -517.
Sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 12 jest dodatkowym miejscem wielokrotnego klonowania (MCS) wprowadzonym technikami inżynierii genetycznej przed pozycją -120 minimalnego promotora TNFa wkonstrukcie 120pGL3.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13jest 3'-końcowym nieulegającym translacji regionem (3'UTR) genu TNFa (Nedwin, G.E.iin., Nucleic Acid Research, 1985, 13, 6361-6373).
Elementy promotora TNFα do przygotowywania konstruktów genów chimerycznych według tego wynalazku wybiera się spośród elementów, które są zdolne do indukowania kierowanej przez promotor TNFa ekspresji genu terapeutycznego. Te elementy promotorowe będą wniniejszym opisie nazywane „indukowalnymi elementami działającymi wkonfiguracji cis”, „elementami indukowalnymi wkonfiguracji cis”lub „elementami wzmacniającymi”promotora TNFa.
Elementy wzmacniające można fizycznie łączyć z sekwencją minimalnego promotora lub oddzielać od minimalnego promotora sekwencją łącznikową, która może posiadać, bądź nie, unikalne
PL 191 586 B1 miejsca restrykcyjne. A zatem, jak podsumowano powyżej, elementy wzmacniające mogą być połączone z genami chimerycznymi według wynalazku bezpośrednio, dystalnie, proksymalnie, lub wjakiejkolwiek kombinacji. Znajdują się one zazwyczaj przed promotorem. Przykłady elementów wzmacniających TNFa podano w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11; można wykorzystywać ich funkcjonalne fragmenty lub warianty oraz kombinacje. Niektóre korzystne konstrukty genowe według tego wynalazku obejmują te, które posiadają liczne kopie elementów wzmacniających, tj. dwie lub więcej kopii. W niektórych rozwiązaniach występuje około 2 do 25 kopii, ściślej 2 do 10 kopii, a jeszcze ściślej 2 do 5 kopii.
Terminy „promotor TNF”, „promotor TNFa” i „TNFp” w niniejszym opisie stosuje się wymiennie. O ile nie stwierdzono inaczej, terminy te odnoszą się do całej sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji natywnego minimalnego promotora TNFa, połączonej z jednym lub więcej elementów wzmacniających, znajdujących się przed nią (albo obecnych naturalnie, to jest natywnych, albo wprowadzonych w laboratorium drogą inżynierii genetycznej). Przykłady obejmują, ale nie ograniczają się do sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3 oraz funkcjonalnych fragmentów, wariantów, i mieszanin którychkolwiek z nich. Wiele funkcjonalnych fragmentów i wariantów tych sekwencji TNFa, i innych tu opisanych, wykazuje homologię sekwencji co najmniej około 80%, a w niektórych przypadkach powyżej 90%, wobec ich odpowiedników natywnych i utworzonych drogą inżynierii genetycznej, ale są one znane specjalistom i zdefiniowane w odnośnikach cytowanych w niniejszym opisie.
W opisywanych tu genach chimerycznych i sposobach można stosować którykolwiek z genów indukujący apoptozę. Gen indukujący apoptozę stosowany w terapeutycznych genach chimerycznych według wynalazku może być taki sam lub inny, niż rodzaj genu indukujący apoptozę obecny w natywnej sekwencji komórek zapalnych wytwarzających TNFa (jeśli te komórki zawierają naturalny gen apoptozy). Korzystne AIG obejmują, ale nie ograniczają się do przedstawicieli rodziny ICE/CED3 proteaz indukujących apoptozę (takich jak kaspaza-1 (ICE), hICE, ICE-LAP45, Mch2a), kaspaza-2 (ICH1), kaspaza-3 (CPP32, Yama, apopaina), kaspaza-4 (TX, ICH2, ICE rel II), kaspaza-5 (ICE rel III, TY), kaspaza-6 (Mch-2), kaspaza-7 (Mch-3, ICE-LAP3, CMH-1), kaspaza-8 (MACH, FLICE, Mch-5), kaspaza-9 (ICE-LAP6, Mch6) i kaspaza-10 (Mch4)), przedstawicieli rodziny granzymów (takich jak granzymAigranzym B), ligandu Fas (FasL) oraz ich funkcjonalnych fragmentów, wariantów i mieszanin. Niektóre rozwiązania wykorzystują kaspazę 3, kaspazę 4, kaspazę 5, granzym Biich funkcjonalne fragmenty, warianty imieszaniny. Geny te, zwyjątkiem FasL, gdy po transfekcji ulegają nadekspresji, indukują apoptozę w stransfekowanych komórkach (Miura M. iin., Cell, 1993, 75, 653-660; Chinnayan A.M.iin., Cell, 1995, 81, 505-512; Los i in., Nature, 1995, 375, 81; Muzioiin., CelI, 1996, 85, 817-827).
W przypadku FasL, apoptoza jest indukowana (na drodze autokrynnej bądź parakrynnej) tylko wtych komórkach, wktórych zachodzi ekspresja Fas. Dlatego też, konstrukt genu chimerycznego TNFp-FasL stanowi wyższy stopień selektywności. Następną zaletą genu chimerycznego TNFp-FasL jest możliwość selektywnego kierowania terapii wobec tych chorobotwórczych komórek na powierzchni błony maziowej, które nie wykazują ekspresji TNFa (przez co nie udaje się wywołać ekspresji genu indukującego apoptozę), ale wykazują ekspresję Fas na powierzchni. W tym przypadku, FasL będzie ulegał ekspresji w komórkach, które posiadają zdolność wytwarzania TNFα, takich jak aktywowane makrofagi i komórki T. Następnie komórki te będą indukowały apoptozę w komórkach, w których zachodzi ekspresja Fas, takich jak stwarzające zagrożenie aktywowane komórki T i synowiocyty wykazujące ekspresję Fas.
Zastosowanie genu chimerycznego do terapii obejmuje etap wprowadzania do komórek ssaka genu chimerycznego, zawierającego gen indukujący apoptozę (AIG) będący pod kontrolą promotora TNFa (TNFp). Przykłady genów chimerycznych według wynalazku podano wsekwencjach onumerach identyfikacyjnych: 4, 5, 6, 7, 8i9, można również wykorzystywać ich funkcjonalne fragmenty lub warianty. Nie ograniczając się do żadnego wytłumaczenia teoretycznego, AIG,wwyniku podlegania kontroli TNFp, ulega ekspresji tylko wtych komórkach, które wytwarzają cytokinę zapalną, TNFa. Dlatego też, wszystkie komórki, w których zachodzi ekspresja TNFa, ulegną samozniszczeniu, podczas gdy komórki, w których nie zachodzi ekspresja TNFα, nie będą podlegać wpływowi. Korzystnie, metodologia ta pozwala kierować terapię wobec wszystkich komórek wytwarzających TNFa (takich jak aktywowane makrofagi, aktywowane komórki T i makrofagopodobne oraz, być może, fibroblastopodobne synowiocyty), bez względu na ich rodzaj. Rzeczywiście, docelową komórką wytwarzającą TNFa może być komórka, która wswojej natywnej, niezmienionej postaci normalnie zawiera lub
PL 191 586 B1 w której zachodzi ekspresja genu apoptozy, bądź też nie. Dlatego też, stosując geny chimeryczne i sposoby według tego wynalazku, można zniszczyć komórkowe źródła TNFa w wysoce selektywny sposób.
Inną zaletą stosowania genu chimerycznego TNFp-AIG według wynalazku jest to, że TNFp wiąże czynniki transkrypcyjne wymagane przez endogenny TNFp, przez co prowadzi do obniżenia wytwarzania endogennego TNFa. W jednym korzystnym rozwiązaniu, TNFp jest obecny w dużym nadmiarze w komórce docelowej. Można to przeprowadzić przez wprowadzenie do komórki licznych kopii transfekowanego genu. Alternatywnie, gen chimeryczny TNFp-AIG według tego wynalazku może zawierać liczne kopie indukowalnych elementów promotora TNFa, działających w konfiguracji cis. Jak wspomniano powyżej, w pewnych rozwiązaniach genów chimerycznych TNFp-AIG według tego wynalazku są obecne liczne kopie „indukowalnych elementów wzmacniających” TNFp. Dzięki zawieraniu wielu kopii indukowalnych elementów działających w konfiguracji cis w konstruktach TNFp, czynniki transkrypcyjne niezbędne transfekowanej komórce do wytwarzania TNFa są wiązane przez sekwencję, którą wprowadzono egzogennie. Ten korzystny konstrukt chimeryczny TNFp-AIG charakteryzuje się zwiększoną skutecznością we współzawodnictwie o czynniki transkrypcyjnespecyficzne dla TNFp wporównaniuzgenami chimerycznymi według wynalazku, które zawierają tylko pojedynczy element wzmacniający połączony zTNFp. W ten sposób skonstruowany „indukowalny superpromotor” jest zdolny do (1) skuteczniejszego współzawodnictwa o czynniki transkrypcyjne specyficzne wobec TNFa i(2) kierowania ekspresją genu indukującego apoptozę w zwiększony sposób, dzięki licznym elementom wzmacniającym.
Na przykład, u pacjentówzreumatoidalnym zapaleniem stawów, synewektomia, tj. usunięcie tkanki maziówkowej, okazała się korzystna klinicznie. W odróżnieniu od konwencjonalnego sposobu leczenia i procedur synewektomii chirurgicznej, przedstawiony w niniejszym opisie sposób leczenia ukierunkowany wobec komórek dotyczy tylko komórek wytwarzających TNFa. A zatem, korzystnie, wprowadzenie i ekspresja genu chimerycznego TNFp-AIG oraz następująca indukcja apoptozy, nie wywołują odpowiedzi zapalnej. Zgodnieztym, sposoby według tego wynalazku są stosunkowo selektywnei wwyniku powodują minimalne zniszczenie tkanki i zmniejszenie stanu zapalnego.
Opisane tu produkty i sposoby są użytecznewleczeniu również innych zaburzeń zapalnych. Takie zaburzenia zapalne obejmują, ale nie ograniczają się do stwardnienia rozsianego, zespołu Guillain-Barre'a, choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, łuszczycy, reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, tocznia rumieniowatego, cukrzycy insulinozależnej, artropatii łuszczycowej, sarkoidozy, alergicznego zapalenia płuc, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa i zbliżonych zapaleń stawów kręgosłupa, zespołu Reiteraistwardnienia układowego. A zatem, wynalazek obejmuje sposoby leczenia u pacjenta zaburzeń zapalnych przez indukowanie apoptozywkomórkach zapalnych lub w komórkach pacjentawmiejscu objętym stanem zapalnym, przez wprowadzenie do komórek co najmniej jednego genu chimerycznego według wynalazku. Zazwyczaj przeprowadza się to przez przygotowanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej co najmniej jeden gen chimeryczny według wynalazku i, zazwyczaj, farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika, oraz podawanie kompozycji pacjentowi z zastosowaniem standardowych środków. W pewnych rozwiązaniach, kompozycje farmaceutyczne dostarcza się bezpośrednio do miejsca zapalenia, stosując podawanie miejscowe, dożylne, dootrzewnowe i podobne sposoby. Szerzej metodologię opisano poniżej.
