JPH09512270A - 細胞形質転換のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞の形質転換のための方法および組成物に関する。特に、目的の核酸とポリヒドロキシル化またはポリグリコシル化ステロイド分子の組合せを含有する、組成物と方法が開示される。最も好適には、アミン含有性側鎖で誘導体化された胆汁酸（例えば、コール酸）の存在下で、外因性または内因性核酸を細胞と接触させる。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞形質転換のための組成物および方法 関連出願の参照 本出願は、1994年11月7日出願の同時係属米国特許出願第08/336,675号の一部 継続出願（CIP）であり、一方この出願は、1994年6月23日出願の同時係属米国特 許出願第08/264,488号のCIPであり、一方この出願は、1994年4月20日出願の同時 係属米国特許出願第08/230,685号のCIPであり、一方この出願は、1992年12月14 日出願の同時係属米国特許出願第07/989,667号のCIPであり、一方この出願は、1 991年12月13日出願の米国特許出願第07/806,985号（現在、米国特許第5,338,837 号）のCIPであり、これらの開示内容は参考のため本明細書に内含される。 1．発明の領域 本発明は、細胞の形質転換のための方法と組成物に関し、該形質転換は真核細 胞および原核細胞への核酸の導入が関与する。特に、目的の内因性または外因性 核酸とポリヒドロキシ化またはポリグリコシル化ステロイド分子の組合せを含む 組成物と方法が開示され、該分子はこれらの分子を陽性に荷電させるアミン含有 基を含有する。開示された組合せは、好適には少なくとも1つの中性脂質成分（ 脂肪酸エステル、トリグリセリド、リン脂質、糖脂質、他のステロイド誘導体（ 例えば、コレステロールエステルおよびコレステリルエステル）、およびリポ蛋 白複合体を含むが、これらに限定されない）を含む。中性脂肪成分は、好適には 融合原性（fusogenic）脂質である。例として、核酸（例えば、外因性核酸）を 、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンと、生物起源のポリアミン側鎖 で誘導体化されたポリグリコシル化コール酸の1：1混合物の存在下で、細胞と接 触させる。 2．発明の背景 DNA組換え法の進展とバイオテクノロジー産業の出現に伴い、細胞に核酸を導 入する方法は、一部にはこの方法の効率がいつまでも低いため、この分野の生物 学者や他の研究者の関心を集めている。例えば、フリードマン,T.（Friedmann， T.）は、「Science(1989)244:1275-1281」中の総説においてヒトの遺伝子治療の進 展について考察して、インビトロの物理的トランスフェクション法は適当な受容 細胞において1％に近づくか、または超えるとしている。 細胞の形質転換を行おうとする研究者は、選択された遺伝子産物の産生のため に細胞を培養するか、または細胞が生体の臓器もしくは組織の一部を構成する場 合（すなわち、遺伝子治療）も、いくつかの一般的方法（無機塩との核酸の共沈 殿、電気穿孔法、オリゴヌクレオチドの直接注入、または陽イオン性脂質／核酸 混合物の使用を含む）を使用してきた。 フェルグナー,P.L.（Felgner，P.L.）は、「Adv．Drug Deliv．Rev. （1990） 5:163-187」において、インビトロおよびインビボの機能的ポリヌクレオチドの送 達のための種々の方法（陽イオン性ポリペプチド、ジエチルアミノエチルデキス トラン（DEAEデキストラン）、リン酸カルシウム、および他の不溶性無機塩、リ ポソーム、プロテオ−リポソーム、および陽イオン性脂質（例えば、N−［1−（ 2，3−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N，N，N，−トリメチルアンモニウム クロリドすなわちDOTMA）の使用を含む）を詳細に調べている。 リポソームは細胞にDNAを導入するためによく使用されるビヒクルである。例 えば、「Nicolau，C.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1983）80:1068-1072」は 、ラットのプレプロインスリンIをコードする配列を含有するリポソーム捕捉プ ラスミドの静脈内投与後のラットにおけるラットインスリンのインビボの明らか な発現を開示している。リポソームは、卵黄ホスファチジルコリン／ウシ脳ホス ファチジルセリン／コレステロールの8：2：10（mol/mol/mol）混合物から作成 された。彼らは肝臓や脾臓細胞による、インスリンの有意であるが一過性の発現 を観察した。 陽イオン性リポソーム介在トランスフェクション（「リポフェクチン」と呼ばれ る）は、Felgnerと共同研究者達の研究により有名になった。DNAトランスフェク ションプロトコールにおけるDOTMAの使用が、「Felgner，P.L．et al.Proc．Nat l．Acad．Sci．USA （1987）84:7417」により記載されている。DOTMAは、ジオレオ イルホスファチジルエタノールアミンベースのリポソーム中に取り込まれている 。次にDNA−総脂質複合体はHBS中で調製され、これは次にちようどコンフルエン スになった細胞に加えられる。かれらは、DEAEデキストラン上のリン酸カルシウ ム法のトランスフェクションに比較して、5〜100倍以上の増加を達成 したと主張している。「Focus（1989）11(2):21-25」において、フェルグナー（Fe lgner），P.L.およびホーム（Holm），M.は、リポソームを形成する（重要なこ とは、自然発生的にDNAまたはRNAと相互作用する）ことができて、リポソーム／ ポリヌクレオチド複合体を形成する、DOTMAの使用について考察している。「広 範囲の組織培養細胞およびDNA、mRNA、dsRNAを含む異なるクラスのポリヌクレオ チド」とともに使用することができるトランスフェクション試薬を記載している 。