WO1997031934A2 - Neue metabolisierbare lipopolyamine, deren darstellung und anwendung - Google Patents

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WO1997031934A2
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Stephan KÖNIG
Roland KLÖSEL
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Chemicon Laboratories Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0005—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring the nitrogen atom being directly linked to the cyclopenta(a)hydro phenanthrene skeleton

Definitions

  • New metabolizable lipopolyamines their preparation and use.
  • Positively charged lipids JPBehr, Biocoujugate Chem. 5, 382-389 (1994)
  • lipids graze in the form of liposomes or as such for the introduction of biologically active substances such as peptides, proteins, antiviral agents, but especially DNA, RNA, antisense DNA / RNA or ribozymes are used in eukaryotic cells (for example mammalian, plant, insect cells).
  • eukaryotic cells for example mammalian, plant, insect cells.
  • Lipopolyamines are a special class of cationic lipids that show comparatively excellent transfection properties. Transfection is the introduction of genetic material into eukaryotic cells.
  • DNA e.g. plasmids, cosmids, single-stranded or double-stranded
  • RNA or related classes of substances such as antisense-DNA / RNA or ribozymes
  • lipofection Another method is called lipofection (PLFelgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 7413 (1987)). This takes advantage of the fact that synthetic cationic lipids in the form of liposomes or as such form complexes with the negatively charged DNA. If the proportions of DNA and cationic lipid are adjusted so that the resulting complexes have a positive net charge, they have a high affinity for the negatively charged membrane surface of eukaryotic cells. If such DNA / lipid complexes meet cells, the genetic material is introduced into the cell.
  • Liposomes are spherical arrangements of lipids in aqueous solutions with a "bilayer structure" and are typically divided into three classifications (see NY Academy Sciences Meeting: “Liposomes and their use in Biology and Medicine” from December 1977): Multilamellar vesicles (MLV, bis 10000 ⁇ m), small unilamellar vesicles (SUN, 20-50 nm) and large unilamellar vesicles (LUV, 600-30000 ⁇ m)
  • MLV Multilamellar vesicles
  • SUN small unilamellar vesicles
  • LUV large unilamellar vesicles
  • Liposomes are typically also produced in the following way: The lipids are taken up in an organic solvent. Evaporation of the solvent under a stream of nitrogen creates a thin lipid film on the glass vessel wall. Adding water or aqueous buffer solution hydrates this film. The solution obtained is finally treated with ultrasound.
  • Cationic lipids are becoming increasingly important in gene therapy.
  • Body cells are transfected in vivo using various methods by administering complexes of carrier and DNA intradermally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously, intranasally, in CSF rooms or directly in tumors, or by removing, transfecting and reimplanting body cells.
  • a method preferred in this context was the introduction of the genetic material by viral carriers.
  • this method runs the risk of being mutated back to a pathogenic virus.
  • the introduced DNA is stably incorporated into the genetic material, so that it is no longer possible to control the therapy or to return the cells to their original state.
  • viral Carriei have restrictions on the size of the DNA to be introduced.
  • Modified DNA or RNA is not transmitted by viruses. In addition, only expensive cells can be transfected in this way. Transfection with cationic lipids, however, is not subject to these restrictions. The transfection is usually transient, meaning that the transferred DNA or RNA is only expressed for a certain time, since it is not built into the genetic material, but only transported into the cytoplasm, where it is broken down over time by nucleases. In this way, gene therapy can be dosed and made reversible. There are no restrictions on the size of the DNA and modified DNA or RNA can be introduced into cells using cationic lipids. Non-expensive cells, such as nerve cells, can also be transfected by cationic lipids.
  • lipids which uses the known high affinity between spermine and DNA for transfection, in which the spermine positively charged at a physiological pH value is linked to a hydrophilic residue, in some cases via a spacer.
  • Spermiu forms particularly stable complexes with DNA and similar compounds by being hydrogen-bonded in the groove of the DNA.
  • the first such lipospermine derivatives were from Behr, J. P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Be. USA 86: 6982-6986; EP 03941 11 synthesized. They linked carboxyspermiu via a spacer with two different hydrophilic residues.
  • the structure of the 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide (DOGS) obtained is:
  • DOGS is commercially available as Transfectam TM (Promega).
  • DPES dipalmitoylpliosphatidylethanolamine-5-carboxyspermylamide
  • L-Sper min-5-carboxyl-3- DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl- ⁇ -hydroxyethyl-amine
  • L-Sper min-5-carboxyl-3- DL-1,2-dipalmitoyl-dimethylaminopropyl- ⁇ -hydroxyethylamine
  • the metabolizability and toxicity of the lipids and their degradation products are of particular importance. These are the determining factors for the tolerance of the lipids to the cells.
  • the metabolism is mainly determined by the chemical linkages contained in the lipids.
  • R 1 is a radical of the general formula II:
  • R 2 and R 3 independently of one another are hydrogen or a branched or unbranched alkyl or a branched or unbranched alkenyl or are a substituted or unsubstituted aryl or aralkyl radical, R 1 is H or methyl,
  • R 1 is a radical of the general formula III:
  • R 5 and R 6 are independently branched or unbranched alkyl or alkenyl radicals with 5-30 carbon atoms.
  • the lipids according to the invention thus contain polyamines as DNA-affine head groups, which are optionally bound to lipid structures via a spacer.
  • the head group is bound to the rest of the molecule via biodegradable compounds, which in turn is made up of biodegradable compounds.
  • a large number of the lipids according to the invention can be easily made from compounds that are not or only slightly toxic by means of structure via amide and urethane linkages good metabolizability, mediocre or no toxicity and high stability, as well as access to simple synthetic routes.
  • the particular value of the lipids according to the invention lies in their stability in solution with simultaneous metabolizability by the cell, since the lipids are built up to a substantial extent from amide linkages.
  • R 2 hydrogen, methyl, 2-propyl, isopropyl, 1- (1-methyl) piopyl or benzyl and
  • lipid component which has the formula IV, V or VI, consists of naturally occurring amino acids, such as ornithine, glutamic acid or aspartic acid, to which two naturally occurring fatty acids Example oleic acid, palmitic acid, stearic acid, myristoyl acid etc., derived alkyl chains are linked via peptide bonds.
  • a diamino component such as ethylenediamine, propylenediamine, butylenediamine, diaminopentane, diaminohexane
  • 5-cholesten-3-a min serves as the starting compound, with generally known peptide linking methods, on the one hand, being bound via the spacer group glycine and, on the other hand, the spermine residue being bound directly to the amino function of the starting compound.
  • the end products are N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amiuo-1-oxopeutyl] cholesteryl-3-amide and N- (2,5-bis (3-aminopropyl) amino] - 1-oxopentylglycylcholesteryl -3-amide.
  • Steroid backbones cholesterol-3-amine, lanosterol-3-amine, campesterin-3-amine, stigmast-5-ene 3-amine, Stigmasta-5,22-diene-3-amine.
  • spacer glycine, alanine, ⁇ -alanine, 4-aminobutyric acid, 5-aminopentanoic acid,
  • Wild aspartic acid is used as starting material, which is bonded to the carboxy functions via generally known paptid linkage methods, in this case in each case with stearylamine and, after deprotection of the amino function, directly to 2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl radical.
  • the end product is N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentylasparagyldistearylamide
  • amino acid backbones aspartic acid, glutamic acid, ⁇ -aminomalonic acid
  • spacers Glycine, alanine, ⁇ -alanine, 4-aminobutyric acid, 5-aminopeutanoic acid
  • fatty acids oleic acid, palmitic acid, myristic acid, stearic acid, lauric acid,
  • Palmitoleic acid linolenic acid, linoleic acid, arachidonic acid, arachic acid, lignoceric acid.
  • the end product obtained is N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] -N'- [(N- ⁇ -, N- ⁇ -dioleoyl) ornithyl] ethylene diamine.
