DE112015003165T5 - Synthese und Verwendung von Aminolipiden - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt neue Aminolipide und ein einfaches Verfahren zu deren Synthese bereit. Erfindungsgemäße haben die Aminolipide eine Sturktur der folgenden Formel:worin Z entweder Wasserstoff oder -X1R1 ist, R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl-Gruppe substituiert sind, X1 und X2 sind gleich oder unterschiedlich, entweder S oder S=O oder S(=O)2, Y ist entwederoder Heterozyklen der Formelwobei k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind, R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl-Gruppe, oder R3 und R4 können miteinander einen optional substituierten heterozyklischen Ring von 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 bis 7 Stickstoffatome, oder R3 und R4 sind die gleichen oder verschiedene Alkylamine, R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, ...

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminolipide und deren Synthesen. Derartige (kationischen) Aminolipide haben gute Eigenschaften als Transfektions-Agenzien. Verwendet werden können diese Lipidpartikel zur Herstellung von Lipidpartikeln, insbesondere von Liposomen, welche das Einschleusen bioaktiver Agenzien in Zellen ermöglichen. Die Einfachheit der Synthese erlaubt die Entwicklung einer kombinatorischen Bibliothek von (kationischen) Aminolipiden in einer Kit-artigen Weise. Die in dieser Bibliothek enthaltene Verbindungen können für bestimmte Eigenschaften, insbesondere für die Verwendung zur Transfektion von verschiedenen Zelllinien, gescreent werden. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von die neutralen oder kationischen Aminolipide enthaltenden Lipidpartikeln als Medikament.
  • Hintergrund
  • Von den verschiedenen Reagenzien, die verwendet werden, um Zellen mit bioaktiven Agenzien, wie Nukleinsäuren, zu transfizieren, wird die auf Liposomen basierende Verabreichung als am effektivsten angesehen. Dies beruht vor allem auf deren Effizienz und Einfachheit der Verwendung. Liposomen sind künstlich hergestellte sphärische Vesikel aus einer Doppellipidschicht. Um die Moleküle an den Wirkort zu bringen, kann die Doppellipidschicht mit anderen Doppelschichten, wie einer Zellmembran, fusionieren und somit den Inhalt des Liposoms in eine Zelle einschleusen.
  • Liposome werden zur Verabreichung von Medikamenten verwendet, da sie besondere Eigenschaften aufweisen. Ein Liposom umschließt eine Region wässriger Lösung innerhalb einer hydrophoben Membran; gelöste hydrophile Stoffe können nicht durch die Lipide hindurch wandern. Hydrophobe Stoffe können in die Membran hinein gelöst werden und auf diese Art können Liposomen sowohl hydrophobe Moleküle als auch hydrophile Moleküle tragen. Liposomen können mit bioaktiven Agenzien wie Medikamenten, Nukleinsäuren, Peptiden, etc., kombiniert werden und zur Verabreichung dieser Agenzien zur Regulation von biochemischen Signalwegen der Zelle verwendet werden. Dies eröffnet Möglichkeiten für neuartige Behandlungen von Krankheiten.
  • Zur Verabreichung von negativ geladenen Nukleinsäuren sind kationische Lipide die effektivsten Transfektions-Agenzien. Kationische Lipide stellen eine vielversprechende Klasse zur Verabreichung von DNA dar. Derzeit gibt es verschiedene kommerziell erhältliche kationische Lipide, aber die Anzahl von kationischen Lipiden zur sicheren und effektiven Einschleusung von Genen ihnen ist noch beschränkt.
  • In “Cationic liposomes for gene therapy” (Miller AD, Angew Chem Int Ed. 1998, 37: 1768–1785) werden die meisten der am häufigsten verwendeten und kommerziell erhältlichen Transfektions-Agenzien beschrieben. Trotzdem erfordert die konventionalle Lipidsynthese typischer Weise eine individuell optimierte, mehrstufige Synthese, einschließlich zeitintensiver Verfahrensschritte, wie das Einfügen und Entfernen von Schutzgruppen, die Verwendung und Entfernung von Katalysten, Lösemittelaustauschen und Aufreinigungen.
  • Kationische Lipide müssen mit natürlichen Phospholipiden (auch als Helfer-Lipide bezeichnet) kombiniert werden, um Liposomen zu bilden, welche in effizienter Weise in Zellmembranen inkorporiert werden können. Durch die Kombination von Liposomen mit DNA oder Medikamenten, welche durch die Membran der Zielzelle alleine nicht diffundieren können, können diese (unterschiedslos) nach jenseits der Lipiddoppelschicht transportiert werden. Die Verwendung von Liposomen zur Transformation oder Transfektion von DNA in eine Wirtszelle ist als Lipofektion bekannt.
  • Obwohl liposomale Agenzien den Stand der Technik der Zelltransfektionsagenzien darstellen, haben sie die folgenden Nachteile: 1. Viele Zelllinien (wie primäre Zellen) können derzeit nicht effektiv transfiziert werden, selbst mit liposomalen Reagenzien. 2. Sie sind relativ schwierig und teuer zu synthetisieren, was häufig zu einem hohen Preis führt.
  • Als Konsequenz des zweiten Punktes verwenden viele Laboratorien weniger effiziente, billigere Alternativen zur Transfektion (zum Beispiel Kalziumphosphat). Es existiert ein konkretes Bedürfnis für neue Transfektions-Agenzien, die leicht zu synthetisieren sind und gute Transfektionsseffizienzen für eine große Vielfalt von Zelltypen haben. Als Alternative wäre es hilfreich, über eine einfache kombinatorische Synthese von Transfektionsagenzien zu verfügen, die die Herstellung einer Vielfalt verschieder Verbindungen ermöglichen.
  • Demgemäß war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue (kationische) Aminolipide und ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, mit welchen die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden. Das Verfahren sollte generisch, ökonomisch und leicht durchzuführen sein. Dieses generische Verfahren ermöglicht die Entwicklung einer Lipid-Bibliothek von kationischen Aminolipiden. Die Herstellung derartiger Bibliotheken (enthaltend Hunderte von verschiedenen Lipidmolekülen) verbessert die Identifikation von Lipiden mit optimalen Eigenschaften als Transformations-Reagenz stark.
  • Es war ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Lipidpartikel, insbesondere Liposomen, enthaltend die genannten (kationischen) Aminolipide bereit zu stellen. Insbesondere sollten diese Lipidpartikel oder Liposomen in der Lage sein, bioaktive Agenzien durch Zellmembranen einzuschleusen.
  • Ein weiteres Ziel ist die Verwendung derartiger Lipidpartikel oder Liposomen zur Behandlung von Krankheiten.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt neue Aminolipide mit der folgenden generellen Formel (I) bereit:
    Figure DE112015003165T5_0005
    worin Z entweder Wasstersoff oder -X1R1 ist, worin R1 and R2 gleich oder unterschiedlich sind und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind,
    X1 und X2 sind gleich oder unterschiedlich, entweder S oder S=O oder S(=O)2,
  • Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0006
    oder Heterocyclen der Formel
    Figure DE112015003165T5_0007
    wobei k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind,
    R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneineander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können miteinander, zusammen mit dem Stuckstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome (einschließlich des Stickstoffatoms an das R3 and R4 gebunden sind),
    R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen,
    R7 is entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl,
    m is eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3,
    wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3;
    und wobei Y in einer Ausführungsform auch
    Figure DE112015003165T5_0008
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind R3 und R4 das gleiche oder unterschiedliche Alkylamin.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind R1 und R2 gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, bevorzugter sind R1 und R2 das gleiche C6-C18 Alkyl.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft in einer Ausführungsform Aminolipide der Formel (Ib)
    Figure DE112015003165T5_0009
    worin die Variablen oben difiniert sind.
  • In einer anderen Ausführungsform sind X1 und X2 gleich oder verschieden, entweder S=O oder S(=O)2.
  • In einer Ausführungsform, stellt die vorliegende Erfindung Aminolipide der allgemeinen Formel (II) bereit:
    Figure DE112015003165T5_0010
    R1 und R2 sind dasselbe C6-C18 Alkyl Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0011
    oder Heterozyklus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0012
    oder
    Figure DE112015003165T5_0013
    R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich C1-C12 Alkyl, wobei Alkyl optional substituiert ist mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 bis 7 Stickstoffatome,
    R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen,
    R7 ist entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl,
    m ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p ist eine ganze Zahl von 1 bis 3,
    wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3; und wobei Y auch
    Figure DE112015003165T5_0014
    sein kann für p = 2.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen gemäß den Formeln (I) oder (II), n und m sind unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1, 2 oder 3, und p ist unabhängig davon eine ganze Zahl von 1 oder 2.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen betreffen Strukturen der Formeln (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (IIIe), (IIIf), (IIIg), (IIIh), (IIIi), (IIIj), (IIIk), (IIIl), (IIIm), (IIIn), (IIIo), (IIIp), (IIIq), (IIIr), (IIIs), (IIIt), (IIIu), (IIIv), oder (IIIw)
    Figure DE112015003165T5_0015
    Figure DE112015003165T5_0016
    wobei R1 und R2 dasselbe C11-C12 Alkyl sind,
    R3 und R4 dasselbe C1-C2 Alkyl sind,
    m eine ganze Zahl von 1 bis 2, n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
  • In einer besondes bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Y in Formel I und II entweder
    Figure DE112015003165T5_0017
    oder ein Heterozyklus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0018
    wobei k und l eine ganze Zahl von 0 bis 2 sind, besonders bevorzugt ist Y entweder
    Figure DE112015003165T5_0019
    oder ein Heterocyclus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0020
    und am meisten bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Aminolipide eine Struktur gemäß IIIa bis IIIl.