Poza wskazaniami leczniczymi, genyikomórki według wynalazku można stosować w różnych użytecznych sposobach przeszukiwania i selekcji. W jednym takim sposobie, warianty komórek somatycznych nie wytwarzających TNFa w populacji komórek wytwarzających TNFα można selekcjonować in vitroprzez wprowadzenie genu chimerycznego TNFp-AIG do populacji komórek wytwarzających TNFa. Komórki, które wytwarzają TNFa, ulegną apoptozie. Komórki, które nie wytwarzają TNFa, będą przeżywać. Selekcja tych wariantów komórek posiadających fenotyp przeżywania stanowi łatwy sposób identyfikacji komórek nie wytwarzających TNFa. Taki proces selekcji można stosować do określenia ekspresji genów, które działająwkonfiguracji trans, regulując aktywność promotora TNFa, obniżającwten sposób wytwarzanie TNFa. Takie geny scharakteryzowanowinnych układach jako dominujące negatywne (DN)/dominujące supresorowe (Behrends S. iin., J. Biol. Chem., 1995, 270, 21109-21113; Zhang S.iin., J. Biol. Chem., 1995, 270, 23934-23936; Watowich S.S.iin., Mol. Cell Biol., 1994, 14/6, 3535-3549).
W dalszym sposobie in vitro, gen chimeryczny TNFp-AIG według wynalazku można stosować do identyfikacji dominujących negatywnych genów odpowiedzialnych za powstawanie populacji komórek nie wytwarzających TNFa. Zgodnieztym sposobem, gen chimeryczny TNFp-AIG według wyna8
PL 191 586 B1 lazku wprowadza się do komórek, które wytwarzają TNFa. Z wyjątkiem komórek zawierających gen dominujący negatywny, komórki te powinny po aktywacji ulegać apoptozie. Dlatego też, można przewidywać, że warianty przeżywające posiadają gen dominujący negatywny zdolny do regulacji prowadzącej do obniżonego wytwarzania TNFa. Gen dominujący negatywny można łatwo zidentyfikować dzięki utworzeniu biblioteki cDNA itransfekowaniu linii komórkowych (np. Jurkat i THP-1). Komórki te są albo trwale stransfekowane indukowalnym genem chimerycznym TNFp-AIG, albo genem TNFplucyferazy. Komórki stransfekowane genem TNFp-AIG będą selekcjonowane pod względem fenotypu przeżywania po aktywacji in vitro; fenotyp przeżywania wskazuje na wpływ genów DN. W komórkach stransfekowanych genem TNFp-lucyferazy, obniżenie aktywności lucyferazy będzie wskazywało na wpływgenu DN. Dominujące negatywne geny zidentyfikowane z zastosowaniem tego protokołu można wykorzystywać jako przyszłe czynniki lecznicze. Geny takie będą kandydatami dla terapii genowej wcelu obniżenia wytwarzania TNFa.
Sposoby wykorzystywane do przenoszenia genów podzielono na dwie szerokie kategorie:
1. Podejście bezpośrednie: transdukcja in situ genu terapeutycznego do komórek docelowych, takichjaksynowiocyty, z zastosowaniem odpowiedniego wektora jako nośnika genu terapeutycznego. Wektor zawierający gen terapeutyczny wstrzykuje się bezpośrednio do obszaru dotkniętego chorobą (np.stawuobjętegozapaleniem).
2. Podejście pośrednie: transfekcja ex-vivo genu terapeutycznego do komórek docelowych, takich jak synowiocyty. W podejściu tym błonę maziową usuwa się ze stawu, izoluje się synowiocyty i hoduje je in vitro. Komórki hodowane in vitro transfekuje się genem terapeutycznym i zmodyfikowane genetyczniesynowiocytyprzeszczepiasięzpowrotemdobłonymaziowej.
Oceniano liczne wektory pod względem ich skuteczności wprzenoszeniu genów in vivo (Nita iin., Arthritis & Rheumatism, 1996, 39/5, 820-828). Spośród wektorów stosowanych wterapii genowej dotąd najlepiej opracowano wektory pochodzące od retrowirusów. Są one zdolne do wstawiania materiału genetycznego do genomu gospodarza i tworzenia stabilnych transfektantów. Wektory te, jednakże, nie są zdolne do infekowania komórek nie ulegających podziałom i, ponieważ są wstawiane do genomu gospodarza, nie można wykluczyć możliwości mutagenezy insercyjnej. Dla porównania, wektory pochodzące od adenowirusów infekują zarówno komórki dzielące się, jaki nie dzielące,i przenoszą DNA wpostaci episomalnej. Wadą wektorów opartych na adenowirusach jest to, że wektory te nadal wytwarzają białka wirusowe wzakażonych komórkach, co czyni je potencjalnie antygenowymi. Trzeci typ wektorów opartych na wirusach, to wektory pochodzące od opryszczki (HSV), które również są zdolne do zakażania zarówno komórek dzielących się, jakinie dzielących.
Spośród niewirusowych układów wektorowych, oceniano liposomy kationowe i nagi DNA plazmidowy. Liposomy są układem najlepiej opracowanym, choć niektóre rodzaje komórek, takie jak komórki mięśni i skóry, pobierają, utrzymują i prowadzą ekspresję nagiego DNA plazmidowego.
Możliwy jest również układ wprowadzania genów za pośrednictwem cząstek (Rakhmilevich i in., PNAS, 1996, 93, 6291) i stanowi on podejście obiecujące.
Do wprowadzania genów chimerycznych według wynalazku można stosować następujące protokoły wprowadzania genów in vivo:
(1) Nita i in ., Arthritis and Rheumatism, 1996, 39, 820-823)
Doświadczenie na królikach invivo:
Każdy wektor wstrzykuje się dostawowo do jednego stawu kolanowego. Dla wektorów wirusowych, wstrzykuje się pomiędzy 108 a109 cząstek zawieszonych w0,5 ml zrównoważonego roztworu soli na kolano.
Kompleksy liposom-DNA (200 nmoli DC-Chol skompleksowanego z 20 μg DNA/ml) wstrzykuje sięw1ml zrównoważonego roztworu soli na kolano.
(2) Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols, Paul Robbins, red., 1997, Barr i in., strony 205-212
Wprowadzanie wektora opartego na adenowirusie do hepatocytów: hepatocyty szczura 1x 1011 PFU na zwierzęomasie 100 g.
U psów (12-17 kg), żyłę wrotną perfunduje się około 1,5 x 1011 PFU/kg, co daje jedną kopię genomu adenowirusa na diploidalną kopię DNA gospodarza.
U królików (2-4 kg), 1,5 x 1013 cząstek wirusowych (około 1,5 x 1011 PFU) powoduje 100% transdukcji hepatocytów; 4 x 1012 cząsteczek wirusa powoduje 50-75% transdukcji. Yang N.-S. iin., 281-296.
PL 191 586 B1
Wprowadzanie genów za pośrednictwem cząstek złota: Transfekcja komórek skóry ssaków
- 0,1; 0,5; 1,0 i 2,5 μg DNA na mg cząstek wykazuje liniową współzależność z poziomami ekspresji transgenów. Nabel i in., 297-305
Wprowadzaniegenuzwykorzystaniemliposomuuludzi:
Protokół 1: 15 nmoli liposomów DC-Chol/Dope połączono z 1 μg DNA w objętości 0,7 ml. 0,2 ml powyższej mieszaniny wstrzykuje się do guzka czerniaka pacjenta. Przy podawaniu przez cewnik do tętnicy wprowadza się 0,6 ml roztworu.
Protokół 2: 15 nmoli liposomów DMRIE/Dope połączonoz5 mg DNA w objętości 1,0 ml.
Do bezpośrednich wstrzyknięć śródnowotworowych: zakres stężeń DNA wynosi od 3 mg DNA skompleksowanego z 4,5 nM DMRIE/Dope do 300 μg DNA skompleksowanego z 450 nM DMRIE/Dope.
(3)Roessleriin.,369-374
Przenoszeniegenówdobłonymaziowej:
12
Zakres dawek: stosuje się od 109 do 1012 cząstek adenowirusa zawierających gen leczniczy/staw. Jednakże, dla każdej określonej serii doświadczeń należy empirycznie określić optymalną dawkę, której wielkość zależy zarówno od właściwości genomu stosowanego zrekombinowego adenowirusa, jakitransgenu mającego ulegać ekspresji.
Dla podejścia pośredniego ustalono szereg metod, włącznie ze stosowaniem transfekcji opartej na lipidach kationowych lub polimerach kationowych oraz elektroporacją.
Przedmiot wynalazku, w korzystnych przykładach wykonania, został przedstawiony na rysunku, na którym figura 1 jest schematycznym przedstawieniem genów chimerycznych TNFp-AIG według tego wynalazku, gdzie geny indukujące apoptozę (AIG) obejmują, ale nie ograniczają się do wymienionych genów,amianowicie kaspaz od 1do 10, granzymu B, ligandu Fas itp., figura2 jest schematycznym rysunkiem przedstawiającym wyniki terapii genowej z zastosowaniem genów chimerycznych TNFp-AIG według tego wynalazku, figura3 jest podsumowaniem konstruktów delecyjnych zastosowanych do identyfikacji indukowalnych elementów promotorowych TNFa działających w konfiguracji cis z zastosowaniem ekspresji genu lucyferazy (Luc) jako układu reporterowego.