細胞は37℃で24〜48時間インキュベートされる。「Nature（1989）337:387-388」 においてフェルグナー（Felgner），P.L.およびリンゴールド（Ringold），G.M .は、DOTMAを用いる陽イオン性リポソーム介在トランスフェクションについてさ らに考察している。この論文の387頁の略図は、リポソーム／核酸複合体の提唱 された構造を示している。著者らは、複合体に陽イオン性実効電荷が必要なこと に注目している。 LIPOFECTION（登録商標）として市販されている、陽イオン性脂質（DOTMA）と ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）の混合物、および他の陽 イオン性脂質含有トランスフェクション介在組成物は、「Brunette，E．et al． in Nucl．Acids Res. （1992）20(5):1151」および「Jarnagin，W.R.et al.,i n Ibid.(1992)20(16):4205」の論文に記載されている。後者の論文にはまた、 リジニルホスファチジルエタノールアミン（L−PE）とベータ−アラニンのコレ ステロールエステル（CEBA）の混合物も開示されている。 マロン（Malone），R.W.らは、「Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1989）86:6077 -6081」において、陽イオン性リポソーム介在RNAトランスフェクションのための リポフェクチンの使用を記載している。この研究でDOTMAは1：1（mol/mol）比で ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）とともにリポソーム中に 取り込まれた。 「Biotechniques（1988）6(7):680-670」中の論文において、Mannino，R.J.およ びGould-Fogerite，S.は、「カスタムデザインした細胞タイプ特異的遺伝子移動 ビヒクル」として使用するためのリポソームについて考察している。これらの研 究者達は、RNAやDNAのような高分子量分子（0．2〜4．0mm）のための大きな単一 ラメラ小胞（LUV）を使用している。著者らは、効率的な遺伝子移動ビヒクル が備えるべき4つの特徴を記載している：（i）DNAのカプセル化；（ii）標的細 胞へのターゲティングと結合；（iii）リポソーム内容物の融合と送達；（iv） 核ターゲティングと発現。リポソームは、ホスファチジルコリンとコレステロー ルから調製される。 Behr，J.P.らは、「Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1989）86:6982-6986」におい て、リポポリアミン被覆DNAを用いる、哺乳動物一次内分泌細胞への遺伝子移動 実験を記載している。種々の真核細胞培養物のトランスフェクションを介在する と著者らが主張する、いくつかのリポカルボキシスペルミン誘導体が記載されて いる。遺伝子移動のマーカーとして、細菌性クロラムフェニコールアセチル−ト ランスフェラーゼ（CAT）が使用されている。この文献および他の引用されたす べての文献は、参考のため本明細書に内含される。 さらにLeonetti，J.P.らは、「Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1990）87:2448-2 451」において、ウイルスRNAに相補的なオリゴヌクレオチドを有する抗体−捕捉 リポソームの使用を記載している。カプセル化したオリゴマーはDNAseに耐性で あり、非カプセル化オリゴマー配列について報告されたものよりは、1〜2オーダ ー少ない量で活性である。リポソームは、ジパルミトイルホスファチジルコリン （65％）、コレステロール（34％mol）、およびN−スクシンイミジル−3−（2− ピリジルジチオ）プロピオネート修飾ホスファチジルエタノールアミン（1％mol ）の混合物から調製される。リポソームをプロテインAに結合し、プロテインA− 結合性モノクローナル抗体とともに使用された。ウイルス産生はインビトロで阻 害されたと報告されている。 Juliano，R.L.とAkhtar，S.は、「Antisense Research and Development(19 92)2:165-176」において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤送達系として リポソームの使用に焦点を当てている。使用できる可能性のある異なる型のリポ ソーム（小さな単ラメラ小胞（SUV）、大きな単ラメラ小胞（LUV）、多重ラメラ 小胞（MLV）、および循環寿命の長いリポソーム（LC−Lipos）を含む）について 記載されている。いわゆる融合原性リポソームや抗体−結合リポソームも記載さ れている。 DNA／蛋白複合体および脂質／ペプチド複合体を含む複合体混合物が、つい最 近 DNAトランスフェクション法に使用された。特に、Legendre，J.Y.とSzoka，Jr. ，F.C.は、「Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1993）90:893-897」において「環状陽 イオン性両新媒性ペプチドグラミシジンSおよびジオレオイルホスファチジルエ タノールアミン」の使用について記載している。「電荷比」1：1のDNA／ペプチ ドおよび「モル比」5：1の脂質／ペプチドのいくつかの組合せが開示されている 。これらの研究者は、粘着性哺乳動物細胞において陽イオン性リポソームより20 倍まで高いレベルのトランスフェクションレベルを報告し、原形質膜を介して細 胞内へDNAが侵入する説を支持する証拠を記載している。この研究は、非ウイル ス系のトランスフェクション効率を改良する必要性に対応することを目的とする ものである。この論文はさらに、グラミシジンSの疎水性面がトランスフェクシ ョン活性に重要であり、電荷中和の重要性を若干低下させることを示唆している 。