    Figure DE112015003165T5_0021
    Figure DE112015003165T5_0022
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Y in Formel I und II Y entweder NH, NR7, +NR6R7,
    Figure DE112015003165T5_0023
    oder ein Heterozyklus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0024
    worin k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind, R6 ist entweder nicht vorhanden oder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen,
    R7 ist entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl,
  • Insbesondere bevorzugt ist Y entweder NH, NR7, +NR6R7,
    Figure DE112015003165T5_0025
    oder ein Heterocyclus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0026
    und am meisten bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Aminolipide eine Struktur gemäß IIIm bis IIIw.
    Figure DE112015003165T5_0027
    Figure DE112015003165T5_0028
  • Die Erfindung stellt auch neuartige Aminolipide mit der folgenden allgemeinen Formel (Ic) bereit:
    Figure DE112015003165T5_0029
    worin R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl sind, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind,
    X1 Und X2 sind gleich oder unterschiedlich, entweder S oder S=O oder S(=O)2,
    Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0030
    wobei Z
    Figure DE112015003165T5_0031
    ist, k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind.
    m ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12.
  • Syntheseverfahren
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Synthese von Aminolipiden der Formeln I und Ic, bevorzugt Ib bereit. Das Verfahren stellt die erste parallele Synthese großer Bibliotheken von ionisierbaren (kationischen) Aminolipiden dar, basierend auf Thiol-in Chemie kombinatorischer Synthese in der Flüssigphase ohne chromatografische Aufreinigung.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst den Schritt der Reaktion von Alkinen oder Alkenen der allgemeinen Formel (VI)
    Figure DE112015003165T5_0032
    mit den Verbindungen der allgemeinen Formeln HS-R1 und HS-R2, unter entweder UV-Bestrahlung oder mittels eines Radikalstarters, so dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (VII) erhalten wird
    Figure DE112015003165T5_0033
    wobei E entweder CH=CH2 oder C≡CH ist,
    Z ist entweder Wasserstoff oder -S-R1,
    R1 und R2 sind gleich oder unterschiedlich voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind,
    Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0034
    oder ein Heterocyclus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0035
    oder
    Figure DE112015003165T5_0036
    wobei k und l ganze Zahlen sind von 0 to 2,
    R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden,
    R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen,
    R7 is entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl,
    m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3,
    wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3;
    und wobei Y in einer Ausführungsform
    Figure DE112015003165T5_0037
    ist für p = 2.
  • In einer Ausführumgsform sind R3 and R4 identisch; in einer anderen Ausführumgsform sind R3 and R4 unterschiedliche Alkylamine.
  • Diese Reaktion verläuft mittels eines radikalischen Mechanismus. Chemische Radikal-Quellen können hinzugegeben werden, um die Reaktion zu starten oder sie kann einfach im Sonnenlicht erfolgen. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Reaktion durch UV-Bestrahlung initiiert.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestelung der Erfindung umfasst das Verfahren der Schritt der Oxidation des Thioethers der allgemeinen Formel (VII) zu Sulfoxide (S=O) und/oder Sulfon (S(=O)2) mittels eines Oxidationsmittels zur Synthese eines Aminolipids enthaltend eine Sulfoxid- oder Sulfongruppe.
  • Die Oxidation des Thioethers wird bevorzugt bei Raumtemperatur mit wässrigem Wasserstoffperoxid in einem Lösemittel wie Methanol durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Oxidation des Thioethers mittels eines Katalysators wie Titanium-enthaltenden Zeolithen katalysiert werden. Diese Reaktion wurde bereits von Hulea et al. (Hulea et al. (Hulea V, Moreau P, Renzo FD. Thioether oxidation by hydrogen peroxide using titanium-containing zeolites as catalysts. Journal of Molecular Catalysis A: Chemcial. 1996, 111: 325–332) vorgeschlagen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin die folgenden beiden Schritte:
    • a) Reaktion von Alkinen oder Alken der allgemeinen Formel (IVa), (IVb), (IVc), oder (IVd)
      Figure DE112015003165T5_0038
      wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist, mit der Verbindung
      Figure DE112015003165T5_0039
      um eine Verbindung der allgemeinen Formel (Va), (Vb), (Vc), oder (Vd) zu erhalten
      Figure DE112015003165T5_0040
    • b) Reaktion von Alkinen oder Alkenen der allgemeinen Formel (Va), (Vb), (Vc), oder (Vd)
      Figure DE112015003165T5_0041
      mit einem Amin der allgemeinen Formel (R3R4R5N)(CH2)mZ, mit m als ganzer Zahl von 1 bis 12, wobei Z OH, NH2, NH, oder ein sekundäres heterozyklisches Amin der Formel
      Figure DE112015003165T5_0042
      ist, wobei k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind, so dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (VI’) erhalten wird
      Figure DE112015003165T5_0043
      wobei E entweder CH=CH2 oder C≡CH ist, R1 and R2 sind gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneineander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind, Y ist entweder
      Figure DE112015003165T5_0044
      oder Heterocyclen der Formel
      Figure DE112015003165T5_0045
      oder wobei k und l ganze Zahlen sind von 0 bis 2, R3 und R4 sind gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneineander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden, R5 ist entweder nicht vorhanden oder ist Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3, wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3. in einer Ausführungsform sind R3 und R4 identisch; in einer anderen Ausführungsform sind R3 und R4 verschiedene Alkylamine.
  • In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den folgendne Schritt:
    Reaktion von Alkinen doer Alkenen der allgemeinen Formel (IVe), (IVf), (IVg), oder (IVh)
    Figure DE112015003165T5_0046
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist,
    mit einem Amin der allgemeinen Formel (R3R4R5N)(CH2)mZ, mit m als ganzer Zahl von 1 bis 12, wobei Z NH2, NH, N oder sekundäres heterozyklic Amin der Formel
    Figure DE112015003165T5_0047
    ist, worin k und l eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist,
    so dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (VI’’) erhalten wird
    Figure DE112015003165T5_0048
    worin E entweder CH=CH2 oder C≡CH ist,
    R1 und R2 sind gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe,
    Y ist entweder NH, NR7,
    Figure DE112015003165T5_0049
    oder ein Heterocyclu der Formel
    Figure DE112015003165T5_0050
    worin k und l ganze Zahlen sind von 0 to 2,
    R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden,
    R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen,
    R7 is entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl,
    m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3,
    wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3;
    und wobei Y in einer Ausführungsform
    Figure DE112015003165T5_0051
    ist für p = 2.
  • In einer Ausführumgsform sind R3 and R4 identisch; in einer anderen Ausführumgsform sind R3 and R4 unterschiedliche Alkylamine.
  • Insbesondere die Synthese der Verbindungen 67–76 wird basierend auf einer Reaktion von Verbindungen der allgemeinen Formel IVg und IVh wie oben und hierin beschrieben durchgeführt.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Synthese von Aminolipiden gemäß Formula I,
    Figure DE112015003165T5_0052
    wobei Z entweder wasserstoff oder -X1-R1 ist,
    R1 und R2 sind gleich oder unterschiedlich voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind,
    X1 und X2 gleich oder unterschiedlich, entweder S oder S=O oder S(=O)2,
    Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0053
    oder ein Heterozyklus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0054
    oder worin k und l eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist,
    R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden,
    R5 ist entweder nicht vorhanden oder ist Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen,
    m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3.
  • In einer Ausführungsform sind R3 and R4 identisch; in einer anderen Ausführungsform sind R3 und R4 unterschiedliche Alkylamine.
  • Das Verfahren stellt die erste parallele Synthese großer Bibliotheken von ionisierbaren kationischen Aminolipiden dar, basierend auf Thiol-in Chemie kombinatorischer Synthese in der Flüssigphase (ohne chromatografische Aufreinigung), umfassend die folgenden Schritte:
  • Der erste Schritt ist die Reaktion von Alkinen oder Alkenen der allgemeine Formel ((IVe), (IVf), (IVg), oder (IVh)
    Figure DE112015003165T5_0055
    wobei n eine ganze Zahl ist von 1 bis 12,
    mit einem Amin der allgemeinen Formel (R3R4R5N)(CH2)mZ, mit m als ganzer Zahl von 1 bis 12, worin Z NH2, NH, N oder ein sekundäres heterozyklisches Amin der Formel
    Figure DE112015003165T5_0056
    ist, worin k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind, um eine Verbidnung der allgemeinen Formel (VI’’) bereitzustellen
    Figure DE112015003165T5_0057
    wobei E entweder CH=CH2 oder C≡CH ist, Y ist entweder NH, NR7, +NR6R7,
    Figure DE112015003165T5_0058
    oder ein Heterozyklus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0059
    und wobei Y in einer Ausführungsform auch
    Figure DE112015003165T5_0060
    ist für p = 2.
