DE69727384T2

DE69727384T2 - Polykatonische sterin-derivate zur transfektion

Info

Publication number: DE69727384T2
Application number: DE69727384T
Authority: DE
Inventors: Andrew David Miller; Robert Geoffrey Cooper; Christopher John Etheridge
Original assignee: IC Vec Ltd
Current assignee: IC Vec Ltd
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2017-05-24
Also published as: WO1997045442A1; EP0918790A1; AU2911197A; DE69727384D1; JP2000510151A; JP4340330B2; US20080075763A1; US20040156890A1; US6756054B1; EP0918790B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in einer Therapie, insbesondere Gentherapie (speziell Gentransfer).
Ein Aspekt der Gentherapie umfaßt das Einbringen fremder Nukleinsäure (wie DNA) in Zellen, so daß deren exprimiertes Protein eine gewünschte therapeutische Funktion ausüben kann.¹
Beispiele für diesen Typ von Therapie umfassen das Einbringen von TK-, TSG- oder ILG-Genen zur Behandlung von Krebs, das Einbringen des CFTR-Gens zur Behandlung von zystischer Fibrose, das Einbringen von NGF-, TH- oder LDL-Genen zur Behandlung neurodegenerativer und kardiovaskulärer Störungen, das Einbringen des Gens für den IL-1-Antagonisten zur Behandlung rheumatoider Arthritis, das Einbringen von HIV-Antigenen und des TK-Gens zur Behandlung von AIDS und CMV-Infektionen, das Einbringen von Antigenen und Cytokinen, die als Vaccine wirken sollen, und das Einbringen von β-Globin zur Behandlung hämoglobinopathischer Zustände, wie Thalassämien.
Viele derzeitige Gentherapiestudien verwenden adenovirale Genvektoren – wie Ad3 oder Ad5 – oder andere Genvektoren. Jedoch gehen mit deren Verwendung schwerwiegende Probleme einher.² Dies hat die Entwicklung weniger gefährlicher, nicht-viraler Ansätze für den Gentransfer hervorgerufen.³
Ein nicht-virales Transfersystem mit großem Potential umfaßt die Verwendung von kationischen Liposomen.⁴ In diesem Zusammenhang wurden kationische Liposome – welche üblicherweise aus einem neutralen Phospholipid und einem kationischen Lipid bestehen – für einen Transfer von DNA⁴, mRNA⁵, Antisense-Oligonukleotiden⁶, Proteinen⁷ und Arzneimitteln⁸ in Zellen verwendet. Eine Anzahl kationischer Liposome ist kommerziell erhältlich^4,9, und viele neue kationische Lipide wurden in letzter Zeit synthetisiert¹⁰. Die Wirksamkeit dieser Liposome wurde sowohl in vitro⁴ als auch in vivo¹¹ gezeigt.
Ein neutrales Phospholipid, das für die Herstellung eines kationischen Liposoms geeignet ist, ist N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, das auch als "DOTMA" gekannt ist. Die Struktur von DOTMA ist in 1 gezeigt. Eines der am häufigsten verwendeten kationischen Liposomensysteme besteht aus einem Gemisch aus einem neutralen Phospholipid, Dioleoylphosphatidylethanolamin (allgemein bekannt als "DOPE"), und einem kationischen Lipid, 3,β-[(N,N-Dimethylaminoethyl)-carbamoyl]-cholesterol (allgemein bekannt als "DC-Chol")¹². Die Struktur von DOPE ist in 2 gezeigt. Die Struktur von DC-Chol ist in 3 gezeigt.
Ein Lipid wurde durch Umsetzung von Spermidin und Cholesterolchloroformat in CH₂Cl₂ in der Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin synthetisiert¹⁸. Dies lieferte jedoch ein Gemisch des Lipids und des entsprechenden regioisomeren Lipids, wobei sich das Gemisch als untrennbar durch Chromatographie erwies.
Trotz der Wirksamkeit der bekannten kationischen Liposome besteht nach wie vor ein Bedarf, die Gentransfereffizienz kationischer Liposome in der Humangentherapie zu optimieren¹⁰.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung bereitgestellt, ausgewählt unter Verbindungen der Formeln
wobei Chol eine Gruppe der folgenden Formel bezeichnet:
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Therapie bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines Zustands oder einer Erkrankung bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein kationisches Liposom bereitgestellt, das aus der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines kationischen Liposoms bereitgestellt, bei dem man das kationische Liposom aus der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung herstellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein kationisches Liposom gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein kationisches Liposom, hergestellt nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, für die Verwendung in der Therapie bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines kationischen Liposoms gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines kationischen Liposoms, hergestellt nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines Zustands oder einer Erkrankung bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination aus einer Nukleotidsequenz und einem oder mehreren der folgenden bereitgestellt: einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, einem Liposom der vorliegenden Erfindung oder einem Liposom, hergestellt nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination gemäß der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in der Therapie bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Kombination gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines Zustands oder einer Erkrankung bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt mit einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung im Gemisch mit einem Arzneimittel und optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt mit einem kationischen Liposom gemäß der vorliegenden Erfindung oder einem kationischen Liposom, hergestellt nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, im Gemisch mit einem Arzneimittel und optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel.
Es wird angenommen, daß ein Hauptvorteil der Verbindung der vorliegenden Erfindung darin besteht, daß sie als ein kationisches Lipid (Amphiphil) bei der Herstellung eines kationischen Liposoms eingesetzt werden kann, welches in der Gentherapie geeignet ist, insbesondere dem Transfer von Nukleinsäuren (einschließlich Genen und Antisense-DNA/RNA) in Zellen (in vitro und in vivo) zum Erzielen eines therapeutischen Nutzens.
Es wird angenommen, daß der Cholesterolrest der vorliegenden Verbindung vorteilhaft ist, indem er die resultierende liposomale Doppelschicht stabilisiert.
Das Cholesterol ist mit der Kopfgruppe über eine Carbamoylverknüpfung verbunden. Es wird angenommen, daß diese Verknüpfung vorteilhaft ist, da das resultierende Liposom eine niedrige oder minimale Cytotoxizität aufweist.
Die Kopfgruppe ist eine Polyamingruppe. Es wird angenommen, daß die Polyamingruppe vorteilhaft ist, weil sie die DNA-Bindungsfähigkeit und die Effizienz von Gentransfer des resultierenden Liposoms erhöht.
Typische Beispiele für natürlich vorkommende Polyamine umfassen Spermidin, Spermin, Caldopentamin, Norspermidin und Norspermin. Diese Polyamine sind in 4 gezeigt.
Es wird angenommen, daß die Polyaminkopfgruppe vorteilhaft für eine DNA-Kondensation ist; die Carbamatverknüpfung ist stabil, aber biologisch abbaubar, und die Cholesterylgruppe verleiht Doppelschichtstabilität. Die Carbamatverknüpfung kann Teil von oder integraler Bestandteil der Kopfgruppe sein.
Vorzugsweise liegt die Verbindung im Gemisch mit einer Nukleotidsequenz vor oder geht mit dieser einher.
Die Nukleotidsequenz kann ein Teil oder die Gesamtheit eines Expressionssystems sein, das in einer Therapie, wie Gentherapie, nützlich ist.
Vorzugsweise wird das kationische Liposom aus der Verbindung der vorliegenden Erfindung und einem neutralen Phospholipid, wie DOTMA oder DOPE, hergestellt. Vorzugsweise ist das neutrale Phospholipid DOPE.
Zwei oder mehr der Amingruppen der Polyamingruppe der vorliegenden Erfindung sind durch eine oder mehrere Gruppen, welche man in der Natur nicht findet, getrennt, die Amingruppen von natürlich vorkommenden Polyaminverbindungen trennen (d.h. vorzugsweise hat die Polyamingruppe der vorliegenden Erfindung einen unnatürlichen Abstandshalter).
Zusammenfassend liefert die vorliegende Erfindung eine Verbindung, die in der Lage ist, als ein kationisches Lipid zu wirken.
Die vorliegende Erfindung wird nun nur anhand von Beispielen, in welchen auf die folgenden Figuren Bezug genommen wird, beschrieben:
1 ist eine Struktur;
2 ist eine Struktur;
3 ist eine Struktur;
4 ist eine Reihe von Strukturen;
5 ist eine Struktur;
6 ist eine Struktur;
7 enthält ein Reaktionsschema;
8 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
9 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
10 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
11 enthält ein Reaktionsschema;
12 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
13 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
14 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
15 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
16 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
17 enthält ein Reaktionsschema;
18 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
19 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
20 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
21 enthält ein Reaktionsschema und eine Tabelle mit Ergebnissen;
22 zeigt ein Modell;
23 zeigt Daten von einigen Studien;
24 zeigt Daten von einigen Studien;
25 zeigt Daten von einigen Studien;
