DE60117465T2

DE60117465T2 - Lipide mit aminoxygruppe

Info

Publication number: DE60117465T2
Application number: DE60117465T
Authority: DE
Inventors: Michael IC Vec Limited Armstrong Road South Kensington JORGENSEN; Michael IC Vec Limited Armstrong Road South Kensington KELLER; Andrew David IC Vec Limited Armstrong Road South Kensington MILLER; Eric IC Vec Limited Armstrong Road South Kensington PEROUZEL
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2021-12-06
Also published as: WO2002048380A3; RU2003120456A; AU2002220894A1; CN1524125A; EP1351972A1; WO2002048380A2; EP1351972B1; HK1057048A1; CA2431896A1; AU2212802A; ATE318834T1; DE60117465D1; RU2290409C2; JP2004520301A; AU2002222128B2; RU2003120455A; JP2004522722A; CA2364392A1; CN1489597A; CN100482676C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung.
Ein Aspekt von Gentherapie umfaßt das Einführen fremder Nukleinsäure (wie beispielsweise DNA) in Zellen, so daß deren exprimiertes Protein eine gewünschte therapeutische Funktion ausüben kann.
Beispiele für diese Art von Therapie umfassen das Einsetzen von TK-, TSG- oder ILG-Genen zur Behandlung von Krebs, das Einsetzen des CFTR-Gens zur Behandlung von zystischer Fibrose, das Einsetzen von NGF-, TH- oder LDL-Genen zur Behandlung von neurodegenerativen und kardiovaskulären Störungen, das Einsetzen des Gens für den IL-1-Antagonisten zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, das Einsetzen von HIV-Antigenen und des TK-Gens zur Behandlung von AIDS und CMV-Infektionen, das Einsetzen von Antigenen und Zytokinen, die als Impfstoffe wirken sollen, und das Einsetzen von β-Globuin zur Behandlung von hämoglobinopathischen Zuständen, wie beispielsweise Thalassämien.
Viele derzeitige Gentherapiestudien verwenden Adenovirus-Genvektoren, wie z. B. Ad3 oder Ad5, oder andere Genvektoren. Jedoch sind mit deren Verwendung schwerwiegende Probleme verbunden. Dies gab Anlaß zur Entwicklung weniger gefährlicher, nicht-viraler Ansätze für einen Gentransfer.
Ein nicht-virales Transfersystem mit großem Potential bezieht die Verwendung kationischer Liposome ein. In dieser Hinsicht wurden kationische Liposome – welche üblicherweise aus einem neutralen Phospholipid und einem kationischen Lipid bestehen – für die Übertragung von DNA, mRNA, Antisense-Oligonukleotiden, Proteinen und Arzneimitteln in Zellen verwendet. Es sind zahlreiche kationische Liposome kommerziell erhältlich, und viele neue kationische Lipide wurden in jüngster Zeit synthetisiert. Die Wirksamkeit dieser Liposome wurde sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt.
Ein Zytofektin, das für die Herstellung eines kationischen Liposoms geeignet ist, ist N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylamoniumchlorid, auch bekannt als „DOTMA".
Eines der am häufigsten verwendeten kationischen Liposomensysteme besteht aus einem Gemisch aus einem neutralen Phospholipid, Dioleoylphosphatidylethanolamin (allgemein bekannt als „DOPE"), und einem kationischen Lipid, 3β-[(N,N-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol (allgemein bekannt als „DC-Chol").
Trotz der Wirksamkeit der bekannten kationischen Liposome besteht nach wie vor ein Bedarf danach, die Gentransfereffizienz von kationischen Liposomen in der Gentherapie am Menschen zu optimieren. Mit dem nahenden Abschluß des humanen Genomprojekts wird zunehmend erwartet, daß die Verwendung von Genen für therapeutische Zwecke, was als Gentherapie beschrieben wird, die Medizin revolutioniert. In diesem Zusammenhang wird die nicht-virale Auslieferung, obwohl sie nach wie vor weniger effektiv ist als die virale Technologie, von der Wissenschaftsgemeinde zunehmend als die sicherste Option für Anwendungen am Menschen anerkannt.
Dieses Gebiet hat sich im letzten Jahrzehnt mit dem Inerscheinungtreten komplexer makromolekularer Konstrukte, einschließlich vieler Elemente verschiedener existierender Technologien (virale Proteine oder Peptide, Liposome, Polymere, Zielsteuerungsstrategien und Tarneigenschaften) beträchtlich entwickelt.
Unsere parallel anhängige Anmeldung PCT/GB00/04767 lehrt ein System auf der Grundlage eines Triplex, zusammengesetzt aus einem viralen Kernpeptid Mu, Plasmid-DNA und kationischem Liposom (LMD). Diese Ausgangstechnologie lieferte uns guten Erfolg in vitro und vielversprechende Ergebnisse in vivo. Aber wie für die gesamte existierende nicht-virale Technologie ist mehr Entwicklung erforderlich, um ein therapeutisches Niveau in vivo zu erreichen.
Zu diesem Zweck muß eine Formulierung Stabilität des Teilchens in biologischen Fluiden (Serum, Lungenschleim) erreichen und nach wie vor effiziente Transfektionsfähigkeiten beibehalten.
Dieses Erfordernis ist eine der Haupthürden der gesamten existierenden Technologie. Derzeitige stabile Formulierungen erreichen geringe Transfektion, und die meisten vorhandenen effizienten Transfektionsmittel sind in dem Ausmaß ihrer Anwendung aufgrund dieser Instabilität drastisch beschränkt.
Nach einer Verabereichung (in Blut für eine systemische Anwendung oder in Schleim für eine topische Verabreichung in der Lunge) werden die geladenen Komplexe Salz und biologischen Makromolekülen ausgesetzt, was zu starker kolloidaler Aggregation und Adsoprtion von biologisch aktiven Elementen (Opsoninen) an deren Oberfläche führt. Die Genvehikel werden drastischen Veränderungen unterworfen, welche Präzipitation, Bindung von Proteinen, die zu Teil cheneliminierung durch Makrophagen führt, und Oberflächenstörung, die zu ihrer Zerstörung führt, umfassen könnten.
Mit dem Ziel, Arzneimittel- und Genauslieferungssysteme für das zellspezifische Anzielen in vitro und in vivo zu erzeugen, sind Protokolle für die Herstellung von in biologischem Fluid stabilen Auslieferungssystemen mit ausreichender Aktivität zur Ausübung therapeutischer Vorteile erforderlich. Daher muß ein Gleichgewicht zwischen Stabilität und Aktivität für ein effizientes Arzneimittel-/Genauslieferungsvehikel gefunden werden.
Unsere parallel anhängige Anmeldung PCT/GB00/04767 lehrt ein System auf der Grundlage eines modifizierten Lipids, bei dem das Lipid einen Kohlenhydratrest trägt. Von diesen modifizierten Lipiden wurde gefunden, daß sie stabil sind und geringe Toxizität aufweisen. Solche Systeme erfordern die Anknüpfung eines zusätzlichen Restes an das Lipid, um die Bereitstellung eines modifizierten Lipids, welches stabil ist und geringe Toxizität aufweist, zu unterstützen. Es besteht ein Bedarf auf dem Gebiet, Lipide bereitzustellen, die Gruppen aufweisen, an welche zusätzliche Reste einfach angebunden werden können. Es wurden auch modifizierte Lipide, die ein über einen Linker oder einen Abstandshalterarm an eine Aminokopfgruppe angebundenes Lipid umfassen, in Human Gene Therapy 7:1701–1717 (1996), US-A-5283185 und WO-A-97145442 offenbart.
Die WO-A-98/28317 hat die Verwendung von Oxim-Linkern zu Anbindung eines breiten Bereiches von Gruppen aneinander vorgeschlagen, und die Verwendung von Oxim-Linkern mit Lipiden wurde in J. Medicinal Chemistry, 17:396–403 (1974) und J. Heterocycl. Chem. 16:1459–1463 (1979) offenbart.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme des Standes der Technik.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung einer Verbindung mit der Formel
welches die Umsetzung

(i) einer Verbindung der Formel
und
(ii) einer Verbindung der Formel
unter Beimengung von oder in Assoziierung mit einer Nukleotidsequenz oder eines pharmazeutisch aktiven Stoffes umfaßt, worin B ein Lipid und A ein interessierender Rest (MOI) ist, worin X eine optionale Linker-Gruppe ist, worin R₁ H oder eine Kohlenwasserstoffgruppe ist und worin R₂ ein einzelnes Elektronenpaar oder R₄ ist, wobei R₄ ein geeigneter Substituent ist.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt,

die (i) eine Verbindung der Formel
(ii) eine Verbindung der Formel
und
(iii) eine Nukleotidsequenz oder einen pharmazeutisch aktiven Stoff umfaßt, worin B ein Lipid ist und A ein interessierender Rest (MOI) ist, worin X eine optionale Linker-Gruppe ist, worin R₁ H oder eine Kohlenwasserstoffgruppe ist und worin R₂ ein einzelnes Elektronenpaar oder ein geeigneter Substituent ist.

Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in der Therapie verwendet werden.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines Zustands oder einer Krankheit verwendet werden.
Ein Liposom kann aus einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gebildet werden.
Ein Verfahren zur Herstellung solch eines Liposoms umfaßt die Bildung des Liposoms aus einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
Solch ein Liposom kann in der Therapie eingesetzt werden.
Solch ein Liposom kann bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines Zustands oder einer Krankheit verwendet werden.
Es kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt, hergestellt werden, die im Gemisch mit einem Arzneimittel und optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel vorliegt.
Es kann eine pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt werden, die ein Liposom umfaßt, wie es oben beschrieben ist, und im Gemisch mit einem Arzneimittel und optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel vorliegt.
Einige weitere Aspekte der Erfindung sind in den anhängigen Patentansprüchen definiert.