この著者らは、リン脂質が2つの機能（グラミシジンSの細胞毒性の低下：トラ ンスフェクションレベルの上昇）を有すると主張している。 Clark，P.O.およびLeach F.R.は、「Molec．Gen．Genet. （1980）178:21-25」 において、枯草菌（Bacillus subtilis）細胞の形質転換性に及ぼすミリモル濃 度のスペルミジンの作用を記載している。細胞の最大の刺激は、DNAの30分前に スペルミジンを加えた時に観察されている。 一方、Gilbon，E.らは、「Biotechniques（1986）4(6):504-511」において、特 定の細胞集団の大部分に特定の遺伝子を送達するための、レトロウイルス介在遺 伝子移動の有用性を記載している。Rosenfield，M.A.らは、「Science（1991）25 2:431-434」において、ラットの肺上皮のインビボトランスフェクションのための cDNA発現カセットを含有する、アデノウイルスゲノムの使用を開示している。 最後に、Kaneda，Y.らは、「Science（1989）243:375-378」において、成体ラッ トの門脈への注入時に核蛋白とともに同時導入したDNAの、発現の増加を観察し ている。培養細胞に添加する時に発現が観察されると報告している。DNAと核蛋 白は、センダイウイルスに融合した脂質小胞中に導入された。 ポリアミン−ステロイド核結合体の一般的分野で、抗生物質活性を有する天然 に存在するスペルミジン−コレスタニル化合物が、1993年3月9日のZasloffらの 米 国特許第5,192,756号に記載されている。この化合物は、一般的なサメ科（dogfi sh shark）のスクアラス・アカンチアス（Squalus acanthias）の胃から単離 された。しかし、この明細書は、この化合物の抗生物質活性としての使用以外に ついては開示していない。 Bellini，A.M.と共同研究者は、「Arch．Pharm. (Weinheim)(1990)323:201-205」 において、塩基性コリン誘導体の抗菌活性を記載している。これらの研究者は 、疎水性アミン誘導体が最も高い抗菌活性を有することを見いだした。その作用 機序は、受容体の接触ではなく膜通過に起因するとされた。この論文は、205頁 において、非イオン化種が活性種であると記載している。さらに、この論文は、 核酸形質転換の過程については、何の開示、教示または示唆もしていない。Bell iniと共同研究者の2つの初期の論文（Eur．J．Med．Chem. （1983）18(2):185-1 90および同上、（1983）18(2):191−195）は、同様の化合物とその抗菌活性を記 載した。さらに開示された誘導体はいずれも、少なくとも1つの非置換アミン基 （すなわち、−NH₂）を有するポリアミン鎖を含有していない。 Burrowsと共同研究者は、「第208回ACS National Meeting，Division of O rganic Chemistry」の抄録第193号と304号中に記載のように、アミンスペーサー を用いてある種のステロールダイマーとトリマーを合成した。これらのダイマー とトリマーは、DNAと結合する空隙を形成すると記載されている。 すなわち、当該分野にはトランスフェクションを行うためのより効率的な方法 、およびさらに一般的には細胞に内因性または外因性の核酸を導入し、その遺伝 子構成を変更するためのより効率的な方法に対する必要性がある。 3．発明の概要 したがって、本発明の目的は、形質転換により細胞に核酸を導入する方法を提 供することである。広義には本発明は、胆汁酸ベースの分子および少なくとも1 つのアミン含有残基（好適には、ポリアミン）を含む化合物の存在下で、細胞に 核酸（外因性または内因性）を接触させることを含んでなる。本発明の1つの実 施態様において、脂質（最も好適には中性脂質）も、接触段階において存在する 。場合によっては、トランスフェクション媒体はまた、陽イオン性脂質を含有す る。 形質転換の効率は、本発明に記載の化合物の非存在下でのトランスフェクショ ン効率に比較して、本発明に記載の化合物の存在下では増加することが発見され た。すなわち、本発明は、遺伝子発現の促進、蛋白工学、形質転換された宿主細 胞による蛋白産生、クローニングおよびサブクローニング法、アンチセンス、遺 伝子治療などを含む種々の方法で使用できるが、これらに限定されない。 本発明はまた、上記目的を達成するために特に関係のある化合物、およびこれ を含んでなる組成物を提供することも企図する。すなわち本発明のさらなる目的 は、形質転換すべき宿主細胞に本発明の化合物またはこれを含有する組成物の有 効量を接触させることを含む、宿主細胞の形質転換能の増強に関する。 開示された化合物、組成物および方法を用いて、細胞への核酸の導入が大幅に 促進されることが見いだされた。さらに重要なことは、核酸を送達する能力は、 生きた生物の組織や器官を含んでなる細胞に拡張されて、こうしてこれに関連し た診断的、予防上の、および治療上の利点が得られることが見いだされた。 本発明の基本的概念の例示を目的とした下記の好適な態様の詳細な説明より、 当該分野の当業者にとって本発明の他の目的が明らかであろう。 4．図面の簡単な説明 図1は、3α−p−メトキシベンゾエート−7α，12α−ジ（2，3，4，6−テトラ −O−ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸メチルエステルの 製造のための合成概略図を示す。 図2は、3β−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラン−2 4−酸メチルエステルの製造のための合成概略図を示す。 図3は、本明細書に記載された胆汁酸化合物への結合に適した脂肪族アミン残 基のタイプの追加の例を示す。 図4は、本明細書に記載された胆汁酸化合物への結合に適した芳香族アミン残 基のタイプの追加の例を示す。 図5は、3α−ヒドロキシ−7−デオキシ−12α−（1’α−グルコシル）−5β −コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（12−（ グリコシル化）デオキシコール酸−スペルミン結合体とも呼ばれる）の製造のた めの合成概略図を示す。 