26 zeigt ein Reaktionsschema;
27 zeigt ein Reaktionsschema;
28 zeigt ein Reaktionsschema und
29 zeigt einige Formeln.
ALLGEMEINE ANMERKUNGEN
In diesen Studien wurde DC-Chol als eine Vorlage für die Synthese effizienterer Gentransferlipide aufgrund seiner guten Gentransfereigenschaft¹² und niedrigen Zytotoxizität¹³ verwendet. Insbesondere wurde die Kopfgruppe von DC-Chol gegen eine Reihe von Polyamin-Kopfgruppen ausgetauscht.
Anfänglich wurde ein Bereich kationischer Lipide, wie sie in 6 gezeigt sind (worin m = 1–3, n = 1–2, bezeichnet mit 2), mit Kopfgruppen auf der Grundlage des natürlich vorkommenden Polyamins, Spermidin (m = 3, n = 3, bezeichnet als 3), synthetisiert.
Zur Herstellung dieser Verbindungen verwendeten wir das Aza-Wittig-Verfahren¹⁶, und so stellten wir her und verwendeten einen Bereich von in geeigneter Weise geschützten homologen Aziden und Aldehyden (siehe Schema 1 in 7).
Unsere anfänglichen Studien legten nahe, daß mit Benzyloxycarbonyl geschützte Aminoazide (siehe 8, bezeichnet als 4) geeignet sein würden. Diese konnten in drei Stufen und mit ausgezeichneter Ausbeute aus Aminoalkoholen (siehe 8, bezeichnet mit 3) durch sequentielle N-Benzyloxycarbonylierung, Mesylierung und Azidation hergestellt werden.
Dieses Verfahren und die Ausbeuten daraus sind in 8 gezeigt (siehe Schema 2 und Tabelle 1).
Das gewünschte Aldehyd konnte ebenfalls aus Aminoalkoholen (siehe 9, bezeichnet mit 5) in ausgezeichneter Ausbeute synthetisiert werden, diesmal durch N-Schutz mit Cholesterylchloroformat unter Erhalt von Alkoholen (siehe 9, bezeichnet mit 8), gefolgt von Swern-Oxidation¹⁷ zu Aldehyden (siehe 9, bezeichnet mit 9).
Dieses Verfahren und die Ausbeuten daraus sind in 9 gezeigt (siehe Schema 3, Tabelle 2).
Die Aldehyde (9) wurden als weiße kristalline Feststoffe isoliert, welche sich im Gegensatz zu analogen Aldehyden mit anderen Schutzgruppen als äußerst stabil erwiesen, einfach zu handhaben waren und für lange Zeiträume ohne jeglichen erkennbaren Abbau gelagert werden konnten.
Die Aza-Wittig-Reaktion zwischen Aziden (4) und Aldehyden (9) fand sanft in THF statt unter Erhalt, nach in situ Reduktion, von geschützten Polyaminen (10) in ausgezeichneter Ausbeute. Wir fanden, daß eher die Verwendung von Trimethylphosphin als von Triphenylphosphin sowohl zu höheren Ausbeuten als auch niedrigeren Reaktionszeiten führte. Die Verwendung von Molekularsieben erwies sich ebenfalls als vorteilhaft beim Erzielen beständig guter Ausbeuten durch Eliminierung von aus dem Reaktionssystem hinzukommendem Wasser. Schließlich lieferte Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe durch Hydrogenolyse die gewünschten Lipide (2) in quantitativer Ausbeute. Diese Verfahren und die Ausbeuten sind in 10 gezeigt (siehe Schema 4, Tabelle 3).
Liposome, welche die neuen Lipide enthielten, konnten unter Verwendung des folgenden allgemeinen Verfahrens, welches beispielhaft auf Lipid (2) und DOPE Bezug nimmt, hergestellt werden.
Lipid (2) (6 μmol) und DOPE (298 μl einer 10 mg/ml Lösung in CHCl₃, 4 μmol) wurden über eine Spritze zu frisch destilliertem CH₂Cl₂ (5 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre hinzugefügt. 4-(2-Hydroxyethyl)-2-piperazinethansulfonsäure-(HEPES-)Puffer (5 ml einer auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellten 20 mM Lösung) wurde hinzugefügt. Das zweiphasige Gemisch wurde für drei Minuten sonifiziert, und die organischen Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Die resultierende Liposomensuspension wurde dann für weitere 30 Minuten sonifiziert, was Liposome mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 150 nm (bestimmt unter Verwendung eines Coulter N4 MD Photonenkorrelationsspektrometers) lieferte.
Die neuen Verbindungen lieferten die korrekten analytischen Daten durch ¹H-NMR, ¹³C-NMR, IR, MS und Elementaranalyse oder HRMS.
Dieses Verfahren lieferte daher Spermidin enthaltende DC-Chol-Analoge aus einfach erhältlichen Ausgangsmaterialien unter Verwendung der Aza-Wittig-Methode. Für diese Studien kann auch auf die 11 bis 21 Bezug genommen werden.
WEITERE STUDIEN
Die weiteren Studien beinhalteten die Aufnahme höherer homologer Polyamine, wie Spermin, und unüblicher Polyamine, wie Caldopentamin, in ein Lipidgerüst. Es wird angenommen, daß diese Lipide, wenn sie in den Begrenzungen eines Liposoms eingesetzt werden, eine DNA-kondensierende Eigenschaft liefern, die zu stärkeren, stabileren Liposom/DNA-Konjugaten führt. Daher nehmen wir an, daß diese Eigenschaften die gesamte Transfektion von beispielsweise Plasmid-DNA in beispielsweise Zellinien verbessern wird.
Für diese weiteren Studien kann auch auf die 11 bis 21 Bezug genommen werden.
Herstellung von Methansulfonatestern
Zu einer Lösung von trockenem Alkohol (1,48 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (15 ml) wurde Triethylamin (0,62 ml, 4,4 mmol) hinzugefügt, und die Lösung wurde unter Stickstoff gerührt und auf ungefähr 0°C gekühlt. An dieser Stelle wurde Methansulfonylchlorid (0,29 ml, 3,7 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (5 ml) vorsichtig und tropfenweise zu der Lösung von Alkohol hinzugefügt. Nach der Zugabe wurde das Rühren bei 0°C für 10 Minuten und dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten fortgesetzt. Dann wurde vorsichtig Eis hinzugefügt und die Reaktion für 35 Minuten abgeschreckt. Das CH₂Cl₂ wurde fünffach verdünnt und dann mit gesättigtem Ammoniumchlorid (70 ml), Wasser (50 ml) und Salzlauge (70 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel in vacuo unter Erhalt einer quantitativen Ausbeute des rohen Mesylates entfernt.
Herstellung von Aziden
Zu einem gerührten Gemisch von Methansulfonatester (1,48 mmol), Natriumazid (0,48 g, 7,4 mmol, 5 eq.) und Natriumiodid (0,222 g, 1,48 mmol) unter N₂ wurde mittels einer Spritze trockenes DMF (10 ml) hinzugefügt und die Suspension auf 80°C erhitzt. Dies wurde für zwei Stunden aufrechterhalten und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der Ansatz wurde dann über Celite^TM filtriert und das DMF unter Hochvakuum unter Erhalt eines blaßgelben Öls entfernt.
Das blaßgelbe Öl wurde dann erneut in Diethylether (100 ml) gelöst und mit Wasser (3 × 60 ml) und Salzlauge (80 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo unter Erhalt des farblosen Azids eingedampft. Das Azid wurde dann weiter durch Flash-Säulenchromatographie (Ether/Aceton 4–30%) unter Erhalt des reinen Azids gereinigt.
Herstellung von Bromiden
Zu einem Gemisch aus Methansulfonatester (1 mmol) und Natriumbromid (0,515 g, 5 mmol, 5 eq.) wurde trockenes DMF (10 ml) über eine Spritze hinzugefügt, die Lösung für zwei Stunden auf 80°C erhitzt, dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und der Ansatz über Celite^TM filtriert und das DMF in vacuo entfernt. Das Bromid wurde dann erneut in Diethylether (50 ml) gelöst und mit Wasser (3 × 30 ml) und Salzlauge (50 ml) gewaschen. Der organische Extrakt wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel in vacuo unter Erhalt eines farblosen Öls entfernt. Das Bromid wurde dann durch Flash-Säulenchromatographie (Diethylether 20%/Petrol 80% → Diethylether) unter Erhalt von reinem Bromid gereinigt.
Mono-N-Alkylierung mit Bromiden
Zu einer gerührten Lösung aus Bromid (1 mmol) und 4-Amino-1-butanol (0,36 g, 4 mmol, 4 eq.) in wasserfreiem DMF (10 ml) unter N₂ wurden wasserfreies K₂CO₃ (0,276 g, 2 mmol, 2 eq.) und Natriumiodid (15 mg, 0,1 mmol, 0,1 eq.) hinzugefügt. Die Reaktion wurde für 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bis die Reaktion vollständig war. Das DMF wurde in vacuo verdampft und ausgiebig unter Hochvakuum getrocknet. Der erhaltene ölige Feststoff wurde in CH₂Cl₂ (100 ml) erneut gelöst und mit Wasser (4 × 50 ml) gewaschen.
Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden dann mit CH₂Cl₂ (40 ml) gewaschen, und die CH₂Cl₂-Extrakte wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Das CH₂Cl₂ wurde in vacuo unter Erhalt eines blaßgelben Öls verdampft.
Aza-Wittig-Reaktion
Zu einer Suspension von flammengetrockneten 4 Å-Molekularsieben (500 mg) und toluolgetrocknetem Azid (1,08 mmol) in wasserfreiem THF (9 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre wurde tropfenweise eine Lösung von Trimethylphosphin (1,2 ml einer 1,0 M Lösung in THF, 1,19 mmol, 1,1 eq.) über eine Spritze hinzugefügt.
Nach Rühren bei Raumtemperatur für eine Stunde wurde der Aldehyd (1,19 mmol, 1,1 eq.) in THF (2 ml) tropfenweise über eine Kanüle hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für 18 Stunden gerührt. An dieser Stelle wurde das THF unter Stickstoff verdampft und der erhaltene Ansatz in trockenem Ethanol (7 ml) resuspendiert. Zu dieser Lösung wurde Natriumborhydrid (4,32 ml einer 0,5 M Lösung in Diglyme, 2,16 mmol, 2 eq.) über eine Spritze hinzugefügt und die Reaktion für weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Danach wurde die Suspension durch ein kurzes Kissen von Celite^TM filtriert und das Diglyme in vacuo entfernt. Vor der Aufarbeitung wurde eine ausgiebige Trocknung durchgeführt, das erhaltene Öl in CH₂Cl₂ (120 ml) erneut gelöst und mit gesättigtem Natriumbicarbonat (100 ml), Wasser (120 ml) und Salzlauge (120 ml) behandelt. Die organische Fraktion wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, das Lösungsmittel in vacuo unter Erhalt eines blaßgelben Öls entfernt und das rohe Produkt durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt.