Wir haben die Bereitstellung eines Lipides gefunden, das eine Aminoxygruppe aufweist, die eine einfache Anbindung weiterer Reste an das Lipid über die Aminoxygruppe erlaubt. Wenn man sie mit einem Rest (MOI) umsetzt, der eine Aldehyd- oder Ketongruppe aufweist, wird eine Verbindung bereitgestellt, in welcher der MOI und das Lipid über eine Amidgruppe verknüpft sind. Solch eine Verknüpfung kann einfach in einer „Eintopf-" Reaktion hergestellt werden. Dieses Verfahren vermeidet ausgiebige Reinigungsverfahren durch einfache Dialyse von überschüssigen, nicht umgesetzten Reagenzien.
Das nach dem Überziehen durchgeführte Eintopf-Verfahren der vorliegenden Erfindung beruht auf selektiver und hoher Reaktivität des Aminoxy-Linkers, der mit Aldehyden und Ketonen unter Bildung von -C=N- (nach Art von Schiff'scher Base) kovalenten Verknüpfungen reagiert. Wichtig ist, daß die Reaktion in wäßrigem Milieu bei basischem oder saurem pH-Wert durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kommt es nicht zu partiellem Abbau der reaktiven Gruppe, wenn sie wäßrigen Bedingungen ausgesetzt wird, wie es für NHS-aktivierte Carboxyle und andere Ester der Fall ist. Daher erlaubt die Stabilität der reaktiven Spezies, z. B. des Aldehyds/Ketons und der Aminoxygruppe, eine vollständige Kontrolle der Oberflächenreaktion ohne Verlust von reaktiven Spezies aufgrund von Hydrolyse/Abbau.
BEVORZUGTE ASPEKTE
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung hat die Formel
worin B ein Lipid ist und worin R₂ H oder eine Hydrocarbylgruppe ist.
Der Begriff „Hydrocarbylgruppe", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Gruppe, die wenigstens C und H umfaßt, und sie kann optional einen oder mehrere andere geeignete Substituenten enthalten. Beispiele für solche Substituenten können Halogen, Alkoxy, Nitro, eine Alkylgruppe, eine zyklische Gruppe etc. umfassen. Zusätzlich zu der Möglichkeit, daß die Substituenten eine zyklische Gruppe sind, kann eine Kombination von Substituenten eine zyklische Gruppe bilden. Wenn die Hydrocarbylgruppe mehr als ein C enthält, dann müssen diese Kohlenstoffatome nicht notwendigerweise miteinander verknüpft sein. Z. B. können wenigstens zwei der Kohlenstoffatome über ein geeignetes Element oder eine geeignete Gruppe verknüpft sein. Somit kann die Hydrocarbylgruppe Heteroatome enthalten. Geeignete Heteroatome werden dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein und umfassen beispielsweise Schwefel, Stickstoff und Sauerstoff. Ein nicht beschränkendes Beispiel für eine Hydrocarbylgruppe ist eine Acylgruppe.
Eine typische Hydrocarbylgruppe ist eine Kohlenwasserstoffgruppe. Hierin bedeutet der Begriff „Kohlenwasserstoff" irgendeines unter einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Alkinylgruppe, wobei die Gruppen linear, verzweigt oder zyklisch sein können, oder einer Arylgruppe. Der Begriff „Kohlenwasserstoff" umfaßt auch solche Gruppen, die darin optional substituiert sind. Wenn der Kohlenwasserstoff eine verzweigte Struktur mit Substituenten) daran ist, dann kann die Substitution entweder an dem Kohlenwasserstoffgrundgerüst oder an der Verzweigung vorliegen; alternativ können die Substitutionen an dem Kohlenwasserstoffgrundgerüst und an der Verzweigung vorliegen.
Vorzugsweise wird die Reaktion der vorliegenden Erfindung in einem wäßrigen Medium durchgeführt.
OPTIONALER LINKER X
In einem bevorzugten Aspekt ist ein optionaler Linker X vorhanden.
In einem bevorzugten Aspekt ist X eine Hydrocarbylgruppe.
In einem bevorzugten Aspekt umfaßt der Linker X eine Polyamingruppe oder ist mit dem Lipid über eine Polyamingruppe verknüpft.
Es wird angenommen, daß die Polyamingruppe vorteilhaft ist, weil sie die DNA-Bindungsfähigkeit und die Effizienz von Gentransfer des resultierenden Liposoms erhöht.
Eine Ausführungsform ist die Polyamingruppe, vorzugsweise ein nicht natürlich vorkommendes Polyamin. Es wird angenommen, daß die Polyamin-Kopfgruppe vorteilhaft ist, weil die erhöhte Aminofunktionalität die positive Gesamtladung des Liposoms erhöht. Darüber hinaus sind Polyamine dafür bekannt, daß sie DNA sowohl stark binden als auch stabilisieren. Darüber hinaus kommen Polyamine natürlich in Zellen vor, und daher wird angenommen, daß toxikologische Probleme minimiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform sind vorzugsweise zwei oder mehr der Amingruppen der Polyamingruppe der vorliegenden Erfindung durch eine oder mehrere Gruppen, die man in der Natur nicht findet, voneinander getrennt, welche Amingruppen von natürlich vorkommenden Polyaminverbindungen trennen (d.h. vorzugsweise hat die Polyamingruppe der vorliegenden Erfindung eine nicht natürliche Beabstandung).
Vorzugsweise enthält die Polyamingruppe wenigstens zwei Amine der Polyamingruppe, die voneinander durch eine Ethylen-(-CH₂CH₂-) Gruppe voneinander getrennt (voneinander beabstandet) sind.
Vorzugsweise sind alle Amine der Polyamingruppe durch eine Ethylen-(-CH₂CH₂-) Gruppe voneinander getrennt (voneinander beabstandet).
Typische Beispiele für geeignete Polyamine umfassen Spermidin, Spermin, Caldopentamin, Norspermidin und Norspermin. Vorzugsweise ist das Polyamin Spermidin oder Spermin, da diese Polyamine dafür bekannt sind, daß sie mit einzelstrangiger oder doppelstrangiger DNA wechselwirken. Ein alternatives bevorzugtes Polyamin ist Caldopentamin.
R₁
In einem bevorzugten Aspekt ist R₁ H.
C=N
Die C=N-Bindung kann säurelabil oder säurebeständig sein.
In einem Aspekt ist die C=N-Bindung säurelabil.
In einem Aspekt ist die C=N-Bindung säurebeständig.
MOI
Der interessierende Rest (MOI) kann jeder Rest sein, den man an ein Lipid anbinden möchte.
Der MOI kann ein Kohlenhydratrest sein.
In einem bevorzugten Aspekt ist der Kohlenhydratrest ein Monosaccharid
In einem bevorzugten Aspekt ist der Kohlenhydratrest ein Zuckerrest.
Vorzugsweise ist der Kohlenhydratrest ausgewählt unter Mannose, Glucose (D-Glucose), Galactose, Glucuronsäure, Lactose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltoheptaose und Gemischen davon. Besonders bevorzugt ist der Kohlenhydratrest D-Glucose.
In einem Aspekt umfaßt die Verbindung der vorliegenden Erfindung 1 bis 7 Kohlenhydratreste. Vorzugsweise umfaßt die Verbindung einen Kohlenhydratrest.
LIPID
In einem bevorzugten Aspekt ist oder umfaßt das Lipid eine Cholesteringruppe oder ein Glycerin/Ceramid-Grundgerüst. Jede lipidartige Struktur oder jedes Polyamin ist geeignet.
Vorzugsweise ist die Cholesteringruppe Cholesterin.
Vorzugsweise ist die Cholesteringruppe über eine Carbamoylverknüpfung mit X verknüpft.
Die Cholesteringruppe kann Cholesterin oder ein Derivat davon sein. Beispiele für Cholesterinderivate umfassen substituierte Derivate, in denen eine oder mehrere der zyklischen CH₂- oder CH-Gruppen und/oder eine oder mehrere der geradkettigen CH₂- oder CH-Gruppen in geeigneter Weise substituiert ist/sind. Alternativ oder zusätzlich kann/können eine oder mehrere der zyklischen Gruppen und/oder eine oder mehrere der geradkettigen Gruppen ungesättigt sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Cholesteringruppe Cholesterin. Es wird angenommen, daß Cholesterin vorteilhaft ist, da es die resultierende liposomale Doppelschicht stabilisiert.
Vorzugsweise ist die Cholesteringruppe über eine Carbamoylverknüpfung mit der optionalen Linker-Gruppe verknüpft. Es wird angenommen, daß diese Verknüpfung vorteilhaft ist, da das resultierende Liposom eine geringe oder minimale Zytotoxizität besitzt.
Weitere Aspekte
Vorzugsweise ist R₂ H oder eine Hydrocarbylgruppe.
In einem bevorzugten Aspekt enthält die R₂-Hydrocarbylgruppe optional Heteroatome; die unter O, N und Halogenen ausgewählt sind.
In einem bevorzugten Aspekt ist R₂ H.
Vorzugsweise findet das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einem wäßrigen Medium oder in einem vollständig wäßrigen Medium statt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Verbindung bereit, die nach einem hierin definierten Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, eine Verbindung, die nach einem hierin definierten Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, und/oder eine Verbindung, die nach einem hierin definierten Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.
Vorzugsweise liegt die Verbindung im Gemisch mit oder assoziiert mit einer Nukleotidsequenz vor.
Die Nukleotidsequenz kann ein Teil oder die Gesamtheit eines Expressionssystems sein, das in der Therapie, wie beispielsweise Gentherapie, geeignet ist.
In einem bevorzugten Aspekt liegt die Verbindung der vorliegenden Erfindung im Gemisch mit einem kondensierten Polypeptid/Nukleinsäurekomplex vor, um einen nicht-viralen Nukleinsäureauslieferungsvektor bereitzustellen. Der kondensierte Polypeptid/Nukleinsäurekomplex umfaßt vorzugsweise solche, die in unserer parallel anhängigen Anmeldung PCT/GB00/04767 offenbart sind. Vorzugsweise sind die Polypeptide oder die Derivate davon in der Lage, den Nukleinsäurekomplex zu binden. Vorzugsweise sind die Polypeptide oder die Derivate davon in der Lage, den Nukleinsäurekomplex zu kondensieren. Vorzugsweise ist der Nukleinsäurekomplex heterolog zu den Polypeptiden oder den Derivaten davon.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren die Verwendung eines Molekularsiebs.