  • a basic amino acid frameworks lysine, ornithine.
  • spacer ethylenediamine, propylenediamine, butylenediamine, pentamethylenediamine,
  • fatty acids oleic acid, palmitic acid, myristic acid, stearic acid, lauric acid,
  • Palmitoleic acid linolenic acid, linoleic acid, arachidonic acid, arachic acid, lignoceric acid.
  • the ⁇ -A amino acid ornithine is again used as the base, the ⁇ -amino function being the base-labile fluorenylmethoxycarbonyl group and the ⁇ - Amino function are protected by the known acid-labile tert-butoxycarbonyl group.
  • peptide linking methods first characterize the ⁇ -carboxy function with stearylamine, then after deprotection of the ⁇ -A amino function that with oleic acid and in the subsequent step the ⁇ -amino group after its deprotection directly with the polyamine component by the 2,5-bis (3- aminopropyl) amino-1-carboxypentyl radical coupled.
  • the end product obtained is N- ⁇ - [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] -N- ⁇ -oleoyl-ornithylstearylamide
  • spacer glycine, alanine, ⁇ -alanine, 4-aminobutyric acid, 5-aminopentanoic acid,
  • Fatty acids oleic acid, palmitic acid, myristic acid, stearic acid, lauric acid.
  • Palmitoleic acid linolenic acid, linoleic acid, arachidonic acid, arachic acid, lignoceric acid.
  • the synthesis of a lipopolyamine compound is carried out, which is contained in the formula I and III.
  • the basic structure here is the ⁇ -amino acid ornithine, which is protected on both amino functions by the generally used beuzyloxycarbonyl group.
  • the carboxy function is converted into the primary amine function via Curtius degradation, which is coupled to the amino functions of the perprotected-2,5-bis (3-aminopropyl) a mino-1-carboxypentyl residue via generally known peptide linkage methods. After deprotection of the amino functions, those are linked to oleic acid using the same method.
  • the end product is 1,4-dioleoylamido-1- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] amidobutane
  • Amino acid frameworks lysine, oniithine.
  • spacer ethylenediamine, propylenediamine, butylenediamine, pentamethylenediamine,
  • Fatty acids oleic acid, palmitic acid, myristic acid, stearic acid, lauric acid
  • Palmitoleic acid linolenic acid, linoleic acid, arachidonic acid, arachic acid, lignoceric acid.
  • liposomes can also be formulated with the above-mentioned lipids alone or in combination with other lipids such as cholesterol, cholesterylamine, dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC).
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DOPC dioleoylphosphatidylcholine
  • lysosomatotropic substances such as chloroquine or virus-derived lysosornatropically acting proteins.
  • the lipopolyamines according to the invention are positively charged at physiological pH and can therefore form stable aggregates with negatively charged macromolecules, in particular with DNA and related classes of substances.
  • the lipids according to the invention or their liposome formulations have no cell specificity.
  • a targeted delivery by the lipids according to the invention or their liposome formulations can be achieved by balancing out the charges of lipids and the biomolecules to be transported and additionally applying internalization factors to the aggregate between the biomolecule and lipids.
  • liposoin formulation with colipids if the colipids carry such luternalization factors as the head group.
  • Another possibility is an aggregate of biomolecule, lipids, and luternation factors, which is tailored to neutrality.
  • So-called internalization factors are transferrin, galactose, maimose, mannose-6-phosphate, asialglycoprotein, conalbumin, lectins, trauscobalamin, ⁇ -2-macroglobulin, biotin, folate, mannosylated glycoproteins. More can be found in EP 0535576, EP 0544292, WO 9421808, which are incorporated herein by reference.
  • cell-specific antibodies can also be used.
  • the compounds according to the invention can be used for therapeutic purposes.
  • such compounds can be used for gene therapy of, for example, cystic fibrosis, muscular dystrophy, phenylketonuria, maple syrup disease, propiouacidemia, methylmalonic acidemia, adenosine deaminase deficiency and hypercholesterolemia, hemophilia, ⁇ -thalassemia.
  • Therapeutic treatment methods are also of interest if hormones, growth factors, cytotoxicity or immunomodulatory proteins are to be synthesized in the organism.
  • DNA fragments can be brought into cells by means of these lipids, in which this DNA is to have the desired effect.
  • the desired effect can be the replacement of missing or defective DNA regions or the inhibition of DNA regions (for example antisense DNA / RNA) which trigger the disease in the diseased cell type.
  • DNA regions for example antisense DNA / RNA
  • tumor-suppressing genes can be used in cancer therapy or, by introducing cholesterol-regulating genes, a contribution can be made to prevent cardiovascular diseases.
  • DNA encoding Ribozyrae or ribozymes themselves can be introduced into diseased cells. The translation of that DNA produces active ribozymes that cleave catalytically at specific positions and thus prevent transcription. In this way, for example, viral m RNA can be cleaved without affecting another cellular m-RNA.
  • the multiplication cycle of viruses HTV, herpes, hepatitis
  • HTV herpes, hepatitis
  • Transfection for the production of cancer vaccines also plays an increasingly important role in cancer therapy. This is also a possible area of application for the compounds according to the invention.
  • lipids can be found, for example, in vaccination methods which function in the body of humans and animals on the basis of the expression of DNA which encodes immuno-new peptides.
  • lipid / DNA complexes are used as vaccines.
  • the introduction of the DNA into the body cells leads to the expression of the immunogenic peptide and thus triggers the immune response.
  • peptides or proteins can also be introduced into cells.
  • they can be coated as such with the lipopolyamines according to the invention or enclosed in liposomes which contain the lipopolyamines according to the invention as a component or adsorbed on their surface. If such aggregates are brought into contact with cells, these molecules are transported through the cell wall.
  • Therapeutic peptides have a beneficial effect on numerous diseases.
  • Such peptides or proteins are, for example, lymphokines, interleukins, tumor necrosis factors or interferons, further growth factors, tissue plasminogen activator, factor VIII: c, granulocyte macrophage colony stimulating factor, erythropoietin, insulin, calcitonin, thymidine kinase and others.
  • Toxic peptides such as ricin, diphtheria toxin and others can also be used therapeutically for profit.
  • the lipids Due to their positive charge, the lipids are mainly used to complex negatively charged molecules because of their negative charge and to introduce them into cells. However, so-called “self assembling systems” can also be used to transport positively charged molecules by first complexing negatively charged liposomes with these positively charged molecules. If the ratios are chosen so that a negative net charge remains, these complexes with these inventive lipopolyamines can be used as such or in the form of liposomes, by bringing the oppositely charged components into contact Resulting positively charged overall complexes are taken up by the cells.
  • cationic lipids can be found in the publications WO 9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746 (1992), which are incorporated herein by reference.
  • Plasmids pCH 110 (contains ⁇ -Gal as repoiter gene) and pMSGCAT: Pharmacia Fine
  • 5-cholesten-3-amine was obtained according to H. Brunner, G. Sperl; Bull. Soc. Chim. Belg. 101, 935 (1992).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TFA / CH 2 CH 2 mixture 10 ml of a TFA / CH 2 CH 2 mixture are added to the purified compound obtained at RT. After stirring for 2 h, excess TFA / CH 2 CH 2 is removed. The TFA salt of the end product can be converted into the free amine by saturated aqueous sodium bicarbonate solution.
  • TFA / CH 2 CH 2 mixture 10 ml of a TFA / CH 2 CH 2 mixture are added to the purified compound obtained at RT. After stirring for 2 h, excess TFA / CH 2 CH 2 is removed. The TFA salt of the end product can be converted into the free amine by saturated, aqueous sodium hydrogen carbouate solution.