図6は、3α−ヒドロキシ−12−デオキシ−7α−（1’α−グルコシル）−5β − コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（7−（グリ コシル化）ケノデオキシコール酸−スペルミン結合体とも呼ばれる）の製造のた めの合成概略図を示す。 図7は、3α，7α，12α−トリヒドロキシ−5β−コラン−24−酸、N−（4，9 −ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（コール酸−スペルミン結合体、化合物 Fとも呼ばれる）の製造のための合成概略図を示す。 図8は、3α，12α−ジヒドロキシ−7α−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N −（12−アミノドデシル）アミド（デオキシコール酸−1，12−ジアミノドデカ ン結合体、化合物Gとも呼ばれる）の製造のための合成概略図を示す。 図9は、3α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラ ン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（ビス（グリコ シル化）コール酸−スペルミン結合体、化合物Eとも呼ばれる）の製造のための 合成概略図を示す。 図10は、本発明の追加のデオキシコール酸−およびケノデオキシコール酸−ポ リ（アミノアルキレン）結合体を示す。 図11は、3β−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラン− 24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミドトリヒドロクロリド の製造のための合成概略図を示す。 図12は、COS−7細胞の形質転換に使用されたいくつかの化合物をリストする。 図13は、図12の選択された化合物2と5の合成概略図を示す。 図14は、図12の化合物6と7の合成の合成概略図を示す。 図15は、形質転換実験に使用したpSVβの概略図である。 図16は、形質転換実験の結果のいくつかのをリストする。 図17は、化合物：DNA電荷比に対する形質転換効率をグラフで示す。 図18は、種々の化合物M／DOPE複合体のONPG測定とX−GAL測定の結果をDNA電荷 比と比較した表である。 図19は、位相差顕微鏡および明視野顕微鏡条件下での、pSVβプラスミドを有 するCOS−7細胞のトランスフェクションのためのリポフェクチン、化合物Eおよ び化合物Mのトランスフェクション効率を示す。 図20は、種々の化合物M対DNA電荷比の、化合物M／DOPE複合体の存在下でのpSV βプラスミドを有するCOS−7細胞のトランスフェクションに及ぼす1％血清の添 加の効果を示す。 図21は、DNAのみ（対照）、化合物1、スペルミンのみ、および化合物E（これ は化合物1のスペルミン誘導体）を用いた、ゲルシフト実験の結果を示す。 5．発明の詳細な説明 本発明の化合物、組成物、および方法は、核酸、特に外因性核酸の細胞への有 利な導入に適用される。特に、外因性核酸の細胞への導入のための本方法は：（ a）式（I） （式中、R₁は、H、OH、OR₅、NH₂、NHR₆、またはNR₆R₇でもよく；R₂とR₃は同じで あるかまたは異なってもよく、H、OHまたはOR₅であってよく；R₄は、CONH₂、CON HR₆、CONR₆R₇、CH₂NH₂、CH₂NHR₆、CH₂NR₆R₇、CO₂−Y−NH₂、CO₂−Y−NHR₆、また はCO₂−Y−NR₆R₇であってよく；R₅は、1〜10個の単糖単位を含む保護または非保 護グリコシル残基であり、ここで各単糖単位のアノマー炭素原子におけるグリコ シド結合は、独立にアルファまたはベータであり；NH₂、NHR₆、およびNR₆R₇は、 それぞれ非置換アミノ基、モノ置換アミノ基、およびジ置換アミノ基であり、こ こでR₆とR₇は同じであるかまたは異なってもよく、1つまたはそれ以上の非置換 、モノ置換またはジ置換アミノ基で随時置換された1〜15個の炭素原子を含む、 直鎖、分岐鎖または環状炭化水素基（例えば、脂肪族基、環状脂肪族基、芳香族 基またはこれらの組合せ）であってよく；Yは、1〜10個の炭素原子を含む直鎖ま たは分岐鎖アルキレン基であり；nは0〜10までの整数（好適には0〜3）である） の化合物；またはその酸付加塩 もしくは四級アンモニウム塩の存在下で、細胞に核酸を接触させ；そして（b） 細胞に核酸を導入するのに充分な時間、化合物の存在下で細胞に核酸を接触し続 ける、ことを含んでなる。 アミノ基の置換の程度は、アミノ基に由来する水素への結合の数により決定さ れる。すなわち、非置換アミノ基は2つのN−H結合（例えば、−CH₂−CH₂−NH₂） を有する。モノ置換アミノ基は1つのN−H結合（例えば、−CH₂−NH−CH₂−また は−CH＝NH）を有する。ジ置換アミノ基は1つも有さない（例えば、＝CH−NR−C H₂−または−CH＝N−CH＝）。「1つまたはそれ以上の非置換、モノ置換またはジ 置換アミノ基で置換されたアミノ基」とは、1〜15個の炭素原子を含む炭化水素 基は、炭化水素骨格内（例えば、−CH₂−NH−CH₂−、−CH₂−NR−CH₂−、−CH＝ N−CH₂、−CH＝N−CH＝など）、または骨格外（例えば、一級アミン、二級アミ ン、三級アミン、イミンなど、例えば、−CH₂−CH₂−NH₂、−CH₂−CH（−NH₂） −CH₂−、−CH₂−CR（NH₂）−CH₂−、−CH＝NHまたは−CR＝NH）に、少なくとも 1つのアミノ基を含有する。 したがって、アミノ基は、例えばプロトン性媒体（例えば、−CH₂−NH₂ ⁺−CH₂ −、または−CH₂−CH₂−NH₃ ⁺）中、または四級アンモニウム塩（例えば、CH₂−C H₂−NMe₃ ⁺、ここでMeはメチルを意味する）の形成時に電荷を有することができ る。本発明の好適な化合物には、2つまたはそれ以上の陽性電荷を有する化合物 が包含される。他の化合物は、3つ、4つまたはそれ以上の陽性電荷を有すること ができる。 