Vorzugsweise wird das kationische Liposom aus der Verbindung der vorliegenden Erfindung und einem neutralen Phospholipid, wie beispielsweise DOTMA oder DOPE, gebildet. Vorzugsweise ist das neutrale Phospholipid DOPE.
Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft ausführlicher beschrieben und nur unter Bezugnahme auf die anhängenden Figuren, in denen folgendes gezeigt ist:
1 – Schema 1, Synthese von Hydroxylamin-Lipid 11. Reagenzien: (a) CH₂Cl₂, Et₃N, Boc₂O, RT, 5 h, 98 %; (b) EtOAc, N-Hydroxysuccinimid (1 Äq.), DCC (1 Äq.), 10 h, RT; (c) (8) EtOAc/THF [95/5], Et₃N (pH = 8), 2 h, RT, 90 %; (d) CH₂Cl₂, TFA (15 Äq.), 0 °C, N₂, 5 h, 86 %.
2 – Prinzip der chemoselektiven Glycosylierung von O-substituiertem Hydroxylamin mit D-Glucose (obwohl das β-Anomer gezeigt ist, findet eine Mutarotation statt und das α-Anomer wird ebenfalls produziert).
3 – Mögliche Strukturen von aus Mannose erhaltenem Neoglycolipid.
4 – Ergebnis der Analyse der Unterschiede der Lipoplexgrößen durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS). Die Größe wurde nach 30 Minuten für Lipoplexe bei [DNA] = i μg/ml in OptiMem +/– 10 % FCS, 37 °C, gemessen. Der Vergleich von Standard-LMD-Formulierung (LMD) und LMD, modifiziert durch Hinzufügung von 7,5 Mol-% Produkt 12 h und 12 i, wurde in OptiMem (weiß) und 10 % Serum (schwarz) durchgeführt und als Prozentsatz der Größenzunahme gegenüber der ursprünglich gemessenen Größe von 180 nm ausgedrückt.
5 – Ein Vergleich zwischen den Transfektionseffizienzen von basischem LMD und LMD, das mit 7,5 Mol-% Produkt 12 h und 12 i glycomodifiziert war, auf HeLa-Zellen in 0 % (weiß), 50 % (schwarz und weiß) und 100 % (schwarz) Serumbedingungen. Die Ergenisse sind als relativ leichte Einheiten pro mg Protein ausgedrückt (n = 4).
6 – Eine Struktur eines Aminoxylipides.
Die folgenden Bespiele beschreiben die Synthese der Verbindungen (i) und (ii) in der Abwesenheit einer Nukleotidsequenz oder eines pharmazeutisch aktiven Mittels, wie es gemäß den vorliegenden Patentansprüchen erforderlich ist.
BEISPIELE
Experimenteller Abschnitt
Synthese von Neoglycolipiden
Allgemeines: ¹H-NMR-Spektren wurden bei Umgebungstemperatur auf entweder Brucker DRX400, DRX300 oder Jeol GX-270Q-Spektrometern mit restlichem nicht isotopenmarkiertem Lösungsmittel (z. B. CHCl₃, δ_H = 7,26) als einen internen Bezug aufgezeichnet. ¹³C-NMR-Spektren wurden auf dem gleichen Bereich von Spektrometern bei 100, 75 bzw. 68,5 MHz entsprechend mit restlichem nicht isotopenmarkiertem Lösungsmittel (z. B. CHCl₃, δ_C = 77,2) als einen internen Bezug aufgezeichnet. Infrarotspektren wurden auf einem Jasco FT/IR 620 unter Verwendung von NaCl-Platten aufgezeichnet, und Massenspektren (Positivionenelektrospray) wurden unter Verwendung von VG-7070B- oder JEOL SX-102-Instrumenten aufgezeichnet. Chromatographie bezieht sich auf Flash-Säulenchromatographie, welche durchgehend an Merck-Kieselgel 60 (Maschenzahl 230–400) mit geeignetem Lösungsmittel durchgeführt wurde. Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde an mit Merck-Kieselgel 60 F254 Aluminiumgestützen Platten durchgeführt und mit Ultraviolettlicht, Jod, saurem Ammoniummolybdat (IV), saurem ethanolischem Vanilin oder anderen Mitteln, wie es geeignet war, entwickelt. Die Reinheit von Neoglycolipiden wurde unter Verwendung von analytischer Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) auf einem Hitachi-System unter Verwendung einer endgruppengeschützten Säule Purospher^® RP-18 (5 μm) untersucht. Elution wurde mit einer isokratischen Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min mit CH₃CN/H₂O (60:40) durchgeführt, und Fraktionen wurden bei einer Wellenlänge von 205 nm vor dem Sammeln und der Massenanalyse detektiert. Getrocknetes CH₂Cl₂ wurde vor der Verwendung mit Phosphorpentoxid destilliert. Alle anderen trockenen Lösungsmittel und Chemikalien wurden von der Sigma-Aldrich Company LTD (Poole, Dorset, UK) bezogen.
Abkürzungen: Boc: tert-Butoxycarbonyl; br: breit; Chol: Cholesteryl; DMF: N,N-Dimethylformamid; DMSO: Dimethylsulfoxid; TFA: Trifluoressigsäure; THF: Tetrahydrofuran.
2-(Cholesteryloxycarbonyl)-aminoethanol (2): Eine Lösung von Cholesterylchloroformat (99,89 g, 0,218 mol) in CH₂Cl₂ ( 600 ml) wurde zu einer gerührten Lösung von 2-Aminoethanol (29,5 ml, 0,489 mol, 2,2 Äquiv.) in CH₂Cl₂ (450 ml) bei 0 °C über einen Zeitraum von 2 Stunden hinzugefügt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und das Rühren über weitere 14 Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (2·200 ml), Wasser (2·200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der erhaltene Feststoff wurde umkristallisiert (CH₂Cl₂/MeOH) unter Erhalt von 2 als ein weißer Feststoff. Ausbeute: 99,67 g (97 %), Smp.: 180 °C; R_f = 0,26 (Aceton, Ether 1:9); IR (CH₂Cl₂): v_max = 3353, 2942, 2870, 1693, 1674, 1562, 1467, 1382, 1264 cm^–1; ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 5,35 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H6'), 5,25–5,29 (m, 1H, NH), 4,42-4,57 (1H, m, H3'), 3,70-3,62 (m, 2H, H1), 3,25-3,35 (m, 2H, H2), 3,12 (s, 1H, OH), 2,28-2,38 (m, 2H, H4'), 1,77-2,03 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,59-0,96 (m, 21H, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 1 (3H, s, H-19'), 0,9 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,87 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,67 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 496 [M+Na]⁺, 474 [M+H]⁺ 369 [Chol]⁺, 255, 175, 145, 105, 95, 81, 43.
2-I(Cholesteryloxycarbonyl)-amino]-ethylmethansulfonat (3): Zu einer Lösung von 2 (25 g, 52,3 mmol) und Triethylamin (22 ml, 016 mol, 3 Äquiv.) in CH₂Cl₂ (500 ml) bei 0 °C wurde tropfenweise eine Lösung von Methansulfonylchlorid (10,5 ml, 0,13 mol, 2,5 Äquiv.) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur erwärmen gelassen und für 1 h 30 min gerührt. Nachdem die Tlc-Analyse ergeben hatte, daß die Reaktion abgeschlossen war, wurde Eis zugegeben, um die Reaktion zu dämpfen. Das Reaktionsgemisch wurde zu gesättigtem, wäßrigem NH₄Cl (600 ml) hinzugegeben und mit Ether (3·300 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser (2·300 ml), Sole (250 ml) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, um einen weißen Feststoff zu erhalten, der bei Reinigung durch Chromatographie (Ether) 3 ergab. Ausbeute: 28,3 g (98 %); IR (CH₂Cl₂): v_max = 3453, 3342, 1716, 1531, 1377, 1137 & 798 cm^–1 H NMR (270 MHz, CDCl l₃): δ = 5,34 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H6'), 5-5,1 (m, 1H, NH), 4,41-4,53 (1H, m, H3'), 4,29-4,25 (t, J = 5 Hz, 2H, H1), 3,47-3,52 (m, 2H, H2), 3,01 (s, 3H, H3), 2,24-2,36 (m, 2H, H4'), 1,74-2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,9-1,6 (m, 21H, H1', H9', H11', H14'-H17', H22'-H25'), 0,98 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27) und 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 1104 [2M+H]⁺, 574 [M+Na]⁺, 552 [M+H]⁺, 369 [Chol]⁺, 255, 175, 145, 95, 81.
4-Aza-N⁶-(cholesteryloxycarbonylamino)-hexanol (4): Zu einer gerührten Lösung von 3 (28,3 g, 51 mmol), das in einer Mindestmenge von THF gelöst war, wurde Aminopropanol (160 ml, 2 mol, 39 Äquiv.) hinzugegeben. Sobald Tlc den Reaktionsabschluß (12 h) anzeigte, wurden CHCl₃ (350 ml) und K₂CO₃ (20 g) hinzugegeben, und die Lösung wurde 30 min lang kräftig gerührt. Die Suspension wurde dann durch eine dünne Schicht Celite^® gefiltert und gründlich mit CHCl₃ gewaschen. Diese wurde mit einer gesättigten Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen und getrocknet (Na₂CO₃). Das Lösungsmittel wurde entzogen, um 4 als weißen Feststoff zu erhalten. Ausbeute: 26,1 g (96 %); IR (CH₂Cl₂): v_max = 3350-3210, 2937, 2850, 1531, 1460, 1380,0 1220, 1120,0 1040 cm^–1; ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 5,33-5,35 (m, 1H, H6'), 4,92-4,96 (m, 1H, NH), 4,42-4,51 (1H, m, H3'), 3,7-3,83 (m, 2H, H5), 3,23-3,29 (m, 2H, H1), 273-2,57 (m, 6H, H2, H3, H4), 2,2-2,36 (m, 2H, H4'), 1,7-2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,85-1,58, (m, 21H, H1', H9', H11', H12', H14'-H17, H22'-H-25'), 0,98 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,8 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,61 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 543 [M+Na]⁺, 530 [M+H]⁺, 485 [M-CO₂]⁺, 369 [Chol]⁺, 144 [M-Ochol]⁺, 69, 55.