  • R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedliche C1-C12 Alkyle, wobei das Alkyl optional substituiert ist mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden,
    R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen,
    R7 ist entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl,
    m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind n and m unabhängig voneinander ganze Zahlen 1, 2 oder 3, und p ist unabhängig die ganze Zahl 1 oder 2.
  • In einer Ausführungsform sind R3 and R4 identisch; in einer anderen Ausführungsform sind R3 und R4 unterschiedliche Alkylamine.
  • In particular, the synthesis of the compounds 67–76 is performed based on a reaction with compounds of general formula IVg and IVh as described above and herein.
  • Insbesondere die Synthese der Verbindungen 67–76 wird basierend auf einer Reaktion von Verbindungen der allgemeinen Formel IVg und IVh wie oben und hierin beschrieben durchgeführt.
  • Der zweite Schritt ist die Reaktion von Alkinen oder Alkenen der allgemeinen Formel a (VI’’) mit Verbindungen der allgemeinen Formeln HS-R1 und HS-R2, wobei R1 und R2 gleich oder unterscheidlich und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl sind, welche optional substituted sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, unter entweder UV-Bestrahlung oder mittels eines Radikalstarters, so dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (VII’’) erhalten wird
    Figure DE112015003165T5_0061
    worin n, m, p, Y, R1, R2, R3, R4 und R5 wie oben für Formula VI’’ definiert sind.
  • Diese Reaktion verläuft mittels eines radikalischen Mechanismus. Chemische Radikal-Quellen können hinzugegeben werden, um die Reaktion zu starten oder sie kann einfach im Sonnenlicht erfolgen. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Reaktion durch UV-Bestrahlung initiiert.
  • Der optionale dritte Schritt ist eine Oxidationsreaktion der Thioethergruppe des Produktes des zweiten Schritts mit einem Oxidationsmittel zur Bereitstellung einer Verbindung der allgmeinen Formel (I), wobei n, m, p, Y, Z, R1, R2, R3, R4 und R5 wie oben definiert sind und X1, X2 gleich oder unterschiedlich, entweder S=O oderr S(=O)2 sind. Der dritte Schritt wird bevorzugt bei Raumtemperatur mit wässrigem Wasserstoffperoxide in einem Lösemittel wie Methanol durchgeführt.
  • Der dritte Schritt kann weiterhin mittels eines Katalysators wie Titanium-enthaltenden Zeolithen katalysiert werden. Diese Reaktion wurde bereits von Hulea et al. (Hulea et al. (Hulea V, Moreau P, Renzo FD. Thioether oxidation by hydrogen peroxide using titanium-containing zeolites as catalysts. Journal of Molecular Catalysis A: Chemcial. 1996, 111: 325–332) vorgeschlagen. Überraschender Weise hat diese Reaktion keinen Einfluss auf andere funktionelle Gruppen des Aminolipids des zweiten Schritts.
  • In einer Ausführungsform ist dieser dritte Schritt notwendig.
  • In einer Ausführungsform umfasst die ERfindung die Reaktion von Alkinen oder Alkenen der allgemeinen Formul (VIII)
    Figure DE112015003165T5_0062
    mit den Verbindungen der allgemeinen Formeln HS-R1 und HS-R2,
    unter entweder UV-Bestrahlung oder mittels eines Radikalstarters, so dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (Ic) erhalten wird
    Figure DE112015003165T5_0063
    worin R1 and R2 gleich oder unterschiedlich sind und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 aAkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optionally substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe,
    X1 und X2 sind identisch oder verschieden, entweder S oder S=O oder S(=O)2,
    Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0064

    wobei Z
    Figure DE112015003165T5_0065
    ist und k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind.
    m ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist ene ganze Zahl von 1 bis 12.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt der Oxidation des Thioethers der allgemeinen Formel (VII) zu Sulfoxide (S=O) und/oder Sulfon (S(=O)2) mittels eines Oxidationsmittels zur Synthese eines Aminolipids enthaltend eine Sulfoxid- oder Sulfongruppe.
  • Die Oxidation des Thioethers wird bevorzugt bei Raumtemperatur mit wässrigem Wasserstoffperoxid in einem Lösemittel wie Methanol durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Oxidation des Thioethers mittels eines Katalysators wie Titanium-enthaltenden Zeolithen katalysiert werden. Diese Reaktion wurde bereits von Hulea et al. (Hulea et al. (Hulea V, Moreau P, Renzo FD. Thioether oxidation by hydrogen peroxide using titanium-containing zeolites as catalysts. Journal of Molecular Catalysis A: Chemcial. 1996, 111: 325–332) vorgeschlagen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren sind sehr vielseitig; sie können verwendet werden, um große Bibliotheken (kationischer) Aminolipide für schnelle Zell-basierte Screening Tests in einer sehr kostengünstigen Weise zu synthetisieren. Die erhaltenen Verbindungen haben sowohl einen hydrophoben Charakter aufgrund ihrer langen unpolaren Reste und einen hydrophilen Charakter aufgrund ihrer Aminogruppe. Dieser amphiphile Charakter kann dazu verwendet werden, Lipidpartikel, zum Beispiel Lipiddoppelschichten, Micellen, Liposomen, etc. herzustellen. Weiterhin verleiht die Aminogruppe dieser Verbindungen eine kationische Ladung, die für Transfektions-Agenzien nützlich ist. Diese Bibliothek verschiedener Verbindungen mit neuen Eigenschaften kann bequem auf ihr Transfektionspotential in einer großen Anzahl von Zelltypen getestet werden.
  • Lipidpartikel
  • Eine weitere Asuführungsform der Erfindung betrifft die Lipidpartikel enthaltend ein Aminolipid nach einem der Formeln I bis III. Innerhalb des Umfangs der Erfindung bedeutet der Begriff „Lipidpartikel“ nanogroße Objekte aus Aminolipiden, die in eine wässrige Lösung gegeben werden. Diese Partikel sind unter anderem bi-schichtige Vesikel (Liposomen), multilamellare Vesikel oder Micellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsformen der vorliegende Erfindung sind diese Nanopartikel Liposmen enthaltend ein Aminolipid nach einer der Formeln I bis III. Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind Liposomen Mikrovesikel, die aufgebaut sind aus einer Doppelschicht lipider amphiphatischer (amphiphiler) Moleküle, die ein wässriges Kompartiment umschließen.
  • Die Bildung von Liposomen ist nicht ein spontaner Prozess. Lipidvesikel werden erst gebildet, wenn Lipide, wie Phosphorlipide, in Wasser gegeben werden und dadurch eine Einzelschicht oder eine Serie von Doppelschichten bilden, die jeweils von Wassermolekülen voneinander getrennt sind. Liposomen können durch Sonifikation von Lipidvesikeln in Wasser hergestellt werden.
  • Innerhalb des Umfangs der Erfindung bedeutet der Begriff „Lipiddoppelschicht“ eine dünne Menbran aus zwei Schichten von Lipidmolekülen. Der Begriff „Micelle“ bedeutet ein Aggregat von oberflächenaktiven Molekülen dispersiert in einem flüssigen Kolloid. In wässriger Lösung bildet eine typische Micelle ein Aggregat mit den hydrophilen Kopfregionen im Kontakt mit Wasser, wobei die eine hydrophobe Schwanzregion in die Mitte der Micelle orientiert wird.
  • Innerhalb des Umfangs der Erfindung bedeutet der Begriff „Zelle“ einen allgemeinen Begriff und umfasst die Kultivierung von einzelnen Zellen, Geweben, Organen, Insektenzellen, Vogelzellen, Fischzellen, Amphibienzellen, Säugetierzellen, primären Zellen, kontinuierlichen Zelllinien, und oder genetisch veränderten Zellen, so wie rekombinanten Zellen, die ein heterologes Polypeptid oder Protein experimieren. Rekombinante Zellen umfassen beispielsweise Zellen, die heterologe Polypeptide oder Proteine experimentieren, wie einen Wachstumsfaktor oder einen Blutfaktor.
  • In einer Ausführungsform enthalten diese Lipidpartikel oder Liposomen auch ein Helferlipid. Ein derartiges Helferlipid ist ein nicht-kationisches Lipid, bevorzugt ein nicht-kationisches Phospholipid. Die aus einer Mischung aus kationischen Aminolipiden und nicht-kationischen (neutralen) Phospholipiden bestehen, sind die effektivsten für die Einschleusung von Nukleinsäure in Zellen. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das nicht-kationische Lipid DOPE. In einer meistbevorzugten Ausführungsform werden Helferlipid and Aminolipid der Ansprüche 1–4 in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, um Liposomen zu bilden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Lipidpartikel oder das Liposom auch ein Sterol auf. Sterol ist wie Cholesterol eine natürliche Komponente von Zellmembranen. Es kann dazu verwendet werden, den Partikel zu stabilisieren und unterstützt die Integration in die Zellmembran.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthalten die Lipidpartikel oder Liposomen weiterhin ein bioaktives Agens. Innerhalb des Umfangs der vorliegende Erfindung ist ein bioaktives Agens eines, welches einen biologischen Effekt zeigt, wenn es in eine Zelle oder in einen Wirt eingeschleust wird, beispielsweise in Form der Anregung einer Immunantwort oder einer Entzündungsreaktion, durch Zeigen einer enzymatischen Aktivität oder durch das Komplimentieren einer Mutation, etc. Bioaktive Agenzien schließen, unter anderem, Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Antikörpern und kleinen Moleküle ein.