R6および／またはR7として使用される選択されたアミノ基含有残基の追加の例 は、図3と4に記載されている。 前述のようにR₅基は、保護または非保護グリコシル残基であり、これは1〜10 個の単糖単位（例えば、単糖、二糖、三糖など）を含有してもよい。本発明にお いて「単糖」という用語は、任意の糖残基またはその誘導体である。単糖は例え ばヘキソース（例えば、D−アロース、L−アロース、D−アルトロース、L−アル トロース、D−フコース、L−フコース、D−グルコース、L−グルコース、D−マ ンノース、L−マンノース、D−グロース、L−グロース、D−イドース、L−イド ース、D−ガラクトース、L−ガラクトース、D−ラムノース、L−ラムノース、D −タロー ス、L−タロースなど、もしくはこれらの任意のデオキシ型（例えば、2−デオキ シヒキソース）、またはアミノ置換誘導体、すなわちアミノ糖（例えば、D−グ ルコサミン、L−グルコサミン、D−ガラクトサミン、L−ガラクトサミンなど） ）であってよい。フラノース、デオキシフラノース、アミノ置換フラノースなど も適当である（例えば、D−リボース、L−リボース、D−アラビノース、L−アラ ビノース、D−キシロース、L−キシロース、D−リキソース、L−リキソースなど ）。 さらにヒドロキシル基（または、場合によりアミノ基）の保護基は、ある特定 の条件に適した広範囲の保護基から選択することができる。これらの保護基（そ の選択は、当業者には明らかである）には、ベンジル、ペンテニル、ピバロイル 、トリメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリル、tert−ブチルジフェニルシ リル、トリイソプロピルシリル、アセチル、テトラヒドロピラニル、ベンゾイル 、C₁−C₃アルキル、イソプロピリデン、ベンジリデン、トリフルオロアセチル、 （2−メトキシエトキシ）メチル、スクシニル、オルトエステル、パラメトキシ ベンジル、アリルなどがあるが、これらに限定されない。 目的の結合体の酸付加塩もしくは四級アンモニウム塩は、好適には薬剤学的に 許容される。このような薬剤学的に許容されるもの例には、無機および有機付加 塩（例えば、それぞれ塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、またはリン酸塩、および酢酸塩 、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩 、酒石酸塩、フマール酸塩、マレイン酸塩、メタン−スルホン酸塩、イソチオン 酸塩、テオフィリン酢酸塩、サリチル酸塩など）があるが、これらに限定されな い。低級アルキル四級アンモニウム塩なども適している。 本発明の方法において、導入される核酸または少なくともその一部は、細胞の 遺伝子構成内に取り込まれることを意図する。このような取り込みは、例えば核 酸または少なくともその一部の、細胞の染色体内への組み込みであってよい。特 に核酸のセグメントは染色体の領域内に挿入されるか、またはその選択された内 因性画分を置換してもよい。また添加された核酸または少なくともその一部は、 染色体外物質として細胞により保持されてよい。 本発明の具体的な態様において、本発明の方法は、式（I）の化合物の存在下 で、およびさらに脂質の存在下で、細胞に外因性または内因性核酸を接触させる こ とを含んでなる。好適には脂質は極性であり、最も好適には、融合原性物質であ る。本発明において、「融合原性（fusogenic）」という用語は、最初膜の外に 位置する物質が最終的に膜の内部に貫通および進行するように、融合原性物質（ 例えば、脂質）が、核酸／胆汁酸−ポリ（アミノアルキレン）／脂質複合体と細 胞膜との融合を促進する性質または特徴を意味する。融合原性脂質の例には、い くつかのホスファチジルエタノールアミン頭部含有性リン脂質（例えば、DOPE、 DMPE）がある。特に、その融合原性挙動が、二重層対六角形相転移を受ける能力 と相関付けられているリン脂質。 本発明はこのような化合物の使用に限定されておらず、融合原性挙動を示す任 意の脂質が使用できる。例えば、リソリン脂質（例えば、リジニルホスファチジ ルエタノールアミン）もまた、DNA−胆汁酸アミン−脂質複合体の融合を促進す る。リン脂質、リソリン脂質および糖の脂肪酸エステルもしくはエーテル以外の 他の一般的なクラスの脂質には、グリコシルジアシルグリセロール（例えば、モ ノガラクトシル−ジグリセリド）、プラスマロゲン（例えば、エタノールアミン プラスマロゲン）、グリコスフィンゴ脂質（セレブロシドを含む）、ガングリオ シド、ステロールおよびジホスファチジルグリセロール（例えば、カルジオリピ ン−Ca²⁺）がある。これらのクラスの脂質のいくつかは、六角形相またはミセル 構造を形成することが知られているものを含有する。 さらに別の態様において、陽イオン性脂質は組成物中に存在してもよい。すな わち、四級アンモニウム基を有する脂質も、本発明に使用できる。陽イオン性脂 質の例としては、N−［1−（2，3−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N，N，N −トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、1，2−ジミリストイル−3−トリ メチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、および1，2−ジミリストイル−3−ジメ チルアンモニウムプロパン（DODAP）があるが、これらに限定されない。 本発明での使用に適した中性脂質の一般的な基には、DOPEのようなリン脂質、 L−PEのようなリソ脂質、モノオレイン酸ショ糖およびモノラウリル酸ショ糖の ような脂肪酸エステルがあるが、これらに限定されない。本発明に使用できる可 能性のある他の一般的な基には、グリコシルジアシルグリセロール、プラスマロ ゲン、アフィンゴミエリン、ガングリオシド、グリセロ脂質、スフィンゴ脂質ま た はカルジオリピンがある。 