4-Aza-(Boc)-N⁶-(cholesteryloxycarbonylamino)-hexanol (5): Zu einer Lösung von 4 (26,1 g, 49 mmol), wurden Et₃N (8,3 ml, 1,1 Äquiv.) und Boc₂O (10,7 g, 1 Äquiv.) in CH₂Cl₂ (200 ml) hinzugegeben und die daraus resultierende Lösung durch TLC überwacht. Bei Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in NHaCl (100 ml) gegossen, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde in vacuo entzogen, um den weißen Feststoff 5 zu erhalten. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entzogen, um einen weißen Feststoff zu erhalten, der bei Reinigung durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92:7:1) 3 ergab. Ausbeute (27,9 g, 90 %); IR (CH₂Cl₂): v_max = 3352, 3054, 2937, 1675, 1530, 1455, 1380, 1220, 1120; ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 5,33-5,35 (m, 1H, H6'), 4,86 (m, 1H, NH), 4,42-4,5 (1H, m, H3'), 3,62-3,7 (m, 2H, H5), 3,27-3,38 (m, 6H, H1, H2, H3), 2,18-2,33 (m, 2H, H4'), 1,73-2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,45 (s, 9H, Boc), 1-1,65 (m, 23H, H4, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,97 (3H, s, H-19'), 0,93 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,8 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 654 (M+Na]⁺, 543 [M-Boc]⁺, 369 [Chol]⁺, 145, 121, 95, 69, 57.
4-Aza-(Boc)-N⁶-(cholesteryloxycarbonylamino)-hexylmethansulfonat (6): Dieses Experiment wurde in ähnlicher Weise durchgeführt, wie die Zubereitung des 2-[(Cholesteryloxycarbonyl)-amino]-ethylmethansulfonat 3, in einem Maßstab von 44 mmol unter Erhalt von 6. Ausbeute (28 g, 90 %); IR (CH₂Cl₂): v_max = 3305, 2980,0 2900, 2865, 1675, 1530, 1455, 1350, 1150; ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 5,33-5,35 (m, 1H, H6'), 4,86 (m, 1H, NH), 4,35-4,55 (m, 1H, H3'), 4,22 (t, 2H, J = 6,5 Hz, H5), 3,2-3,4 (m, 6H, H1, H2, H3), 3,01 (s, 3h, H6), 2,15-2,33 (m, 2H, H4'), 1,73-2 (m, 5H, H2', H7',H8'), 1,44 (s, 9H, Boc), 1-1,67 (m, 23H, H4, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,97 (3H, s, H-19'), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,8 (d, J = 6,5 Hz, 6 Hz, 6 H26' & H27') und 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 722 [M+Na]⁺, 609 [H-Boc]⁺, 369 [Chol]⁺, 145, 121, 95, 69, 55.
4-Aza-(Boc)-N⁶-(cholesteryloxycarbonylamino)-hexanamin (7): Zu 6 (25 g, 35 mmol), Natriumazid (11,49, 175,7 mmol, 5 Äquiv) und Natriumiodid (5 g, 35 mmol, 1 Äquiv) wurde unter Stickstoff wasserfreies DMF (200 ml) unter Rühren hinzugegeben. Ausgestattet mit einem Rückflußkühler resultierte das Erwärmen bei 80 °C für 2 h im Abschluß der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, das DMF wurde unter vermindertem Druck entzogen und der Rückstand in EtOAc aufgelöst. Dieser wurde mit Wasser (2·100 ml) und Sole (100 ml) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), um nach der Reinigung durch Chromatographie (Hexan/Ether 1:1) 7 als weißen Feststoff zu erhalten. Ausbeute (22 g, 95 %); ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 5,34-5,36 (m, 1H, H6'), 4,35-4,55 (m, 1H, H3'), 4,25 (t, 2H, J = 6,5 Hz, H5), 3,2-3,5 (m, 6H, H1, H2, H3), 2,25-2,33 (m, 2H, H4'), 1,7-2,05 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,45 (s, 9H, Boc), 1-1,72 (m, 23H, H4, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,98 (3H, s, H-19'), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,64 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 568 [M+Na-Boc]⁺, 556 [M-Boc]⁺, 3,69 [Chol]⁺, 145, 121, 95, 69, 57.
4-Aza-(Boc)-N⁶-(cholesteryloxycarbonylamino)-hexylamin (8): Zu einem Rundkolben, der mit 7 (22,75 g, 34,6 mmol) in THF (230 ml) gefüllt war, wurde Trimethylphosphin in THF (1 M, 40 ml, 1,15 Äquiv.) hinzugegeben und die Reaktion wurde durch TLC überwacht. Nach Abschluß wurde die Reaktion 1 h fang mit Wasser (3 ml) und wäßrigem Ammoniak (3 ml) gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entzogen. Nach der Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92:7:1 bis 75:22:3) wurde 8 als weißer Kristall erhalten. Ausbeute (19,1 g, 88 %); IR (CH₂Cl₂): v_max = 3689, 3456, 3155, 2948, 2907, 2869, 2253, 1793, 1709, 1512, 1468, 1381, 1168; ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃); δ = 5,32-5,35 (m, 1H, H6'), 4,35-4,51 (m,1H, H3'), 3,45-3,05 (m, 8H, H1, H2, H3 H5), 2,18-2,4 (m, 2H, H4'), 1,8-2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,46 (s, 9H, Bloc), 1,01-1,72 (m, 23H, H4, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,97 (3H, s, H-19'), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,64 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 630 [M+H]⁺, 530 [M-Boc]⁺, 369 [Chol]⁺, 145, 121, 95, 57.
(Boc)-aminooxy-essigsäure (9) : O-(Carboxymethyl)-hydroxylamin-Hemihydrochlorid (1,16 g, 5,3 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (40 ml) gelöst und der pH-Wert durch Hinzufügen von Triethylamin (3 ml) auf 9 eingestellt. Dann wurde Di-tert-butyldicarbonat (2,36 g, 10,6 mmol, 2,0 Äquiv.) zugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis TLC den Abschluß der Reaktion anzeigte. Der pH-Wert wurde durch Hinzufügen von verdünntem HCl auf 3 verringert. Das Reaktionsgemisch wurde in gesättigtes wäßriges NH₄Cl (20 ml) und CH₂Cl₂ (30 ml) aufgeteilt. Die wäßrige Phase wurde mit CH₂Cl₂ (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H₂O (2 × 100 ml) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde in vacuo entzogen, um 9 als weißen Feststoff hervorzubringen. Ausbeute (1,86 g, 97 %); IR (CH₂Cl₂): v_max = 3373, 2983, 2574, 2461, 1724, 1413, 1369, 1235; ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 4,48 (s, 2H, CH₂), 1,48 (s, 9H, Boc); MS (FAB⁺): m/z = 214 [M+Na]⁺, 192 [M+H]⁺, 135, 123, 109, 69.
(Boc)-aminoxy-Verbindung (10): N-Hydroxysuccinimid (0,36 g, 3,13 mmol, 1 Äquiv.), 9 (0,6 g, 3,13 mmol, 1 Äquiv.) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (0,68 g, 3,13 mmol, 1 Äquiv.) wurden in EtOAc (90 ml) gelöst, und das heterogene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann durch eine Schicht Celite^® gefiltert, um den Dicylcohexylharnstoff zu entziehen, der als ein weißes Präzipitat (ausgespült mit 60 ml EtOAc) ausgebildet war und zu einer Lösung von 8 (1,97 g, 3,13 mmol, 1 Äquiv. ) in THF (10 ml) hinzugegeben. Ein pH-Wert von 8 wurde für diese heterogene Reaktion durch Hinzufügen von Triethylamin (6 ml) aufrechterhalten. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluß wurde das Gemisch gefiltert, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entzogen, um nach der Reinigung durch Flash-Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92:7:1) 10 als weißen Feststoff zu erhalten. Ausbeute (2,3 g, 90 %); ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 5,33-5,35 (m, 1H, H6'), 4,4-4,52 (m, 1H, H3'), 4,3 (s, 2H, H90, 3,2-3,42 (m, 8H, H1, H2, H4, H6), 2,23-2,35 (m, 2H, H4'), 1,7-2,1 (m, 7H, H2', H7', H8', H5), 1,44-1,46 (m, 18H, 2 Bloc), 1-1,73 (m, 21H, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,98 (3H, s, H-19'), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 803 [M+H]⁺, 703 [M-Boc]⁺, 647, 603 [M-2Boc]⁺, 369, 279, 255, 204, 145, 95, 69.
Hydroxylamin (11): Zu einer Lösung von 10 (1,1 g, 1,36 mmol, 1 Äquiv) in CH₂Cl₂ (10 ml) wurde TFA (2 ml, 20,4 mmol, 15 Äquiv) bei 0 °C hinzugegeben. Diese Lösung wurde über Nacht 5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluß wurde Toluol zu azeotroper TFA aus dem Reaktionsgemisch hinzugegeben. Die Lösungsmittel wurden in vacuo entzogen, um nach der Reinigung durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92:7:1 zu 75:22:3) 11 als weißen Feststoff hervorzubringen. (709 mg, Ausbeute: 86 %); IR (CHCl₃): vmax = 3306, 2948, 2850,0 2246, 1698, 1647, 1541, 1467, 1253, 1133; ¹H NMR (270 MHz, CDCl₃): δ = 5,26-5,4 (m, 1H, H6'), 4,4-4,52 (m, 1H, H3'), 412 (s, 2H, H9), 3,34-3,41 (m, 2H, H2), 3,15-3,3 (m, 2H, H4), 2,6-2,74 (m, 4H, H1 & H6), 2,14-2,39 (m, 2H, H4'), 1,62-2,1 (m, 7H, H2', H7', H8', H5), 1,02-1,6 (m, 21H, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,96 (3H, s, H-19'), 0,86 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,66 (s, 3H, H18'); MS (FAB⁺): m/z = 603 [M+H]⁺, 396 [Chol]⁺, 160, 137, 109, 95, 81, 69, 55.