  • Wenn ein Liposom dazu verwendet wird, ein Medikament entweder innerhalb der Lipiddoppelschicht oder im inneren wäßrigen Raum einzuschließen, kann der Begriff „Liposom-Medikament“ verwendet werden.
  • In einer meist bevorzugten Ausführungsform ist das bioaktive Agens eine Nukleinsäure. In einer anderen Ausführungsformen ist das bioaktive Agens ein Mitglied optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem antineoplastischen Agens, einem Antibiotikum, einem Immunmodulator, einem anti-entzündlichen Agens, einem im Zentralen Nervensystem wirkenden Agens, einem Polypeptid oder einem Polypeptoid.
  • In einer weiteren Ausführungsform enthält der Lipidpartikel oder das Liposom mindestens ein Polyethylenglycol(PEG)-Lipid. PEG-Lipide helfen dabei, die Partikel und ihrer Fracht vor der Degradation in vitro und in vivo zu schützen. Es kann bei der Medikamentenverabreichung mittels Liposemen verwendet werden (PEG-Liposom).
  • Lipidpartikel oder Liposomen, die ein bioaktives Agens enthalten, können zur Verabreichung jeglicher einer Vielfalt angehörender therapeutischer Agenzien in Zellen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von oben beschriebenen Lipidpartikeln, insbesondere Liposmen, für die Verabreichung eines bioaktiven Agens in eine Zelle.
  • Bevorzugt ist das bioaktive Agens eine Nukleinsäure, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA, antisense Oligonucleotide, eine DNA, ein Plasmid, eine ribosomale RNA (rRNA), eine micro RNA (miRNA), transfer RNA (tRNA), eine kleine inhibitorische RNA (siRNA) oder kleine nukleäre RNA (snRNA). Das bioaktive Agens kann auch ein antineoplastisches Agens, ein Antibiotikum, ein Immunmodulator, ein anti-entzündliches Agens, ein im Zentralen Nervensystem wirkendes Agens, ein Antigens oder Fragmente davon, Proteine, Peptide, Polypeptoide, Vaccine und kleine Moleküle oder Mischungen daraus.
  • Wie oben beschrieben sind Lipidpartikel oder Liposomen enthaltend Aminolipide wie in der vorliegenden Erfindung definiert geeignet, um bioaktive Agenzien in Zellen zu verbringen. Die große Vielfalt von verschiedenen Aminolipiden, die mittels des genannten vielseitigen Syntheseverfahrens synthetisiert werden können, kann für bestimmte Charakteristika gescreent werden, die den Liposmen verliehen werden. Wichtige Charakteristika sind beispielsweise die Transfektionseffizienz, Zytotoxizität, Adhäsion des in die Zelle zu verbringenden Agens, die Stabilität der Liposomen, die Größe der Liposomen, etc. Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Herstellung von spezifisch adaptierten Liposomen für bestimmte Anwendungen.
  • Beispielsweise können Lipidpartikel (Liposomen) dazu verwendet werden, multizelluläre Gewebe oder Organe zu transfizieren. Dies eröffnet die Möglichkeit neuartiger Therapien für Patienten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Patient jedes Säugetier sein, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Menschen, Mäusen, Ratten, Schweinen, Katzen, Hunden, Pferden, Ziegen, Rindern und Affen und/oder anderen. Am bevorzugtesten ist der Patient ein Mensch.
  • Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Lipidpartikel oder Liposemen enthaltend ein Aminolipid gemäß einer der Formeln (I–III) zur Verwendung als Medikament.
  • Insbesondere können die Lipidpartikel oder Liposomen an Patienten verabreicht werden zur Verwendung in der Gentherapie, in der Genvaccination, in der Antisense-Therapie oder in Therapie mittels interferierender RNA. Ein erfindungsgemäßer Lipidpartikel kann auch verwendet werden für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung im Nukleinsäure-Transfer, beispielsweise bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie, insbesondere in der Behandlung eines Zustandes, der durch einen genetischen defekt oder eine genetische Modifikation verursacht wird oder damit im Zusammenhang steht.
  • Ziele für eine Gentherapie sind wohlbekannt und schlißen monogene Störungen ein, beispielsweise zystische Fibrose, verschiedene Krebsarten und Infektionen, zum Beispiel virale Infektionen, zum Beispiel mit HIV. Zum Bsipiel eröffent die Transkefektion mit dem p53 Gen ein großen Potenzial zur Krebsbehandlung. Ziele zur Genvaccination gegen Pathogene, für die Vaccine aus natürlichen Quellen zu gefährlich für die Anwendung beim Menschen sind, und rekombinante Vaccine, sind nicht immer effektiv, zum Beispiel Hepatitis B Virus, humanes Immunodefizienz Virus (HIV), Hepatitis C Virus (HCV) und Herpes simplex Virus.
  • Ziele für eine Therapie sind ebenfalls bekannt. Weitere Ziele für Gentherapie und Antisense-Therapie werden fortlaufend vorgeschlagen, da das Wissen der genetischen Grundlagen von Krankheiten wächst, was auch für weitere Ziele für Gen-Vaccination gilt.
  • Ein erfindungsgemäßer Lipidpartikel kann im Rahmen einer Vaccination verwendet werden. Daher kann ein Lipidpartikel oder Liposom dazu verwendet werden, ein Antigen oder eine für ein Antigen kodierende Nukleinsäure einzuschleusen. Derartige Techniken sind einem Fachmann bekannt. Beispiele für Liposm-Vaccination sind beschrieben in Butts C, et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 2005, 23: 6674–6681 und in U’Ren L, et al. Vaccination with liposome-DNA complexes elicits enhanced antitumor immunity. Cancer Gene Therapy. 2006, 13: 1033–1044.
  • Ein erfindungsgemäßer Lipidpartikel kann dazu verwendet werden, eine Immunreaktion gegen eine große Anzahl von Antigenen zur Behandlung und Prävention einer Anzahl von Zuständen hervorzurufen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Krebs, Allergien, Toxizität und Infektion durch Pathogene wie Viren, Bakterien, Pilzen und anderen pathogenen Organismen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Lipidpartikel oder das Liposom zur Behandlung einer viralen Infektion, einer Lebererkrankung oder -funktionsstörung, oder Krebs als Medikament verwendet werden. Bei Lebererkrankungen können Liposomen durch Zellen des retikulo-endothelialen Systems eingefangen werden, welche in erster Linie in der Leber vorhanden sind. Die Liposomen werden dort angereichert.
  • Figuren
  • Die folgenden Figuren und Beispiele werden gezeigt, um ein besseres Verständnis der Beschreibung von Verfahren und konzeptioneller Aspekte der Erfindung zu ermöglichen.
  • 1: Vergleichende mikroskopische Aufnahmen, die die Ergebnisse einer Lipofektion zeigen, die unter Verwendung des amino-liposomalen Reagenz # 30 und eines kommerziell erhältlichen Transfektions-Agens durchgeführt wurden.
  • 2: Vergleichende mikroskopische Aufnahmen, die die Ergebnisse einer Lipofektion zeigen, die unter Verwendung des amino-liposomalen Reagenz # 60 und eines kommerziell erhältlichen Transfektions-Agens durchgeführt wurden.
  • 3: Grafischer Überblick der Transfektionseffizienz einer Bibliothek der Beispielverbindungen 1 bis 44 verglichen mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz.
  • 4: Grafischer Überblick der Transfektionseffizienz einer Bibliothek der Beispielverbindungen 47 bis 76 verglichen mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz.
  • 5: siRNA Gen silencing in MEF Zellen mittels Lipidreagenz #24.
  • 6: siRNA Gen silencing in MEF Zellen mittels Lipidreagenz #64.
  • Beispiele
  • Die folgenden 81 Beispiele werden gezeigt, um ein besseres Verständnis der Beschreibung von Verfahren und konzeptioneller Aspekte der Erfindung zu ermöglichen. Beispiel 1: Synthese und Charakterisierung von 2,3-Bis(dodecylthio)propyl (2-(dimethylamino)ethyl)carbamat
    Figure DE112015003165T5_0066
  • Das Aminolipid wurde mit zwei Schritten synthetisiert. Der erste Schritt besteht darin, Prop-2-yn-1-yl(2-(dimethylamino)ethyl) zu synthetisieren. 0,1 mmol Carbonyiimidazol und 0,1 mmol Propargylalkohol wurden in 2 ml DCM gelöst und in ein 20 ml Glasgefäß gegeben, das mit Aluminiumfolie bedeckt ist. Die Lösung wurd für 1 h geschüttelt, dann wurden 0,1 mmol Dimethylethan-1,2-diamin und 0,01 mmol DMAP hinzugegeben und die Lösung wurde über Nacht geschüttelt. Der zweite Schritt ist die Photoaddition von Dodecanethiol mit Prop-2-yn-1-yl(2-(dimethylamino)ethyl)carbamat. Dazu wurden 0,2 mmol Dodecanthiol und 3 mg DMPA zu der Lösung aus dem ersten Schritt hinzugegeben und das Gefäß wurde für 5 Minuten entgast und 3 Minuten mit Argon und unter 365 nm UV for 2h bestrahlt. Das Gefäß wurde getrocknet und bei 4 °C aufbewahrt. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Molekülion wurde deutlich als 574,46 W/z identifiziert.