  • a 95% aqueous solution of TFA is added to the purified compound obtained at RT. After stirring for 2 h, excess TFA / H 2 O is removed. Then it is taken up in 160 ml (1 mmol) of N-Boc-ethylenediamine in 10 ml of THF or DMF and the solution is mixed with 206 mg (1 mmol) of DCCI. The reaction mixture is stirred at RT and, after a reaction time of 12 h, is filtered off from precipitated DCH and the solvent is stripped off. The product obtained is purified by flash chromatography.
  • TFA / CH 2 CH 2 mixture 10 ml of a TFA / CH 2 CH 2 mixture are added to the purified compound obtained at RT. After stirring for 2 h, excess TFA / CH 2 CH 2 was stripped off. The TFA salt of the end product can be converted into the free amine by saturated, aqueous sodium hydrogen carbouate solution.
  • a solution of 10% diethylamine in DMF is added to the purified compound obtained at RT. After concentration in vacuo and purification by flash chromatography, the product obtained is mixed with 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino] -tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentane in 10 ml of THF or DMF were added and the solution was mixed with 206 mg (1 mmol) of DCCI. After stirring at RT for 12 h, the precipitated DCH is filtered off and the solvent is stripped off. The product obtained was purified by means of flash chromatography.
  • the product obtained is taken up together with 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3-a-minopropyl) amino] tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentane in 10 ml of THF or DMF and the solution 206 mg (X mmol) of DCCI are added. After 12 hours of ruining at RT, precipitated DCH is filtered off and the solvent is stripped off. The product obtained is purified by flash chromatography
  • TFA / CH 2 CH 2 mixture 10 ml of a TFA / CH 2 CH 2 mixture are added to the purified compound obtained at RT. After stirring for 2 hours, excess TFA / CH 2 CH 2 is stripped off. The TFA salt of the end product can be converted into the free amine by saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution become.
  • Dioleoylphosphatidylethanolamine, dioleoylphosphatidylcholine, cholesterol and cholesterylamine are dissolved in an organic solvent.
  • the lipids from Examples 1-6 are dissolved as such or in the form of their salts, for example trifluoroacetate salts, in an organic solvent.
  • a thin lipid film was created in a glass flask using a rotary evaporator. This is freed of solvent residues in a high vacuum. The film is hydrated with so much water or aqueous buffer solution that the concentration is 1 mg lipid per ml solution. Then treated with ultrasound with cooling.
  • the liposome formation was sterile filtered through a filter (pore size 0.2 ⁇ m).
  • the lipids from Example 1-6 are dissolved as such and in the form of their TFA salts to a concentration of 1-2.5 mg / ml in water, ethanol and a mixture of water and ethanol of various compositions.
  • the cell lines COS-7, Hela and BHK-21 are in "Dulbecco's-modified Eagle's medium” (DMEM), the 10% fetal calf serum (FBS), 2mM L-glutamine (Gln), 0.1 mM non-essential amino acids (NEAA ) Containing 100U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin, in an incubator (5% CO 2 atmosphere).
  • DMEM Dulbecco's-modified Eagle's medium
  • FBS fetal calf serum
  • Gln 2mM L-glutamine
  • NEAA non-essential amino acids
  • the cells are plated on a 96-well microtiter plate and incubated overnight at approximately 60% confluence.
  • 1-2 ⁇ g of pCH 110 or pMSGCAT are dissolved in 100 ⁇ l Opti-MEM I.
  • the cationic lipid as an ethanoic solution or liposome formulation is also dissolved in 100 ⁇ l Opti-MEM I.
  • Both solutions are mixed in a polystyrene container, left to stand for 10-15 minutes to allow the formation of the lipid / DNA complex, then made up to 1 ml by 0.8 ml of Opti-MEM 1 or DMEM with 5% FBS, 2 mM gin , 0.5 mM NEAA can be added without antibiotics.
  • the cells are washed once with Opti-MEM I or serum-free DMEM and the DNA / lipid complex is added directly to the cells.
  • the transfection complex is removed and 2 ml of DMEM with 10% FBS, 2 mM Gln, 0.2 mM NEAA, 100 U / ml penicil lin and 100 ⁇ g / ml streptomycin are added to each “well”.
  • the cells are cultivated for a further 48 h and lysed by freezing and thawing in 300 ⁇ l of 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8-8.0), which contains 0.1% Triton X-100, for one to two days mphenicolacetyl transferase, which are performed using commercially available ELISA test kits following the manufacturers instructions.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue metabolisierbare Lipopolyamine (einschließlich deren Salze), sowie deren Herstellung und Anwendung. Diese neuen Verbindungen ermöglichen zum Beispiel die Einschleusung von biologisch aktiven Materialien, wie zum Beispiel von DNA, Antisense-DNA/RNA, Ribozymen, antiviralen Wirkstoffen, Proteinen und Peptiden in eukaryotische Zellen.

Description

Neue metabolisierbare Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung Positiv geladene Lipide (J.P.Behr, Biocoujugate Chem. 5, 382-389 (1994)) weiden in Form von Liposomen oder als solche zur Einschleusung von biologisch aktiven Substanzen wie Peptiden, Proteinen, antiviralen Wirkstoffen insbesondere aber DNA, RNA, Antisense-DNA/RNA oder Ribozymen in eukariotische Zellen (zum Beispiel Säuger-, Pflanzen-, Insekten-Zellen) eingesetzt. Lipopolyamine sind eine spezielle Klasse von kationischen Lipiden, die vergleichsweise hervorragende Transfektionseigeuscliaften zeigen. Unter Transfektion versteht man die Einschleusung von Erbmaterial in eukariotische Zellen.
Die Notwendigkeit DNA (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, einzelsträngig oder doppelsträngig), RNA oder verwandte Stoflklassen, wie Antisense-DNA/RNA oder Ribozyme in eukariotische Zellen einzufuhren, um beispielsweise erfolgreich Gentherapie betreiben zu können, führte zur Entwicklung einer Vielzahl von Trausfektionsmethodeu. Zur Einführung von Nukleinsäuren in eukariotische und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, wie zum Beispiel die CaPO4-Präzipitationsmethode, die DEAEDextran-Methode, Methoden, welche die rezeptorvermittelte Endocytose nutzen, Elektroporation, Mikroinjektion und Verfahren, die virale Capside als DNA-Carrier benutzen, bekannt. Eine weitere Methode wird Lipofektion (P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 7413 (1987)) genannt. Diese nützt die Tatsache, daß synthetische kationische Lipide in Form von Liposomen oder als solche mit der negativ geladenen DNA Komplexe bilden. Stellt man die Mengenverhältnisse von DNA und kationischem Lipid so ein, daß die resultierenden Komplexe eine positive Nettoladung tragen, so besitzen sie eine hohe Affinität zu der negativ geladenen Membranoberfläche eukariotischer Zellen. Treffen solche DNA/Lipid-Komplexe auf Zellen, so kommt es zu einer Einschleusung des genetischen Materials in die Zelle. Der genaue Mechanismus, wie die DNA in die Zellen gelangt, ist noch weitgehend unbekannt, man vermutet jedoch, daß es entweder zu einer Fusionierung der kationischen Lipide mit der anionischen Zellmembran bei gleichzeitiger Ausschüttung der DNA in das Zellinn ere kommt, oder daß die DNA/Lipid-Komplexe als ganzes über einen natürlichen Trausportmecha nismus der Zellen, die sogenannte Endozytose, in die Zelle gelangen und danach die DNA freigesetzt wird.