figura4 (aib) podaje podsumowanie wyników uzyskanych z zastosowaniem konstruktów opisanych na fig. 3, przy czym krótkotrwałą ekspresję konstruktów ocenianowdwóch różnych liniach komórkowych wytwarzających TNFa, a mianowicie Jurkat (fig. 4a)iTHP-1 (fig. 4b),ahistogramy na każdej figurze przedstawiają wskaźnik stymulacji dla poszczególnych doświadczeń jako miarę idukowalności przez czynniki aktywujące, takie jak PMA (fig. 4a) lub LPS (fig. 4b); linia nałożona na każdej figurze wskazuje średnią indukowalność, uśrednioną dla od czterech do sześciu doświadczeń, figura5 jest diagramem przygotowywania TNFpAIG z zastosowaniem wybranych natywnych elementów promotora TNFa iAIGzwydeletowaną prodomeną (stosowanymi AIG są kaspaza i kaspaza 4/5), figury6 (a,b,ic) podaje podsumowanie wyników reprezentatywnych doświadczeń przeprowadzonych dla zaobserwowania ekspresji chimerycznych TNFpAIG, gdzie apoptozę w krótkotrwale stransfekowanych komórkach Jurkat (fig. 6ai6b)ikomórkach THP-1 (fig. 6c) oceniano stosując test Elisa śmierci komórkowej (test CDE), przy czym na wszystkich trzech figurach histogramyzrzadko rozsianymi kropkami przedstawiają kontrolę transfekcji, gdzie komórki traktowano czynnikiem transfekującym w nieobecności DNA, histogramyzgęsto rozsianymi kropkami odpowiadają elementom TNFp kierującym ekspresją genu lucyferazy,apełne histogramy odpowiadają tym samym elementom TNFp, kierującym ekspresją albo AIG.1, albo AIG.2, natomiast liczba w nawiasie powyżej pełnych histogramów oznacza współczynnik wzmocnienia (stosunek apoptozy indukowanej przez TNFpAIG do indukowanej wektorem kontrolnym TNFpLuc), figura7 (aib) jest diagramowym przedstawieniem genu chimerycznego TNFp-AIG według wynalazku, obejmującego liczne kopie indukowalnych elementów promotora TNFa działającychwkonfiguracji cis, którezkolei kierują ekspresją AIG (fig. 1a) i diagramowym przedstawieniem genu chimerycznego TNFpAIG, obejmującego liczne kopie indukowalnych elementów promotora TNFa działających w konfiguracji cis, kierujących ekspresją AIG, za którymi znajduje się 3'-końcowy nie ulegający translacji region genu TNFa (TNF3'UTR) (fig.7b); 3'UTR genu TNFa bierze udziałwregulacji indukowanej -ekspresji TNFa (Han, J.iin., J. Immunology, 1991, 146, 1843-1843; Crawford, E.K.iin., J. Biol. Chem., 1997, 272, 21120-21137, oraz fig. 9),
PL 191 586 B1 figura 8 (a i b) jest diagramami schematów przygotowywania konstruktów chimerycznych superpromotor TNFa-AIG, figura 9 przedstawia podsumowanie wyników dwóch doświadczeń dla przedstawienia regulującego wpływu TNF3'UTR na indukowalną ekspresję genu reporterowego lucyferazy, gdzie przeprowadzono krótkotrwałą transfekcję linii komórkowej fibroblastów, przy czym wykropkowane histogramy przedstawiają indukowalność TNFpLuc w nieobecności TNF3'UTR, a pełne histogramy przedstawiają indukowalność TNFpLuc w obecności TNF3'UTR; Podobne wyniki uzyskano dla komórek Jurkat, natomiast figura 10 jest diagramowym przedstawieniem selekcji nie wytwarzających TNFa wariantów komórek somatycznych w populacji komórek wytwarzających TNFa i identyfikacji dominujących negatywnych genów supresorowych odpowiedzialnych za hamowanie wytwarzania TNFa.
P r z y k ł a d 1
Tworzenie konstruktów TNFp-AIG
W celu skonstruowania chimerycznego AIG pozostającego pod kontrolą elementów wzmacniających promotor TNF, działających w konfiguracji cis, w jednej lub wielu kopiach tego samego lub różnych regionów, przeprowadzono identyfikację będących przedmiotem zainteresowania regionów odpowiedzialnych za optymalną indukowalną ekspresję genu reporterowego.
Selekcja elementów promotora TNFa do konstruowania genu chimerycznego. Regiony promotora TNFa amplifikuje się przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), stosując startery obejmujące różne konstrukty delecyjne promotora TNFa (figura 3). Jako układy odniesienia stosuje się regiony zidentyfikowane przez innych badaczy w różnych innych układach komórkowych (Rhoades i in., J. Biol. Chem., 1992, 267, 22102-22107; Leitman i in., Mol. Cell Biol., 1992, 12, 1352-1356; Pauli U., Crit. Reviews Eukaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344). Geny zamplifikowane przez PCR klonuje się następnie przed genem reporterowym, takim jak gen lucyferazy, w pozbawionym promotora wektorze dostępnym komercyjnie. Konstrukty te testuje się pod kątem ich konstytutywnej i indukowalnej ekspresji w różnych liniach komórkowych, takich jak Jurkat (limfoblastyczna T), U973 (mielomonocytarna), THP-1 (monocytarna), fibroblastach i ludzkich synowiocytwch w hodowli in vitro. Identyfikacja regionów odpowiedzialnych za indukowalną ekspresję genu reporterowego jest zasadniczo oparta na wynikach uzyskanych z zastosowaniem dwóch linii komórek wytwarzających TNFa, a mianowicie Jurkat (po stymulacji PMA) i THP-1 (po stymulacji LPS) (figura 4a i b). Komórki te krótkotrwale transfekuje się stosując dobrze znane metody i odczynniki dostępne komercjalnie, np. DEAE-dekstran i Superfect. Elementy cis promotora TNFa, które są odpowiedzialne za indukowalną ekspresję genu reporterowego, stosuje się następnie do konstruowania genów chimerycznych TNFp-AIG.
Konstruowanie genów chimerycznych TNFp-AIG. Spośród opisanych tu genów indukujących apoptozę, korzystne są następujące:
i) proteazy cysteinowej - CPP32 (znanej także jako Yama, apopainalub kaspaza 3) i ii) proteazy cysteinowej - Tx/Ty(kaspaza 4/kaspara 5)
AIG stosuje się w skróconych postaciach z wydeletowaną prodomeną w celu potencjalnego zwiększenia samoaktywacji kaspaz. Jest istotne dla przemiany nieaktywnej kaspazy w postać aktywną.
CPP32 z wydeletowaną prodomeną amplifikuje się stosując startery odpowiadające kodonom 29-36 i 271-278 (278 jest kodonem stop). Skróconą postać genu CPP32 określa się w niniejszym opisie jako „CCCPP32” lub „AIG.1”.
W celu amplifikacji przez PCR Ty z wydeletowaną prodomeną, syntetyzuje się startery odpowiadające sekwencjom w obrębie genu Ty. Wszystkie dotąd odkryte kaspazy wykazują homologię do innych przedstawicieli rodziny kaspaz. Starter 3'-końcowy, odpowiadający kodonom 359-365 (kodon 365 jest kodonem stop), wykazuje 100% homologii sekwencji do kodonów 372-378 (kodon 378 jest kodonem stop) w genie Tx. Jednakże, starter 5'-końcowy, odpowiadający kodonom od 81-87 w genie Ty, nie wykazuje 100% homologii z odpowiadającym regionem w genie Tx (dla Tx kodony od 94-100). Reszta 87 (alanina) w genie Ty różni się od reszty 100 (glicyna) w genie Tx. Zamplifikowany przez PCR produkt, utworzony z cDNA przygotowanego z aktywowanych ludzkich limfocytów krwi obwodowej, posiada sekwencję Tx, co jest spowodowane występowaniem nadmiaru transkryptów Tx. Dlatego też, skrócona postać AIG utworzona z zastosowaniem syntetycznych starterów oligonukleotydowych odpowiadających sekwencjom w Ty, w rzeczywistości odpowiada sekwencji w Tx, chociaż flankują ją sekwencje starterów Ty. Zastosowane sekwencje starterów Ty odpowiadają także, poza jednym kodonem, sekwencji Tx. A zatem, gen stosowany w tym wynalazku odpowiada skróconemu genowi Tx z zamianą reszty G100 na A. Gen ten określa się w niniejszym opisie jako ,^Ty/x” lub „AIG.1”.
PL 191 586 B1
AIG.1 i AIG.2 wstawia się za promotorem TNFa przez zastąpienie genu reporterowego lucyferazy w konstruktach delecyjnych (-120, -706 i -1005) promotora TNFa (figura 5). Konstrukty te bada się pod kątem indukcji apoptozy po stymulacji krótkotrwale infekowanych komórek Jurkat i THP-1 (figury 6 a, b,ic).
Konstrukcja genów chimerycznych superpromotor TNFa-AIG. Przez PCR amplifikuje się dwa rozległe korzystne regiony, a mianowicie ER1 (od -1005 do -905) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10) iER2 (od -706 do -517) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11) promotora TNFa, obejmujące elementy odpowiedzialne za opisaną powyżej indukowalną ekspresję genu reporterowego (figura 4a i 4b), i liguje się je, w jednej lub w wielu kopiach, przed natywnym promotorem minimalnym (od -120 do TSS, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3). Dwa dalsze regiony promotora TNFa (od -234 do -120) i (od -234 do -65) także identyfikuje się jako odpowiednio potencjalny region wzmacniający 3 (ER3) i potencjalny region wzmacniający 4 (ER4), które można wykorzystać w konstruktach chimerycznych, stosując opisane poniżej strategie. Superpromotor obejmuje liczne (od 2 do 10) kasetki wspomnianych powyżej regionów, zawierające indukowalne elementy promotora (figura 7). Uzyskuje się to poprzez amplifikację przez PCR regionów będących przedmiotem zainteresowania, stosując zsyntetyzowane startery z miejscami restrykcyjnymi wstawionymi na końcu 5' każdego ze starterów. Te unikalne miejsca restrykcyjne flankują będący przedmiotem zainteresowania zamplifikowany produkt genowy. Korzystnie, zamplifikowany przez PCR AIG klonuje się za superpromotorem TNFa, zastępując gen reporterowy lucyferazy w pierwotnym konstrukcie, jak opisano (figura 5) dla natywnego promotora TNFa.
Schematy konstruowania superpromotora TNFa i sekwencji łącznikowych stanowiących unikalne miejsca restrykcyjne (te miejsca restrykcyjne nie występują w branych pod uwagę wybranych elementach promotora TNFa iAIG) dla wydajnej kierunkowej insercji opisanej poniżej i przedstawionej na figurze 8:
Schemat 1:
ETAP 1: Insercja minimalnego promotora TNFa (od -120 do TSS) do podstawowego (pozbawionego promotora) wektora lucyferazy pGL3 (Promega):
Elementy podstawowych wektorów pGL3, które stosuje się do konstruowania genu chimerycznego TNFp-AIG, przedstawiono poniżej.
_KpnI.SacI.Mlul.Nhel.Smal.Xhol.Bglll.Hindlll.
[lucyferaza].Xbal_
Minimalny promotor amplifikuje się przez PCR stosując startery obejmujące miejsca Xhol iBglll.Hindlll, tak że Xhol znajduje się na końcu 5',amiejsca Bglll.Hindlll na końcu 3' zamplifikowanego produktu. Fragment ten wstawia się do poliłącznika podstawowego wektora pGL3 wykorzystując te same miejsca restrykcyjne. Konstrukt ten określa się jako „konstrukt A1.”ijest on następujący:
_KpnI. Sad.Mlul.NheISmalXhoI. (od -120 do TSSBglll).