  • Die Synthesen der Verbindungen der Beispiele 2–22 wurden ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt. Schritt 1 unterscheidet sich in der Verwendung der Amine und das stöchiometrische Verhältnis unterscheidet sich für die Beispiele 17–22. Schritt 2 unterscheidet sich in den Edukten, wohingegen das stöchiometrische Verhältnis unverändert blieb. Die entstehenden Verbindungen und die korrespondierenden MW/z Werte sind in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1: Beispiele der synthetisierten Verbindungen 2–22 und der korrespondierenden MW/z Werte.
    Figure DE112015003165T5_0067
    Figure DE112015003165T5_0068
    Figure DE112015003165T5_0069
    Synthese und Charakterisierung von 1-(2,3-bis(dodecylthio)propyl)-3-(2-(dimethylamino)ethyl)harnstoff
    Figure DE112015003165T5_0070
  • Das Syntheseverfahren für 1-(2,3-bis(dodecylthio)propyl)-3-(2-imethylamino)ethyl)hernstoff ist ähnlich zumvorangehenden Beispiel. Der erste Schritt ist die Synthese von 1-(2-(Dimethylamino)ethyl)-3-(prop-2-yn-1-yl)harnstoff. 0,1 mmol Carbonyiimidazole und 0,1 mmol Propargylamin wurden in 2 ml DCM gelöst und und in ein 20 ml Glasgefäß gegeben, das mit Aluminiumfolie bedeckt ist. Die Lösung wurde für 1 h geschüttelt, dann wurden 0,1 mmol Dimethylethan-1,2-diamin und 0,01 mmol DMAP hinzugegeben und die Lösung wurde über Nacht geschüttelt.
  • Der zweite Schritt ist die Photoaddition von Thiol mit 1-(2-(dimethylamino)ethyl)-3-(prop-2-yn-1-yl)harstoff. Dazu wurden 0,2 mmol Dodecanthiol und 3 mg DMPA zu der Lösung aus dem ersten Schritt hinzugegeben und das Gefäß wurde mit Argon entgast und unter 365 nm UV for 2h bestrahlt. Das Gefäß wurde getrocknet und bei 4 °C aufbewahrt. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Molekülion wurde deutlich als 573,47 W/z identifiziert.
  • Die Synthesen der Verbindungen der Beispiele 24–44 wurden ähnlich wie in Beispiel 23 durchgeführt. Schritt 1 unterscheidet sich in der Verwendung des Amins und das stöchiometrische Verhältnis unterscheidet sich für die Beispiele 39–44. Schritt 2 unterscheidet sich in den Edukten, wohingegen das stöchiometrische Verhältnis unverändert blieb. Die entstehenden Verbindungen und die korrespondierenden MW/z Werte sind in Tabelle 2 zusammengefasst: Tabelle 2: Beispiele der synthetisierten Verbindungen 24–44 und der korrespondierenden MW/z Werte.
    Figure DE112015003165T5_0071
    Figure DE112015003165T5_0072
    Figure DE112015003165T5_0073
    Figure DE112015003165T5_0074
    Beispiel 45: Synthese und Charakterisierung von 3-(Dodecylsulfinyl)-2-(dodecylthio)propyl(2-(dimethylamino)ethyl)carbamat
    Figure DE112015003165T5_0075
  • Das Aminolipid wurde in einem Schritt synthesiert. 1 mmol 2,3-Bis(dodecylthio)propyl (2-(dimethylamino)ethyl)carbamat (Produkt von Beispiel 1) wurde mit 10 mmol wässrigem Wasserstoffperoxid (30%) in 10 ml Methanol gemischt, und bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Dann wurde die Mischung in ein 50 ml Kolben überführt und verdampft. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Molekülion wurde deutlich als 590,5 W/z identifiziert. Beispiel 46: Synthese und Charakterisierung von 2,3-Bis(dodecylsulfonyl)propyl (2-(dimethylamino)ethyl)carbamat
    Figure DE112015003165T5_0076
  • Das Aminolipid wurde in einem Schritt synthetisiert. 1 mmol 2,3-Bis(dodecylthio)propyl (2-(dimethylamino)ethyl)carbamat (Produkt aus Beispiel 1) wurde mit 10 mmol wässrigem Wasserstoffperoxid (30%) in 10 ml Methanol gemischt, und bei Raumtemperatur für 2 d gerührt. Dann wurde die Mischung in einen 50 ml Kolben überführt und verdampft. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Molekülion wurde deutlich als 638,4 W/z identifiziert. Beispiel 47: Synthese und Charakterisierung von N1,N1-Bis(3-(dodecylthio)propyl)-N2,N2-dimethylethan-1,2-diamin
    Figure DE112015003165T5_0077
  • Das Syntheseverfahren für N1,N1-Bis(3-(dodecylthio)propyl)-N2,N2-dimethylethan-1,2-diamin ist ähnlich zu den vorangehenden Beispielen. 1 mmol of N1,N1-Dimethylethan-1,2-diamin, und 2 mmol 3-Bromoprop-1-en wurden in ein 20 ml Glasgefäß enthaltend 2 ml THF und 1 wt % Cs2CO3 gegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei 40°C geschüttelt. Das Lösungsgemfäß wurde dann aus dem Schüttler entfernt, zentrifugiert und der Überstand wurde in ein neues 20 ml Gefäß überführt. 2 mmol Dodecan-1-thiol und 5–7 wt% 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetonphenon (DMPA) Lösung in THF wurden zu dem 20 ml Glasgefäß gegeben. Die Mischung wurde mit UV 365 nm für 2 h bestrahlt und dan wurde das THF verdampft. Dieser Schritt wurde ähnlich zum vorangehenden Beispiel ausgeführt. Die stöchiometrischen Verhältnisse wurden beibehalten. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert (m/z 572.51).
  • Die Synthesen der Beispiele 48–59 wurden ähnlich zu Beispiel 47 ausgeführt. Schritt 1 unterscheidet sic him verwendeten Amin, wobei die stöchimetrischen Verhältnisse beibehalten wurden. Die entstehenden Verbindungen und die korrespondierenden Molekülionen sind in Tabelle 3 zusammengefasst: Tabelle 3: Beispiele der synthetisierten Verbindungen 48–56 und der korrespondierenden MW/z Werte.
    Figure DE112015003165T5_0078
    Figure DE112015003165T5_0079
    Beispiel 57: Synthese und Charakterisierung von 11-(Dodecylthio)-2-methyl-9-oxa-13-thia-2,5-diazapentacosan-7-ol
    Figure DE112015003165T5_0080
  • Das Lipid wurde wie folgt synthetisiert. 1 mmol N1,N1-Dimethylethane-1,2-diamin, und 1 mmol 2-((Prop-2-yn-1-yloxy)methyl)oxiran wurden in 2 ml Ethanol in einem 20 ml Glasgefäß gelöst, das mit einem Septum bedeck war. Die Lösung wurde über Nacht bei 40 °C geschüttelt. Das Lösungsgefäß wurde dann aus dem schüttler entfernt, da Ethanol wurd verdampft 2 ml frisches THF wurde hinzugegeben und gut vermischt, die Lösung wurde dann für 5 min entgast und mit Argon (Ar) für 3 min gefüllt, dann mit einer Kappe verschlossen. 2 mmol Dodecan-1-thiol und 5–7 wt% 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetonphenon (DMPA) Lösung in THF wurden in das 20 ml Glasgefäß gegeben. Die Mishcung wurde unter UV 365 nm für 2 h bestrahlt, dann wurde das THF verdampft. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Molekülion wurde deutlich als 605,08 MW/z identifiziert.
  • Die Synthese der Verbindungen der Beispiele 58–66 wurden ähnlich wie Beispiel 57 ausgeführt. Die entstehenden Verbindungen und die korrespondierenden Molekülionen sind in Tabelle 4 zusammengefasst: Tabelle 4: Beispiele der synthetisierten Verbindungen 48–56 und der korrespondierenden MW/z Werte.
    Figure DE112015003165T5_0081
    Figure DE112015003165T5_0082
    Beispiel 67: Synthese und Charakterisierung von 21-(2-(Dimethylamino)ethyl)-17,25-dioxa-13,29-dithia-21-azahentetracontan-19,23-diol
    Figure DE112015003165T5_0083
  • Das Syntheseverfahren für 21-(2-(dimethylamino)ethyl)-17,25-dioxa-13,29-dithia-21-azahentetracontan-19,23-diol ist ähnlich zum vorangehenden Beispiel. 1 mmol N1,N1-Dimethylethane-1,2-diamin und 2 mmol 2-((Allyloxy)methyl)oxiran wurden in 2 ml Ethanol in einem 20 ml Glasgefäß gelöst, dass mit einem Septum bedeck war. Die Lösung wurde über Nacht bei 40°C geschüttelt. Das Lösungsgefäß wurde dann aus dem Schüttler entfernt, Ethanol wurde verdampft und 2 ml frisches THF wurden hinzugefügt und gut vermischt, die Lösung wurde dann entgast für 5 min und mit Argon (Ar) for 3 min gefüllt, dann mit einer Kappe bedeckt. 2 mmol dDodecan-1-thiol und 5–7 wt% 2,2-Dimethoxy-2phenylacetonphenon (DMPA) Lösung in THF wurden in das 20 ml Glasgefäß gegeben. Die Mischung wurde mit UV 365 nm für 2 h bestrahlt und dan wurde das THF verdampft. Dieser Schritt wurde ähnlich zum vorangehenden Beispiel ausgeführt. Die stöchiometrischen Verhältnisse wurden beibehalten. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert (m/z 721.24).