Liposomen sind kugelartige Anordnungen von Lipiden in wäßrigen Lösungen mit „Bilayer- Struktur" und werden typischerweise in drei Klassifikationen eingeteilt (siehe N.Y. Academy Sciences Meeting:„Liposomes and their use in Biology and Medicine" von Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu 10000 um), kleine unilamellare Vesikel (SUN, 20-50 nm) und große unilamellare Vesikel (LUV, 600-30000 um) Eine Reihe von Herstellungsmethoden für Liposomen ist bekannt und in ,,Liposome Technology" (Gregoriadis, CFC Press, Ν.Y. 1984) , in ,, Liposomes" (Ostro, Marcel Dekker, Ν.Y. 1987) oder in Übersichtsartikeln von Lichtenberg et al. (Metbods Bio- chem. Anal. 33, 337-462, 1988), Pagano und Weinstein (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng 7, 435-68, 1978), oder Szoka und Papahadjopoulos (Ami. Rev. Biophysic. Bioeng. 9, 467-508, 1980) beschrieben. Bekannte Methoden sind beispielsweise die„reverse-phase evaporation"-Methode und die Extrusiousmethode, bei der eine Lipidlösung durch eine mikroporöse Membran gepresst wird.
Liposomen werden typischerweise auch auf folgendem Weg hergestellt: Die Lipide werden in einem organischen Lösungsmittel aufgenommen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels unter einem Strom von Stickstoff wird an der Glasgefäßwand ein dünnei Lipidfilm erzeugt. Zugabe von Wasser oder wässriger Pufferlösung hydratisiert diesen Film. Die erhaltene Lösung wird zuletzt mit Ultraschall behandelt.
Kationische Lipide gewinnen zunehmende Bedeutung in der Gentherapie. Dabei werden in vivo mit verschiedenen Verfahren Körperzellen transfektiert, indem Komplexe aus Carrier und DNA intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, intranasal, in Liquorräume oder direkt in Tumore verabreicht werden oder Körperzellen entnommen, transfektiert und wieder reimplantiert werden. Eine in diesem Zusammenhang favorisierte Methode war bis vor einiger Zeit die Einbringung des genetischen Materials durch virale Carrier. Diese Methode besitzt jedoch die Gefahr der Rückmutation zu einem pathogenen Virus. Desweiteren wird die eingeschleuste DNA stabil in das Erbgut eingebaut, so daß eine Steuerung der Therapie oder eine Rückführung der Zellen in ihren ursprüngüchen Zustand nicht mehr möglich ist. Zudem besitzen virale Carriei Restriktionen bezüglich der Größe der einzuschleusenden DNA. Modifizierte DNA oder RNA wird durch Viren nicht übertragen. Außerdem können nur sich teüeude Zellen auf diesem Wege transfektiert werden. Die Transfektion mit kationischen Lipiden ist diesen Restriktionen hingegen nicht unterworfen. Die Transfektion verläuft in der Regel transient, das heißt die transferierte DNA oder RNA wird nur für eine bestimmte Zeit exprimieit, da sie nicht in das Erbgut eingebaut wird, sondern nur ins Cytoplasma transportiert und dort durch Nukleasen mit der Zeit abgebaut wird. Auf diese Weise kann Gentherapie dosiert und reversibel gemacht werden. Restriktionen bezüglich der Größe der DNA bestehen nicht und modifizierte DNA oder RNA kann mittels kationischer Lipide in Zellen eingeschleust werden Auch sich nicht teüende Zellen, wie zum Beispiel Nervenzellen, können durch kationische Lipide transfektiert werden.
Während die in vivo- Anwendung von Mikroinjektion und Elektroporation aus Verfahrensgründen nicht möglich erscheinen, besitzen die CaPO4- und DEAE-Dextran-Methoden vergüchen mit der Lipofektion eine schlechtere Transfektionseffizienz.
Unter den kationischen Lipiden gibt es eine Klasse, die die bekannt hohe Affinität zwischen Spermin und DNA zur Transfektion ausnützt, in dem das bei einem physiologisehen pH- Wert positiv geladene Spermin mit einem hydrophilen Rest, in manchen Fällen über einen Spacer, verknüpft wird. Spermiu bildet besonders stabile Komplexe mit DNA und ähnlichen Verbindungen, indem es über Wasserstoffbrückenbindung in dei Furche der DNA gebunden wird.
Die ersten solchen Liposperminderivate wurden von Behr, J. P.et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6982-6986; EP 03941 11 synthetisiert. Dabei verknüpften sie Carboxyspermiu über einen Spacer mit zwei unterschiedlichen hydrophilen Resten Die Struktur des dabei erhaltenen 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) ist:
Figure imgf000005_0001
DOGS ist als Transfectam™ (Promega) kommerziell erhältlich.
Die zweite von Behr et al. entwickelte Verbindung ist Dipalmitoylpliosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES):
Figure imgf000006_0001
wobei R = CH3(CH2)15 ist.
Ein weiteres Liposperminderivat wird von P.L.Felguer et al. in WO 91 16024 unter der Bezeichnung L-Sper min-5-carboxyl-3-(DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl-β- hydroxyethyl-amin) beansprucht. In der Patentschrift beschrieben ist jedoch L-Sper min- 5-carboxyl-3-(DL- 1,2-dipalmitoyl-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylamin):
Figure imgf000006_0002
Gebeyehu, G. et al. beschreiben in WO 9405624 die Verbindung N-[N-(5-Carboxysper- myl)amiuoethyl] N, N-dimethyl-2,3-bis (9-octadecenyloxy) 1-propanammonium tetra(trifluoracetat), welches kommerziell als Lipofectamin™ (Gibco-BRL:Life Technologies Inc.) erhältlich ist.
Figure imgf000006_0003
Trotz großer Fortschritte auf diesem Gebiet, verbleibt ein Bedarf an einer größeren Auswahl an kationischen Lipiden. Bis heute wurde kein kationisches Lipid gefunden, daß mit allen Zelltypen befriedigende Ergebnisse liefert. Da verschiedene Zelltypen sich in ihrer Membranzusammensetzung unterscheiden, ist es nicht verwunderlich, daß verschiedene Kompositionen von Lipiden und verschiedenartige Lipidtypen für eine effektive Transfektion unterschiedlicher Zellen benötigt werden.
Von besonderer Bedeutung ist die Metabolisierbarkeit und Toxizität der Lipide und ihrer Abbauprodukte. Diese sind die bestimmenden Faktoren für die Verträglichkeit der Lipide für die Zellen. Die Metabolisierbarkeit wird hauptsächlich durch die in den Lipiden enthaltenen chemischen Verknüpfungen bestimmt.
Da über den eigentlichen Transfektionsschritt bis heute noch wenig bekannt ist, ist die Entwicklung von neuen kationischen Lipiden weitgehend empirisch. Wichtige zu beachtende Punkte für das Design solcher Lipide sollte ihre Toxizität gegenüber den zu transferierenden Zielzellen, desweitereu ihre Stabilität, Metabolisierbarkeit, die Möglichkeit einer in vivo- Anwendung und einfache Synthesewege sein. Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel 1:
Figure imgf000007_0001
die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-,L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei a, b, c, d, e und f unabhängig voneinander 0, 1,2,3,4,5 oder 6 sind und wobei a nur dann 0 ist, wenn b 0 ist und e nur dann 0 ist, wenn f 0 ist, R1 ein Rest der allgemeinen Formel II ist:
Figure imgf000007_0002
in welcher g 0,1,2,3,4,5 oder 6 ist, h 0,1,2 oder 3 ist, wobei g 0 ist, wenn h 0 ist und h 1 ist, wenn g 0 ist, X -O- oder -NH-, alle Positionen der Steroid-Substitueuten α- oder β- konfiguriert sein können, die C-Atome 4 und 5 und/oder 5 und 6 und/oder 7 und 8 und/oder 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, mit der Maßgabe, daß die C- Atome 5 und 8 neben Einfachbindungen jeweils über höchstens eine Doppelbindung mit benachbarten Atomen verknüpft sind, R2 und R3 unabhängig voneinauder Wasserstoff oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkyl- oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkenyl- oder ein substituierter oder unsubstituierter Aryl- oder Aralkylrest sind, R 1 H oder Methyl ist,
oder R1 ein Rest der allgemeinen Formel III ist:
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wobei alle chirale Zentren in D-, L- oder als Racemat vorliegen, m 0, 1,2 oder 3 ist, k 0,1,2,3,4,5 oder 6 ist, wobei k 0 ist, wenn m 0 ist und m 1 ist, wenn k 0 ist, u, p und q unabhängig voneinander 0,1,2,3,4,5 oder 6 sind, R2 wie vorstehend definiert ist, X1, X2, und X3 unabhängig voneinander
Figure imgf000008_0002
sind,
R5 und R6 unabhängig voneinander verzweigte oder unverzweigte Alkyl- oder Alkenyl- reste mit 5-30 Kohleustoffatomen sind. Die erfindungsgemäßen Lipide enthalten also Polyamine als DNA-affine Kopfgruppen, die gegebenenfalls über einen Spacer an Lipidstrukturen gebunden sind. Die Kopfgruppe wird dabei über biologisch abbaubare Verbindungen an das Restmolekül gebunden, welches wiederum aus biologisch abbaubaren Verbindungen aufgebaut ist Eine Vielzahl der erfindungsgemaßen Lipide läßt sich aus nicht oder nur wenig toxischen Verbindung einfach duich Aufbau über Amid- und Urethanverknüpfungen beistellen Damit erreicht man eine Kombination von guter Metabolisierbarkeit, medriger beziehungsweise gar keiner Toxizität und hoher Stabilität, sowie einen Zugang zu einfach durchführbaren Synthesewegen.