Hydrogenolyse
Zu einer Lösung von Z-geschütztem Lipid (0,52 mmol, 1 eq.) in Ethanol (6 ml) wurde Cyclohexen (2,11 ml, 20,8 mmol, 40 eq.), gefolgt von Palladium auf Aktivkohle (10%, 277 mg, 0,5 eq.) unter einem Stickstoffkissen hinzugefügt. Die Lösung wurde dann unter Stickstoff rückflußgekocht und die Reaktion durch TLC (CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ 92 : 7 : 1) angeschlossen.
Nach zwei Stunden wurde der Katalysator vorsichtig unter Stickstoff abfiltriert, mit frischem Ethanol gewaschen und das Lösungsmittel in vacuo unter Erhalt eines weißen Feststoffs verdampft.
Herstellung von Silanolen
Zu einer gekühlten, gerührten Lösung von Alkohol (0,93 mmol), Triethylamin (0,39 ml, 2,8 mmol) und DMAP (11,4 mg, 0,093 mmol, 0,1 eq.) in trockenem CH₂Cl₂ (1,5 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von tert-Butylchlorodiphenylsilan (0,6 ml, 2,33 mmol, 2,5 eq.) in trockenem CH₂Cl₂ (1,5 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für drei bis fünf Stunden gerührt, woraufhin CH₂Cl₂ (45 ml) zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und dann mit gesättigtem Natriumbicarbonat (70 ml) und Salzlauge (70 ml) extrahiert wurde.
Die CH₂Cl₂-Extrakte wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel in Oacuo unter Erhalt eines blaßgelben Öls entfernt. Dieses wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt.
N-Schutz von Aminosilanolen
Zu eisgekühltem Aminosilanol (0,85 mmol) und Triethylamin (0,24 ml, 1,7 mmol, 2 eq.) in CH₂Cl₂ (4 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von Phenylmethoxycarbonylchlorid (0,26 ml, 1,7 mmol, 2 eq.) in CH₂Cl₂ (1 ml) hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Die Lösung wurde dann mit CH₂Cl₂ (30 ml) Oerdünnt, mit gesättigtem Ammoniumchlorid (40 ml) und Salzlauge (40 ml) gewaschen. Der CH₂Cl₂-Extrakt wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in Oacuo unter Erhalt eines blaßgelben Öls zur Trockene eingedampft. Die Verbindung wurde durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt.
Herstellung von Aldehyden
Zu einer gerührten Lösung von Ethandioyldichlorid (0,80 ml, 9,3 mmol, 1,5 eq.) in CH₂Cl₂ (20 ml) bei –78°C unter einer Stickstoffatmosphäre wurde eine Lösung von DMSO (1,35 ml, 18,6 mmol, 3 eq.) in CH₂Cl₂ (20 ml) über eine Kanüle über einen Zeitraum von 15 Minuten hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde für weitere 20 Minuten gerührt, woraufhin eine Lösung von Alkohol (6,2 mmol, 1 eq.) in CH₂Cl₂ (60 ml) tropfenweise über eine Kanüle hinzugefügt wurde. Nach weiteren 30 Minuten wurde N,N,N-Diisopropylethylamin (3,25 ml, 18,6 mmol, 3 eq.) tropfenweise hinzugefügt und die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmt.
Die blaßgelbe Lösung wurde dann mit gesättigtem Ammoniumchlorid (150 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (80 ml) und Wasser (100 ml) gewaschen. Die wäßrigen Extrakte wurden Oereinigt und mit CH₂Cl₂ (100 ml) gewaschen. Die CH₂Cl₂-Extrakte wurden Oereinigt, mit Salzlauge (100 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde dann in Oacuo unter Erhalt eines blaßgelben Feststoffs Oerdampft. Der rohe Aldehyd wurde dann durch Flash-Säulenchromatographie (Ether) zu einem weißen Feststoff gereinigt.
Entfernung des Schutzes von Silanolen
Zu einer Lösung von Silanol (1 mmol) in THF (5 mmol) wurde Oorsichtig Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) (1,1 mmol) hinzugefügt und die Lösung für zwei bis drei Stunden gerührt. Die Lösung wurde dann mit CH₂Cl₂ (50 ml) Oerdünnt und gesättigtes Natriumbicarbonat (50 ml) hinzugefügt. Die organische Phase wurde gesammelt und mit Wasser (50 ml) und Salzlauge (60 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel in Oacuo entfernt. Das blaßgelbe Öl wurde dann durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt.
ZUSÄTZLICHE STUDIEN
Für diese speziellen Studien wird unter anderem auf die 22 bis 28 Bezug genommen.
Insbesondere ist 22 die Oermeintliche Anordnung von DC-Chol 1 und DOPE 2 in einer kationischen Liposomen-Doppelschicht.
23 ist ein Beispiel für in Oitro Optimierung von pCF1-βGal-Plasmidtransfektion von CFT1-Zellen in Oitro unter Verwendung von Komplexen von pCF1-βGal und kationischen Liposomen, formuliert aus dem DC-Chol-Analogen 8f' und DOPE 2 (1 : 1) molares Verhältnis. CFT1-Zellen wurden mit einem Bereich Oerschiedener kationischen Liposome und PlasmidOerhältnisse in einer 96-Kammer-Platte transfiziert. Das Ausmaß an Transfektion in jeder Kammer wurde nach zwei Tagen durch Messung der Mengen an β-Galactosidaseexpression bestimmt. Plasmid-DNA-Konzentration ist als die Konzentration von Nukleotiden ausgedrückt unter der Annahme eines durchschnittlichen Nukleotid-FWt von 330. Kationische Liposomenkonzentration ist als die Konzentration des Bestandteils DC-Chol-Analoges 8f' alleine ausgedrückt.
24 zeigt eine Rangfolge von DC-Chol-Polyaminanalogen, welche CFT1-Zellen in Oitro mit dem pCF1-βGal-Plasmid transfizieren. GenauslieferungsaktiOität ist als ein Anteil der AktiOität, gemessen mit Standardliposomen, die DC-Chol 1 und DOPE 2 enthalten, ausgedrückt. Die gezeigten Daten sind Durchschnittswerte von Oier separaten Experimenten, die jeweils dreifach durchgeführt wurden.
Die Verhältnisse in runden Klammern beziehen sich auf das zur Formulierung der Liposome Oerwendete molare Verhältnis von DC-Chol-Analogem : DOPE 2. Die Zahlen in eckigen Klammern beziehen sich auf Seriennummern der Verbindung. Wo es angebracht ist, sind Namensabkürzungen für DC-Chol-Analoge ebenfalls enthalten (siehe Experimentelles).
25 zeigt die Rangfolge von DC-Chol-Polyaminanalogen, welche die Lungen von weiblichen BALB/c-Mäusen mit dem pCF1-CAT-Plasmid transfizieren. Mäusen wurde eine Lösung des Plasmids (4 mM Nukleotidkonzentration) und der optimalen Menge und dem optimalen Verhältnis von kationischem Liposom in einem GesamtOolumen von 100 μl eingeträufelt. GenauslieferungsaktiOität wurde als eine Funktion von ChloramphenicolacetyltransferaseaktiOität in Lungenhomogenaten nach zwei Tagen bestimmt.
Datenpunkte stammen aus separaten Experimenten mit jeder optimalen Formulierung, die in 4 BALB/c-Mäusen getestet wurden. Die Verhältnisse in runden Klammern beziehen sich auf das molare Verhältnis von DC-Chol-Analogem : DOPE 2. Die Zahlen in eckigen Klammern beziehen sich auf die Seriennummern der Verbindungen. Wo es angebracht ist, sind Namensabkürzungen für DC-Chol-Analoge ebenfalls enthalten (siehe Experimentelles).
Zusätzliche Studien haben gezeigt, daß die Genauslieferungseffizienz von DC-Chol/DOPE-Liposomen äquiOalent zu der Leistung von Liposomen, die das DC-Chol-Analoge 8c' enthalten, ist.^[32]
Zur Verbesserung von DC-Chol/DOPE-Liposomen wurde ein einfaches Modell für die Verknüpfung von DC-Chol 1 und DOPE 2 in der Doppelschicht eines kationischen Liposoms erdacht (22). Dieses basierte auf dem Oorgeschlagenen Verhalten von Cholesterol in Doppelschichtmembranen^[26] und einem Liposomenmodell, das von Felgner und Mitarbeitern Oorgeschlagen wurde^[27].
Die Kohlenstoffatome C-1 bis C-9 der Oleoylseitenketten von DOPE 2 grenzen gegen die Oier kondensierten Cholesterolringe von DC-Chol 1 ab, so daß die Phosphatestergruppe von DOPE und die protonierte tertiäre Aminfunktionalität von DC-Chol 2 ausgerichtet sind und sich gegenseitig neutralisieren. Die positiOe Ladung des Liposoms stammt dann von der protonierten Ethanolaminseitenkette von DOPE 2. Auf der Grundlage der kürzlichen Transfektionsexperimente in Maus und Mensch^[24,25] wurde angenommen, daß man eine erhöhte Transfektionseffizienz am besten dadurch erreichen könnte, daß man entweder DC-Chol oder DOPE-Polyaminanaloge konstruierte, von denen man erwartete, daß sie mit DNA stärker wechselwirken. Da DOPE empfindlich für eine Oxidation der cis-Doppelbindungen von Oleoyl ist, nahmen wir an, daß es geeigneter sei, stattdessen Polyaminanaloge von DC-Chol zu synthetisieren. Das Modell (22) legte nahe, daß der Methylengruppenabstand zwischen Carbamoyl und der ersten aminfunktionalen Gruppe eines gegebenen DC-Chol-Polyaminanalogen zwei oder höchstens drei betragen sollte, um eine Ladungskomplementierung mit DOPE 2 aufrechtzuerhalten. Die beOorzugten DC-Chol-Polyaminanaloge (d. h. Polyaminanaloge von 3DF-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol) wurden mit dieser Notwendigkeit im Sinne entworfen.
Die Synthesen von Triaminanalogen von DC-Chol wurden wie folgt durchgeführt.
Anfänglich wurden zwei Oerschiedene N-Cholesteryloxycarbonylaminoaldehyde 3' durch N-Schutz von Aminoalkoholen 4' mit Cholesterylchloroformat, gefolgt von Swern-Oxidation^[28] von geschützten Alkoholen 5' unter Erhalt des Aldehyds 3' hergestellt (siehe Schema A in 26). Herkömmlich gesprochen können Aminoaldehyde ziemlich instabil und anfällig für Polymerisation sein, aber die sterische Stabilisierung des N-Cholesterylrests lieferte eine kristalline Verbindung, welche für längere Zeiträume ohne jeglichen erkennbaren Abbau gelagert werden konnte.