  • Syntheses according to the examples 68–76 were carried out similarly to example 67. The resulting compounds and the corresponding molecular ion are resumed in table 5:
    Die Synthesen der Beispiele 68–76 wurden ähnlich zu Beispiel 67 ausgeführt. Die entstehenden Verbindungen und die korrespondierenden Molekülionen sind in Tabelle 5 zusammengefasst: Tabelle 5: Beispiele der synthetisierten Verbindungen 68–76 und der korrespondierenden MW/z Werte.
    Figure DE112015003165T5_0084
    Figure DE112015003165T5_0085
    Figure DE112015003165T5_0086
    Beispiel 77: Synthese und Charakterisierung von N1-(3-(dodecylsulfinyl)-2-(dodecylthio)propyl)-N2,N2-dimethylethan-1,2-diamin
    Figure DE112015003165T5_0087
  • Das Aminolipid wurde in einem Schritt synthetisiert. 1 mmol N1-(2,3-Bis(dodecylthio)propyl)-N2,N2-dimethylethan-1,2-diamin (Produkt aus Beispiel 50) wurde mit 10 mmol wässrigem Wasserstoffperoxid (30%) in 10 ml Methanol gemischt, und bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Dann wurde die Mischung in einen 50 ml Kolben überführt und verdampft. Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Molekülion wurde deutlich als 546,5 MW/z identifiziert. Beispiel 78: Synthese und Charakterisierung von N1-(2,3-Bis(dodecylsulfonyl)propyl)-N2,N2-dimethylethan-1,2-diamin
    Figure DE112015003165T5_0088
  • Das Aminolipid wurde in einem Schritt synthetisiert. 1 mmol N1-(2,3-Bis(dodecylthio)propyl)-N2,N2-dimethylethan-1,2-diamin (Produkt aus Beispiel 50) wurde mit 10 mmol wässrigem Wasserstoffperoxid (30%) in 10 ml Methanol gemischt, und bei Raumtemperatur für 2 d gerührt. Dann wurde die Mischung in einen 50 ml Kolben überführt und verdampft.
  • Um die Identität des Moleküls zu verifizieren, wurde unaufbereitetes Produkt mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Molekülion wurde deutlich als 594,4 MW/z identifiziert.
  • Screening der kationischen Lipide zur Zelltransfektion
  • Die gut dokumentierte HEK 293T Zelllinie wurde für die Beispiele 79 und 80 verwendet.
  • Das natürliche Phospholipid Dioleolylphosphatidylethanolamin (DOPE – Struktur unten gezeigt) wurde als das benötigte Co-Lipid (auch als Helfer-Lipid bezeichnet) ausgewählt. Es wird nicht für die Stabilität von Liposomen per se benötigt, sondern für den Abbau der Lipidmembranen im endozytischen Kompartiment (Endosomen) von Zellen, was die Freigabe des bioaktiven Agens in das Cytosol und/oder den Nukleus ermöglicht. Im Grunde ist es für den erwünschten Effekt der stabilen Liposombildung in Kombination mit den erfindungsgemäßen Aminolipiden (DEDPA) nötig. DOPE mit einem representativen kationischen Aminolipid (Struktur unten gezeigt) in verschiedenen Verhältnisse gemischt. Beide Lipide wurden in Ethanol zu 50 mg/ml gelöst und zu einem finalen Volumen von 30 µl zusammen gegeben. DOPE (Co-Lipid):
    Figure DE112015003165T5_0089
    2,3-Bis(dodecylthio)propyl(2-(dimethylamino)ethyl)carbamat (DPDEC) als representatives neuartiges kationisches Aminolipid: DPDEC:
    Figure DE112015003165T5_0090
    Tabelle 6: getestete DPDEC Verhältnisse
    DPDEC DOPE
    0 1
    1 3
    1 2
    1 1
    2 1
    3 1
    1 0
  • Diese 30 µl Ethanolmischungen wurden dann 70 µl einer 0,2 mol/l Natriumacetat Pufferlösung (pH 5,0) hinzugegeben, mit konstantem vortexen für 30 s, gefolgt von einer Ultraschlallbehandlung für 5 min, um Liposomen zu bilden. Der finale Lipidgehalt beträgt 2 mg/ml. Diese finale 2 mg/ml Liposomprobe wird als “Lipidreagenz” bezeichnet.
  • 0,1 µl, 0,2 µl, 0,3 µl, 0,4µl und 0,5 µl des obigen Lipidreagenz wurden mit entweder 50 ng oder 100 ng Plasmid-DNA (aufweisend die pCS-LacZ und pEGFP-C1 Plasmids in einem Verhältnis von 9:1) gemischt und mit Zellen wie unten beschreiben gemischt:
    (gezeigte Mengen sind für eine Vertiefung einer 96 Vertiefungen aufweisenden Kulturplatte)
    • 1. 0,1 µl–0,5 µl Lipid-Reagenz verdünnt in 10 µl of 50 mmol/l Natriumacetatpuffer, pH 5,0
    • 2. Nach 2–5 min Inkubation, die verdünnte Lipid-Reagenz aus (1) wurde zu entweder zu 50 ng oder 100 ng Plasmid DNA (DNA gelöst in 10 µl 50 mmol/l Natriumacetatpuffer, pH 5,0) hinzugegeben.
    • 3. Proben wurden bei RT für 30 min stehen gelassen, damit Lipid/DNA Transfektionskomplexe gebildet wird. Da DNA negativ geladen ist, assoziiert es unspezifisch mit den positiv geladenen Kopfgruppen der kationischen Lipide in den Liposomen.
    • 4. Nach 30 min wurden 50 µl frisch suspendierte HEK 293 Zellen (ungefähr 50,000 Zellen, in DMEM Kulturmedium ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum) zu den Lipid/DNA Komplexen hinzugegeben, mittels Pipettenbewegung gemischt und 65 µl der Lipid/DNA Komplexe wurden in eine Vertiefung einer Kulturplatte mit 96-Vertiefungen gegeben.
  • Um die Fähigkeit der Lipidmischungen zur Einbringung von Plasmid DNA den Zellen zu bestimmen, wurde ein Mikroskop zur Visualisierung der Fluoreszenz, die von dem Grünen Fluoreszierenden Protein (GFP) emittiert wird, 20–24 Stunden nach der anfänglichen Transfektion verwendet. Das Protein wird von dem pEGFP-C1 Plasmid kodiert und wird von erfolgreich transfizierten Zellen effizient synthetisiert und innerhalb des Cytoplasmas lokalisiert.
  • ERGEBNISSE:
  • Es wurde ein optimales Verhältnis von Aminolipid: DOPE von 2:1 festgestellt und das optimale Lipidreagenz: DNA Verhältnis betrug 0,4 µl pro 75 ng DNA. Dieses Verhältnis wurde daher im primären Screen zur Identifikation der Lipidreagenzien mit der höchsten Zelltransfektionseffizienz und er geringsten Zelltoxizität verwendet, wie im Beispiel 80 unten beschrieben.
  • Beispiel 80: Primärer Screen mittels neuartiger Lipidreagenzien
    • Zellline: HEK 293 Zellen
    • Screen Format: Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen
    • Detektion (read-out): YFP Fluoreszenz relativ zu absoluter Zellzahl (absoluter Zellzahl bestimmt mittels Kernfarbstoff, Hoechst – siehe 1 und 2)
    • Ein kommerziell erhältliches liposomales Transfektionsagens wurde als Referenz (Referenzagenz) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, siehe 1 und 2.
  • Verfahren:
  • Alle Schritte wurden in einem 96er-Kulturplattenformat unter Verwendung von 8- oder 12-Kanal Multipetten durchgeführt. Die gezeigten Mengen beziehen sich auf zwei Vertiefungen (2×) einer 96er-Kulturplatte.
    • 1. 0,8 µl Lipidreagenz verdünnt in 20 µl 50 mmol/l NaOAc Puffer, pH 5,0.
    • 2. Verdünnte Lipidreagenz aus (1) wurde zu 100 ng DNA (25 ng pH2B-YFP + 90 ng pCS-LacZ Plasmid) in 20 µl NaOAc buffer, pH 5,0 hinzugegeben und mittels Pipettenbewegung gemischt.
    • 3. Nach 30 min Inkubation bei RT, wurden 100 µl frisch resuspendierte Zellen (5 × 104 Zellen/Vertiefung DMEM Kulturmedium ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum) hinzugegeben und einer Pipette gmischt.
    • 4. Zweifache 65 µl Aliquots der Zellen + Lipid/DNA Komplexen wurden sofort in separate Vertiefungen einer 96-Kultureplatte transferiert und in 37°C Inkubator mit 5% CO2 platziert.