Der besondeie Wert der erfindungsgemäßen Lipide liegt in ihrer Stabilität in Lösung, bei gleichzeitiger Metabolisierbarkeit durch die Zelle, da die Lipide zu einem wesentlichen Auteil aus Amidverknüpfungen aufgebaut sind .
Von ganz besondere m Interesse sind Lipopolyamine der Formel I, worin a, d, e = 3 , b, f = 1 und c = 0 sind.
Von ganz besonderem Interesse sind außerdem Verbindungen der Formel I, wobei a, d, e = 3 , b, f = 1 und c = 0 sind, R1 die Formel II aufweist, wobei die Reste und Indizes wie vorstehend definiert sind und direkt oder über einen Spacer, wie zum Beispiel Aminosäuren, verknüpft sem können. Dies entspricht Verbindungen der Formel II, wobei h = 0 oder 1, g (falls h = 1 ist) 1,2,3,4,5 oder 6,
R2 = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-( 1-Methyl-) piopyl oder Benzyl und
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oder
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Weiterhin von besonderem Interesse sind Verbindungen der Formel I, wobei a, d, e = 3 , b, f = 1 und c = 0 ist und die allgemeine Formel IV, V oder VI aufweist:
oder
Figure imgf000010_0001
oder
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Von ganz besonderem Interesse sind dabei solche Verbindungen, in denen das Grundgerüst der Lipidkomponente, welche die Formel IV, V oder VI aufweist, aus natürlich vorkommenden Aminosäuren besteht, wie zum Beispiel Ornithin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, an die zwei von natürlich vorkommenden Fettsäuren, zum Beispiel Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Myristoylsäure etc., abgeleitete Alkylketten über Peptidbindungen verknüpft sind. Die Lipidkomponente kann wiederum direkt oder über einen Spacer an den Polyamin-Rest, welcher der Formel 1 entspricht, wobei a, d, e = 3 , b, f = 1 und c = 0 ist, gebunden sein.
Dies bedeutet in Formel IV, daß n = 0, m = 0 oder 1, für m = 1 und k = 1 der Spacer ebenfalls aus einer natürlich vorkommenden Aminosäure aufgebaut ist, so daß R2 = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-( 1-Methyl-) propyl oder Beuzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5, oder 6 der Spacer die Verbindungen Homoalauin, Amino- capronsäure usw. darstellen kann, q - 3, und p - 0, R5 = -(CH2)17CH3 und R6 = - (CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 sein kann.
Dies bedeutet in Formel V, daß n = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 oder 6, der Spacer somit aus einer Diaminokomponente, wie Ethylendiamin, Propylendia min, Butylendiamin, Diaminopentan, Diaminohexan, besteht, R5 und R6 = (CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 sein kann.
Dies bedeutet für Formel VI, daß n =0, m = 0 oder 1, q = 0, p = 0, 1 oder 2, k = 1 (falls m =1) R2 = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-( 1-Methyl-) propyl oder Benzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5 oder 6 der Spacer die Verbindungen Homoalanin, Aminocapronsäure usw. darstellen kann, R5 und R6 = -(CH2)17CH3 ist.
Nachstehend werden allgemeine Synthesewege der folgenden ganz besonders interessanten Verbindungen erläutert. Zunächst zwei Verbindungen, die durch die Formeln I und II gekennzeichnet sind.
Als Ausgangsverbindung dient in beiden Fällen 5-Cholesten-3-a min, wobei durch allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden einerseits über die Spacer-Gruppe Glycin, andererseits direkt der Sperminrest an die Aminofunktion der Ausgangsverbindung gebunden wird. Als Endprodukte erhält man N-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amiuo- 1- oxopeutyl] cholesteryl-3-amid und N-(2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]- 1-oxopentylgly- cylcholesteryl-3-amid.
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Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Steroid-Grundgerüste und Spacer bestehen: a) Steroidgrundgerüste: Cholesterin-3-amin, Lanosterin-3-amin, Campesterin-3- amin, Stigmast-5-en-3-amin, Stigmasta-5,22-dien-3-amin.
b) Spacer: Glycin, Alanin, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminopentansäure,
6-Aminocaprousäure, 7-Aminoheptansäure.
Das nächste Beispiel beschreibt die Synthese eines Lipopolyamins, welche durch die Formeln 1 und VI gekennzeichnet ist:
Als Edukt wild Asparaginsäure eingesetzt, welche über allgemein bekannte Paptidverknüpfüngsmethoden an den Carboxyfünktionen, in diesem Falle jeweils mit Stearylamin und nach der Entschützung der Aminofünktion direkt an 2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl-Rest gebunden wird. Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis (3- aminopropyl) amino-1-oxopentylasparagyldistearylamid
Figure imgf000015_0001
Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und Aminen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgelisteten Fettsäuren ableitet, bestehen: a) Aminosäuregrundgerüste: Asparaginsäure, Glutaminsäure, α-Aminomalonsäure b) Spacer: Glycin, Alanin, β- Alanin, 4-A m inobuttersäure, 5-Aminopeutansäure,
6-Aminocapronsäure, 7-Aminoheptansäure
c) Fettsäuren: Ölsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure,
Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsaure, Arachidonsäure, Arachinsäure, Lignocerinsäure.
Im nächsten Beispiel wird die Synthese einer weiteren Verbindung vorgestellt, welche durch die Formel I und V gekennzeichnet ist. Hierbei wird als Grundgerüst die an der Carboxyfunktion als tert-Butylester geschützte α- Aminosäure Ornithin eingeserzt. Ebenfalls durch allgemem bekannte Peptidverknüpfungsmethoden wird jene Verbindung in diesem Falle mit Ölsäure und nach der Entschützung der Carboxyfunktion über den Spacer Ethyleudiamin an 2,5-Bis (3-aminopropyl) amino- 1-carboxypentyl-Rest gebunden. Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino- 1-oxopentyl]-N'- [(N-α-,N-δ-dioleoyl)ornithyl]ethylen-diamin.
Figure imgf000017_0001
Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und den aufgelisteten Fettsäuren bestehen:
a) A minosäuregrundgerüste: Lysin, Ornithin.
b) Spacer: Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendia min, Pentamethylendiamin,
Hexamethylendiamin.
c) Fettsäuren: Olsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure,
Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Arachinsäure, Lignocerinsäure.