Hindlll.[lucyferaza].Xbal_
ETAP 2: Wzmacniający fragment (ER1 lub ER2) amplifikuje się przez PCR stosując starter zawierający kilka miejsc restrykcyjnych. Otrzymany fragment będzie miał na końcu 5' miejsca restrykcyjne KpnI.Aatll.BssHII, ana końcu 3' miejsca Nsil.Spel.MluI, jak następuje: 5' KpnI.Aatll.BssHII. (ER1 lub ER2).Nsil.Spel.MluI 3'. Fragment ten wstawia się do „konstruktu A1” otrzymanego na etapie 1, wykorzystując miejsca restrykcyjne KpnI iMlul. Konstrukt ten określa się jako „konstrukt B1”ijest on następujący:
_KpnI.Aatll.BssHII.(ER1 lub ER2).Nsil.Spel.Mlul.Nhel. Smal.XhoI.(od -120 do TSS Bglll).
Hindlll. [lucyferaza].Xbal_
ETAP 3: Fragment wzmacniający TNFa (ER1 lub ER2) amplifikuje się stosując startery obejmujące miejsca restrykcyjne Aatll i BssHII, tworząc następujący produkt PCR: 5' Aatll.(ER1 lub ER2).BssHII 3'. Fragment ten klonuje się w „konstrukcie B1” wykorzystując te same miejsca restrykcyjne. Konstrukt ten określa się jako „konstrukt C1”,ijest on następujący:
_KpnI.AatII.(ER1 lub ER2).BssHII.(ER1 lub
ER2).Nsil.Spel.Mlul. Nhel.Smal.Xhol(-120 doTSS Bglll).Hindlll.[lucyferaza].Xbal_
ETAP 4: Fragment wzmacniający TNFa (ER1 lub ER2) amplifikuje się stosując startery obejmujące miejsca restrykcyjne NsiliSpel, tworząc następujący produkt PCR: 5'NsiI.(ER1 lub ER2).SpeI 3'.
PL 191 586 B1
Fragment ten klonuje się w „konstrukcie C1” stosując te same miejsca restrykcyjne. Konstrukt ten określa się jako „konstrukt D1”ijest on następujący:
_KpnI.AatII.(ER1 lub ER2).BssHii.(ER1 lub ER2).Nsil.(ER1 lub ER2).Spel.Mlul.Nhel Smal.Xhol(-120 do TSSBgIII). Hindlll.[lucyferaza].Xbal_
ETAP 5: Regiony kodujące AIG.1 lub AIG.2 (korzystne, ale regiony te nie ograniczają się do AIG.1 iAIG.2; można zastosować którykolwiekz wymienionych AIG) amplifikuje się przez PCR stosując startery obejmujące miejsca restrykcyjne Bgllli Xbal, tworząc następujący fragment: 5' BglII.(AIG.1 lub AIG.2).XbaI 3''. Fragment ten wstawia się do „konstruktu D1” wykorzystując te same miejsca restrykcyjne. Otrzymany konstrukt określa się jako „konstrukt E1”,ijest on następujący:
_KpnI.Aatll.(ER1 lub ER2).BssHII.(ER1 lub ER2).Nsil.(ERl lub ER2).Spel.Mlul.Nhel.Smal.Xhol(-120 do TSS.Bglll)[AIG.1 lub AIG.2].Xbal_
Alternatywny schemat 2 jest następujący:
Schemat2:
ETAP 1: Tak samo jak w schemacie 1, prowadzi do powstania „konstruktu A1”, który jest następujący:
_KpnI.SacI.MluI.Nhel.Smal.Xhol.(-120 do TSS Bglll).Hindlll.[lucyferaza].Xbal_
ETAP2: Insercja dodatkowego MCS.
Dwakomplementarneoligonukleotydy(zufosforylowanymikońcami5'),zapewniające:
_Nhel.SacII.EcorY.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.XhoI_, syntetyzuje się stosując komercjalne źródła handlowe. Oligonukleotydy te łączy się, a następnie klonuje w miejsca Nheli Xhol „konstruktu A1”.
Otrzymany konstrukt określa się jako „konstrukt B2”, i jest on następujący:
_KpnI.SacI.Mlul.Nhel.SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.Spel. PvuII.XhoI. (-120 do TSS Bglll).
Hindlll. [lucyferaza].Xbal_
ETAP 3: Fragment wzmacniający TNFa (ER1 lub ER2) amplifikuje się stosując startery zawierające miejsca restrykcyjne SpelI.PvuII na końcu 5' iPuvII na końcu 3', tworząc następujący produkt PCR: 5' Spel.PvuII.(ER1 lub ER2). Xhol 3'. Fragment ten klonuje się w „konstrukcie B2”, wykorzystując miejsca restrykcyjne SpeliXhol. Konstrukt ten określa się jako „konstrukt C2”,ijest on następujący:
_KpnI.SacI.Mlul.Nhel.SacII.EcorV.AfIII.AatH.AvrII.Spel. PvuII.(ER1 lub ER2) Xhol.(-120 do TSS
Bglll). Hindlll.[lucyferaza].Xbal_
ETAP 4: Fragment wzmacniający TNFa (ER1 lub ER2) amplifikuje się stosując startery zawierające miejsca restrykcyjne AvrII.SpeI na końcu 5' i PvuII na końcu 3', tworząc następujący produkt PCR: 5' AvrII.Spel. (ER1 lub ER2). Pvull3'. Fragment ten klonuje się w „konstrukcie C2” wykorzystując miejsca restrykcyjne AvrIIiPvuII. Konstrukt ten określa się jako „konstrukt D2”,ijest on następujący:
_KpnI.SacI.Mlul.Nhel.SacII.EcorV.Af III.AatH.AvrII.Spel.(ER1 lub ER2).PvuII. (ER1 lub ER2)Xhol.
(-120 do TSS Bglll).Hindlll.[lucyferaza].Xbal_
A zatem, stosując tą strategię, podczas amplifikacji przez PCR wybranych regionów wzmacniających, można dołączyć co najmniej siedem kopii, po jednej na raz, regionów wzmacniających (ER1, ER2 lub ER3, pojedynczo lub w kombinacjach) poprzez wykorzystanie jednego lub więcej miejsc restrykcyjnych położonych za miejscami poprzednimi.
Po dołączeniu pożądanej liczba kopii regionów wzmacniających, AIG wstawia się za superpromotorem, jak opisanowetapie 5 schematu 1.
Indukowalną ekspresję genu chimerycznego TNFp-AIG bada się przez krótkotrwałą transfekcję wymienionych powyżej linii komórkowych. Ekspresję genu TNFp-AIG mierzy się wykrywając apoptozę stransfekowanych komórek, oceniając ilość ulegających ekspresji białek AIG na blotach typu Western zwykorzystaniem dostępnych komercjalnie przeciwciał i oznaczając aktywność proteaz zwykorzystaniem dostępnego komercjalnie, dobrze udokumentowanego, specyficznego, syntetycznego substratu tetrapeptydowego.
Indukowalną ekspresję genu chimerycznego TNFp-FasL bada się przez krótkotrwałą transfekcję tych samych linii komórkowych. Ekspresję FasL na powierzchni komórek stransfekowanych ocenia się ilościowo stosując wiązanie przeciwciała skierowanego przeciw FasL, wykrywane metodą pośredniej immunofluorescencji, oraz przez pomiar indukcji apoptozy komórek Fas-pozytywnych.
PL 191 586 B1
Regulacja kierowanej przez TNFp ekspresji genu reporterowego. Nie ulegający translacji 3'-końcowy region genu TNFa odgrywa ważną rolę wregulacji biosyntezy TNFa. Bierze on udział w translacyjnej ekspresji ekspresji genu TNFα w normalnym, nieaktywowanym stanie. Co ważne, elementy te pozwalają na występowanie derepresji, gdy komórki wytwarzające TNFa ulegają aktywacji przez bodźce zewnętrzne (Han, J.iin., J. Immunology, 1991, 146, 1843-1848; Crawford, F.K.iin., J. Biol. Chem., 1996, 271, 22383-22390).
Tworzy się konstrukty genetyczne, wktórych cały nie ulegający translacji region 3'-końcowy (sekwencjaonumerze identyfikacyjnym: 13) wstawia się za genem lucyferazy kierowany przez fragmenty delecyjne promotora TNFa, a mianowicie -120, -706 i -1005. Wyniki krótkotrwałej ekspresjitych konstruktówpodsumowanonafigurze9.
Przykład 2
Protokołybadawcze
Metodyinvitro:
Oznaczenie lucyferazy: Aktywność lucyferazy określa się stosująckomercjalniedostępneodczynniki(Promega).
EkspresjagenówAIG.1iAIG.2:
a) Bloty typu Western lizatów stransfekowanych komórek wywołuje się wykorzystując przeciwciałaskierowaneprzeciwCPP32, jak również przeciwciała skierowane przeciw PRAP. Przeciwciało skierowane przeciw PRAP wykrywa zarówno zhydrolizowane, jak inie zhydrolizowane produkty PRAP,będącewynikiemenzymatycznejaktywnościCPP32.
b) Oznaczenie enzymu CPP32: W oznaczeniu tym wykrywa się reakcję enzymatyczną CPP32 irozkład substratu kolorymetrycznego lub fluorogennego. W oznaczeniu tym stosuje się dostępny komercjalniezestawodczynników(Clonotech,Pharmingen).
c) Apoptoza stransfekowanych komórek: Apoptozę stransfekowanych komórek powodowaną przezAIG.1iAIG.2określasiępoprzezbarwieniejąderkomórkowychjodkiempropidyny(Krishan, A., J. Cell Biol., 66, 1994, 188-193) oraz stosując dostępny komercjalnie zestaw do testu Elisa śmierci komórek (Boehringer Mannheim).
Modelezwierzęce
Model indukowanego IL-1 zapalenia stawów u królików (Pettipher E. R.iin., Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, 83, 8749-8753): IL-1 wstrzykuje się do stawów kolanowych królików rasy New Zealand White. Dostawowe wstrzyknięcie IL-1 powoduje zależną od dawki infiltrację leukocytów do przestrzeni wewnątrzstawowej i utratę proteoglikanu w chrząstce stawowej.
Zapalenie stawów indukowane antygenami: Dostawowe wstrzyknięcie antygenu (owoalbumina) do stawu kolanowego indukuje akumulację leukocytówidegradację chrząstki, które bardzo przypominają reumatoidalne zapalenie stawów u ludzi. Obrzęk stawu, występujący po wstrzyknięciu utrzymywał się przez 14 dni.