Mannosyl-Verbindung (12a): Eine Lösung von D-Mannose (266 mg, 4,8 mmol) in einem essigsauren, wäßrigen Puffer (Natriumacetat/Essigsäure 0,1 M, pH-Wert 4,7 ml) und eine Lösung von 11 (290 mg, 0,48 mmol, 10 Äquiv.) in DMF (7 ml) wurden gemischt und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo durch Gefriertrocknen und Chro matographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) entzogen, um das Produkt 21 als weißen Feststoff (233 mg, Ausbeute 65 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner durch HPLC bestätigt. Das Endprodukt umfaßte die β-Pyranose (82 %)-Form und die α-Pyranose (18 %)-Form, die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 765 [M+H]⁺, 787 [M+Na]⁺, 397, 369 [Chol]⁺, 322, 240, 121, 109, 95, 81, 69, 57. β-Pyranose-Form. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD/CDCl3 [75/25]): δ = 7,64-7,62 (d, ³J_1a-2a = 7 Hz, 1H, H1a), 5,35-5,36 (m, 1H, H6'), 4,45-4,5 (s, 2H, H9), 4,35-4,5 (m, 1H, H3'), 4,19-4,24 (dd, 1h, H2_a, ³J_1a-2a = 7,4 Hz, ³J_2a-3a = 7,7 Hz), 3,81-3,9 (m, 1H, H3a), 3,73-3,8 (m, 2H, H4a; H6_axa), 3,63-3,71 (m, 2H, H5a, H_eq6a), 3,34-3,42 (m, 2H, H2), 3,27-3,30 (m, 2H, H4), 3-3,08 (m, 2H, H1), 2,9-2,98 (m, 2H, H6), 2,25-2,35 (m, 2H, H4'), 1,78-2,07 (m, 2H, H2', H7', H8', H5), 1,03-1,65 (m, 21H, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 1,01 (3H, s, H-19'), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,69 (s, 3H, H18'); ¹³C NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD [25/75]): 12,33 (C18'), 19,20 (C21'), 19,74 (C19'), 21,91 (C11'), 22,91 (27'), 23,17 (C26'), 24,67 (C23'), 25,07 (C15'), 27,37 (C5), 28,85 (C25'), 28,96 (C2'), 29,07 (C12'), 32,76 (CT), 32,87 (C8'), 36,38 (C2), 26,78 (C20'), 37,09 (C1), 37,76 (C22'), 37,95 (C1'), 38,4 (C4), 39,36 (C4'), 40,41 (C24'), 40,76 (C16'), 46,16 (C6), 51,19 (C9'), 57,19 (C17'), 57,75 (C14'), 64,62 (C6a), 70,19 (C2a), 70,58 (C4a), 72,12 (C3a), 72,37 (C5a), 73,11 (C9), 75,91 (C3'), 123,39 (C6'), 140,72 (C5'), 155,02 (C1a), 158,69 (NHCOOChol), 173,1 (C8); α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD/CDCl₃ [75/25]): δ = 6,90-6,88 (d, ³J_1a-2a = 7 Hz, 1H, H1a), 5-5,05 (dd, 1H, H2a, ³J_1a-2a = 7,3 Hz, ³J_2a-3a = 7,6 Hz); 13C NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD [25/75]): 65,33 (C2a), 155,79 (C1a). ¹H NMR (400, CD₃OD/CDCl₃ [75/25]): (m, 1H, H3') fehlend, unterhalb des Lösungsmittel-Peaks, bestätigt durch ¹H NMR (300 Mhz, DMSO): δ = 4,67-4,82 (m, 1H, H3'). ¹³C NMR (400, NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD [25/75]): C1 fehlend, unterhalb des MeON-Peaks, bestätigt durch ¹H/¹³C-Korrelation bei 400 MHz, ungefähr 49. Protonenresonanzzuweisungen wurden unter Anwendung von ¹H-Gradienten der Typen DQF-COSY und TOCSY bestätigt; ¹H/¹³C-Korrelation und DEPT 135 wurden verwendet, um die Kohlenstoffresonanzen eindeutig zuzuweisen. Die α-Pyranose-Form ergab ¹J¹³C1a-H1a = 177 Hz und die β-Pyranose-Form ergab ¹J¹³C1a-H1a = 167 Hz. ¹H-phasensensitives NOESY bestätigte die Konformation.
Glucosyl-Verbindung (12b): Diese wurde mit einer Lösung von D-Glucose (150 mg, 0,82 mmol) und 11 (100 mg, 0,16 mmol) in ähnlicher Weise zubereitet wie die Zubereitung von 12a, einen Tag lang gerührt und durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) gereinigt, um das Produkt als weißen Feststoff (103 mg, Ausbeute: 82 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner durch HPLC bestätigt. Das Endprodukt umfaßte das α-Pyranose (11 %)-Anomer und das β-Pyranose (89 %)-Anomer, die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. (FAB⁺): m/z = 765 [M+H]⁺, 787 [M+Na]⁺, 391, 369 [Chol]⁺, 309, 290, 171, 152, 135, 123, 109, 95, 81, 69 ; β-Pyranose-Form. (300 MHz, CDCl₃/CD₃OD [90/10]): δ = 7,53-7,56 (d, J = 5,6 Hz, 1H, H1a), 5,26-5,36 (m, 1H, H6'), 4,2-4,45 (m, 3H, H9, H3'), 4,05-4,15 (m, 1H, H2a), 3,45-3,85 (m, 5H, H6a, H3aa, H4a), 2,9-3,4 (m, H2, H4, MeOH), 2,9-3,15 (m, 4H, H1, H6), 2,15-2,3 (m, 2H, H4'), 1,65-2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,95-1,55 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,93 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,62 (s, 3H, H18'); α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/CD₃OD [90/10]): δ = 7,22-7,24 (d, J = 6,61 Hz, 1H, H1a), 4,95-5,07 (m, 1H, H2a); ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): (m, 1H, H3') fehlend, wahrscheinlich unterhalb des Lösungsmittel-Peaks; bestätigt durch ¹H NMR (300 MHz, DMSO): δ = 4,7-4,86 (m, 1H, H3').
Galactosyl-Verbindung (12c): Diese wurde mit einer Lösung von D-Galactose (50 mg, 0,27 mmol) und 11 (40 mg, 0,066 mmol) in ähnlicher Weise wie die Zubereitung von 12a zubereitet, einen Tag lang gerührt und durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) gereinigt, um das Produkt 12c als weißen Feststoff (35 mg, Ausbeute: 70 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner bestätigt durch HPLC. Das Endprodukt umfaßte die α-Pyranose-Form (15 %) und die β-Pyranose-Form (85 %), die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 765 [M+H]⁺, 588, 391, 369 [Chol]⁺, 322, 290, 165, 152, 135, 121, 109, 95, 81, 69; β-Pyranose-Form. ¹H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 7,78-7,82 (m, 1H, NHCO von C8), 7,55-7,58 (d, J = 7,2 Hz, 1H, H1a), 6,95-7,1 (m, 1H, NHCOOChol), 5,25-5,37 (m, 1H, H6'), 4,2-4,43 (m, 3H, H9, H3'), 3,2-3,9 (m, H2a, H6a, H3a, H5a, H4a, OH), 2,9-3,18 (m, 4H, H2, H4), 2,4-2,65 (m, 4H, H1, H6), 2,15-2,3 (m, 2H, H4'), 1,67-2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,92-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,96 (3H, s, H-19'), 0,89 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,65 (s, 3H, H18'). α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (270 MHz, DMSO): 6,86-6,88 (d, J = 6 Hz, 1H, H1a).
Glucuron-Verbindung (12d): Diese wurde mit einer Lösung von D-Glucuronsäure-Natriumsalz-Monohydrat (30 mg, 0,128 mmol, 1,5 Äquiv.) und 11 (50 mg, 0,08 mmol) in ähnlicher Weise wie die Zubereitung von 12a zubereitet, einen Tag lang gerührt, gereinigt durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3), um das Natriumsalz von 12d als weißen Feststoff (41 mg, Ausbeute: 60 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner durch HPLC bestätigt. Das Endprodukt umfaßte die α-Pyranose-Form (85 %) und die β-Pyranose-Form (15 %), die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 779 [M+H]⁺, 733, 588, 411, 369 [Chol]⁺, 336, 290, 240, 214, 159, 145, 135, 121, 109, 95, 81, 69, 55. β-Pyranose-Form. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/CD₃OD [75/25]): δ = 7,51-7,53 (d, J = 5,9 Hz, 1H, H1a), 5,25-5,33 (m, 1H, H6'), 4,2-4,45 (m, 3H, H9, H3'), 3,8-4,1 (m, 3H, H2a, H3a, H4a), 3,6-3,75 (m, 1H, H5a), 3,2-3,55 (m, H2, H4, MeOH), 2,7-3,15 (m, 4H, H1, H6), 2,18-2,32 (m, 2H, H4'), 1,62-2 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,9-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,93 (3H, s, H-19'), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,77 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,6 (s, 3H, H18')); α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ = 7,22-7,24 (d, J = 6,3 Hz, 1H, H1a), 5-5,1 (m, 1H, H2a).