Mit N-Benzyloxycarbonyl geschützte Aminoazide 6' wurden dann in drei Stufen aus Aminoalkoholen 4' unter Anwendung aufeinanderfolgender N-Benzyloxycarbonylierung, Mesylierung und Azidierung hergestellt (Schema A). Schließlich wurden die Azide 6' mit Aminoaldehyden 3' unter Verwendung der Aza-Wittig-Methode^[29,30] gekoppelt, was geschützte DC-Chol-Triaminanaloge 7' lieferte, welche in dieser Stufe gelagert wurden. In unseren Händen wurde gefunden, daß Aza-Wittig-Kopplungsreaktionen mit Trimethylphosphin effizienter waren als das herkömmliche Triphenylphosphin, was mit Oorausgegangener Literatur in Einklang ist^[29]. Auch die Eliminierung von hinzugekommenem Wasser mit aktiOierten Molekularsieben erwies sich als hilfreich für den Erhalt beständig hoher Ausbeuten^[29]. Unmittelbar Oor jeglichen Genauslieferungsstudien wurden schützende Gruppen durch katalytische Transferhydrogenolyse unter Erhalt von Triaminanalogen 8' (Schema A) in 44–77% Gesamtausbeute entfernt.
Die Synthesen von Tetraminanalogen von DC-Chol wurden auf die nachfolgende Art und Weise durchgeführt. Mehrere Oerschiedene N-geschützte Diaminoalkohole 9' wurden durch Mono-N-Alkylierung von Aminoalkoholen 4' mit N-Benzyloxycarbonyl-geschützten Aminoalkylbromiden 10' hergestellt. Bromide 10' wurden selbst in drei Stufen aus Aminoalkoholen durch aufeinandertolgen de N-Benzyloxycarbonylierung, Mesylierung und Bromierung hergestellt (siehe Schema B in 27). Üblicherweise wird angenommen, daß Mono-N-Alkylierungen von primären Aminen schwierig zu kontrollieren sind. Nichtsdestotrotz wurde nun herausgefunden, daß eine Kombination von sterischer Zusammendrängung in den Reaktanten und milden Reaktionsbedingungen zunehmend daOor schützt, daß übermäßige N-Alkylierung stattfindet^[31]. Zeitweiliger Schutz der funktionalen Alkoholgruppe von 9' als t-Butyldiphenylsilylester, gefolgt von N-Benzyloxycarbonylierung und fluoridgeförderter Desilylierung lieferte bonafide mit Di-N-benzyloxycarbonyl geschützte Diaminoalkohole, welche dann durch Mesylierung, gefolgt von Azidierung in Diaminoazide 11' umgewandelt wurden (Schema B). Schließlich wurden geschützte DC-Chol-Tetraminanaloge 12' durch Kopplung von Aziden 11' an Cholesterylaminoaldehyde 3' mittels des Aza-Wittig-Verfahrens noch einmal gebildet (Schema B). Hinsichtlich der Herstellung von 8' (Schema A) wurden Schutzgruppen unmittelbar Oor Transfektionsstudien durch katalytische Transferhydrogenolyse unter Erhalt von Tetraminanalogen 13' (Schema B) in 12–38% Gesamtausbeute entfernt. Erfreulicherweise fanden wir, daß das Mono-N-AlkylierungsOerfahren in gleicher Weise gut zur Herstellung von N-Cholesteryloxycarbonyldiaminoaldehyd 14' aus N-Cholesterylalkohol 5' über Bromid 15' Oerwendet werden konnte (siehe Schema C in 28). Als ein Ergebnis konnten mehrere Oollständig geschützte DC-Chol-Pentaminanaloge 16' durch Aza-Wittig-Kopplung von Diaminoaldehyd 14' zu mit Di-N-benzyloxycarbonyl geschützten Diaminoaziden 11' hergestellt werden. DC-Chol-Pentaminanaloge 17' wurden dann durch Hydrogenolyse der schützenden Gruppen auf die übliche Art und Weise hergestellt (Schema C).
Die Fähigkeit von kationischen Liposomen, welche die Oerschiedenen DC-Chol-Polyaminanaloge enthielten, Genauslieferung zu Oermitteln, wurde sowohl in Oitro als auch in OiOo analysiert. Kationische Liposome wurden durch Hydratisierung eines getrockneten Lipidfilms, der DC-Chol-Analoges und DOPE 2 in einem geeigneten molaren Verhältnis von entweder 1 : 0, 1 : 1, 1 : 2 oder 2 : 1 enthielt, und Vortex-Mischen formuliert^[32]. Komplexe von kationischem Liposom/Plasmid-DNA wurden dann durch Hinzufügen von geeignet Oerdünnten kationischen Liposomensuspensionen in gleiche Volumina wäßriger Plasmid-DNA-Lösungen bei 30°C und Äquilibrierenlassen des Gemisches auf Umgebungstemperatur für 15 Minuten hergestellt^[32]. in Oitro Studien wurden dann mit immortalisierten Luftwegsepithelzellen von zystischer Fibrose (CFT1) durchgeführt, gefolgt von in OiOo Studien, bei denen Komplexe von kationischem Liposom/Plasmid-DNA intranasal in die Lungen von weiblichen BALB/c-Mäusen eingeträufelt wurden^[32]. Typischerweise wurde die kationische Liposomen-GenOerabreichung zuerst in Oitro optimiert, um das beste molare Verhältnis von kationischem Liposom zu Plasmid-DNA (die DNA-Konzentration wurde als Nukleotidkonzentration ausgedrückt) sowie die besten absoluten Mengen von beidem festzustellen, wie es erläutert ist (23). Diese optimierte Kombination wurde dann in OiOo getestet. Die in Oitro Ergebnisse sind gezeigt (24). Sechs DC-Chol-Analoges enthaltende Liposome zeigten, daß sie signifikante Verbesserungen der Genauslieferungseffizienz gegenüber DC-Chol/DOPE-Liposomen, die auf ähnliche Weise formuliert waren, Oerliehen. Die Analogen waren 8a', 8b', 8e', 8f', 13a' und 17b', wobei die ersten Oier Triamine, das fünfte ein Tetramin und das sechste ein Pentamin waren. Mit einer Ausnahme, 8f', enthalten diese Polyaminanaloge Inter-Stickstoff-Methylengruppenabstände, die normalerweise nicht mit den natürlichen Polyaminen Spermidin 18' (siehe z. B. 29), Spermin 19' (siehe z. B. 29) und Pentamin 20' (siehe z. B. 29), auf welchen diese Strukturen basieren, einhergehen. in OiOo ( 25) waren die besten DC-Chol-Analoge 13c', 13f' und insbesondere 17a'. Sowohl 17a' als auch 13c' enthalten auch unnatürliche Methylengruppenabstände.
Unter den besten in OiOo Analogen arbeitet 17a' etwa 100-fach effizienter in Mauslunge als DC-Chol 1 und ungefähr 500-fach relatiO zu Plasmid-DNA alleine (25). Es wurde nur von einem anderen Cytofectin berichtet, daß es auf diesem NiOeau der Wirksamkeit in OiOo arbeitet, nämlich das Lipid 67 21' (siehe 29), ein "T"-förmiges Tetraminanaloges von DC-Chol^[32]. Keines der anderen beschriebenen Cytofectine scheint nahe an dieses NiOeau der in OiOo Wirksamkeit heranzukommen mit der möglichen Ausnahme von (B1)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis-(dodecyloxy)-1-propanaminiumbromid (GAP-DLRIE) 22' (siehe 29), von dem beschrieben wurde, daß es etwa 100-fach besser arbeitet als Plasmid-DNA alleine^[33]. Andere Cytofectine wurden beschrieben, aber häufig wurden sie noch nicht in OiOo eingesetzt oder ansonsten mit eher schlechten Ergebnisse^[21,34,35].
Die Analogen 8f' und 13f' wurden zuOor entweder ohne Details über eine synthetische Charakterisierung^[32] oder als unreine Mischungen, bekannt als SpdC bzw. SpC, beschrieben. Im ersten Fall wurde gefunden, daß die Genauslieferungsverhalten in Oitro und in OiOo mit unseren hierin berichteten Ergebnissen vergleichbar waren^[32]. Im letzteren Fall wurde über SpC berichtet, daß es nicht gut arbeitet und relatiO toxisch ist^[34]. Unsere Daten mit dem Analogen 13f' stützen diese Beobachtungen nicht.
Experimentelles Verfahren
Die synthetischen Verfahren, die zur Herstellung der DC-Chol-Polyaminanalogen verwendet wurden, werden nachfolgend dokumentiert.
Schema A
Reagenzien und Bedingungen: i, CH₂Cl₂ (0,2 M), CholOC(O)Cl (0,45 eqv), 5 h, 98–99%; ii, (a) CH₂Cl₂ (0,1 M) (COCl)₂ (1,5 eqv), DMSO (3 eqv), –78°C, 15 min; (b) 5', 15 min; (c) i-Pr₂NEt (3 eqv) bis RT, 93–97%; iii, (a) CH₂Cl₂ (0,2 M), PhCH₂OC(O)Cl (0,45 eqv), 10 h; (b) CH₂Cl₂ (0,2 M), Et₃N (3 eqv), CH₃SO₂Cl (2,5 eqv), 0°C bis RT, 15 min; (c) DMF (0,15 M), NaN₃ (5 eqv), NaI, 80°C, 2 h, 68–87%; iv, (a) 6', THF (0,5 M), 4 Å-Molekularsiebe, PMe₃ (1,15 eqv), 30 min; (b) 3' (1,1 eqv), 3 h; (c) EtOH (0,5 M), NaBH₄ (2 eqv), 20 h, 72–90%; v, EtOH (0,2 M), c-C6H10 (20 eqv), 10% Pd(C) (0,5 eqv), Rückflußkochen, 30 min, 99%.
Schema B
Reagenzien und Bedingungen: i, (a) CH₂Cl₂ (0,2 M), PhCH₂OC(O)Cl (0,45 eqv), 10 h; (b) CH₂Cl₂ (0,2 M), Et₃N (3 eqv), CH₃SO₂Cl (2,5 eqv), 0°C bis RT, 15 min; (c) DMF (0,15 M), NaBr (5 eqv), 80°C, 2 h, 68–87%; ii, 10', DMF (0,1 M), 4' (5 eqv), K₂CO₃ (2 eqv), NaI (0,3 eqv), 24–72 h, 74–88%; iii, (a) CH₂Cl₂ (0,2 M), Et₃N (1,5 eqv), TBDPSCl (1,2 eqv), DMAP (0,1 eqv), 09AC bis RT, 2–4 h; (b) CH₂Cl₂ (0,2 M), PhCH₂OC(O)Cl (1,5 eqv), Et₃N (1,5 eqv), 6–10 h; (c) THF (0,5 M), TBAF (1,1 eqv), 4–5 h; (d) CH₂Cl₂ (0,2 M), Et₃N (3 eqv), CH₃SO₂Cl (2,5 eqv), 0°C bis RT, 15 min; (e) DMF (0,15 M), NaN₃ (5 eqv), NaI, 80°C, 2 h, 37–70%; iv, (a) 11', THF (0,5 M), 4 Å-Molekularsiebe, PMe₃ (1,15 eqv), 30 min; (b) 3' (1,1 eqv), 3 h; (c) EtOH (0,5 M), NaBH₄ (2 eqv), 20 h, 64–71%; v, EtOH (0,2 M), c-C6H10 (20 eqv), 10% Pd(C) (0,5 eqv), Rückflußkochen, 30 min, 99%.
Schema C
Reagenzien und Bedingungen: i, (a) CH₂Cl₂ (0,2 M), Et₃N (3 eqv), CH₃SO₂Cl (2,5 eqv), 0°C bis RT, 15 min; (b) DMF (0,15 M), NaBr (5 eqv), 80°C, 2 h, 68–87%; ii, (a) 15', DMF (0,1 M), 4' (5 eqv), K₂CO₃ (2 eqv), NaI (0,3 eqv), 24–72 h; (b) CH₂Cl₂ (0,2 M), Et₃N (1,5 eqv), TBDPSCl (1,2 eqv), DMAP (0,1 eqv), 0°C bis RT, 2–4 h; (c) CH₂Cl₂ (0,2 M), PhCH₂OC(O)Cl (1,5 eqv), Et₃N (1,5 eqv), 6–10 h; (d) THF (0,5 M), TBAF (1,1 eqv), 4–5 h; (e) CH₂Cl₂ (0,1 M) (COCl)₂ (1,5 eqv), DMSO (3 eqv), –78°C, 15 min; (f) mit Di-N geschützter Diaminoalkohol, 15 min; (g) i-Pr₂NEt (3 eqv) bis RT, 53–66%; iii (a) 11', THF (0,5 M), 4 Å-Molekularsiebe, PMe₃ (1,15 eqv), 30 min; (b) 14' (1,1 eqv), 3 h; (c) EtOH (0,5 M), NaBH₄ (2 eqv), 20 h, 56–74%; iv, EtOH (0,2 M), c-C6H10 (20 eqv), 10% Pd(C) (0,5 eqv), Rückflußkochen, 30 min, 99%.
Daten
Repräsentative analytische Daten, angegeben für die wirkungsvollsten Analogen in vitro (Triamin 8e', Tetramin 13a' und Pentamin 17b') und in vivo (Tetramin 13f' und Pentamin 17a').
4-Aza-N¹-cholesteryloxycarbonyl-1,7-heptandiamin (ACH) [B178] 8e'
Vergleichsbeispiel