Model ludzkich synowiocytów w myszach SCID (HouriJ.M.iin., Current Opinions in Rheumatol., 1995, 7, 201-205; Sack U.iin., J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58; Geiler T.iin., Arthritis & Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671): Są to ostatnio opracowane modele zapalenia stawów, w których świeżą tkankę maziówki pacjentówzRAznormalną ludzką chrząstką implantuje się myszom SCID, podskórnie, pod torebką nerkową (Geiler T.iin., Arthritis & Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671) lub do stawów kolanowych (Sack U.iin., J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58). Implanty rosnąwsposób charakterystyczny dla zapalenia stawów, włącznie z formowaniem tkanki łuszczki o wysokiej gęstości komórek, nadżerkami kości ichrząstki, rozwojem wielojądrzastych komórek olbrzymich inaciekaniem chrząstki przez fibroblastymaziówkowe.
Metoda pośrednia: Synowiocyty transfekuje się in vitro genem terapeutycznym i przeszczepia zpowrotem do królików. U królików tych indukuje się zapalenie stawów przez wstrzyknięcie IL-1 iocenia się ekspresję genu leczniczego po aktywacji. Indukowana aktywacją ekspresja genu chimerycznego wywołuje apoptozę w przeszczepionych komórkach.
Metoda bezpośrednia: dostawowe wstrzyknięcia genów chimerycznych. Można zastosować którykolwiekzopisanych powyżej sposobów wprowadzania genów, włącznie ze stosowaniem nagiego DNA plazmidowego lub kationowych liposomów. Przy stosowaniu wektora opartego na wirusie, geny chimeryczne klonuje sięwodpowiednich wektorach. Wektory następnie modyfikuje się przez delecję obecnego w tych wektorach promotora eukariotycznego. Dostawowe wstrzyknięcia genów leczniczych wstawionych do odpowiednich wektorów można prowadzić w celu oceny skuteczności terapeutycznej, jak również profilaktycznej.
PL 191 586 B1
Przykład 3
SelekcjaniewytwarzającychTNFa wariantów komórek somatycznych
Komórki (THP-1, Jurkat) stabilnie transfekuje się in vitrogenem chimerycznym TNFp-AIG. Po kilku cyklach stymulacji, które indukują apoptozę w komórkach, w których zachodzi ekspresja genu TNFp-AIG, zbiera się komórki przeżywające. Następnie konstruuje się bibliotekę cDNA tych komórek, którą stosuje się do klonowania funkcjonalnego (Legerski R.iPeterson C., Nature, 1992, 359, 70-73; Jaattela M.iin., Oncogene, 1995, 10, 2297-2305).
Przykład 4
Identyfikacjaicharakterystykagenówdominującychnegatywnych(DN)
Stabilnie stransfekowane TNFp-AIG komórki THP-1iJurkat poddaje się powtarzającym się cyklom stymulacjiwcelu aktywacji ekspresji THFp-AIG. Komórki, które nie wykazują ekspresji regulujących genów negatywnych ulegają apoptozie, podczas gdy te, w których zachodzi ekspresja genów dominujących negatywnych, przeżywają. W tych przeżywających komórkach produkty genów DN działająwkonfiguracji transwstosunku do promotora TNFa,wten sposób hamując jego aktywację do transkrypcji AIG, czego wynikiem ostatecznie jest fenotyp przeżywania. Wykorzystując poliadenylowany mRNA z tych komórek konstruuje się bibliotekę cDNA. Geny DN, które uniemożliwiają apoptozę komórek THP-1 lub Jurkat stransfekowanych genem TNFp-AIG identyfikuje się poprzez klonowanie funkcjonalne, jak opisano dla innych genów (Legerski R.iPeterson C., Nature, 1992, 359, 70-73; Jaattela M.iin., Oncogene, 1995, 10, 2297-2305).
Powyższy opis ma na celu przedstawienie osobie będącej specjalistąwtej dziedzinie, wjaki sposób praktycznie stosować niniejszy wynalazek, inie ma na celu szczegółowego wyjaśniania wszystkich jego oczywistych modyfikacji i odmian, które staną się oczywiste dla specjalisty po przeczytaniu opisu. Zamiarem jest jednakże, aby wszystkie takie modyfikacjeiodmiany objęte były zakresem niniejszego wynalazku, który definiują poniższe zastrzeżenia. Zamiarem jest, aby zastrzeżenia pokrywały zastrzegane składniki i etapy wjakiejkolwiek kolejności, która skutecznie spełnia zamierzone cele,oilekontekst nie wskazuje szczegółowo inaczej.
Artykuły cytowane w niniejszym opisie wyraźnie włączono są do niego w całości poprzez odnośniki literaturowe.
PL 191 586 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Revati J. Tatake, Steven D. Marlin i Randall W. Barton (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Samoregulująca apoptoza komórek zapalnych dzi$ki terapii genowej (iii) LICZBA SEKWENCJI: 13 (ivj ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Boehringer Ingelheim Corporation (B) ULICA: 900 Ridgebury Road, P.O. Box 368 (C) MIASTO: Ridgefield (D) STAN: Connecticut (E) KRAJ: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD POCZTOWY: 06877-0368 (v) ZAPIS KOMPUTEROWY:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka 3,5 1,44 Mb (B) KOMPUTER: IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: MS DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Word Processing <vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: zostanie przyznany (B) DATA ZŁOŻENIA: w załączeniu (C) KLASYFIKACJA:
(vi) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 60/038 266 (B) DATA ZŁOŻENIA: 28 lutego 1997 <viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:
(A) NAZWISKO: Robert P. Raymond (B) NUMER REJESTRACYJNY: 25089
EC) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁY16
PL 191 586 B1
WAĆ/NUMER W REJESTRZE: 203-791-6183 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) NUMER TELEFONU: 203-798-4865 (B) NUMER TELEFAXU: 203-791-6183 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1178 (B) TYP: kwas nukleinowy (Cj ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: promotor odniesienia ludzkiego TNFa (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:
(A) AUTORZY: Takashiba, S. i in.
(B) PISMO: Gene (D) TOM: 131 (E) STRONY: 307-308 <xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJĄ O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:!:
GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA 50 GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC. 100 TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG 150 GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG AGTATCGGGG ACCCCCCCTT 200 AACGAAGACA GGGCCATGTA GAGGGCCCCA GGGAGTGAAA GAGCCTCCAG 250 GACCTCCAGG TATGGAATAC AGGGGACGTT TAAGAAGATA TGGCCACACA 300 CTGGGGCCCT GAGAAGTGAG AGCTTCATGA AAAAAATCAG GGACCCCAGA 350 GTTCCTTGGA AGCCAAGACT GAAACCAGCA TTATGAGTCT CCGGGTCAGA 400 ATGAAAGAAG AAGGCCTGCC CCAGTGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 450 TCACTCCCCG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 500 TCCTGAGGCC TCAAGCTGCC ACCAAGCCCC CAGCTCCTTC TCCCCGCAGA 550 CCCAAACACA GGCCTCAGGA CTCAACACAG CTTTTCCCTC CAACCCCGTT 600 TTCTCTCCCT CAAGGACTCA GCTTTCTGAA GCCCCTCCCA GTTCTAGTTC 650
PL 191 586 B1
TATCTTTTTC CTGCATCCTG TCTGGAAGTT AGAAGGAAAC AGACCACAGA 700 CCTGGTCCCC AAAAGAAATG GAGGCAATAG GTTTTGAGGG GCATGGGGAC 750 GGGGTTCAGC CTCCAGGGTC CTACACACAA ATCAGTCAGT GGCCCAGAAG 600 ACCCCCCTCG GAATCGGAGC AGGGAGGATG GGGAGTGTGA GGGGTATCCT 850 TGATGCTTGT GTGTCCCCAA CTTTCCAAAT NCCCGCCCCC GCGATGGAGA 900 AGAAACCGAG ACAGAAGGTG CAGGGCCCAC TACCGCTTCC TCCAGATGAG 950 CTTATGGGTT TCTCCACCAA GGAAGTTTTC CGCTGGTTGA ATGATTCTTT 1000 CCCCGCCCTC CTCTCGCCCC AGGGACATAT AAAGGCAGTT GTTGGCACAC 1050 CCAGCCAGCA GACGCTCCCT CAGCAAGGAC AGCAGAGGAC CAGCTAAGAG 1100 GGAGAGAAGC AACTGCAGAC CCCCCCTOAA AACAACCCTC AGACGCCACA 1150 TCCCCTGACA AGCTGCCAGG CAGGTTCT n?8 (23 INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1096 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: gen promotora ludzkiego TNFa (x) INFORMACJA O PUBLIKACJI:
| (A) AUTORZY: Takashiba, S., | i i n |
| (B) PISMO: Gene | |
| (D) TOM: 131 | |
| (E) STRONY: 307-308 |
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI
KACYJNYM:2:
GAGGCCGCCA GACTGCTGCA GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA 50 AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT 100 ATGGCCACAT GTAGCGGCTC TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG 150 AGATGTGACC ACAGCAATGG GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG 200 AGTATGGGGA CCCCCCCTTA ACGAAGACAG GGCCATGTAG AGGGCCCCAG 250 GGAGTGAAAG AGCGTCCAGG ACCTCCAGGT ATGGAATACA GGGGACGTTT 300 AAGAAGATAT GGCCACACAC TGGGGCCCTG AGAAGTGAGA GCTTCATGAA 3S0 AAAAATCAGG GACCCCAGAG TTCCTTGGAA GCCAAGACTG AAACCAGCAT 400 TATGAGTCTC CGGGTCAGAA TGAAAGAAGA AGGCCTGCCC CAGTGGGGTC 450 TGTGAATTCC CGGGGGTGAT TTCACTCCCC GGGGCTGTCC CAGGCTTGTC 500 CCTGCTACCC CCACCCAGCC TTTCCTGAGG CCTCAAGCCT GCCACCAAGC 550 CCCCAGCTCC TTCTCCCCGC AGGGACCCAA ACACAGGCCT CAGGACTCAA 600 CACAGCTTTT CCCTCCAACC CCGTTTTCTC TCCCTCAAGG ACTCAGCTTT 650 CTGAAGCCCC TCCCAGTTCT AGTTCTATCT TTTTCCTGCA TCCTGTCTGC 700
PL 191 586 B1
AAGTTAGAAG GAAACAGACC ACAGACCTGG TCCCCAAAAG AAATGGAGGC 750
AATAGGTTTT GAGGGGCATG GGGACGGGGT TCAGCCTCCA GGGTCCTACA Θ00
CACAAATCAG TCAGTGGCCC AGAAGACCCC CCTCGGAATC GGAGCAGGGA 850
GGATGGGGAG TGTGAGGGGT ATCCTTGATG CTTGTGTGTC CCCAACTTTC 900
CAAATCCCCG 'CCCGCGCGAT GGAGAAGAAA CCGAGACAGA AGGTGCAGGG 950
CCCACTACCG CTTCCTCCAG ATGAGĆTCAT GGGTTTCTCC ACCAAGGAAG 1000
TTTTCCGCTG GTTGAATGAT TCTTTCCCCG ĆCCTCCTCTC GCCCCAGGGA 1050
CATATAAAGG CAGTTGTTGG CAGACCCAGC CAGCAGACGC TCCCTC 1096 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ:· 139 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: natywny minimalny promotor TNFa (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI:
CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50
CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100
AGGCAGTTGT ATGGCACACC CGCCAGCAGA CGCTCCCTC 139 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 904 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: chimeryczny gen TNFpl20 AIG.l