Im nächsten Beispiel, welches die Synthese einer Verbindung, charakterisiert durch die Formel I und IV, beschreibt, wird als Grundkörper wiederum die α-A minosäur e Ornithin verwendet, wobei die α-Aminofünktion durch die basenlabile Fluorenylmethoxy- carbonyl-Gruppe und die δ-Aminofünktion durch die bekannt erweise säurelabile tert- Butoxycarbonyl-Gruppe geschützt sind . Durch allgemein bekannte Peptidveiknüpfüngsmethoden wird zunächst die α-Carboxyfunktion mit Stearylamin, dann nach Entschützung der δ-A minofünktion jene mit Ölsäure und im darauffolgenden Schritt die α- Aminogruppe nach deren Entschützung direkt mit der Polyaminkomponente gekennzeichnet durch den 2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl-Rest gekuppelt. Als Endprodukt erhält man N-α-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino- 1-oxopentyl]-N-δ-oleoyl- ornithylstearylamid
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Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Am inosäure-Grundgerüste, Spacer, Aminen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgelisteten Fettsäuren ableitet, und den Fettsäuren als solche bestehen:
a) Aminosäuregrundgerüste: Ornithin, Lysin
b) Spacer: Glycin, Alanin, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminopentansäure,
6-Aminocaprousäure, 7-Aminoheptansäure.
c) Fettsäuren: Ölsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure.
Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Arachinsäure, Lignocerinsäure.
Als letztes Beispiel wird die Synthese einer Lipopolyamin- Verbindung ausgeführt, welehe in der Formel I und III enthalten ist. Als Grundgerüst dient hier die an beiden A minofunktionen durch die allgemein angewendete Beuzyloxycarbonylgruppe geschützte α-Aminosäure Ornithin. Zunächst wird über Curtius-Abbau die Carboxyfunktion in die primäre Aminfunktion übergeführt, welche mit an den Aminofünktionen des pergeschützteu 2,5-Bis (3-aminopropyl) a mino-1-carboxypentyl-Restes über allgemein bekannte Peptid-verknüpfüngsmethoden gekuppelt wird. Nach Entschützung der A minofunktionen werden jene nach gleicher Methodik jeweils mit Ölsäure verknüpft. Als Endprodukt erhält man 1,4-Dioleoylamido-1-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1- oxopentyl] amidobutan
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Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und den aufgelisteten Fettsäuren bestehen:
a) Aminosäuregrundgerüste: Lysin, Oniithin.
b) Spacer: Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiamin, Pentamethylendiamin,
Hexamethylendiamin.
c) Fettsäuren: Olsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Laurinsäure
Palmitoleinsäure, Linolensäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Arachinsäure, Lignocerinsäure.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche in wässriger oder wässriger Puffer- oder ethanolischer Lösung angewendet werden. Es können jedoch auch Liposomen mit oben genannten Lipiden allein, oder in Kombination mit anderen Lipiden wie zum Beispiel Cholesterol, Cholesterylamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder Dioleoylphospatidylcholin (DOPC) formuliert werden.
Um die Transfektionseffizienz der erfindungsgemaßen Lipide zu steigern, beisteht die Möglichkeit, Zellen in Gegenwart von Substanzen zu transfektieren, die die enzymatisehe Aktivität in den Lysosomen inhibieren, sogenannte lysosomatotrope Substanzen, wie zum Beispiel Chloroquin oder von Viren abgeleitete lysosornatropisch wirkende Proteine.
Die erfindungsgemaßen Lipopolyamine sind bei physiologischem pH positiv geladen und können daher mit negativ geladenen Makromolekülen, insbesondere mit DNA und verwandten Stoffklassen stabile Aggregate bilden. Die mit den Lipopolyaminen bemäntelten und positivierten Makromoleküle wechselwirken mit der negativ geladenen Zellmembran auf eine Weise, die zu einer Einschleusung der Makromoleküle in die Zelle fülut. Dabei sind in vitro als auch in vivo Anwendungen möglich. Analoges gilt für Liposomenformulierungen der erfindungsgemäßen Lipide.
Im Vergleich zur zielgerichteten rezeptorvermittelten Endocytose (Wu et al., J. Chem. 262, 4429-4432 (1987)), in denen Polykationeu, welche auch DNA-Binder genannt werden (zum Beispiel Polylysin etc.) au sogenannte Intenialisierungsfaktoreu (zum Beispiel bestimmte Glykoproteine) gebunden sind, die zielgerichtet an Oberflächeurezepto ren bestimmter Zellen binden, besitzen die erfindungsgemäßen Lipide, bzw. deren Liposomenformuüerungen keine Zellspezifität. Eine zielgerichtete Lieferung durch die erfindungsgemäßen Lipide bzw. derer Liposomenformuherungen kann dadurch erreicht werden, daß die Ladungen von Lipiden und den zu transportierenden Biomolekülen ausgegüchen werden und zusätzlich an das Aggregat zwischen Biomolekül und Lipiden lnternalisierungsfaktoreu augebracht werden. Dies kann zum Beispiel durch Liposoinenformulierung mit Colipiden erreicht werden, falls die Colipide als Kopfgruppe solche luternalisierungsfaktoren tragen. Eine andere Möglichkeit ist ein auf Ladiuigsneutralität abgestimmtes Aggregat aus Biomolekül, Lipiden und luternahsierung-faktoren. Sogenannte Internalisierungsfaktoren sind Transferrin, Galactose, Maimose, Mannose-6- phosphat, Asialglycoprotein, Conalbumin, Lectine, Trauscobalamin, α-2-Makroglobulin, Biotin, Folat, mannosylierte Glycoproteine. Weitere sind in EP 0535576, EP 0544292, WO 9421808 zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Analog wie Internalisierungsfaktoren, können auch zellspezifische Antikörper eingesetzt werden.
Die erfindungsgemaßen Verbindungen können zu Therapiezwecken eingesetzt weiden. Insbesondere können solche Verbindungen für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibröse, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propiouazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel und Hypercholesterinämie, Hämophilie, β-Thalassämie genutzt werden. Geutherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wemi Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxiue oder immunomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels dieser Lipide in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfalten soll. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen ( zum Beispiel Antisense-DNA / RNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können tumorunterdrückende Gene in der Krebs- Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene eine Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutgefäßkrankheiteu geleistet werden. Weiters können DNA, welche Ribozyrae kodiert, oder Ribozyme selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation jener DNA erzeugt aktive Ribozyme, die an spezifischen Stelleu m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kami zum Beispiel virale m- RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehruugszyklus von Viren (HTV, Herpes, Hepatitis) kann auf diesem Wege unterbrochen werden.
Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für die erfindimgsgernäßen Verbindungen.
Eine weitere Anwendung können solche Lipide zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogeue Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden Lipid / DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen Peptids und löst somit die Immunantwort aus.
Abgesehen von DNA können auch andere Makromoleküle, wie zum Beispiel Peptide oder Proteine, in Zellen eingeschleust werden. Zu diesem Zweck können sie mit den erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche bemäntelt werden oder in Liposomen, welche als Komponente die erfindungsgemäßen Lipopolyamine enthalten, eingeschlossen oder an deren Oberfläche adsorbiert werden. Bringt man derartige Aggregate mit Zellen in Kontakt, so findet ein Transport dieser Moleküle durch die Zellwand statt. Therapeutische Peptide haben einen günstigen Einfluß auf zahlreiche Erkrankungen. Solche Peptide oder Proteine sind zum Beispiel Lymphokine, Interleukine, Tumore Nekrose Faktoren oder Interferone, weiterhin Wachstumsfaktoren, Gewebeplasminogen- aktivator, Faktor-VIII:c, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendei Faktor, Erythropoietin, Insulin, Calcitonin, Thymidinkinase und andere. Auch toxische Peptide wie Ricin, Diphteriatoxin und andere können therapeutisch gewinnbringend eingesetzt werden.