特定の態様において、実効中性電荷を有する融合原性脂質（例えば、DOPE）は 、実効陽性電荷（例えば、DOTMA）と随時組合せ、次に本発明の化合物と目的の 核酸との混合物に添加される。本発明の具体的な態様において、接触段階はさら に、ジエチルアミノエチルデキストラン（DEAE）などの存在下で行われる。 さらに、ある場合には中性脂質と式（I）の化合物を核酸とあらかじめ混合し て、核酸と化合物の間に複合体を形成させることが好ましい。次に得られる混合 物を細胞と接触させて、核酸を細胞に形質転換または導入させる。 すなわち、本発明はまた、特定の化合物群に関する。式（I）（式中、R₁は、H 、OH、OR₅、NH₂、NHR₆、またはNR₆R₇でもよく：R₂とR₃は同じであるかまたは異 なってもよく、H、OHまたはOR₅であってよく；R₄は、CONHR₆、CONR₆R₇、CH₂NHR₆ 、CH₂NR₆R₇、CO₂−Y−NH₂、CO₂−Y−NHR₆、またはCO₂−Y−NR₆R₇であってよく； R₅は、1〜10個の単糖単位を含む保護または非保護グリコシル残基であり、ここ で各単糖単位のアノマー炭素原子におけるグリコシド結合は、独立にアルファま たはベータであり；NH₂、NHR₆、およびNR₆R₇は、それぞれ非置換アミノ基、モノ 置換アミノ基、およびジ置換アミノ基であり、ここでR₆とR₇は同じであるかまた は異なってもよく、1つまたはそれ以上の非置換、モノ置換またはジ置換アミノ 基で随時置換された1〜15個の炭素原子を含む、直鎖、分岐鎖または環状炭化水 素基であってよく（ただし、R₆またはR₇の1つは少なくとも1つの非置換（好適に は一級）アミノ基を含有しなければならない）；Yは、1〜10個の炭素原子を含む 直鎖または分岐鎖アルキレン基であり；nは0〜10までの整数（好適には0〜3）で ある）の化合物；またはその酸付加塩もしくは四級アンモニウム塩が開示される 。 具体的な好適な態様において、R₁基はベータ配置を有する。別の態様において 、R₁基はアルファ配置を有する。特定の態様において、R₁、R₂、およびR₃の少な くとも1つはOHである。別の態様において、R₁、R₂、およびR₃の少なくとも2つは OHであり、さらに別の態様において、R₁、R₂、およびR₃のすべてはOHである。 本発明は、種々の基のすべての他の組合せを意図し、R₁とR₂がOR₅であり、R₃ がOHである；R₁とR₃がOR₅であり、そしてR₂がOHである；またはR₂とR₃がOR₅であ り、そしてR₁がOHである態様を含むが、これらに限定されない。 さらに、窒素原子が結合したR₆基がポリアミン由来である化合物が開示される 。適当なポリアミンには、アルキレンジアミン（例えば、1，3−ジアミンプロパ ン）、生物起源のポリアミン（例えば、1，4−ジアミノブタン（プトレスシン） 、1，5−ジアミノペンタン（カダベリン）、N−（4−アミノブチル）−1，3−ジ アミノプロパン（アルキレントリアミンであるスペルミジン）、およびN−［N− （3−アミノプロピル）−4−アミノブチル］−1，3−ジアミノプロパン（アルキ レンテトラアミンであるスペルミン））、および分岐鎖脂肪族ポリアミンを含む ものがあるが、これらに限定されない。非対称ポリアミンでは、本発明は、ポリ アミンとステロイド核のすべての他の可能な結合点を企図する。例えばスペルミ ジンでは、3つのアミノ基の任意のものが、側鎖またはステロイド核のC−3位で 結合してよい。 本発明の選択された態様において、R₁またはR₄基はアミノ酸でもペプチドでも ない。 細胞に導入される核酸はDNAまたはRNAを含有することができ、多くの型をとる ことができる。例えば、核酸は1本鎖、2本鎖（またはリボザイムのように1本鎖 と2本鎖の両方を含有してもよい）でもよく、染色体またはその断片、プラスミ ド、ファージ由来、またはベクター（例えば、クローニングベクター、発現ベク ター）、および酵母の人工染色体を含んでもよい。好適には核酸は遺伝子をコー ドし、最も好適には哺乳動物または植物起源の遺伝子をコードする。具体的な態 様において、核酸はオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、好適にはアン チセンス配列である。例えばアンチセンス配列は、スプライスアクセプター部位 またはその相補物（例えば、配列5’ACA CCC AAT TCT GAA AAT GG 3'またはその 相補物）に対応してもよい。あるいはオリゴヌクレオチドは、プライマー結合部 位またはその相補物に対応する配列を有する。そのような配列は、例えば5’AAG TCC CTG TTC GGG CGC CA 3'またはその相補物を含んでよい。 好適なステロイド核は、胆汁酸、コール酸、アロコール酸、3β−および3α− アミノ−5β−コール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコー ル酸、または3−デオキシコール酸を含むが、これらに限定されない。コレスタ ニル誘導体も使用できるが、特に陰性荷電基を含有するものはあまり好ましくな い。 したがって、本発明は、遺伝子発現、蛋白製造などの分野のみでなく、診断、 子防および治療の分野（特にアンチセンスおよび遺伝子治療）でもきわめて有望 である。形質転換性核酸の摂取を増加させることで、形質転換の効率が上昇する 。従って投与レベルも本発明により良い影響を受けるかも知れない。 5．1 典型的な結果の説明 DNAと本発明の化合物の間の堅い複合体の形成、細胞のトランスフェクション の成功、およびトランスフェクションされた細胞中のDNAにコードされた蛋白の 発現を確認する、種々の測定法が行われている。これらの測定法のうち、染色測 定法とONPG測定法は、いずれもレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ（β−ga l）（これは、形質転換実験に使用されるプラスミドDNA中に存在する）に依存す る。アガロースゲル測定法は、複合体形成の効率の指標を与える。 5．2．複合体形成を評価するためのアガロースゲル測定法 典型的には、細胞内へのDNAの摂取を促進するための好適な化合物または混合 物は、DNAと複合体を形成する。