    • 5. 20 bis 24 Stunden nach der ursprünglichen Transfektion der Zellen wurde Hoechst 33258 Farbstoff zu den Zellen zu einer finalen Konzentration von 0,2 µg/ml hinzugegeben und die Zellen wurden für weitere 30 min bei at 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann auf ein invertiertes Mikroskop gegeben und es wurden zwei unabhängige Bildersets der Zellen aus jeder Vertiefung aufgenommen, gezeigt in 1 und 2.
  • Von jeder Probe wurden drei Aufnahmen aufgenommen: Hellfeldaufnahme der Zellen (1 und 2 oben), mit Höchst Farbstoff gefärbte Zellen von ganzen Zellkernen (1 und 2 Mitte) und YFP Bilder, die erfolgreich mit Plasmid DNA transfizierte Zellen zeigen und das YFP Protein exprimieren (1 und 2 unten). Mikroskopiebilder von transfizierten HEK 293 Zellen, die sowohl die Transfektionseffizienz und den Toxizitätslevel zweier der erfindungsgemäßen Lipidmoleküle (#30 und #60) im Vergleich zu einem normalerweise verwenden kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenz (Referenzreagenz) zeigen. Lipid eagenzien #30 und #60 haben eine Transfektionseffizienz von ungefähr 90 % und haben eine geringe Zelltoxizität (sehr wenige hell gefärbte apoptotische Zellkerne).
  • Gemäß dem in Beispiel 80 angegebenen Protokoll wurde eine Bibliothek von neuartigen Verbindungen gemäß Anspruch 1 auf ihre Fähigkeit zur Transfection von HEK 293 Zellen getestet. Der Graf der 3 und 4 zeigt die Transfektionseffizienz dieser Lipidverbindungen verglichen mit einem kommerziell erhältlichen Transitionsagens als Referenz. 1 der Lipidmoleküle ist signifikant effizienter beim Einschleusen von Plasmid DNA (YFP-Gen) in HEK 293 Zellen im Vergleich zu einer weit verbreiteten kommerziellen Transaktionsreagenz, gezeigt durch eine durchgängige Linie. Insbesonder zwei Reagenzein wurde eine als eine nur sehr geringe Toxizität aufweisende Verbindung identifiziert, die die Fähigkeit aufweist, siRNA Moleküle sehr effizient in Zellen einzuschleusen (#24, siehe 5 und #24, siehe 6).
  • Beispiel 81: Screen der „Treffer“ aus der Bibliothek auf die Fähigkeit zur Transfektion von siRNA
  • Eine der Schlüsseltechnologien zur Manipulation der Genfunktion sowohl in Zellen als auch in ganzen Organismen ist das Gen Silencing mittels RNA Interferenz (RNAi). Das Einschleusen von kleinen interferierenden Molekülen in Säugetiere ist entscheidend für diese Technologie und hat klinische/therapeutische Implikationen.
  • Daher wurden nicht nur die erfindungsgemäßen Lipide in Bezug auf das Einschleusen von Plasmid DNA (den Genen), sondern auch Aminolipide hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur effizienten Einschleusung von siRNA Molekülen (den Gen Silencern) gescreent.
  • Hierfür wurden zwei verschiedene Zelltypen verwendet, um die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Lipidreagenzien zu testen, siRNA für Geringe Dichte Lipoprotein Rezeptor verwandtes Protein 6 (LRP6) als Ziel einzuschleusen. Dies ist ein 200 kD Transmembranrezeptor für Wnt Liganden, der die Zellmembran einmal durchläuft (single-pass) und den Wnt/b-catenin Signalweg aktiviert. Es wird relativ gering in HEK 293 Zellen und relativ stark in MEF Zellen exprimiert.
  • Test 1. Transfektion von siRNA in Maus embryonischen Fibroblasten (MEF) Zellen
  • Verfahren:
  • Alle Schritte wurden in 0,2 ml PCR Gefäßen und 96er Platten durchgeführt. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf eine Vertiefung einer 96er Zellkulturplatte.
    • 1. 0,25 µl Lipidreagenz verdünnt in 50 µl 50 mmol/l NaOAc Puffer, pH 5,0.
    • 2. Verdünnte Lipidreagenz aus (1) hinzugegeben zu 1 pmol (0,2 µl of 5 µmol/l) siRNA Molekülen in 8 µl NaOAc Puffer, pH 5,0 und durch Pipettenbewegungen gemischt. Die verwendeten siRNA Moleküle hatten entweder eine zufällige (scrambled) Sequenz unspezifisch für jegliches bekanntes Gen (Con siRNA), oder eine für endogene mRNA aus dem LRP6 Gen (LRP6 siRNA) spezifische Sequenz.
    • 3. Nach 30 min Inkubation bei RT wurden 50 µl frisch resuspendierte Zellen (2 × 104 Zellen/Vertiefung DMEM Kulturmedium ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum) in eine Vertiefung einer 96er Kulturplatte gegeben und bei 37 °C incubator mit 5 % CO2 in einen Inkubator gestellt.
    • 4. 24 Stunden nach der ursprünglichen Transfektion wurden die Zellen in 25 µl Waschpuffer (50 mM Tris, 1 % Triton X-100, 0,15 M NaCl, pH 7,0, enthaltend Protease- und Phosphataseinhibitorsen) lysiert, zur Entfernung von unlöslichen Zellbruchstücken zentrifugiert und 30 µl gereinigte Lysate wurden zu 10 µl eines 4× SDS Ladepuffer (250 mM Tris HCl, 40 % Glycerol, 8 % SDS, 0,01% Bromophenol Blue, 5% 2-Mercaptoethanol, pH 6,8) hinzugegeben.
    • 5. Proben wurden durch Erhitzen auf 96°C für 2 min denaturiert und 12 µl davon auf ein 9 % SDS-PAGE Gel zur Separation der Proteine gemäß ihrem Molekulargewicht geladen. Die separierten Proteine wurden zur Western Blot (WB) Analyse von dem SDS-PAGE Gel auf eine Nitrocellulosemembran transferiert.
    • 6. Ein WB wurde unter Verwendung eines automatischen BioLane HTI Instruments mit einem Antikörper gegen LRP6 und α-Tubublin durchgeführt. Ein HRP-gebundener sekondärer Antikörper und Chemilumineszenz wurde zur Detektion des Proteins auf der Membran verwendet.
  • Ergebnisse
  • 5 und 6 zeigen eine Western Blot (WB) Analyse von LRP6 Protein von Gesamtlysaten von MEF (Maus embryonischen Fibroblasten) Zellen transfiziert mit dem angegebenen siRNA Molekülen und Inkubation für 24 Stunden. Lipidreagenzien #24 und #64 sind effektiv verglichen mit der kommerziellen Reagenz A beim siRNA vermittelten Gen Silencing. Dies zeigt den Unterschied in den Eigenschaften von verwandten Transfektionsreagenzien und unterstreicht die Bedeutung der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese Hunderter von verwandten Lipiden, welche zur Identifikation derjenigen mit den optimalen Eigenschaften (so wie hoher Effizienz der DNA und siRNA Einschleusung und geringer Zelltoxizität) gescreent werden können.
  • Abkürzungen
    • Ar
      Argon
      DCM
      Dichloromethan
      DEDPA
      N-(2-(Dimethylamino)ethyl)-4,5-bis(dodecylthio)pentanamid
      DIC
      N, N’-Diisopropylcarbodiimid
      DMEM
      Kulturmedium
      DMF
      Dimethylformamid
      DMPA
      2,2-Dimethoxy-2-phenylacetonphenon
      DNA
      Desoxyribonukleinsäure
      DOPE
      Dioleolylphosphatidylethanolamin
      YFP
      Gelbes Fluoreszierendes Protein
      HOBt
      Hydroxylbenzotriazol
      HRP
      Meerrettich Peroxidase
      kD
      kilo Dalton
      LRP6
      Geringe Dichte Lipoprotein Rezeptor verwandtes Protein 6
      MEF
      Maus embryonischer Fibroblast
      PEG
      Polyethylenglycol
      RNA
      Ribonukleinsäure
      RNAi
      RNA Interferenz
      siRNA
      kleine interferierende RNA
      SDS
      Natriumdodecylsulfat
      THF
      Tetrahydrofuran
      WB
      Western Blot
      Wnt
      Signalproteine der Zelldifferenzierung

Claims (18)

  1. Aminolipide mit der folgenden Formel:
    Figure DE112015003165T5_0091
    worin Z entweder Wasserstoff oder -X1R1 ist, R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl-Gruppe substituiert sind, X1 und X2 sind gleich oder unterschiedlich, entweder S oder S=O oder S(=O)2, Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0092
    oder Heterozyklen der Formel
    Figure DE112015003165T5_0093
    wobei k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind, R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl-Gruppe, oder R3 und R4 können miteinander einen optional substituierten heterozyklischen Ring von 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 bis 7 Stickstoffatome, oder R3 und R4 sind die gleichen oder verschiedene Alkylamine, R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, R7 ist entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, m ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist eine ganze Zahl von 2 bis 12, und p ist eine ganze Zahl von 1 bis 3, wobei bevorzugt Y = N für p = 2 oder 3; und wobei Y auch
    Figure DE112015003165T5_0094
    sein kann für p = 2.