α-D-Lactosyl-Verbindung (12e): Eine Lösung von β-D-Lactose, die 25–30 % von α (1,13g, 3,3 mmol) und 11 (200 mg, 0,33 mmol) in 14 ml DMF/essigsaurem wäßrigem Puffer enthielt, wurde 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo durch Gefriertrocknen entzogen und Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) brachte das Produkt 12e als weißen Feststoff (145 mg, Ausbeute: 47 %) hervor. Die Reinheit wurde ferner bestätigt durch HPLC. Das Endprodukt umfaßte die α-Pyranose-Form (15 %) und die β-Pyranose-Form (85 %) (die allein etwa 25 % α-Lactose enthielt), die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 927 [M+H]⁺, 588, 482, 369 [Chol]⁺, 290, 243, 216, 178, 152, 135, 121, 109, 95,81, 69, 55; β-Pyranose-Form. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD [20/80]): δ_H = 7,69-7,71 (d, ³J_1a-2a = 5,8 Hz, 1H, H1a von β-Lactose), 7,66-7,68 (d, ³J_1a-2a = 6,2 Hz, 1H, H1a von α-Lactose), 5,35-5,37 (m, 1H, H6'), 4,37-4,6 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4,2-4,37 (m, 1H, H1b), 3,65-4,05 (m, 7H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,25-3,6 (m, 8H, H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH), 3-3,2 (m, 4H, H1, H6), 2,25-2,42 (m, 2H, H4'), 1,8-2,15 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1-1,65 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 1,01 (3H, s, H-19'), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,69 (s, 3H, H18'); ¹³C NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD [20/80]): ¹³C NMR (400 MHz, CDCl₃/CD₃OD [20/80]): 12:32 (C18'), 19,2 (C21'), 19,76 (C19'), 21,94 (C11'), 22,91 (C27'), 23,17 (C26'), 24,7 (C23'), 25,1 (C15'), 27,22 (C5), 28,89 (C25'), 29 (C2'), 29,1 (C12'), 32,8 (C7'), 32,92 (C8'), 36,29 (C22'), 36,81 (C10'), 37,12 (C1'), 37,99 (C6), 38,11 (C1), 39,48 (C2), 40,45 (C24'), 40,80 (C16'), 46,13 (C4'), 51,23 (C9'), 57,22 (C17'), 57,80 (C14'), 62,41 (C6a), 63,4 (C6a), 70,02 (C5b), 70,63 (C2a), 72,8 (C3a), 73 (C3'), 73,18 (C9), 74,75 (C2b), 76,8 (C3a), 81 (C4b), 92,39 (C1b), 105,2 (C3'), 123,42 (C6'), 140,72 (C5'), 154,8 (C1a), 156,2 (NHCOOChol), 173,17 (C8). α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD/CDCl₃ [80/200]): δ_H = 7,04-7,05 (d, ³J_1a-2a = 5,6Hz, 1H, H1a), 5,05-5,07 (m, 1H, H2a), 4,09-4,11 (m, 1H, H3a); ¹H NMR (270 MHz, CD₃OD): (m, 1H, H3') fehlend, wahrscheinlich unterhalb des Lösungsmittel-Peaks; bestätigt durch ¹H NMR (300 MHz, DMSO): δ = 4,7-4,85 (m, 1H, H3'). Protonenresonanzzuweisungen wurden unter Anwendung von ¹H-Gradienten der Typen DQF-COSY und TOCSY bestätigt; ¹H/¹³C-Korrelation und DEPT 135 wurden verwendet, um die Kohlenstoffresonanzen eindeutig zuzuweisen. ¹H-phasensensitives NOESY bestätigte die Konformation.
Maltosyl-Verbindung (12f): Diese wurde mit einer Lösung von D-Maltose-Monohydrat (30 mg, 1,8 mmol, 5 Äquiv.) und 11 (100 mg, 0,16 mmol) in ähnlicher Weise wie die Zubereitung von 12e zubereitet, einen Tag lang gerührt und durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) gereinigt, um 12f als weißen Feststoff (100 mg, Ausbeute: 65 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner durch HPLC bestätigt. Das Endprodukt umfaßte die α-Pyranose (87 %)-Form und die β-Pyranose (13 %)-Form, die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 927 [M+H]⁺, 765, 588, 559, 484, 369 [Chol]⁺, 322, 290,0 213, 167, 161, 143, 135, 121, 109, 95, 81, 69, 55. β-Pyranose-Form. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/CD₃OD [80/20]): δ = 7,55-7,57 (d, ³J_1a-2a = 5,3 Hz, 1H, H1a), 5,3 (s, 1H, H6'), 4,85-5,02 (m, 1H, H3'), 4,09-4,22 (m, 1H, H1b), 3,57-4 (m, 7H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,2-3,6 (m, 8H, H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH), 2,8-3,1 (m, 4H, H1, H6), 2,1-2,36 (m, 2H, H4'), 1,6-2,05 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,93 (3H, s, H-19'), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,6 (s, 3H, H18'); α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD/CDCl3 [80/20]): δ = 6,92-6,94 (d, J = 4,62 Hz, 1H, H1a), 5,02-5,15 (m, 1H, H2a), 4,04-4,08 (m, 1H, H3a).
Maltotriosyl-Verbindung (12g): Diese wurde mit einer Lösung von Maltotriose (246,4 mg, 0,46 mmol, 7 Äquiv.) und 11 (40 mg, 0,066 mmol) in ähnlicher Weise zubereitet, wie die Zubereitung von 12e, 5 Tage lang gerührt und durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) gereinigt, um 12f als weißen Feststoff (61 mg, Ausbeute: 85 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner bestätigt durch HPLC. Das Endprodukt umfaßte die α-Pyranose-Form (15 %) und die β-Pyranose-Form (85 %), die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 1111 [Ma + Na]⁺, 1089 [M+H]⁺, 588, 423, 391, 369 [Chol]⁺, 240, 171, 159, 145, 121, 105, 95, 81, 69; β-Pyranose-Form.: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/MeOH [20/80]): δ = 7,56-7,58 (d, J = 6Hz, 1H, H1a), 5,2-5,27 (m, 1H, H6'), 4,9-4,95 (m, 1H, H3'), 4,2-4,45 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4,05-4,2 (m, 2H, H1b, H1c), 2,95-4 (m, 21H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, MeOH), 2,85-2,95 (m, 4H, H1, H6), 2,2-2,3 (m, 2H, H4'), 1,8-2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 0,98-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,94 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,61 (s, 3H, H18'); α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/MeOH [20/80]): δ = 6,85 (d, J = 5,6 Hz, 1H, H1a).
Maltotetraosyl-Verbindung (12h): Diese wurde zubereitet mit einer Lösung von D-Maltotetraose (200 mg, 0,3030 mmol) und 11 (80 mg, 0,133 mmol), 5 Tage lang gerührt und durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) gereinigt, um 12h als weißen Feststoff (67,5 mg, Ausbeute: 41 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner durch HPLC bestätigt. Das Endprodukt umfaßte die α-Pyranose-Form (15 %) und die β-Pyranose-Form (85 %), die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 1273 [M+Na]⁺, 1251 [M+H]⁺, 588, 369 [Chol]⁺, 159, 145, 121, 109, 95, 81, 69; HRMS (FAB⁺) C₅₉H₁₀₂N₄O₂₄Na: [Ma+Na]⁺ errechnet 1273,6782, gefunden 1273,6821. β-Pyranose-Form.: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/MeOH [20/80]): δ = 7,56-7,58 (d, 1H, H1a), 5,15-5,25 (m, 1H, H6'), 4,95-5,1 (m, 1H, H3'), 4,38-4,5 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4,04-4,22 (m, 3H, H1b, H1c, H1d), 3,1-3,95 (m, 27H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, H2d-6d, MeOH), 2,85-3,1 (m, 4H, H1, H6), 2,2-2,33 (m, 2H, H4'), 1,75-2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,92 (3H, s, H-19'), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,68 (s, 3H, H18'); α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/MeOH [20/80]): δ = 7 (d, 1H, H1a).
Maltoheptaosyl-Verbindung (12i): Diese wurde mit einer Lösung von D-Maltoheptaose (100 mg, 0,08673 mmol) und 11 (30 mg, 0,0497 mmol) zubereitet, 7 Tage lang gerührt und durch Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 75:22:3) gereinigt, um 12i als weißen Feststoff (46 mg, Ausbeute: 53 %) hervorzubringen. Die Reinheit wurde ferner durch HPLC bestätigt. Das Endprodukt umfaßte die α-Pyranose-Form (15 %) und die β-Pyranose-Form (85 %), die nicht isoliert, aber in dem Gemisch bestimmt wurden. MS (FAB⁺): m/z = 1759 [M+Na]⁺, 1737 [M+H]⁺, 369 [Chol]⁺, 145, 121, 109, 95, 81. β-Pyranose-Form.: ¹H NMR (300 Mhz, CDCl₃/MeOH [20/80]): δ = 7,53-7,58 (d, 1H, H1a), 5,35-5,37 (m, 1H, H6'), 4,97-5,12 (m, 1H, H3'), 4,45-4,6 (m, 4H, H9, H3', H2a), 4-4,5 (m, 6H, H1b, H1c-g), 3,1-3,9 (m, 45H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b, H2c-6c, H2d-6d, H2e-6e, H2f-6f, H2g-6g, MeOH), 2,7-3 (m, 4H, H1, H6), 2,15-2,35 (m, 2H, H4'), 1,7-2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,94 (3H, s, H-19'), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H21'), 0,77 (d, J = 6,5 Hz, 6H, H26' & H27') und 0,63 (s, 3H, H18'); α-Pyranose-Form: identische Daten außer ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃/MeOH [20/80]): δ = 6,9 (d, 1H, H1a).
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung von Zusammensetzungen, die eine Nukleotidsequenz umfassen.
Biologische und biophysikalische Bewertung:
Allgemeines: Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) wurde von Avanti Lipid (Alabaster, AL, USA) bezogen. Das Plasmid pCMVβ wurde von Bayou Biolabs (Harahan, LA, USA) hergestellt. DC-Chol wurde in unserem Labor synthetisiert. Mu-Peptid wurde von M. Keller durch auf Fmoc basierender Standard-Merrifield-Festphasenpeptidchemie an Wang-Harz synthetisiert. Alle anderen Chemikalien hatten Reagenzienqualität.
Herstellung von Liposomen: DC-Chol (7,5 mg, 15 μmol) und DOPE (7,5 mg, 10 μmol) wurden in Dichlormethan vereinigt. Die Lösung wurde in einen Rundkolben (typischerweise 50 ml) überführt und organisches Lösungsgmittel unter vermindertem Druck (Rotationsverdampfer) entfernt unter Erhalt eines dünnen Lipidfilms, der für 2 bis 3 Stunden unter Vakuum getrocknet wurde.