Die Lipide werden aufgrund ihrer positiven Ladung vorwiegend dazu eingesetzt, negativ geladene Moleküle wegen ihrer negativen Ladung zu komplexieren und in Zellen einzuschleusen. Durch sogenannte„self assembling Systems" können jedoch auch positiv geladene Moleküle transportiert werden, in dem zunächst negativ geladene Liposomen mit diesem positiv geladenen Molekülen komplexiert werden. Wählt man die Verhältnisse so, daß eine negative Nettoladung verbleibt, können diese Komplexe mit diesen erfindungsgemaßen Lipopolyaminen als solche oder in Form von Liposomen positiviert werden, in dem die gegensätzlich geladeneu Komponenten in Kontakt gebracht werden. Die resultierenden positiv geladenen Gesamtkomplexe werden von den Zellen aufgenommen.
Weitere Anwendungsmögüchkeiten für kationische Lipide sind den Veröffentlichungen WO 9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746 (1992) zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Beispiele der für derzeit als für therapeutisch aussichtsreich augesehene Sequenzen für genetisches Material sind in der Übersicht von F.W.Anderson, Science 256, 808 ( 1992) entnehmbar, die ebenfalls hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Beispiele:
Bezugsquellen:
1. Plasmide pCH 110 (enthält β-Gal als Repoitergen) und pMSGCAT: Pharmacia Fine
Chemicals,Uppsala, Schweden
L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- 1-oxopeutan (tetra- BOC-ACP) wurde nach J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 86, PP- 6982- 6986, (1998) synthetisiert.
5-Cholesten-3-amin wurde nach H. Brunner, G. Sperl; Bull. Soc. Chim. Belg. 101, 935 ( 1992) synthetisiert.
Beispiel 1:
Synthese von N-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino- 1-oxopentyl] cholesteryl-3-amid Zu einer Lösung von 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aιninopropyl) amino]-tetra-tert- butyloxy-carboxy-1-oxopentan und 385 mg ( 1 mmol) 5-Cholesten-3-amin in 10 ml THF (Tetrahydrofüran) oder DMF (N,N-Dimethylformamid) werden 206 mg ( 1mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) gegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren des Reaktionsgemisches durchgefühlt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem Dicyclohexylharastoff (DCH) abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines Trifluoressigsäure (TFA)/CH2CH2-Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergefühlt werden.
Beispiel 2:
Synthese von N-(2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]-1-oxopentylglycylcholesteryl-3-amid. Zu einer Lösung von 175 mg ( 1 mmol) N-Boc-Glycin und 385 mg ( 1 mmol) 5-Cholesten-3-amin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg ( 1 mmol) DCCI gegeben und bei RT 12 h gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren des Gemisches wnd überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]- tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt und bei RT für 12 h gerührt. Danach wird das ausgefallene DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriu mhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.
Beispiel 3:
Synthese von N-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino- 1-oxopentylasparagyldistearylamid
Zu einer Lösung von 233 mg (1 mmol) N-Boc-Asparaginsäure und 540 mg ( 2 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT und Rühren des Reaktionsgemisches durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wnd überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wässrige Na triumhydrogeucarbonatlösung in das freie A min übergefülut. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- 1- oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( 1 mmol) DCCI versetzt. Die Reaktion wird wiederum bei RT und unter Rühren ausgeführt und nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml emes TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbouatlösung in das freie Amin übergeführt werden.
Beispiel 4:
Synthese von N-[2,5-Bis O-aminopropyl) amino- 1-oxopentyl]-N'-[(N-α - ,N-δ-dioleoyl)- ornithyl]ethylendiamin
Zu einer Lösung von 455 mg (1 mmol) Ornithin-OtBu und 566 mg (2 mmol) Ölsäure in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT 12 h lang gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchiomatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine 95 %ige wässrige Lösung von TFA gegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/H2O abgezogen. Danach wird zusammen mit 160 mg (1 mmol) N-Boc-Ethylendiamin in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( 1 mmol) DCCI versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerühit und nach emer Reaktionszeit von 12 h von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/CH2CH2 abgezogen. Das erhaltene TFA-Salz wird durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- 1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( 1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wüd überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbouatlösung in das freie Amin übergeführt werden.
Beispiel 5:
Synthese von N-α-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl]-N-δ-oleoylomithylste- arylamid
Zu einer Lösung von 455 mg ( 1 mmol) N-α-Fmoc-N-δ-Boc-Ornithin und 270 mg ( 1 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg ( 1 mmol) DCCI gegeben. Der bei RT und unter Rühren durchgeführte Reaktionsansatz wird nach einer Reaktionszeit von 12 h vom ausgefallenem DCH filtriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2Cl2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH2Cl2 abgezogen. Danach wird zusammen mit 283 mg ( 1 mmol) Olsäure in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine Lösung von 10 % Diethyl- amin in DMF zugegeben. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchro- matographie wird das erhaltene Produkt zusammen mit 647 mg ( 1 mmol) L-[2,5-Bis (3- aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy- 1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg ( 1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wüd mittels Flashchromatographie gereinigt.
Zu der erhalteneu gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt weiden. Beispiel 6
Synthese von 1,4-Dioleoylamido-1-[2,5-Bis (3-aminopropyl) a mino- 1-oxopentyl] amido- butan
Zu einer Losung von 400 mg (1 mmol) N-α-N-δ-di-CBz-Ornithin in 20 ml CH2Cl2 werden 140 μl NEt3 und 119 mg SOCl2 tropfenweise zugegeben, wobei das Reaktionsgemisch 0°C nicht übersteigen sollte. Nach Erwärmen des Gemisches auf RT weiden 0.33-0 65 g NaN3 (5-10 facher Überschuß) zusammen mit Tetra-n-Butylammoniumhy- drogensulfat ( 10 mol% bezüglich Edukt) zugegeben Nach ca 6 h unter Rückfluß wud mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencaibouatlösung und Wasser mehrmals gewasehen Das erhaltene Rohprodukt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.
Das erhaltene Produkt wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis (3-a minopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (X mmol) DCCI versetzt Nach 12 h Ruinen bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt
Nach Abspaltung der Cbz-Gruppen durch Hydrogenolyse bei RT und Rühren mit 5 % Pd auf Aktivkohle in Methanol wird das Lösungsmittel abgezogen, danach wnd der Rückstand zusammen mit 565 mg (2 mmol) Ölsäure in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 412 mg (2 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen Das er haltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt .
Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH2CH2 - Gemisches zugegeben Nach 2 h Rühren wüd überschüssiges TFA/CH2CH2 abgezogen Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.
Beispiel 7:
Liposomenformulierung
Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol und Cholesteryl-amin werden in einem organischen Lösungsmittel gelost Die Lipide aus den Beispielen 1-6 werden als solche oder in Form ihrer Salze, zum Beispiel Trifluoracetat- Salze in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Durch Kombination ver schiedener Mengen der unterschiedlichen Lösungen werden veischiedene Kompositionen aus ein zelnen Lipiden aus den Beispielen 1-6 oder Lipidgemische aus Colipideu und Lipiden aus den Beispielen 1-6 hergestellt. In einem Glaskolben wüd mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein dünner Lipidfilm erzeugt. Dieser wird ün Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit. Der Film wird mit soviel Wasser oder wässriger Pufferlösung hydratisiert, daß die Konzentration 1mg Lipid pro ml Lösung beträgt. Danach wüd unter Kühlung mit Ultraschall behandelt. Die Liposomenformuherung wüd durch einem Filter (Porenweite 0.2 μm) sterilfitriert.
Beispiel 8:
Lipidlösungen
Die Lipide aus den Beispieleil 1-6 werden als solche und in Form ihrer TFA- Salze zu einer Konzentration von 1-2.5 mg/ml in Wasser, Ethanol und einem Gemisch aus Wasser und Ethanol verschiedener Zusammensetzung gelöst.