PL 191 586 B1 (D) INNE INFORMACJE: reszty 1 do 139 obejmują sekwencję promotora; reszty 140 do 151 sekwencję łącznika, a pozostałe reszty obejmują sekwencje AIG.l (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI :
CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50
CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100
AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAGA CGCTCCCTCA GCAGATCCAC 150
CATGTCTGGA ATATCCCTGG ACAACAGTTA TAAAATGGAT TATCCTGAGA 200
TGGGTTTATG TATAATAATT AATAATAAGA ATTTTCATAA AAGCACTGGA 250
ATGACATCTC GGTCTGGTAC AGATGTCGAT GCAGCAAACC TCAGGGAAAC 300
ATTCAGAAAC TTGAAATATG AAGTCAGGAA TAAAAATGAT CTTACACGTG 350
AAGAAATTGT GGAATTGATG'CGTGATGTTT CTAAAGAAGA TCACAGCAAA 4 00 AGGAGCAGTT TTGTTTGTGT GCTTCTGAGC CATGGTGAAG AAGGAATAAT 450
TTTTGGAACA AATGGACCTG TTGACCTGAA AAAAATAAC/s. AACTTTTTCA 500
GAGGGGATCG TTGTAGAAGT CTAACTGGAA AACCCAAACT TTTCATTATT 550
CAGGCCTGCC GTGGTACAGA ACTGGACTGT GGCATTGAGA CAGACAGTGG 600
TGTTGATGAT GACATGGCGT GTCATAAAAT ACCAGTGGAG GCCGACTTCT 650
TGTATGCATA CTCĆACAGCA CCTGGTTATT ATTCTTGGCG AAATTCAAAG 700
GATGGCTCCT GGTTCATCCA GTCGCTTTGT GCCATGCTGA AACAGTATGC 750
CGACAAGCTT GAATTTATGC ACATTCTTAC CCGGGCTAAC CGAAAGGTGG 800
CAACAGAATT TGAGTCCTTT TCCTTTGACG CTACTTTTCA TGCAAAGAAA 650
CAGATTCCAT GTATTGTTTC CATGCTCACA AAAGAACTCT ATTTTTATCA 900
CTAA 904 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1490 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: chimeryczny gen TNFp706 AIG.l JD) INNE INFORMACJE: reszty 1 do 724 obejmują sekwencje promotora; reszty 725 do 736 sekwencję łącznika, a pozostałe reszty obejmują sekwencję AIG.l (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI20
PL 191 586 B1
KACYJNYM:S:
TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50
GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100 TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT 150 TTCCTGAGGC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 200 GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 250 GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 300 TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 350 AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 400 GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 450 AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 500 CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 550 AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 600 GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 650 TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 700 CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC 750 CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA 800 ΤΑΑΤΤΛΑΤΑΑ TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATCTCGGTCT 850 GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGAA 900 ATATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT 950 TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATCACA GCAAAAGGAG CAGTTTTGTT 1000 TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAAATGG 1050 ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 1100 GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1150 ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1200 GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1250 CAGCACCTGG TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1300 ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT TGCTGAAACA GTATGCCGAC AAGCTTGAAT 1350 TTATGCACAT TCTTACCCGG GCTAACCGAA AGGTGGCAAC AGAATTTGAG 1400 TCCTTTTCCT TTGACGCTAC TTTTCATGCA AAGAAACAGA TTCCATGTAT 1450 TGTTTCCATG CTCACAAAAG AACTCTATTT TTATCACTAA 1490 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1769 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: chimeryczny gen TNFplOOS AIG.l (D) INNE INFORMACJE: reszty 1 do 1023 obejmują sekwencje promotora; reszty 1024 do 1036 sekwencję łącznika, a pozostałe reszty obejmują sekwencję AIG.l
PL 191 586 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM : 6:
GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50
AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT 100
AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC 150
GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 200
CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG 250
GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT 300
CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 350
AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT 400
CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 450
TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 500
GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 550
GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 600
TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 650
AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 700
GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 750
AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 800
CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 050
AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 900
GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 950
TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 1000
CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC 1050
CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA 1100
TAATTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATCTCGGTCT 1150
GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGAA 1200
ATATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT 1250
TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATCACA GCAAAAGGAG CAGTTTTGTT 1300
TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAAATGG 1350
ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 1400
GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1450
ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1500
GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1550
CAGCACCTGG TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1600
ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT GCTGAAACAG TATGCCGACA AGCTTGAATT 1650
TATGCACATT CTTACCCGGG CTAACCGAAA GGTGGCAACA GAATTTGAGT 1700
CCTTTTCCTT TGACGCTACT TTTCATGCAA AGAAACAGAT TCCATGTATT 1750 GTTTCCATGC TCACAAAAGA ACTCTATTTT TATCACTAA 1789 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:?:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1008 (B) TYP: kwas nukleinowy !C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa ' (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ίχ) CECHA:
PL 191 586 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: chimeryczny gen TNFpl20 AIG.2 (D) INNE INFORMACJE: reszty 1 do 138 obejmują sekwencję promotora; reszty 139 do 150 sekwencję Łącznika, a pozostałe reszty obejmują sekwencję AIG.2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:?:
CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50 CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100 AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAGA GCTCCCTCAG CAGATCCACC 150 ATGGCTGGAC CACCTGAGTC AGCAGAATCT ACAGATGCCC TCAAGCTTTG 200 TCCTCATGAA GAATTCCTGA GACTATGTAA AGAAAGAGCT GAAGAGATCT 250 ACCCAATAAA GGAGAGAAAC AACCGCACAC GCCTGGCTCT CATCATATGC 300 AATACAGAGT TTGACCATCT GCCTCCGAGG AATGGAGCTG ACTTTGACAT 350 CACAGGGATG AAGGAGCTAC TTGAGGGTCT GGACTATAGT GTAGATGTAG 400 AAGAGAATCT GACAGCCAGG GATATGGAGT CAGCGCTGAG GGCATTTGCT 450 ACCAGACCAG AGCACAAGTC CTCTGACAGC ACATTCTTGG TACTCATGTC 500 TCATGGCATC CTGGAGGGAA TCTGCGGAAC TGTGCATGAT GAGAAAAAAC 550 CAGATGTGCT GCTTTATGAC ACCATCTTCC AGATATTCAA CAACCGCAAC S00 TGCCTCAGTC TGAAGGACAA ACCCAAGGTC ATCATTGTCC AGGCCTGCAG 650 AGGTGCAAAC CGTGGGGAAC TGTGGGTCAG AGACTCTCCA GCATCCTTGG 700 AAGTGGCCTC TTCACAGTCA TCTGAGAACC TGGAGGAAGA TGCTGTTTAC 750 AAGACCCACG TGGAGAAGGA CTTCATTGCT TTCTGCTCTT C/iACGCCACA 800 CAACGTGTCC TGGAGAGACA GCACAATGGG CTCTATCTTC ATCACACAAC 850 TCATCACATG.CTTCCAGAAA TATTCTTGGT GCTGCCACCT AGAGGAAGTA 900 TTTCGGAAGG TACAGCAATC ATTTGAAACT CCAAGGGCCA AAGCTCAAAT 950 GCCCACCATA GAACGACTGT CCATGACAAG ATATTTCTAC CTCTTTCCTG 1000 GCAATTGA 1008 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1587 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: chimeryczny gen TNFp706 AIG.2
PL 191 586 B1 (D) INNE INFORMACJE: reszty 1 do 724 obejmują sekwencję promotora; reszty 725 do 736 sekwencję łącznika, a pozostałe reszty obejmują sekwencje AlG.2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 8:
TCCTTGGAĄG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT SO GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100 TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT ISO TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT TCTCCCCGCA 200 GGGACCCAAA CACAGGCCTC AGGACTCAAC ACAGCTTTTC CCTCCAACCC 250 CGTTTTCTCT CCCTCAAGGA CTCAGCTTTC TGAAGCCCCT CCCAGTTCTA 300 GTTCTATCTT TTTCCTGCAT CCTGTCTGGA AGTTAGAAGG AAACAGACCA 350 CAGACCTGGT CCCCAAAAGA AATGGAGGCA ATAGGTTTTG AGGGGCATGG 400 GGACGGGGTT CAGCCTCCAG GGTCCTACAC ACAAATCAGT CAGTGGCCCA 450 AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 500 CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 550 AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 600 GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 650 TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 700 CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 750 TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 800 TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 850 AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAGTTTGA 900 CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT GACATCACAG GATGAAGGAG 950 TACTTGAGGG TCTGGACTAT GTGTAGATGT GAAGAGAATC GACAGCCAGG 1000 ATATGGAGTC AGCGCTGAGG GCATTTGCTA CCAGACCAGA GCACAAGTCC 1050 TCTGACAGCA CATTCTTGGT ACTCATGTCT CATGGCATCC TGGAGGGAAT 1100 CTGCGGAACT GTGCATGATG AGAAAAAACC AGATGTGCTG CTTTATGACA 1150 CCATCTTCCA GATATTCAAC AACCGCAACT GCCTCAGTCT GAAGGACAAA 1200 CCCAAGGTCA TCATTGTCCA GGCCTGCAGA GGTGCAAACC GTGGGGAACT 1250 GTGGGTCAGA GACTCTCCAG CATCCTTGGA AGTGGCCTCT TCACAGTCAT 1300 CTGAGAACCT GGAGGAAGAT GCTGTTTACA AGACCCACGT GGAGAAGGAC 1350 TTCATTGCTT TCTGCTCTTC AACGCCACAC AACGTGTCCT GGAGAGACAG 1400 CACAATGGGC TCTATCTTCA TCACACAACT CATCACATGC TTCCAGAAAT 1450 ATTCTTGGTG CTGCCACCTA GAGGAAGTAT TTCGGAAGGT ACAGCAATCA 1500 TTTGAAACTC CAAGGGCCAA AGCTCAAATG CCCACCATAG AACGACTGTC 1550 CATGACAAGA TATTTCTACC TCTTTCCTGG CAATTGA 1587 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