Anschließend wurden 4 mM HEPES-Puffer, pH 7,2 (3 ml), zu dem Rundkolben hinzugefügt, um den dünnen Lipidfilm zu hydratisieren. Nach kurzer Ultraschallbehandlung (2 bis 3 min) unter Argon, wurde die resultierende kationische Liposomensuspension (Lipidkonzentration von 5 mg/ml) mit einer Extruder-Vorrichtung (Northern Lipid) extrudiert. Anfänglich erfolgte dies dreimal durch zwei übereinander angeordnete Polycarbonatfilter (0,2 μm) und anschließend zehnmal durch zwei übereinander angeordnete Polycarbonatfilter (0,1 μm) unter Bildung kleiner unilamellarer kationischer Liposome (mittlerer Durchmesser von 105 nm gemäß PCS-Analyse). Lipidkonzentrationen (etwa 4 bis 4,8 mg/ml) wurden nach dem Stewart-Assay bestimmt.
Herstellung von Liposom:Mu:DNA-(LMD-) und Liposom:DNA-(LD) Komplexen:
Zunächst wurden mu:DNA-(MD-) Teilchen durch Mischen wie folgt hergestellt. Plasmid-DNA-Stammlösungen (typischerweise 1,2 mg/ml) wurden zu einer mittels Vortex gemischten, verdünnten Lösung von Mu-Peptid (1 mg/ml) in 4 mM HEPES-Puffer, pH 7,2, hinzugefügt. Das Mu:DNA-Endverhältnis betrug 0,6:1 w/w, wenn es nicht anders angegeben ist, und die Plasmid-DNA-Endkonzentration betrug 0,27 mg/ml. MD enthaltende Lösungen wurden dann langsam unter Vortex-Bedingungen zu Suspensionen von extrudierten kationischen Liposomen (typischerweise etwa 4,5 mg/ml), die wie oben beschrieben hergestellt waren, hinzugefügt, was zu der Bildung von kleinen LMD-Partikeln mit enger Größenverteilung (120 ± 30 nm), gemessen durch PCS, führte. Das Lipid:mu:DNA-Endverhältnis betrug 12:0,6:1 w/w/w. Eine Lösung von Saccharose (100 % w/v) in 4 mM HEPES-Puffer, pH 7,2, wurde dann hinzugefügt unter Erhalt von LMD-Teilchensuspensionen in 4 mM HEPES-Puffer, pH 7,2, die 10 % w/v Saccharose bei der gewünschten DNA-Konzentration (DNA-Endkonzentration typischerweise 0,14 mg/ml) enthielten, und das Ganze wurde bei – 80 °C gelagert. Liposom:DNA- (LD-) Komplexe (Lipoplexe) wurden für Experimente mit einem Lipid:DNA-Verhältnis von 12:1 (w/w) nach dem gleichen Protokoll ohne die Zugabe von Mu-Peptid hergestellt.
Teilchengrößenmessungen: Die Größen der Lipoplexe wurden nach 30-minütigem Aussetzen bei 37 °C an biologische Medien durch Photonenkorretationsspektroskopie (N4 plus, Coulter) bestimmt. Die gewählte jeweilige DNA-Konzentration war mit dem in vitro-Zustand kompatibel (1 μg/ml DNA). Die verwendeten Parameter waren: 20 °C, 0,089 cP, Brechungsindex von 1,33, Winkel von 90 °C, 632,8 nm. Es wurde eine unimodale Analyse verwendet, um die mittlere Teilchengröße in OptiMem zu bestimmen. Es wurde ein Größenverteilungsprogramm unter Anwendung des CONTIN-Algorithmus verwendet, um die Unterpopulation von kleinen Serumteilchen von weniger als 50 nm abzutrennen und die berechnete Größe von Lipoplexen in OptiMem plus 10 % FCS zu extrahieren.
Transfektion von HeLa-Zellen: Zellen wurden in einer 24-Well-Kulturplatte in DMEM, versetzt mit 10 % FCS, ausgesät und bis zu einer Konfluenz von etwa 70 % für 24 Stunden bei 37 °C in der Gegenwart von 5 % CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden in PBS gewaschen, bevor das Transfektionsmedium zu jedem Well hinzugegeben wurde (0,5 ml Lösung von 0,50 oder 100 % fötalem Kälberserum in Dubelco OptiMem). 5 μl mit 100 μg/ml DNA (nls βgal) von LMD wurden für 30 min auf HeLa-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gespült und für weitere 48 Stunden in DMEM, versetzt mit 10 % FCS, inkubiert, bevor sie hinsichtlich β-Gal-Expression unter Verwendung eines Standard-Chemilumineszenzreportergentestkits (Roche Diagnostics GmbH, Katalog Nr. 1758241) weiter bearbeitet wurden.
Ergebnisse und Diskussion:
Synthese von Neoglycolipiden: Jedes Mitglied der angezielten Familie von Neoglycolipiden bestand aus einem Cholesterin-tragenden Lipid und einem Oligosaccharidmolekül, die über einen Linker aneinander gebunden waren. Der gesamte synthetische Ansatz wurde in zwei Teile aufgeteilt: zuerst die Synthese eines Lipides, das den Linker enthielt, und zweitens die chemoselektive Kopplung dieses Lipides mit ausgewählten Zuckermolekülen. Der Schlüssel zu dieser Strategie ist die Bildung eines Hydroxylamins (1).
Diese Synthese des Boc-geschützten Lipids (8) war ursprünglich auf der Grundlage eines konvergenten Verfahrens unter Verwendung einfach erhältlicher Aminoalkohole als Ausgangsmaterialien mit einer komplementären Blockierungsgruppenstrategie für die Amingruppe entworden worden. Dieses zuvor veröffentlichte Verfahren erlaubte die Herstellung dieses auf Polyamid basierenden Lipids für den Gentransfer mit geringer Modifikation.
Wie erwähnt, bietet die Glycosylierung von Hydroxylaminderivaten eine elegante Lösung für unsere Syntheseanforderungen. Das kommerziell erhältliche O-(Carboxymethyl)-Hydroxylaminhydrochlorid wurde zuerst mit Boc geschützt und anschließend mit N-Hydroxysuccinimid und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) umgesetzt, was zu dem entsprechenden aktivierten Ester führte. Diese Verbindung wurde unmittelbar in situ mit Lipid (8) in THF bei einem pH-Wert von 8 behandelt, was ein geschütztes Hydroxylamin lieferte. Nach einer sehr geradlinigen Schutzgruppenentfernung mit wäßriger Trifluoressigsäure war die Synthese des Hydroxylaminlipids (11) abgeschlossen. An dieser Stelle untersuchten wir das Potential unserer chemoselektiven Kopplung durch Umsetzen des Lipids (11) mit einer Anzahl kommerziell erhältlicher nicht geschützter Oligosaccharide. Diese Reaktion wurde unter milden Bedingungen durchgeführt, wobei ein Lösungsmittelsystem aus DMF und einem Puffer von wäßriger Essigsäure mit einem pH-Wert von 4 (1:1), welches die Löslichkeit von sowohl Zucker als auch Lipid erleichtert, verwendet wurde. Wie es in 2 gezeigt ist, befinden sich die Reaktanten in dynamischem Gleichgewicht mit der protonierten Zwischenstufe des offenen Sessels. Um das Gleichgewicht zur Produktbildung zu zwingen, wurde ein Überschuß an Zucker hinzugefügt. Aufgrund der amphiphilen Natur des Neoglycolipidprodukts, stellte sich heraus, daß eine Isolierung während der Aufarbeitung infolge von Mizellen- und Schaumbildung schwierig war. Löslichkeitsprobleme erschwerten ebenfalls die Isolierung, Reinigung und analytische Verarbeitung. Reaktionszeiten und Ausbeuten variierten in Abhängigkeit von dem verwendeten Kohlenhydrat (Tabelle 1).
Tabelle 1 Ausbeuten, Reaktionszeiten und Diastereoselektivität von Glycosylierung des Produkts 11.
Neoglycolidkonformation: Kohlenhydratkonformationen können durch NMR in Lösung bestimmt werden. Die nützlichsten Daten für die Konformation an dem anomeren Zentrum (C1a) sind wahrscheinlich ¹J¹³C1a-H1a. Der absolute Wert dieser Kopplungskonstante hängt von der Orientierung der Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung relativ zu den Ionenpaaren des Ringsauerstoffs, der Elektronegativität des Substituenten am C1 und der Art des an den Rest des Moleküls gebundenen elektronegativen Substituenten ab. Der Unterschied von ¹J¹³C1a-H1 zwischen dem α- und β-Anomer von Pyranosen kann dazu verwendet werden, die Anomerkonfiguration zu bestimmen. Es ist anerkannt, daß ¹J(C1-H1eq) > ¹J(C1-H1ax) mit einem ungefähren Unterschied von 10 Hz. ¹J(C1-H1eq) liegt üblicherweise um 170 Hz und ¹J(C1-H1ax) bei etwa 160 Hz. Höhere Werte werden beobachtet, wenn 0–1 gegen ein elektronegativeres Element, wie Chlor oder Fluor, ausgetauscht wird, aber es wird üblicherweise ein Unterschied von 10 Hz beobachtet. Kohlenstoff-Wasserstoff-Kopplungskonstanten von Furanosiden wurden untersucht, und ¹J(C1-H1eq) > ¹J(C1-H1ax), aber der Unterschied ist viel geringer (1 bis 3 Hz).