v_max (CH₂Cl₂) 3347, 2937, 2905, 2868, 1698, 1534, 1467, 1379 und 1264 cm^–1; δ_H (300 MHz) 5,76 (1H, br s, NHCO), 5,22 (1H, m, H-6'), 4,33 (1H, m, H-3'), 3,08 (2H, m, H-1), 2,65 (2H, t, J 6,5 Hz, H-7), 2,53 (2H, t, J 6,5 Hz, H-3), 2,41 (2H, m, H-5), 2,24–2,12 (2H, m, H-4'), 1,90–1,69 (5H, m, H-2', H-7', H-8'), 1,55–0,93 (28H, m, H-2, H-4, H-6, H-1', H-9', H-11', H-12', H-14' bis H-17', H-20', H-22' bis H-25', NH₂), 0,88 (3H, s, H-19'), 0,79 (3H, d, J 6,5 Hz, H-21'), 0,73 (6H, dd, J 6,0 und 0,5 Hz, H-26' und H-27'), 0,55 (3H, s, H-18'); δ_C (75 MHz) 156,29 (NHC(O)O), 139,77 (C-5'), 122,24 (C-6'), 73,85 (C-3'), 56,59 (C-14'), 56,09 (C-17'), 49,92 (C-9'), 47,61 (C-1), 47,52 (C-3), 42,20 (C-4'), 40,22 (C-5), 39,66 (C-16'), 39,42 (C-24'), 38,57 (C-7), 36,94 (C-2), 36,44 (C-22'), 36,11 (C-8'), 35,71 (C-20'), 33,04 (C-7'), 31,78 (C-6), 28,14 (C-2'), 27,87 (C-25'), 24,19 (C-12'), 23,78 (C-15'), 22,74 (C-23'), 22,49 (C-26'), 20,96 (C-11'), 19,25 (C-19'), 18,65 (C-21'), 11,77 (C-18'); m/z (FAB) 544 (M + H)⁺, 369 (Chol)⁺, 95 43 (Gefunden: (M + H)⁺, 544,4885. C₃₄H₆₂N₃O₂ erfordert (M + H)⁺, 544,4842).