DNAと複合体を形成する種々の化合物の能力を評 価するために、アガロースゲル測定法が使用される。DNAと堅い複合体を形成す る化合物は、比較的小さな（すなわち、10未満）電荷比でウェルの中または近く にDNAを保持される（電荷比は、胆汁酸結合体中の陽電荷とDNA中の陰電荷の比で あり、胆汁酸結合体のアミン基のすべてがイオン化していることを仮定している ）。 典型的な測定法において、250〜500ngのpBR322プラスミドDNAは、異なる量の 胆汁酸結合体、または胆汁酸結合体と他の脂質との混合物と、総量10μlで混合 され、30分間インキュベートされる。次に各試料に、6×フィコールローディン グ緩衝液2μlを加え、試料を0．5×TBEで調製した1％水平アガロースゲルにのせ る。次に、0．5×TBE中で水平アガロースゲル電気泳動を、100〜125ボルトで2〜 3時間行う。 次にゲルを電気泳動チャンバーから取り出し、臭化エチジウム（5μg/mL）で 染色する。ゲルをトランスイルミネーターの上に置いて写真を撮る。6×フィコ ールローディング緩衝液とTBEランニング緩衝液の組成は、「Sambrook，J.:Frit sch，E.F.およびManiatis，T.、分子クローニング（Moleular Cloning）、コー ルド・スプリング・ハーバー・大学・プレス（Cold Spring Harbor Universi ty Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、1989 」に記載されている。 こうして試験した多くの化合物や組成物の結果を、下記の表1に示す。 5．3．材料 COS−7細胞および（10）3細胞を、100units/mLペニシリンGナトリウムおよび1 00μg/mLストレプトマイシン硫酸を含有する10％胎児牛血清（FBS）を有するD− MEM中で培養する。すべての細胞培地と成分は、ギブコ（Gibco）−BRLから購入 できる。 プロメガ（Promega）から得たプラスミドpSV40−βGalを、NovaBlue細胞（ノ バゲン（Novagen））中で増幅し、単離し、そしてアルカリ溶解法で精製した後 、酸性化フェノール抽出を行う。Aubin，R.; Weinfeld，M.;Paterson，M.C.， 分子生物学の方法（Methods in Molecular Biology）第7巻中の第1章：遺伝 子移動と発現方法（Gene Transfer and Expression Protocols）、Murray， E.J.編、ヒューマンプレス（Human Press）：クリフトン（Clifton）、ニュー ジャージー州、1991。 5．4．細胞の一過性トランスフェクション トランスフェクションの前日に35mmウェルに細胞を蒔く。ウェル当たりの細胞 数は、約3×10⁵である。トランスフェクションの前に、リン酸緩衝化生理食塩水 、pH7．2（ギブコ（Gibco）-BRL）で細胞を3回洗浄する。次に2μgのpSV40−β −Galプラスミドと種々の量の試験化合物または組成物（例えば、胆汁酸結合体 、または胆汁酸結合体と脂質の混合物、DOPE）を含有するOpti−MEM溶液（ギブ コ（Gibco）-BRL）1mlを、細胞に重層する。細胞を、5％CO₂を含有する加湿雰囲 気中で37℃で3時間インキュベートし、次に抗生物質を添加していない20％FBS／ D−MEM 1mLを各ウェルに加える。細胞をさらに25時間インキュベートして、次 にβ−ガラクトシダーゼの発現を測定する。 表3と4に要約する実験では、トランスフェクション混合物は204μl中に1μg/m LのDNAを含有する。DNA：エンハンサー混合物をまず5倍濃縮物として調製し、15 分間インキュベートし、無血清Opti−MEMで最終濃度に希釈し、次に細胞に添加 する。測定は、2×10⁴細胞／ウェルの24ウェルプレートの11．3mmのウェルで行 う。細胞をトランスフェクション混合物に6時間接触させ、次にトランスフェク ション混合物を取り除く、プレートに再度、10％胎児牛血清含有D−MEMを添加す る。48時間インキュベート後、β−ガラクトシダーゼ発現を調べる。 5．5．トランスフェクションした細胞のin situ染色 細胞をPBSで洗浄し、0．5％グルタルアルデヒドで10分間固定した。次に細胞 をPBSで2回洗浄し、5mMフェリシアン化カリウム（シグマ（Sigma））；5mMフェ ロシ アン化カリウム（シグマ（Sigma））；1mM MgCl₂、1mg/mL X−gal（ベーリン ガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））を含有する溶液1mLで一晩染色する。 前述のようにCOS−7細胞を、1：1（w:w）デオキシコール酸−スペルミン結合 体：DOPEの5mg/mL溶液6μlの存在下で、pSV40−β−Gal DNA2μgで処理した。 染色測定の結果を、下記の表2に要約する。 わずかに異なる条件を用いてさらに別のセットの実験を行う。データを表3に 示す。データは、すべての完全なウェル内のトランスフェクションした細胞の計 測数、またはウェルの5つの100倍視野の平均に基づき計算する。トランスフェク ションは1μg/mLのDNAを用いて行ない、DNAでインキュベートした後、細胞を48 時間染色する。すべての場合に、エンハンサーと脂質の比は1：1（w:w）に維持 する。 表2と3のデータは、スペルミン側鎖（例えば、B、E、およびF）を有する化合 物は、DOPEおよびDNAと混合した時、リポフェクチンや陽イオン性：中性（DISTA P：DOPE）脂質混合物で観察される頻度に近い、そしてある場合にはこれを越え る頻 度で細胞をトランスフェクションすることを示す。 5．6．発現レベルの測定法、ONPG測定法 下記の表4は、トランスフェクション効率のこの定量的な尺度を与える。この 測定法では、細胞は染色測定法（5．3節と5．4節を参照）で記載したように増殖 させ、次に以下のように処理する： 溶解物の調製：測定すべき細胞から増殖培地を取り除く。細胞をPBS緩衝液で2 回洗浄する。PBS緩衝液を除く。