  2. Aminolipid nach Anspruch 1 mit einer sturktur der Formel (Ia) oder (Ib).
    Figure DE112015003165T5_0095
    wobei R1 und R2 gleich oder unterscheidlich und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oer C6-C24 Acyl sind, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind, X1 und X2 sind gleich oder unterschiedlich, entweder S oer S=O oer S(=O)2, Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0096
    der Heterozykles der Formel
    Figure DE112015003165T5_0097
    oder
    Figure DE112015003165T5_0098
    wobei k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind, R3 und R4 sind gleich oder unterscheidlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkynyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 bilden optional miteinander, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten Nheterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome (einschließlich des Stickstoffatoms an das R3 and R4 gebunden sind), oder R3 und R4 sind gleich oder unterschiedlich das gleiche oder unterschiedliche Alkylamine; R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, R7 is entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, m is eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3, wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3; und wobei Y in einer Ausführungsform auch
    Figure DE112015003165T5_0099
    ist für p = 2.
  3. Aminolipid aufweisend eine Stuktur der folgenden Formel (Ic)
    Figure DE112015003165T5_0100
    wobei R1 und R2 gleich oder unterscheidlich sind und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind X1 und X2 sind gleich oder unterschiedlich, entweder S oder S=O oder S(=O)2, Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0101
    wobei Z
    Figure DE112015003165T5_0102
    ist, k und l sind ganze Zahlen von 0 bis 2. m ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12.
  4. Aminolipid nach Anspruch 1 oder 2, wobei X1 und X2 are gleich oder unterscheidlich sind und unabhängig voneinander S=O oder S(=O)2 sind.
  5. Aminolipid nach Anspruch 1 bis 4, wobei R1 und R2 gleich oder unterscheidlich und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl sind, welches optional substituiert ist mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe.
  6. Aminolipid nach Anspruch 1 bis 5, mit einer Struktur nach Formel (IIa) oder (IIb)
    Figure DE112015003165T5_0103
    wobei R1 und R2 das gleiche C6-C18 Alkyl sind, Y ist entwede
    Figure DE112015003165T5_0104
    oder Heterozyklen der Formel
    Figure DE112015003165T5_0105
    oder
    Figure DE112015003165T5_0106
    R3 und R4 sind gleich oder unterscheidlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, wobei Alkyl optional substituiert ist mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 bilden optional, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, R7 is entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, m is eine ganze Zahl von 1 bis 12 und n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3, wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3; und wobei Y auch
    Figure DE112015003165T5_0107
    sein kann für p = 2.
  7. Aminolipid nach Anspruch 1, 5 oder 6, mit einer STruktur nach Formel (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId), (IIIe), (IIIf), (IIIg), (IIIh), (IIIi), (IIIj), (IIIk), (IIIl), (IIIm), (IIIn), (IIIo), (IIIp), (IIIr), (IIIs), (IIIt), (IIIu), (IIIv), oder (IIIw)
    Figure DE112015003165T5_0108
    Figure DE112015003165T5_0109
    worin R1 und R2 das gleiche C11-C12 Alkyl, R3 und R4 das gleiche C1-C2 Alkyl sind, m ist eine ganze Zahl von 1 bis 2, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 3.
  8. Lipidpartikel enthaltend ein Aminolipid nach einer der Ansprüche 1 bis 7.
  9. Lipidpartikel nach Anspruch 8, wobei der Lipidpartikel ein Liposom ist.
  10. Lipidpartikel nach Anspruch 8 oder 9, weiterhin enthaltend ein nicht-ionisches Lipid, ein sterol und/oder ein bioaktive Agens, wobei das bioaktive Agens insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einer Nukleinsäure, einem antineoplastischen Agens, einem Antibiotikum, einem Immunmodulator, einem anti-entzündlichen Agens, einem im Zentralen Nervensystem wirkenden Agens, einem Polypeptid oder einem Polypeptoid.
  11. Verwendung eines Lipidpartikels nach einem der Anspüche 8 bis 10 zur Einbringung eines bioaktiven Agens in eine Zelle.
  12. Verwendung eines Lipidpartikels nach Anspruch 8 bis 10 als Medikament, insbesondere als Medikament zur Behandlung einer viralen Infektion, einer Lebererkrankung oder Leberfunktionsstörung, oder von Krebs.
  13. Verfahren zur Synthese eines Aminolipids nach Anspruch 1 und 4 bis 7, aufweisend den Schritt: Durchführen einer Reaktion von Alkinen oder Alkenen der allgemeinen Formel (VI)
    Figure DE112015003165T5_0110
    wobei E entweder CH=CH2 oder C≡CH ist, mit den Verbindungen der allgemeinen Formeln HS-R1 und HS-R2, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (VII) zu erhalten
    Figure DE112015003165T5_0111
    wobei R1 and R2 gleich oder unterschiedlich voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl sind, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind, Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0112
    oder ein Heterocyclus der Formel
    Figure DE112015003165T5_0113
    wobei k und l ganze Zahlen sind von 0 to 2, R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden, R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, R7 is entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3, wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3; und wobei Y in einer Ausführungsform
    Figure DE112015003165T5_0114
    ist für p = 2.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Reaktion von Alkinen oder Alkenen der allgemeinen Formel (VI) mit Verbindungen der allgemeinen Formel HS-R1 und HS-R2 unterUV-Bestrahlung oder mittels eines Radikalstarters durchgeführt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 14, wobei das Produkt der Reaktion eine Verbindung nach Formel (VIIb) ist.
  16. Verfahren der Ansprüche 13 bis 15, weiter umfassend den Schritt der Oxidation des Thioethers der allgemeinen Formel (VIIa) oder (VIIb) zu Sulfoxid (S=O) und/oder Sulfon (S(=O)2) mittels eines Oxidationsmittels zur Synthese eines Aminolipids enthaltend eines eine Sulfoxid- oder Sulfongruppe enthaltenden Aminolipids nach Anspruch 1 oder 2.
  17. Verfahren nach Anspruch 13 oder 16, weiter aufweisend den Schritt: a) Durchführen einer Reaktion von Alkinen oder Alken der allgemeinen Formel (IVa), (IVb), (IVc), oder (IVd)
    Figure DE112015003165T5_0115
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist, mit der Verbindung
    Figure DE112015003165T5_0116
    um eine Verbindung der allgemeinen Formel (Va), (Vb), (Vc), oder (Vd) zu erhalten
    Figure DE112015003165T5_0117
    und/oder b) Durchführen einer von Alkinen oder Alkenen der allgemeinen Formel (Va), (Vb), (Vc), oder (Vd)
    Figure DE112015003165T5_0118
    mit einem Amin der allgemeinen Formel (R3R4R5N)(CH2)mZ, mit m als ganzer Zahl von 1 bis 12, wobei Z OH, NH2, NH, oder ein sekundäres heterozyklisches Amin der Formel
    Figure DE112015003165T5_0119
    ist, wobei k und l ganze Zahlen von 0 bis 2 sind, so dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (VI’) erhalten wird
    Figure DE112015003165T5_0120
    wobei E entweder CH=CH2 oder C≡CH ist, R1 and R2 sind gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneineander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe substituiert sind, Y ist entweder
    Figure DE112015003165T5_0121
    oder Heterocyclen der Formel
    Figure DE112015003165T5_0122
    oder wobei k und l ganze Zahlen sind von 0 bis 2, R3 und R4 sind gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneineander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden, R5 ist entweder nicht vorhanden oder ist Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3, wobei bevorzugt Y = N für p = 2 oder 3.
  18. Verfahren nach Anspruch 13 oder 16, weiter aufweisend den Schritt: Durchführen einer von Alkinen doer Alkenen der allgemeinen Formel (IVe), (IVf), (IVg), oder (IVh)
    Figure DE112015003165T5_0123
    wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist, mit einem Amin der allgemeinen Formel (R3R4R5N)(CH2)mZ, mit m als ganzer Zahl von 1 bis 12, wobei Z NH2, NH, N oder sekundäres heterozyklic Amin der Formel
    Figure DE112015003165T5_0124
    ist, worin k und l eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, so dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (VI’’) erhalten wird
    Figure DE112015003165T5_0125
    worin E entweder CH=CH2 oder C≡CH ist, R1 und R2 sind gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C6-C24 Alkyl, C6-C24 Alkenyl, C6-C24 Alkinyl, oder C6-C24 Acyl, welche optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, Y ist entweder NH, NR7,
    Figure DE112015003165T5_0126
    oder ein Heterocyclu der Formel
    Figure DE112015003165T5_0127
    worin k und l ganze Zahlen sind von 0 to 2, R3 und R4 sind entweder gleich oder unterschiedlich und unabhängig voneinander C1-C12 Alkyl, C1-C12 Alkenyl, oder C1-C12 Alkinyl, wobei Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional substituiert sind mit einer C1-C6 Hydrocarbyl Gruppe, oder R3 und R4 können, zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen optional substituierten N-heterozyklischen Ring mit 3 bis 10 Atomen aufweisend 1 to 7 Stickstoffatome, bilden, R5 und R6 sind entweder nicht vorhanden oder sind Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, um ein quaternäres Amin bereitzustellen, R7 is entweder Wasserstoff oder C1-C12 Alkyl, m is eine ganze Zahl von 1 bis 12, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 12 und p is eine ganze Zahl von 1 bis 3, wobei in einer Ausführungsform Y = N für p = 2 oder 3; und wobei Y in einer Ausführungsform
    Figure DE112015003165T5_0128
    ist für p = 2.
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