N¹-Cholesteryloxycarbonyl-3,7-diaza-1,9-nonandiamin (CDAN) [B198] 13a'

v_max (CH₂Cl₂) 3584–3245, 2937, 2868, 1695, 1538, 1469, 1379, 1251, 1133 und 1014 cm^–1; δ_H (400 MHz) 5,82 (1H, br s, NHCO), 5,23 (1H, m, H-6'), 4,33 (1H, m, H-3'), 3,54–2,55 (16H, m, H-1 bis H-4, H-6 bis H-9, HN₂), 2,21–2,09 (2H, m, H-4'), 1,97–1,73 (5H, m, H-2', H-7', H-8'), 1,55–0,99 (23H, m, H-5, H-1', H-9', H-11', H-12', H-14' bis H-17', H-20', H-22' bis H-25'), 0,88 (3H, s, H-19'), 0,78 (3H, d, J 6,0 Hz, H-21'), 0,74 (6H, d, J 6,5 Hz, H-26' und H-27'), 0,55 (3H s, H-18'); δ_C (100 MHz) 156,38 (NHC(O)O), 139,70 (C-5'), 122,30 (C-6'), 73,99 (C-3'), 56,56 (C-14'), 56,05 (C-17'), 51,91 (C-1), 49,88 (C-9'), 47,95 (C-2), 42,18 (C-4'), 41,12 (C-8), 39,63 (C-16'), 39,40 (C-24'), 38,53 (C-2), 36,90 (C-1'), 36,42, (C-22'), 36,08 (C-8'), 35,69 (C-20'), 31,75 (C-7'), 29,62 (C-5), 28,12 (C-2'), 27,86 (C-25'), 24,17 (C-12'), 23,75 (C-15'), 22,73 (C-23'), 22,48 (C-26'), 20,94 (C-11'), 19,24 (C-19'), 18,62 (C-21'), 11,76 (C-18'); m/z (FAB) 573 (M + H)⁺, 544, 513, 460,369 (Chol)⁺, 215, 95 (Gefunden: (M + H)⁺, 573,5139. C₃₅H₆₅NaO₂ erfordert (M + H)⁺, 573,5108).

N¹⁰-Cholesteryloxycarbonyl-4,8,13-triaza-1,16-hexadecandiamin (CTAH) [B222] 17b'
Vergleichsbeispiel

v_max (CH₂Cl₂) 3344, 2936, 2855, 1700, 1536, 1468, 1379, 1265, 1122 und 1028 cm^–1; δ_H (300 MHz) 5,69 (1H, br s, NHCO), 5,22 (1H, d, J 4,0 Hz, H-6'), 4,33 (1H, m, H-3'), 3,20 (2H, m, H-1), 2,63 (2H, t, J 6,5 Hz, H-3), 2,55–2,35 (12H, m, H-5, H-8, H-10, H-12, H-14, H-16), 2,23–2,08 (7H, m, H-4, H-9, H-13, H-4'; NH₂), 1,90–1,63 (5H, m, H-2', H-7', H-8'), 1,57–0,90 (31H, m, H-2, H-6, H-7, H-11, H-15, H-1', H-9', H-11', H-12', H-14' bis H-17', H-20', H-22' bis H-25'), 0,87 (3H, s, H-19'), 0,78 (3H, d, J 6,5 Hz, H-21'), 0,73 (6H, d, J 6,5 Hz, H-26' und H-27'), 0,55 (3H, s, H-18'); δ_C (75 MHz) 156,27 (NHC(O)O), 139,79 (C-5'), 122,24 (C-6'), 73,86 (C-3'), 56,58 (C-14'), 56,06 (C-17'), 49,92 (C-9'), 49,62 (C-1), 49,72 (C-3), 49,62 (C-12), 47,52 (C-14), 42,20 (C-4'), 39,65 (C-16'), 39,42 (C-24'), 38,56 (C-8), 36,93 (C-1'), 36,45 (C-22'), 36,09 (C-8'), 35,69 (C-20'), 31,78 (C-7'), 28,14 (C-2'), 27,88 (C-25'), 27,74 (C-2), 24,19 (C-12'), 23,74 (C-15'), 22,75 (C-23'), 22,49 (C-26'), 20,95 (C-11'), 19,26 (C-19'), 18,64 (C-21'), 11,77 (C-18'); m/z (FAB) 672 (M + H)⁺, 570, 539, 369 (Chol)⁺, 84 (Gefunden: (M + H)⁺, 672,6205. C₄₁H₇₈N₅O₂ erfordert (M + H)⁺, 672,6156).

N¹-Cholesteryloxycarbonyl-4,9-diaza-1,12-dodecandiamin (CDAD) [B185] 13f'
Vergleichsbeispiel

v_max (CH₂Cl₂) 3349, 2937, 2868, 1697, 1468, 1378 und 1253 cm^–1; δ_H (400 MHz) 5,70 (1 H, br s, NHCO), 5,27 (1H, m, H-6'), 4,38 (1H, m, H-3'), 3,28–3,14 (6H, m, H-1, H-4, H-9, NH₂), 2,71 (2H, t, J 6,5 Hz, H-12), 2,63–2,52 (8H, m, H-3, H-5, H-8, H-10), 2,33–2,17 (2H, m, H-4'), 1,93–1,85 (5H, m, H-2', H-7', H-8'), 1,77–1,07 (29H, m, H-2, H-6, H-7, H-11, H-1', H-9', H-11', H-12', H-14' bis H-17', H-20', H-22' bis H-25'), 1,03 (3H, s, H-19'), 0,97 (3H, d, J 6,0 Hz, H-21'), 0,77 (6H, dd, J 5,0 und 1,5 Hz, H-26' und H-27'), 0,59 (3H, s, H-18'); δ_C (100 MHz) 156,25 (NHC(O)O), 139,77 (C-5'), 122,26 (C-6'), 73,87 (C-3'), 56,57 (C-14'), 56,04 (C-17'), 49,90 (C-1), 49,60 (C-9'), 49,47 (C-3), 47,40 (C-10), 42,19 (C-4'), 39,63 (C-16'), 39,40 (C-24'), 38,55 (C-8), 36,92 (C-5), 36,44 (C-22'), 36,08 (C-8'), 35,69 (C-20'), 31,77 (C-7'), 28,13 (C-2'), 27,87 (C-25'), 27,53 (C-2), 24,18 (C-16), 23,74 (C-12'), 22,73 (C-23'), 22,48 (C-26'), 20,94 (C-11'), 19,25 (C-19'), 18,62 (C-21'), 11,76 (C-18'); m/z (FAB) 615 (M + H)⁺, 539,369 (Chol)⁺, 57 (Gefunden: (M + H)⁺, 615,5626. C₃₈H₇₁H₄O₂ erfordert (M + H)⁺, 615,5577).