Die Charakterisierung wird auf der Grundlage des Beispiels von Mannose diskutiert, aber das gleiche Analyseverfahren wurde für die anderen Saccharide verwendet, wenn NMR-Analysebedingungen geeignet waren. Es können vier verschiedene Ringstrukturen in Betracht gezogen werden (3). Es kann vernünftigerweise erwartet werden, daß die Pyranoseformen gegenüber den Furanoseringen aus sterischen Gründen bevorzugt werden. Somit ist von den zwei in der NMR beobachteten Verbindungen die überwiegende wahrscheinlich eine Pyranose. Die zweite beobachtete Verbindung könnte einem Mutarotationsgleichgewicht zuzuschreiben sein, weil phasensensitive NOESY keinen Quer-Peak zwischen den zwei C1a-Signalen zeigte (was beweisen würde, daß es sich um ein unterschiedliches Molekül handelt). Daher wurde diese Verbindung nicht einer Furanoseform zugeordnet, weil keine Verschiebung von ¹³C5a beobachtet wurde und ¹³C1a nicht entschirmt war, wie es für verwandte substituierte Furanoseäquivalente gezeigt wurde.
Wir maßen ¹J¹³C1a-H1a = 167 Hz für die Hauptverbindung und ¹J¹³C1a-H1a = 177 Hz für die zweite. Der absolute Wert von solchen ¹J¹³C1-H1 ist 10 Hz höher als für eine klassische ⁴C1-Konformation erwartet, aber dies wird durch die extreme Elektronegativität der O-substituierten Hydroxylamingruppe erklärt, welche die Sesselstruktur geringfügig deformieren könnte. Für Pyranoseringe hat sich herausgestellt, daß [¹J(C1-H1eq) – ¹J(C1-H1ax)] ≈ 10 Hz, und daher kann einfach geschlußfolgert werden, daß die Hauptverbindung das β-Anomer (H1ax) und die sekundäre Verbindung das α-Anomer (H1eq) ist.
¹H-phasensensitive NOESY bestätigte diese Schlußfolgerung. Der Nuclear Overhouser-Effekt wurde zwischen H1a und H2a & H3a für die Hauptverbindung beobachtet. Berücksichtigt man die oben genannte ausführliche Struktur, konnte diese Verbindung nicht das α-Pyranosylanomer sein, weil der äquatoriale H1 nicht im Raum mit H3 wechselwirken kann, wogegen das β-Anomer zur Erzeugung solcher Wechselwirkungen perfekt in der Lage ist. Es wurde kein Nuclear Overhouser-Effekt für H1a der sekundären Verbindung beobachtet, aber dies könnte auf ein Fehlen von Empfindlichkeit zurückzuführen sein. Daher schlußfolgerten wir gemäß den Daten von ¹J¹³C1-H1 und NOESY-Analysen, daß zwei Mannose-Pyranose- α/β-Formen (20/80) produziert wurden.
Das sehr ähnliche anomerische (β/α) Isomerenverhältnis, das für die Neoglycolipide erhalten wurde, ist nicht überraschend (Tabelle 1), wobei sämtliche Zucker eine äquatoriale Hydroxygruppe in C2 haben außer Mannose.
Das für diese letzte Verbindung erzielte Verhältnis ist überraschend, weil von dem β-Anomer üblicherweise berichtet wird, daß es sterisch weniger bevorzugt ist als das α-Anomer. Eine mögliche Erklärung ist, daß diese Reaktion durch einige sekundäre Wechselwirkungen (Wasserstoffbindung) zwischen dem Zucker und dem Hydroxylamin-Linker, welche das β-Anomer stabilisieren, angetrieben wird (dies stimmt mit der Beobachtung überein, daß das NMR-Signal des β-Anomers immer viel stärker entschirmt ist als dasjenige des α-Anomers). Von diesem Anomerengemisch aus synthetisierten Glycolipiden wird nicht erwartet, daß es die erforschten biologischen Eigenschaften der Liposomenkonstrukte stark beeinflußt, und daher haben wir keine langwierige Trennung dieser Diastereoisomere durch präparative Hochdruckflüssigchromatographie versucht.
Biologische Anwendung: Die Glycomodifizierung von LMD beruhte auf der natürlichen Fähigkeit einer Mizellensuspension, in Lipidmembrane aufgenommen zu werden. Zuerst wurden LMD nach einem Standardprotokoll formuliert und anschließend wurde eine Suspension von synthetisierten Neoglycolipidmizellen in HEPES-Puffer, 4 mM, pH 7, zu den LMD hinzugefügt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur vor einer üblichen Lagerung bei –80 °C inkubiert. Verschiedene prozentuale Anteile aller der hergestellten Neoglycolipide wurden hinsichtlich Stabilisierungswirkung getestet, aber nur die längere Kette (Maltotetraose 12h und Maltoheptaose 12i) zeigten signifikante Eigenschaften bei weniger als 10 % (Daten nicht gezeigt).
Die Stabilisierungswirkung von mit Neoglycolipid modifiziertem LMD wurde durch Aufnahme von 7,5 Mol-% der Verbindung 12h oder 12i gezeigt. Lipidschichten von auf Liposomen basierender Formulierung sind dafür bekannt, daß sie sich nach Aussetzen an Salz oder Serum zusammenlagern. Dieses Phänomen kann durch Messen der Zunahme der mittleren Teilchengröße nach einer festen Zeit verfolgt werden; jede Stabilisierung des LMD-Teilchens sollte sich in einer Reduzierung dieses Parameters wiederspiegeln. Es wurde bestimmt, die Größe der Lipoplexe mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) nach 30 Minuten Aussetzen bei 37 °C an OptiMem oder OptiMem + 10 % FCS zur Nachahmung von Standardbedingungen in vitro zu messen. Es war nicht möglich, die Wirkung mit PCS bei höheren Serumanteilen zu analysieren, die Bedingungen waren zu extrem für die Aufnahme von aussagekräftigen Messungen. 4 beschreibt den Prozentsatz der Größenzunahme dieser Lipoplexe.
Die Ergebnisse zeigen eine klare Stabilisierung des Teilchens zwischen LMD und Standardliposomenformulierung. die Einführung von Neoglycolipiden mit 7,5 % erwies sich als deutlich vorteilhaft in OptiMem und 10 % Serum. Die Aufnahme von 12i erwies sich als besonders effizient. Dieses Ergebnis zeigt die Notwendigkeit langer Kohlenhydratketten zur Erzeugung effizienter molekularer Bürsten auf der Oberseite dieser kationischen Lipidschichten.
Auch wenn ein gewisses Ausmaß an Stabilisierung gezeigt wird, führt dies üblicherweise zu einer Reduzierung der Affinität der positiv geladenen LMD für die negativ geladene Zellmembran, was einen Abfall in der Transfektionsfähigkeit des Konstruktes auslöst. Jedoch zeigten in diesem Fall die in vitro Transfektionsergebnisse eine Verbesserung der Transfektionseffizienz aufgrund von Neoglycolipid-Modifikation unter Bedingungen von sowohl 0 % als auch 50 % Serum (5). Dieses Ergebnis wurde einer Nahbereichsschutzwirkung zugeschrieben, da diese Neoglycolipide auf van der Waals-Kräften basierende Wechselwirkungen im Nahbereich zwischen Lipiddoppelschichten ähnlicher Polaritäten behindern, aber die Ladungswechselwirkungen im Fernbereich zwischen gegensätzlich geladenen Membranen nicht beeinflussen. Die durch Serum induzierte Zusammenlagerung beruht in erster Linie auf einer Wechselwirkung von LMD mit negativ geladenen Proteinen, und die vorteilhafte Wirkung unserer Neoglycolipide wurde mit zunehmendem Anteil an Serum ebenfalls erniedrigt (kein signifikanter Vorteil in 100 % Serum).

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit der Formel
welches die Umsetzung (iii) einer Verbindung der Formel
und (iv) einer Verbindung der Formel
unter Beimengung von oder in Assoziierung mit einer Nukleotidsequenz oder eines pharmazeutisch aktiven Stoffes umfaßt, worin B ein Lipid und A ein interessierender Rest (MOI) ist, worin X eine optionale Linker-Gruppe ist, worin R₁ H oder eine Kohlenwasserstoffgruppe ist und worin R₂ ein einzelnes Elektronenpaar oder R₄ ist, wobei R₄ ein geeigneter Substituent ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Reaktion in einem wäßrigen Medium durchgeführt wird.
Zusammensetzung, die (i) eine Verbindung der Formel
(ii) eine Verbindung der Formel
und (iii) eine Nukleotidsequenz oder einen pharmazeutisch aktiven Stoff umfaßt, worin B ein Lipid ist und A ein interessierender Rest (MOI) ist, worin X eine optionale Linker-Gruppe ist, worin R₁ H oder eine Kohlenwasserstoffgruppe ist und worin R₂ ein einzelnes Elektronenpaar oder ein geeigneter Substituent ist.
Erfindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin X vorhanden ist.
Erfindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin X eine Kohlenwasserstoffgruppe ist.
Erfindung von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin R₂ eine Kohlenwasserstoffgruppe ist.
Erfindung von Anspruch 6, worin R₂ eine Kohlenwasserstoffgruppe ist, die optionale Heteroatome enthält, die unter O, N und Halogenen ausgewählt sind.
Erfindung von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin R₂ H ist.
Erfindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin R₁ H ist.
Erfindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die C=N – Bindung säurelabil oder säurebeständig ist.
Erfindung gemäß Anspruch 10, worin die C=N – Bindung säurelabil ist.
Erfindung gemäß Anspruch 10, worin die C=N – Bindung säurebeständig ist.
Erfindung gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Lipid eine Cholesteringruppe ist oder umfaßt.
Erfindung gemäß Anspruch 13, worin die Cholesteringruppe Cholesterin ist.
Erfindung gemäß Anspruch 13, worin die Cholesteringruppe mit X über eine Carbamoyl-Verknüpfung oder eine Ether-Verknüpfung verbunden ist.
Erfindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Lipid mit X über eine Polyamingruppe verbunden ist.
Verbindung gemäß Anspruch 16, worin die Polyamingruppe kein natürlich vorkommendes Polyamin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 16 oder 17, worin die Polyamingruppe wenigstens zwei Amine der Polyamingruppe enthält, die voneinander durch eine Ethylengruppe (-CH₂CH₂-) beabstandet sind.
Erfindung gemäß Anspruch 16, worin das Polyamin entweder Spermidin, Spermin oder Caldopentamin ist.