| (A) | DŁUGOŚĆ: 1894 | |
| (B) | TYP: kwas | nukleinowy |
| (C) | ILOŚĆ NICI | : jedna |
| (D) | TOPOLOGIA: | liniowa |
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI (A) OPIS: DNA
PL 191 586 B1 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: chimeryczny gen TNFpl005 AIG.2 (D) INNE INFORMACJE: reszty 1 do 1024 obejmują sekwencję promotora; reszty 1025 do 1036 sekwencję łącznika, a pozostałe reszty obejmują sekwencję AIG.2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI:
GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50
AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT AGCTACTTGA GGGTCTGGAC TATAGTGTAG GCCAGGGATA TGGAGTCAGC GCTGAGGGCA CAAGTCCTCT GACAGCACAT TCTTGGTACT AGGGAATCTG CGGAACTGTG CATGATGAGA TATGACACCA TCTTCCAGAT ATTCAACAAC GGACAAACCC AAGGTCATCA TTGTCCAGGC GGGAACTGTG GGTCAGAGAC TCTCCAGCAT CAGTCATCTG AGAACCTGGA GGAAGATGCT GAAGGACTTC ATTGCTTTCT GCTCTTCAAC GAGACAGCAC AATGGGCTCT ATCTTCATCA CAGAAATATT CTTGGTGCTG CCACCTAGAG GCAATCATTT GAAACTCCAA GGGCCAAAGC GACTGTCCAT GACAAGATAT TTCTACCTCT (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O
ATGTGACCAC AGCAATGGGT 100 TATGGGGACC CCCCCTTAAC 150 AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 200 GAAGATATGG CCACACACTG . 250 AAATCAGGGA CCCCAGAGTT 300 TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 350 TGAATTCCCG GGGGTGATTT 400 TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 450 CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 500 CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 550 OAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 600 GTTAGAAGGA AACAGACCAC 650 TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 700 CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 750 ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 800 AATCCCCGCC CCCGCGATGG 850 CACTACCGCT TCCTCCAGAT 900 TTCCGCTGGT TGAATGATTC 950 TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 1000 TCCACCATGG CTGGACCACC 1050 GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 1100 AGATCTACCC AATAAAGGAG 1150 ATATGCAATA CAGAGTTTGA 1200 TGACATCACA GGGATGAAGG 1250 ATGTAGAAGA GAATCTGACA 1300 TTTGCTACCA GACCAGAGĆA 1350 CATGTCTCAT GGCATCCTGG 1400 AAAAACCAGA TGTGCTGCTT 1450 CGCAACTGCC TCAGTCTGAA 1500 CTGCAGAGGT GCAAACCGTG 1550 CCTTGGAAGT GGCCTCTTCA 1600 GTTTACAAGA CCCACGTGGA 1650 GCCACACAAC GTGTCCTGGA 1700 CACAACTCAT CACATGCTTC 1750 GAAGTATTTC GGAAGGTACA 1800 TCAAATGCCC ACCATAGAAC 1850 TTCCTGGCAA TTGA 1894
NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 123
PL 191 586 B1 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: region wzmacniający 1 (ER1) promotora TNF α (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 10:
GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC 50
TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG 100
GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATG 123 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 190 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: region wzmacniający 2 (ER2) promotora TNF α (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 11:
TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50
GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 10O
TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT 150
TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT 190 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
PL 191 586 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 223 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: miejsca wielokrotnego klonowania (D) INNE INFORMACJE: utworzone technikami inżynierii genetycznej miejsca wielokrotnego klonowania wstawione przed minimalnym promotorem TNFa w konstrukcie 120pGL3 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 12:
GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCGCG GATATCTTAA GACGTCCTAG 50
GACTAGTCAG CTGCTCGAGC CGCTTCCTCC AGATGAGCTC ATGGGTTTCT 100
CCACCAAGGA AGTTTTCCGC TGGTTGAATG ATTCTTTCCC COCCCTCCTC 150
TCGCCCCAGG GACATATAAA GGCAGTTGTT GGCACACCCA GCCAGCAGAC 200
GCTCCCTCAG CAGATCTAAG CTT 223 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 787 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:
(A) OPIS: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: nie ulegający translacji region
TNFa (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 13:
PL 191 586 B1
TCTAGAGGAG GACGAACATC CAACCTTCCC AAACGCCTCC CCTGCCCCAA 50 TCCCTTTATT ACCCCCTCCT TCAGACACCC TCAACCTCTT CTGGCTCAAA 100 AAGAGAATTG GGGGCTTAGG GTCGGAACCC AAGCTTAGAA CTTTAAGCAA 150 CAAGACCACC ACTTCGAAAC CTGGGATTCA GGAATGTGTG GCCTGCACAG 200 TGAAGTGCTG GCAACCACTA AGAATTCAAA CTGGGGCCTC CAGAACTCAC 250 TGGGGCCTAC AGCTTTGATC CCTGACATCT GGAATCTGGA GACCAGGGAG 300 CCTTTGGTTC TGGCCAGAAT GCTGCAGGAC TTGAGAAGAC CTCACCTAGA 350 AATTGACACA AGTGGACCTT AGGCCTTCCT CTCTCCAGAT GTTTCCAGAC 400 TTCCTTGAGA CACGGAGCCC AGCCCTCCCC ATGGAGCCAG CTCCCTCTAT 450 TTATGTTTGC ACTTGTGATT ATTTATTATT TATTTATTAT TTATTTATTT 500 ACAGATGAAT GTATTTATTT GGGAGACCGG GGTATCCTGG GGGACCCAAT 550 GTAGGAGCTG CCTTGGCTCA GACATGTTTT CCGTGAAAAC GGAGCTGAAC 600 AATAGGCTGT TCCCATGTAG CCCCCTGGCC TCTGTGCCTT CTTTTGATTA 650 TGTTTTTTAA AATATTTATC TGATTAAGTT GTCTAAACAA TGCTGATTTG 700 GTGACCAACT GTCACTCATT GCTGAGCCTC TGCTCCCCAG GGGAGTTGTG 750 TCTGTAATCG CCCTACTATT CAGTGGCGAG ATCTAGA 787
Claims (22)
1. Gen chimeryczny, znamienny tym, że obejmuje co najmniej jedną sekwencję wzmacniającą promotor TNFa, oznaczoną numerem identyfikacyjnym 10 lub 11, lub jej funkcjonalny fragment, połączoną z funkcjonalną kopią minimalnego promotora TNFa, posiadającego sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 1, 2, 3 lub ich funkcjonalne fragmenty i połączoną ponadto z co najmniej jedną kopią genu indukującego apoptozę, którego ekspresją kieruje promotor TNFa.
2. Gen według zastrz. 1, znamienny tym, że połączenie sekwencji wzmacniającej z promotorem oraz promotora z genem indukującym apoptozę jest wybrane spośród grupy obejmującej połączenie bezpośrednie, połączenie dystalne, połączenie proksymalne oraz ich kombinacje.
3. Gen według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dwie lub więcej kopii sekwencji wzmacniającej promotor TNFa.
4. Gen według zastrz. 1, znamienny tym, że gen indukujący apoptozę wybiera się z grupy składającej się z kaspazy 1, kaspazy 2, kaspazy 3, kaspazy 4, kaspazy 5, kaspazy 6, kaspazy 7, kaspazy 8, kaspazy 10, granzymu A, granzymu B, ligandu Fas, oraz funkcjonalnych fragmentów i mieszanin któregokolwiek z nich.
5. Gen według zastrz. 4, znamienny tym, że gen indukujący apoptozę jest wybrany z grupy składającej się z kaspazy 3, kaspazy 4, kaspazy 5, granzymu B oraz funkcjonalnych fragmentów i mieszanin któregokolwiek z nich.
6. Gen według zastrz. 1, znamienny tym, że ma sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub ich funkcjonalne fragmenty.
7. Gen według zastrz. 1, znamienny tym, że ma sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub ich funkcjonalne fragmenty, przy czym 3'UTR genu TNFa jest zligowany za genem indukującym apoptozę.
8. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera gen określony w zastrz. 1.
9. Zastosowanie genu chimerycznego określonego w zastrz. 1 do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia zaburzeń zapalnych u pacjenta przez indukowanie apoptozy w komórkach zapalnych lub w komórkach w miejscu stanu zapalnego u pacjenta przez wprowadzenie tego genu do komórek.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że indukcja apoptozy nie indukuje odpowiedzi zapalnej u pacjenta.
11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że komórką zapalną jest komórka wytwarzająca TNFa.
12. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że zaburzeniem zapalnym jest reumatoidalne zapalenie stawów.
13. Gen chimeryczny, znamienny tym, że obejmuje od 2 do 10 kasetek sekwencji wzmacniającej promotor TNFa, oznaczonej numerem identyfikacyjnym 10 lub 11, lub jej funkcjonalnych fragmen28
PL 191 586 B1 tów, połączonych zco najmniej jedną kopiąminimalnego promotora TNFa, posiadającego sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 1, 2, 3 lubichfunkcjonalnefragmenty,ipołączonychponadtoconajmniejjednąkopiągenuindukującegoapoptozęwybranego zgrupyskładającej sięzkaspazy3, kaspazy 4, kaspazy 5, granzymuB orazfunkcjonalnychfragmentów, wariantów imieszanin któregokolwiek znich, przy czym ekspresją genu indukującego apoptozę kieruje promotor TNFa.
14. Środekfarmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera gen określony w zastrz. 13.
15. Zastosowanie genu chimerycznego określonego w zastrz. 13 do wytwarzania środka farmaceutycznegodoindukowaniaapoptozywwytwarzającej TNFa komórcezapalnej przez wprowadzenie tegogenudokomórki.
16. Zastosowaniegenuchimerycznegookreślonegowzastrz.13do wytwarzaniaśrodkafarmaceutycznegodoleczeniazaburzeniazapalnegou pacjenta przez indukowanie apoptozy w komórkach zapalnychlubwkomórkachwmiejscustanuzapalnegou pacjenta przez wprowadzenie tego genu do komórek bez indukowania odpowiedzi zapalnej u pacjenta.