N¹⁵-Cholesteryloxycarbonyl-3,7,12-triaza-1,15-pentadecandiamin (CTAP) [B232] 17a'

v_max (CH₂Cl₂) 3568–3295, 2937, 1690, 1537, 1467, 1380, 1130 und 1019 cm^–1; δ_H (300 MHz) 5,76 (1H, br s, NHCO), 5,22 (1H, m, H-6'), 4,32 (1H, m, H-3'), 3,21 (2H, m, H-15), 2,65 (2H, t, J 5,5 Hz, H-13), 2,56–2,45 (12H, m, H-1, H-2, H-4, H-6, H-8, H-11), 2,18–2,05 (2H, m, H-4'), 1,97–1,67 (10H, m, H-3, H-7, H-12, H-2', H-7', H-8', NH₂), 1,59–0,91 (29H, m, H-5, H-9, H-10, H-14, H-1', H-9', H-11', H-12', H-14' bis H-17', H-20', H-22' bis H'-25), 0,86 (3H, s, H-19'), 0,77 (3H, d, J 6,5 Hz, H-21'), 0,72 (6H, dd, J 6,0 und 1,0 Hz, H-26' und H-27'), 0,53 (3H, s, H-18'); δ_C (75 MHz) 156,24 (HHC(O)O), 139,77 (C-5'), 122,21 (C-6'), 73,81 (C-3'), 56,57 (C-14'), 56,05 (C-17'), 49,91 (C-9'), 49,67 (C-15), 48,20 (C-13), 42,19 (C-4'), 39,64 (C-16'), 39,40 (C-24'), 38,56 (C-2), 36,92 (C-1'), 36,43 (C-22'), 36,08 (C-8'), 35,68 (C-20'), 31,77 (C-7'), 28,12 (C-2'), 27,86 (C-25'), 27,69 (C-14), 27,63 (C-5), 24,17 (C-12'), 23,74 (C-15'), 22,73 (C-23'), 22,48 (C-26'), 20,94 (C-11'), 19,25 (C-19'), 18,63 (C-21'), 11,76 (C-18'); m/z (FAB) 658 (M + H)⁺, 539, 369 (Chol)⁺, 95, 84 (Gefunden: (M + H)⁺, 658,6056. C₄₀H₇₆H₅O₂ erfordert (M + H)⁺, 658,5999).

IN VITRO UND IN VIVO TESTS
Für die Tests in vitro und in vivo wurde ein getrockneter Lipidfilm, der das vorgegebene DC-Chol-Analoge und DOPE 2 (in jeweiligem molarem Verhältnis von entweder 1 : 0, 1 : 1, 1 : 2 oder 2 : 1) enthielt, für 10 Minuten in sterilem pyrogenfreiem Wasser hydratisiert, und anschließend wurden die Liposome durch Vortex-Mischen für 2 Minuten hergestellt. Der durchschnittliche Durchmesser betrug zwischen 200–400 nm^[32]. Kationische Liposome, die DC-Chol 1 und DOPE 2 enthielten, wurden auf die gleiche zuvor beschriebene Weise formuliert^[24,36].
Komplexe von kationischem Liposom/Plasmid-DNA wurden wie folgt hergestellt.
Sowohl Suspensionen von kationischem Liposom als auch Lösungen von DNA (entweder pCF1-βGal-Plasmid, welches β-Galactosidase exprimiert, oder pCF1-CAT, welches Chloramphenicolacetyltransferase exprimiert)^[32] wurden separat für 5 Minuten bei 30°C vorinkubiert, bevor sie auf die geeigneten Endkonzentrationen verdünnt und anschließend vereinigt wurden. Üblicherweise wurden Suspensionen von kationischem Liposom zu einem etwa gleichen Volumen Plasmid-DNA-Lösungen hinzugefügt. Die Komplexe wurden für ein Minimum von 15 Minuten bei Umgebungstemperatur äquilibrieren gelassen und innerhalb von zwei Stunden nach der Herstellung verwendet. In vitro und in vivo Genauslieferungstests wurden dann durchgeführt, wie es zuvor beschrieben ist, unter Verwendung von CFT1-Zellen bzw. weiblichen BALB/c-Mäusen^[32].
DISKUSSION
In der Theorie wird genetische Eigenschaftsanalyse möglicherweise in der Lage sein, alle genetischen Loci zu identifizieren, welche eine Krankheit verursachen oder dazu beitragen. Mit dieser Information können ein korrigierendes Gen oder korrigierende Gene identifiziert werden, welche, wenn sie in die entsprechenden Organe und Zellen des Körpers in vivo eingebracht werden, den ursächlich pathophysiologischen Defekt der Krankheit korrigieren sollten. Dies ist das Grundkonzept von Gentherapie. Solch ein einfacher Ansatz sollte in der Lage sein, die Krankheit im Gegensatz zu den meisten herkömmlichen pharmazeutischen Ansätzen, welche typischerweise nur Symptome behandeln, zu heilen.
Jedoch ist das Einbringen von potentiell korrigierendem Gen oder korrigierenden Genen nicht einfach. Während unter bestimmten Umständen nackte DNA verabreicht werden kann, ist meistenteils ein Auslieferungsvehikel oder ein Vektor erforderlich, um eine effiziente Genauslieferung zu bewirken. Verschiedene physikalische, chemische und virusbasierte Vektorsysteme sind bekannt, aber keines ist ausreichend wirkungsvoll für eine allgemeine Anwendung in humaner Gentherapie. Trotzdem sind einige Vektoren aussichtsreich, insbesondere auf kationischen Liposomen basierende Gentransfersysteme^[21].
Kationische Liposome sind heterogene Lipidvesikel, die typischerweise entweder aus einem einzelnen kationischen Amphiphil (in einigen Fällen bekannt als ein Cytofectin) oder allgemeiner aus einer Kombination eines kationischen Amphiphils und eines neutralen Lipids gebildet werden. Sie vermitteln Genauslieferung durch elektrostatische Wechselwirkung mit negativ geladenen DNA-Sequenzen, welche Komplexe bilden, die in Zellen durch Endocytose^[22] oder Phagocytose^[23] eindringen können und dann DNA für eine Expression in dem Zellkern freisetzen^[21]. Wir haben gezeigt, daß kationische Liposome, die aus dem kationischen Amphiphil 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol (DC-Chol) 1 und dem neutralen Phospholipid Dioleoyl-L-α- phosphatidylethanolamin (DOPE) 2 gebildet werden, in der Lage waren, die Lungen von Mäusen in vivo zu transfizieren^[24]. Seitdem wurden einige präparatorische klinische Versuche am Menschen unter Verwendung ähnlicher DC-Chol/DOPE-kationischer Liposome durchgeführt^[25].
Beide Sätze von Experimenten repräsentieren einen Beweis des Prinzips, welches zeigt, daß Gentherapie mit kationischen Liposomen möglich ist. Jedoch zeigten beide Sätze von Experimenten auch, daß DC-Chol/DOPE-kationische Liposome bei der Genauslieferung für eine allgemeine Anwendung in der humanen Gentherapie nicht ausreichend wirkungsvoll sind. Darüber hinaus ist es schwierig beim Fehlen von jeglichem Verständnis der Verhältnisse von kationischer Liposomenstruktur/Aktivität Verbesserungen vorzunehmen.
Die vorliegende Erfindung will die früheren Studien verbessern. Darüber hinaus will die vorliegende Erfindung einige der hinter liposomenvermittelter Genauslieferung zugrundeliegender chemischer Prinzipien verstehen.
In diesem Zusammenhang wurde eine systematische Reihe von DC-Chol-Analogen hergestellt, welche in kationische Liposome aufgenommen werden konnten, und hinsichtlich Genauslieferung bewertet.
In der Schlußfolgerung haben wir einen flexiblen synthetischen Weg zu DC-Chol-Polyaminanalogen entwickelt, welcher es uns erlaubt hat, Analoge mit optimierten Methylengruppenabständen zwischen aminfunktionalen Gruppen sowohl für in vitro als auch in vivo Genauslieferung zu identifizieren. Insgesamt haben wir so weit herausgefunden, daß ein unnatürlicher Abstand besser zu arbeiten scheint. Ohne daß man an eine Theorie gebunden sein möchte, weisen diese Polyamine vielleicht eine geringfügig abgeschwächte Wechselwirkung mit DNA auf, was die Freisetzung von DNA in das Cytoplasma nach einem Transfer des Komplexes aus kationischem Liposom/DNA durch die äußere Zellmembran erleichtert.
Derzeit legen Hinweisen so weit nahe, daß unser bevorzugtes DC-Chol-Analoges für in vivo Studien und Anwendung N¹⁵-Cholesteryloxycarbonyl-3,7,12-triaza-1,15-pentadecandiamin (CTAP) 17a' ist. Diese Verbindung ist ein neues Pentamin eines Typs, von dem zuvor nicht gezeigt wurde, daß er Zellen transfiziert. Die Wirksamkeit dieser Verbindung scheint die erforderlichen Niveaus zu erfüllen, die scheinbar für ein Cytofectin erforderlich sind, daß es eine realistische potentielle klinische Anwendung besitzt^{[21,24,25,32]}.
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassend wurden in den oben genannten Beispielen Liposome hergestellt aus Verbindungen, die einen Cholesterolbestandteil und einen Kopfgruppenbestandteil umfassen. Die Ausgestal tung der Verbindungen, welche als kationische Lipide verwendet wurden, konzentrierte sich auf die direkte Manipulation der Kopfgruppe. Bei diesen Verbindungen nimmt man an, daß das Vorhandensein der Carbamoylverknüpfung für eine niedrige Cytotoxizität vorteilhaft ist, und man nimmt an, daß das Vorhandensein von Cholesterol für die Stabilisierung der liposomalen Doppelschicht vorteilhaft ist. In diesen Studien waren wir in der Lage, die Identität der Kopfgruppe zu verändern, um die positive Nettoladung des Liposoms zu erhöhen. Eine Erhöhung der positiven Nettoladung ist vorteilhaft, weil man annimmt, daß dies die DNA-Bindungsfähigkeit und die Effizienz von Gentransfer des resultierenden Liposoms erhöht.
LITERATUR