Beispiel 9:
Zellkulturen
Die Zelllinien COS-7, Hela und BHK-21 werden in„Dulbecco's-modified Eagle's medium" (DMEM), das 10% fötales Kälberserum (FBS), 2mM L-Glutamin (Gln), 0. 1 mM nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), 100U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält, in einem Inkubator (5% CO2- Atmosphäre) kultiviert.
Beispiel 10:
Transfektion
Die Zellen werden auf einer 96-well-Mikrotiterplatte ausplattiert und über Nacht zu annähernd 60 % Konfluenz inkubiert. Um die Zellen in einem„well" zu transfizieren, werden 1-2 μg von pCH 110 oder pMSGCAT in 100 μl Opti-MEM I gelöst. Das kationische Lipid als ethanoüsche Lösung oder Liposomenformuherung wird ebenfalls in 100 μl Opti-MEM I gelöst. Die beiden Lösungen werden in einem Polystyrolbeliälter gemischt, für 10-15 min stehengelassen, um die Bildung des Lipid/DNA-Komplexes zu ermöglichen. Danach wird auf 1 ml aufgefüllt indem 0.8 ml Opti-MEM 1 oder DMEM mit 5% FBS, 2 mM Gin, 0.5 mM NEAA ohne Antibiotika zugegeben werden. Die Zellen werden einmal mit Opti-MEM I oder serumfreien DMEM gewaschen und der DNA/Lipid-Komplex wird direkt zu den Zellen gegeben. Nach 6 h Inkubationszeit bei 37°C wird der Transfektionskomplex entfernt und 2 ml DMEM mit 10% FBS, 2 mM Gln, 0.2 mM NEAA, 100 U/ml Penicil lin und 100 μg/ml Streptomycin zu jedem„well" hinzugegeben. Die Zellen werden weitere 48 h kultiviert und durch ein bis zweimahges Frieren und Tauen in 300 μl 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8-8.0), welches 0. 1 % Triton X-100 enthält, lysiert. Die Zelllysate werden auf β-Galactosidase oder Chlora mphenicolacetyl- transferase getestet. Diese Tests werden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Testkits nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemem en Formel I:
Figure imgf000032_0001
die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-,L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei a, b, c, d, e und f unabhängig voneinander 0, 1 ,2,3,4,5 oder 6 sind und wobei a nur dann 0 ist, wenn b 0 ist, e nur dann 0 ist, wenn f 0 ist, R1 ein Rest der allgemeinen Formel II ist:
Figure imgf000032_0002
in welcher g 0, 1,2,3,4,5 oder 6 ist, h 0, 1,2 oder 3 ist, wobei g 0 ist, wenn h 0 ist und h 1 ist, wenn g 0 ist, X -O- oder -NH- ist, alle Positionen der Steroid-Substituenten α- oder β-konfiguriert sein können, die C-Atome 4 und 5 und/oder 5 und 6 und/oder 7 und 8 und/oder 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, mit der Maßgabe, daß die C- Atome 5 und 8 neben Einfachbindungen jeweils über höchstens eine Doppelbindung mit benachbarten Atomen verknüpft sind, R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkyl- oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkenyl- oder ein substituierter oder unsubstituierter Aryl- oder Aralkylrest sind, R4 H oder Methyl ist
oder R1 ein Rest der allgemeinen Formel III ist:
Figure imgf000033_0001
wobei alle chiralen Zentren unabhängig voneinander in D- oder L- Form vorliegen, m 0,1,2 oder 3 ist, k 0,1,2,3,4,5 oder 6 ist, wobei k 0 ist, wenn m 0 ist und m 1 ist, wenn k 0 ist, n, p und q unabhängig vonemauder 0,1,2,3,4,5 oder 6 sind, R2 wie vorstehend definiert ist, X1, X2, und X3 unabhängig voneinander
Figure imgf000033_0002
sind,
R5 und R6 unabhängig voneinander verzweigte oder unverzweigte Alkyl- oder Alkenyl- reste mit 5-30 Kohlenstoffatomen sind.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei a, d und e 3 sind, b und f 1 sind und c 0 ist.
3. Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei h 0 oder 1 ist und g (falls h 1 ist) 1,2,3,4,5 oder 6 ist,
R2 = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-( 1-Methyl-) propyl oder Beuzyl und
Figure imgf000033_0003
Figure imgf000034_0001
4. Verbindungen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R1 ein Rest der allgemeinen Formel IV ist:
Figure imgf000034_0002
worin k, m, n ,p, q, R2, R5, und R6 wie in Anspruch 1 definiert sind.
5. Verbindungen nach Anspruch 4, wobei n = 0, m = 0 oder 1, q = 3, und p = 0, k (falls m = 1) = 1,2, 3, 4, 5 oder 6, R2 Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-( 1-Methyl-) propyl oder Benzyl, R5 = -(CH2)17CH3 und R6 = -(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 ist.
6. Verbindungen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R1 ein Rest der allgemeinen Formel V ist:
Figure imgf000035_0001
worin k 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist und n ,p, q, R5 und R6 wie in Ansprach 1 definiert sind.
7. Verbindungen nach Ansprach 6, in denen n = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, R5 und R6 = -(CH2)7 CH=CH(CH2)7CH3 sind.
8. Verbindungen nach Anspruch 1 oder Ansprach 2 , worin R1 ein Rest der allgemeinen Formel VI ist:
Figure imgf000035_0002
worin k, m, n ,p, q, R2, R5, und R6 wie in Anspruch 1 definiert sind.
9. Verbindungen nach Anspruch 8, in denen n 0 ist, m 0 oder 1 ist, q 0 ist, p 0, 1 oder 2 ist, k 0 ist, wenn m 0 ist, k, falls m 1 ist, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, R2 = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-) propyl oder Benzyl, R5 und R6 = -(CH2)17CH. ist.
10. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach einem der Anspräche 1 bis 9, wobei ein Polyaminderivat der Formel VII:
Figure imgf000036_0001
wobei a, b, c, d, e und f wie in Anspruch 1 definiert sind, gegebenenfalls mit einem Spacer, der aus Aminoalkylensäurederivaten oder Dia minoal- kylenderivaten der Formel VIII besteheu kann:
Figure imgf000036_0002
wobei k, m und R2 wie in Anspruch 1 definiert smd und X4 -COOH oder -NH2 sein kann, und mit einem Steroidgerüst der Formel IX:
Figure imgf000036_0003
4
wobei R3 und R4 wie in Anspruch 1 definiert sind, alle Positionen am Steroid-Grundge- rüst α- oder β-konfiguriert sem können, die C-Atome 4 und 5 und/oder 5 und 6 und/oder 7 und 8 und/oder 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, mit der Maßgabe, daß die C-Atome 5 und 8 neben Einfachbindungen jeweils über höchstens eine Doppelbindung mit benachbarten Atomen verknüpft sind, X5 -NH2 oder -OH sein kann, oder einem trifunktionellen Grundgerüst der Formel X:
Figure imgf000037_0001
wobei u, p, q, X2, X3, R5 und R6 wie in Ansprach 1 definiert sind und X6 -NH2 oder - COOH entspricht, umgesetzt wird.
1 1. Liposomenformulierungen mit Verbindungen nach einem der Anspräche 1-9 mit oder ohne Colipide.
12. Verfahren zum Einbringen von biologisch wüksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, Antisense-RNA, Peptiden und Proteinen in eukariotische Zellen, wobei Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-9 oder 11 mit den einzubringenden Verbindungen und die entstandenen Komplexe mit eukariotischen Zellen in vivo oder in vitro in Kontakt gebracht werden.
13. Verwendung der Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-9 oder 1 1 als Reagenz zur Einbringung von biologisch wüksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, Antisense-RNA, Peptiden und Proteinen in vivo oder in vitro in eukariotische Zellen.
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