17. Sposób konstruowania genu chimerycznego zawierającego co najmniej jedną kopię sekwencji wzmacniającej promotor TNFa, oznaczoną numerem identyfikacyjnym 10lub 11, lubjej funkcjonalny fragment, połączoną zfunkcjonalną kopią minimalnego promotora TNFa, posiadającego sekwencję wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 1, 2, 3 lub ich funkcjonalne fragmenty i połączoną ponadto zco najmniej jedną kopią genu indukującego apoptozę, którego ekspresją kieruje promotor TNFa, znamienny tym, że (a) amplifikuje się promotor TNFa przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z zastosowaniemstarterówobejmującychkonstruktydelecyjnepromotoraTNFa;
(b) klonujesięotrzymanewetapie(a)genyzamplifikowaneprzezPCRprzedgenemreporterowym;
(c) testuje się konstrukty otrzymane wetapie (b) pod kątem ich konstytutywnej i indukowalnej ekspresjiwconajmniejjednejliniikomórekwytwarzającychTNFa;
(d) przeprowadza się selekcję promotora TNFa odpowiedzialnego za indukowalną ekspresję genu reporterowego w linii komórkowej; oraz albo (e) amplifikuje się przez PCR regiony promotora TNFa, które wzmacniają ekspresję genu reporterowego otrzymując sekwencję wzmacniającą iliguje się co najmniej jedną kopię sekwencji wzmacniającej przed promotorem; albo (f) wstawia sięco najmniejjednąkopięgenuindukującegoapoptozęz wydeletowanąprodomeną za promotorem TNFa poprzez zastępowanie genu reporterowego konstruktami delecyjnymi genu indukującego apoptozę otrzymując gen chimeryczny; albo (g) amplifikujesięprzezPCR3'UTRTNFa iligujesięgozagenemreporterowym,albo przeprowadza się jakąkolwiek kombinację tych procedur.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że przed promotorem wstawia się dwie lub więcej kopii sekwencji wzmacniającej.
19. Sposóbwedług zastrz. 17, znamienny tym, że genem reporterowym jest lucyferaza.
20. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że gen indukujący apoptozę zwydeletowaną prodomeną wybiera się zgrupy składającej się z kaspazy 3, kaspazy 4, kaspazy 5, granzymu B oraz ich funkcjonalnych fragmentów.
21. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wytwarza się gen o sekwencji wybranej spośród grupy obejmującej sekwencje onumerze identyfikacyjnym 4, 5, 6, 7, 8, 9 iich funkcjonalne fragmenty.
22. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że linie komórkowe do testowania konstruktów wybierasięzgrupyskładającej sięzliniilimfoblastoidalnejT,mielomonocytarnej,monocytarnej,fibroblastowej i hodowanych ludzkich synowiocytów.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3926697P | 1997-02-28 | 1997-02-28 | |
| PCT/US1998/003911 WO1998037901A1 (en) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL335409A1 PL335409A1 (en) | 2000-04-25 |
| PL191586B1 true PL191586B1 (pl) | 2006-06-30 |
Family
ID=21904557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL335409A PL191586B1 (pl) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | Gen chimeryczny, środek farmaceutyczny go zawierający, zastosowanie genu chimerycznego oraz sposób konstruowania genu chimerycznego |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6525184B1 (pl) |
| EP (1) | EP0989853B1 (pl) |
| JP (1) | JP2001516210A (pl) |
| KR (1) | KR20000075788A (pl) |
| CN (1) | CN1286530C (pl) |
| AT (1) | ATE362369T1 (pl) |
| AU (1) | AU729063C (pl) |
| BR (1) | BR9807622A (pl) |
| CA (1) | CA2281567A1 (pl) |
| DE (1) | DE69837787D1 (pl) |
| HK (1) | HK1023942A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0002317A3 (pl) |
| IL (1) | IL131328A0 (pl) |
| NZ (1) | NZ338013A (pl) |
| PL (1) | PL191586B1 (pl) |
| RU (1) | RU2198683C2 (pl) |
| TR (1) | TR199902068T2 (pl) |
| WO (1) | WO1998037901A1 (pl) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040039186A1 (en) * | 1997-02-28 | 2004-02-26 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy |
| EP1056877A1 (en) * | 1998-02-27 | 2000-12-06 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy |
| AU2004233486B2 (en) * | 1999-01-11 | 2007-09-13 | Leadd B.V. | Use of apoptosis inducing agents in the treatment of (auto)immune diseases |
| EA200100770A1 (ru) * | 1999-01-11 | 2002-02-28 | Леадд Б.В. | Применение агентов, индуцирующих апоптоз, в лечении (ауто)имунных заболеваний |
| EP1939300A1 (en) * | 1999-05-28 | 2008-07-02 | Targeted Genetics Corporation | Methods and compositions for lowering the level of tumor necrosis factor (TNF) in TNF-associated disorders |
| PT1180159E (pt) * | 1999-05-28 | 2008-12-05 | Targeted Genetics Corp | Métodos e composições para abaixamento do nível de factor de necrose tumoral (tnf) nos distúrbios associados a tnf |
| EP1206542B1 (en) * | 1999-08-19 | 2005-11-09 | Centre for Translational Research in Cancer | Replication protein a binding transcriptional factor (rbt1) and uses thereof |
| US7094891B1 (en) | 1999-08-19 | 2006-08-22 | Center For Translation Research In Cancer | Replication protein a binding transcriptional factor (RBT1) and uses thereof |
| US8039261B2 (en) | 2000-11-17 | 2011-10-18 | Vascular Biogenics Ltd. | Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis |
| AU2003222427B8 (en) | 2000-11-17 | 2010-04-29 | Vascular Biogenics Ltd. | Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same |
| US8071740B2 (en) | 2000-11-17 | 2011-12-06 | Vascular Biogenics Ltd. | Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis |
| ZA200305980B (en) | 2001-02-12 | 2007-01-31 | Res Dev Foundation | Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof |
| JP2004535202A (ja) | 2001-07-17 | 2004-11-25 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | アポトーシス促進性蛋白質を含む治療剤 |
| JP4173446B2 (ja) | 2001-10-19 | 2008-10-29 | ヴァスキュラー バイオジェニックス リミテッド | 血管形成の標的化されたダウンレギュレーションおよび抗ガン治療のためのポリヌクレオチド構築物および薬学的組成物および方法 |
| WO2007046087A2 (en) * | 2005-10-16 | 2007-04-26 | Yeda Research And Development Co.Ltd. | Pharmaceutical compositions and diagnostic methods for inflammatory skin disesaes, disorders or conditions |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01137976A (ja) * | 1987-11-20 | 1989-05-30 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規ｄｎａフラグメント |
| US5792751A (en) | 1992-04-13 | 1998-08-11 | Baylor College Of Medicine | Tranformation of cells associated with fluid spaces |
| US6071890A (en) * | 1994-12-09 | 2000-06-06 | Genzyme Corporation | Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy |
| US7097972B1 (en) * | 1995-02-13 | 2006-08-29 | Regents Of The University Of Michigan | Method and composition for regulating apoptosis |
| US5744304A (en) * | 1995-05-30 | 1998-04-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inflammation-induced expression of a recombinant gene |
| CA2230852A1 (en) * | 1995-08-30 | 1997-03-06 | The Regents Of The University Of California | Therapy for cellular accumulation in chronic inflammatory diseases |
-
1998
- 1998-02-27 BR BR9807622-1A patent/BR9807622A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-02-27 HU HU0002317A patent/HUP0002317A3/hu unknown
- 1998-02-27 AT AT98908778T patent/ATE362369T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 EP EP98908778A patent/EP0989853B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 CA CA002281567A patent/CA2281567A1/en not_active Abandoned
- 1998-02-27 CN CNB98802960XA patent/CN1286530C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-27 WO PCT/US1998/003911 patent/WO1998037901A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-02-27 NZ NZ338013A patent/NZ338013A/en unknown
- 1998-02-27 RU RU99120779/14A patent/RU2198683C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 AU AU66724/98A patent/AU729063C/en not_active Ceased
- 1998-02-27 US US09/032,297 patent/US6525184B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 IL IL13132898A patent/IL131328A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 PL PL335409A patent/PL191586B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 KR KR1019997007861A patent/KR20000075788A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-02-27 JP JP53790998A patent/JP2001516210A/ja not_active Ceased
- 1998-02-27 DE DE69837787T patent/DE69837787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 TR TR1999/02068T patent/TR199902068T2/xx unknown
-
2000
- 2000-05-23 HK HK00103061A patent/HK1023942A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU729063B2 (en) | 2001-01-25 |
| WO1998037901A1 (en) | 1998-09-03 |
| PL335409A1 (en) | 2000-04-25 |
| EP0989853A4 (en) | 2004-03-17 |
| EP0989853A1 (en) | 2000-04-05 |
| DE69837787D1 (de) | 2007-06-28 |
| ATE362369T1 (de) | 2007-06-15 |
| NZ338013A (en) | 2001-05-25 |
| IL131328A0 (en) | 2001-01-28 |
| TR199902068T2 (xx) | 1999-12-21 |
| CN1249688A (zh) | 2000-04-05 |
| HUP0002317A2 (hu) | 2000-11-28 |
| AU6672498A (en) | 1998-09-18 |
| JP2001516210A (ja) | 2001-09-25 |
| BR9807622A (pt) | 2000-02-15 |
| KR20000075788A (ko) | 2000-12-26 |
| AU729063C (en) | 2005-02-03 |
| EP0989853B1 (en) | 2007-05-16 |
| CN1286530C (zh) | 2006-11-29 |
| HK1023942A1 (en) | 2000-09-29 |
| RU2198683C2 (ru) | 2003-02-20 |
| US6525184B1 (en) | 2003-02-25 |
| CA2281567A1 (en) | 1998-09-03 |
| HUP0002317A3 (en) | 2001-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1171617B1 (en) | Enhancement of the immune response for vaccine and gene therapy applications | |
| PL191586B1 (pl) | Gen chimeryczny, środek farmaceutyczny go zawierający, zastosowanie genu chimerycznego oraz sposób konstruowania genu chimerycznego | |
| EP1555317B1 (en) | Synthetic genes and genetic constructs comprising the same | |
| SG192856A1 (en) | Vectors conditionally expressing protein | |
| WO1998035028A9 (en) | An oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system | |
| EP0968281A2 (en) | An oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system | |
| EP0927263A1 (en) | Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors | |
| JP2008301832A (ja) | インターフェロン−α核酸の送達および発現のための方法および組成物 | |
| JP2000201680A (ja) | エピソ―ム的に複製するベクタ―、その製造および使用 | |
| US20090004146A1 (en) | Humanised Baculovirus | |
| JPH09501309A (ja) | アデノ関連性ウイルスレプタンパク質および細菌性タンパク質含有融合タンパク質 | |
| US6537784B1 (en) | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy | |
| CA2337496A1 (en) | Anti-angiogenesis plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same | |
| CZ306199A3 (cs) | Chimérní gen | |
| US20040039186A1 (en) | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy | |
| MXPA99007769A (en) | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy | |
| MXPA00008367A (en) | Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy | |
| EP0225177B1 (en) | Dna sequence coding for human tissue plasminogen activator | |
| CZ20003111A3 (cs) | Samoregulovatelná apoptóza zánětlivých buněk genovou terapií | |
| KR100512018B1 (ko) | 상동 재조합에 의해 인간 세포에서 인간 변이 단백질을 생성시키는 방법 | |
| JPH09501306A (ja) | 血友病の遺伝子療法 | |
| AU1737899A (en) | Adenoviral transfer vector for the gene transport of a DNA sequence | |
| JPH0746983A (ja) | ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080227 |