1. W F Anderson, Science, 1992, 256, 808.
2. F D Ledley, Current Opinion in Biotechnology, 1994, 5, 626; K F Kozarsky, et al, ibid, 1493, 3, 499; Gordon, et al, ibid, 1994, 5, 611.
3. C P Hadgon, BioTech, 1995, 13, 222.
4. P L Felgner, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84, 7413; Felgner, er al, Nature, 1989, 337, 387; H-J Burges, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89, 2145.
5. Malone, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86, 6077.
6. M-Y Chiang, et al, J Biol Chem, 1991, 226, 18162.
7. R J Debs, et al, J Biol Chem, 1990, 265, 10189; C Walker, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89, 7915.
8. A D Bangham, Hospital Practice, 1992, 27, 51.
9. J-P. Behr, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86, 6982; R Leventis, et al, Biochim Biophys Acta, 1990, 1023, 124.
10. X Gao, et al, Gene Therapy, 1995, 2, 710.
11. R Stribling, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89, 11277.
12. E W F W Alton, et al, Nature Genetics, 1993, 5, 135.
13. X Gao, et al, Biochim Biophys Res Commun, 1991, 199, 280.
14. J E Morgan, er al, Arch Biochem Biophys, 1986, 246, 225.
15. A E Pegg, Biochem, 1986, 234, 249.
16. H Staudinger, et al, Helv Chim Acta, 1919, 2, 635; S Knapp, et al, J Org Chem, 1992, 57, 6239
17. K Omura, et al, Tetrahedron, 1978, 34, 1651.
18. J K Guy-Caffey, et al, 7 Biol Chem, 1995, 270, 31391,
21. a) X. Gao, L. Huang, Gene Ther. 1995, 2, 710–722, and references therein;
b) A. D. Miller, R. G. Cooper, C. J. Etheridge, L. Stewart in Microspheres, Microcapsules and Liposomes (Ed. R. Arshady), John Wiley & Sons, 1997, in press, and references therein; c) P. L. Felgner, Hum. Gene Ther. 1996, 7, 1791–1793.
22. a) H. Farhood, N. Serbina, L. Huang, Biochim. Biophys. Acta 1995, 1235, 289–295;
b) J. Zabner, A. J. Fasbender, T. Moninger, K. A. Poellinger, M. J. Weish, J. Biol. Chem. 1995, 274, 18997–19007.
[23], H. Mitsui, L. G. Johnson, S. H. Randell, R. C. Boucher, J. Biol. Chem. 1997, 272, 1117–1126.
24. E. W. F. W. Alton, P. G. Middleton, N. J. Caplen, S. N. Smith, D. M. Steel, F. M. Munkonge, P. K. Jeffery, D. M. Geddes, S. L. Hart, R. Williamson, K. I. Fasold, A. D. Miller, P. Dickinson, B. J. Stevenson, G. McLachlan, J. R. Dorin, D. J. Porteous, Nature Genetics 1993, 5, 135–142.
25. a) N. J. Caplen, E. W. F. W. Alton, P. G. Middleton, J. R. Dorin, B. J. Stevenson, X. Gao, S. R. Durham, P. K. Jeffery, M. E. Hodson, C. Coutelle, L. Huang, D. J. Porteous, R. Williamson, D. M. Geddes, Nature Medicine 1995, 1, 39–46;
b) G. J. Nabel, E. G. Nabel, Z.-y. Yang, B. A. Fox, G. E. Plautz, X. Gao, L, Huang, S. Shu, D. Gordon, A. E. Chang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 11307–11311.
26. Liposomes: a practical approach (Ed.: R. R. C. New), IRL Press, Oxford, 1990.
27. J. N. Felgner, R. Kumar, C. N. Sridhar, C. J. Wheeler, Y. J. Tsai, R. Border, P. Ramsey, M. Martin, P. L. Felgner, J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550–2561.
28. K. Onura, D. Swern, Tetrahedron 1978, 34, 1651–1660.
29. S. Knapp, J. J. Hale, M. Bastos, A. Molina, K. Y. Chen, J. Org. Chem. 1992, 57, 6239–6256
30. (a) H. Staudinger, J. Meyer, Helv. Chim. Acta 1919, 2, 635–646;
(b) E. Fabiano, B. T. Golding, M. M. Sadeghi, Synthesis 1987, 190–192;
(c) B. T. Golding, M. C. O'Sullivan, L. L. Smith, Tetrahedron Lett. 1988, 29, 6651–6654;
(d) Y. G. Gololobov, L. F. Kasukhin, Tetrahedron 1992, 48, 1353–1406;
(e) A. W. Johnson, W. C. Kaska, K. A. O. Starzewski, D. A. Nixon, Ylides and Imines of Phosphorus (Ed.: A. W. Johnson), J. Wiley and Sons, New York, 1993. chap. 13, pp. 403–483.
31. (a') J. E. Baldwin, R. M. Adlington, A. S. Elend, M. L. Smith, Tetrahedron 1995, 51, 11581–11594;
(6) R. M. Moriarty, S. M. Tuladhar, L. Guo, S. Wehrli, Tetrahedron Lett. 1194, 35, 8103–8106.
32. E. R. Lee, J. Marshall, C. S. Siegel., C. Jiang, N. S. Yew, M. R. Nichols, J. B. Nietupski, R. J. Ziegler, M. B. Lane, K. X. Wang, N. C. Wan, R. K. Scheule, D. J. Harris, A. E. Smith, S. H. Cheng, Hum. Gene Ther. 1996, 7, 1701–1717.
33. C. J. Wheeler, P. L. Felgner, Y. J. Tsai, J. Marshall, L. Sukhu, S. G. Doh, J. Hartikka, J. Nietupski, M. Manthorpe, M. Nichols, M. Plewe, X. Liang, J. Norman, A. Smith, S. H. Cheng, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11454–11459.
34. J. K. Guy-Caffey, V. Badepudi, J. S. Bishop, K. Jayaraman, N. Chaudhary, J, Biol. Chem. 1995, 270, 31391–31396.
35. a) J.-P. Vigneron, N. Oudrhiri, M. Fauquet, L. Vergely, J.-C. Bradley, M. Basseville, P. Lehn, J.-M. Lehn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9682–9686;
b) J. G. Lewis, K.-Y. Lin, A. Kothavale, W. M. Flanagan, M. D. Matteucci, B. De Prince, R. A. Mook Jr., R. W. Hendren, R. W. Wagner, ibid 1996, 93. 3176–3181;
e) D. Moradpour, J. I. Schauer, V. R. Zurawski Jr., J. R. Wands, R. H. Boutin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 221, 82–88.
36. X. Gao. L. Huang, Biochem, Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 280–285.

Claims

Verbindung, ausgewählt unter Verbindungen der Formeln

wobei Chol eine Gruppe der folgenden Formel bezeichnet:
Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt unter Verbindungen der Formeln
Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt unter Verbindungen der Formeln
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 im Gemisch mit oder einhergehend mit einer Nukleotidsequenz.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines genetischen Zustandes oder einer genetischen Krankheit.
Kationisches Liposom, hergestellt aus der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verfahren zur Herstellung eines kationischen Liposoms, bei dem man das kationische Liposom aus der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bildet.
Kationisches Liposom nach Anspruch 10 oder kationisches Liposom, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 11, zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung eines kationischen Liposoms nach Anspruch 10 oder eines kationischen Liposoms, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 11, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines genetischen Zustands oder einer genetischen Krankheit.
Kombination aus einer Nukleotidsequenz und einem oder mehreren der folgenden: einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einem kationischen Liposom nach Anspruch 10 oder einem kationischen Liposom, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 11.
Kombination nach Anspruch 14 für die Verwendung in der Therapie.
Verwendung einer Kombination nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer genetischen Störung oder eines genetischen Zustands oder einer genetischen Krankheit.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 im Gemisch mit einem Arzneimittel und optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein kationisches Liposom nach Anspruch 10 oder ein kationisches Liposom, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 11, im Gemisch mit einem Arzneimittel und optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel enthält.