細胞をちょうどカバーするのに充分量（35mMの 培養ウェルについて約250μl）の1×レポーター溶解緩衝液（プロメガ（Promega ））を、細胞に加える。次にプレートを室温で15分間インキュベートする。次に 細胞溶解物をピペットでマイクロ遠心管に移し（細胞破片をはがすのに細胞掻き 器が必要である）、遠心管を氷の上に置く。次に種々のウェルからの遠心管をマ イクロ遠心機中で4℃で2分間最大速度(〜14k rpm)で遠心分離する。上澄液を新 しい管に移し、−70℃で凍結するかまたは直ちに使用する。 β−gal活性の測定法：細胞抽出物150μlをマイクロ遠心管に入れる（対照と して、β−gal遺伝子でトランスフェクションしなかった細胞からの同量の細胞 抽出物を別の試験管に入れる）。試験管に測定2×緩衝液（プロメガ（Promega） ）150μlを加える。測定2×緩衝液は、β−galの基質である、ONPGを含有する。 試料をボルテックス混合し、37℃で30分間インキュベートする。500μlの1M炭酸 ナトリウムを加えてボルテックスして、反応を停止させる。次に、細胞抽出物に 対して420nmで吸光度を読む。β−gal活性を定量するために、吸光度に380を掛 け、インキュベート時間（分）で割る。1U＝37℃で1分間で加水分解される1nmol のONPG（β−ガラクトシダーゼの純品を用いて検量線を作成することができる） 。 表4は、細胞の形質転換において、A：B 1：1はリポフェクチン（これは、DOT MAとDOPEの1：1混合物）より優れていることを示す。測定間で変動はあるが、一 般的傾向は維持されており、染色結果と一致する。 わずかに異なる条件下で、トランスフェクション効率の尺度としての相対的β −ガラクトシダーゼ活性を定量するために、再度ONPG測定を行う。表5に示すデ ータは、24ウェルトランスフェクションプレートのウェルのin situ解析により 測定される。細胞をPBSで3回洗浄し、蒸留水中で3回凍結融解を行う。100mMのリ ン酸ナトリウム緩衝液pH7．5中最終濃度0．88mg/mL ONPG、1mM MgCl₂、45μM β−メルカプトエタノールを与える、等量の基質混合物の添加により、溶解物 のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する。測定プレートを37℃で30〜60分間イン キュベートする。反応混合物100μlずつを、96ウェルプレートに移す。96ウェル プレートをマイクロプレートリーダーで420nmで読む。24ウェルプレートでイン キュベートしたβ−ガラクトシダーゼの検量線を、96ウェルプレートに含める。 β−ガラクトシダーゼ活性は、検量線の一次回帰により得られた式から求める。 表4と5のデータは、スペルミン側鎖（例えば、A、E、およびF）を有する化合 物は、DOPEおよびDNAと混合した時、リポフェクチンや陽イオン性：中性（DISTA P：DOPE）脂質混合物で観察される頻度に近い、そしてある場合にはこれを超え る頻度でトランスフェクションを促進することを示す。酵素測定法に基づく種々 の化合物の相対的効率は、X−gal染色法で得られるものと非常によく似ている。 これらの結果は、本発明の化合物は、トランスフェクションされる細胞の数を増 加させることを示唆する。しかし、表4と5のデータは最適化されておらず、Bの 密接に関連する類似体（例えば、EまたはF）について、A：B（1：1）実験で観察 された結果に近い結果が予測されることが強調されなければならない。 すなわち、本明細書に記載した化合物や組成物は、現在市販されているトラン スフェクション物質で観察される発現レベルに匹敵またはこれを超える発現レベ ル（および、従ってトランスフェクションレベル）を与える。さらに本明細書に 記載の化合物や組成物は、現在市販の物質に比較して、宿主細胞（または、個体 、臓器、組織など）に対して毒性がより低いかもしれないことが指摘される。 本発明をさらに例示するために、好適な態様の例を以下に示す。 6．実施例 6．1．2，3，4，6−テトラ−O−ベンジル−α−D−グルコピラノース（2） 図1に示されるように、メチル−α−D−グルコピラノース（100g、0．516mol ）を塩化ベンジル（400mL、3．5mol）中にKOHペレット（336g、6mol）と共に懸 濁し、混合物をメカニカルスターラーを使用して120〜130℃で3時間撹拌する。 反応混合物を冷却して、水（800mL）を添加してこの結晶性の塊を溶解し、これ をエーテル（2×200mL）で抽出する。合わせた有機層を水（2×500mL）で洗浄し て乾燥（Na₂SO₄）する。減圧蒸留により溶媒を除去して、次の反応のための粗生 成メチル2，3，4，6−テトラ−O−ベンジル−α−D−グルコピラノシドを得る。 110℃の氷酢酸（700mL）中の上記粗生成化合物の撹拌溶液に、3N硫酸（120mL ）を15分間で滴下により添加する。3時間後、この反応混合物を室温に冷却し、 生成物の結晶化のため一晩放置する。結晶を濾過し、水（4×500mL）とメタノー ル（2×250mL）で連続して洗浄し、空気乾燥して、白色の粉末として2（115g、2 工程全体で41％）を得る（融点150〜51℃、文献値151〜152℃；Perrine，T.D.ら ，J．Org．Chem．（1967）32:664参照）。TLC（EtOAC：ヘキサン＝3：7）Rf 0. 2。赤外吸収（KBr）：3362，3030，2911，2863，1454，1357，1146，1088cm^-1。¹ H NMR（300MHz、CDCl₃）：δ 7.38−7.10(m，20H)，5.21(d，J=3.3Hz，1H)， 4.98-4.44(m，9H)，4.25(m，1H)，3.72-3.50(m，4H)。元素分析：C₃₄H₃₆O₆の計 算値：C，75.53; H，6.71。実測値：C，75.68; H，6.80。 6．2．フェニル2，3，4，6−テトラ−O−ベンジル−1−チオ−D−グルコピラノ シド（3） ジクロロメタン（500mL）中の2（108g、0．2mol）と二硫化フェニル（53g、0. 24mol）の撹拌溶液に、トリ−n−ブチルホスフィン（60mL、90％、0．22mol）を 添加する。この反応混合物を室温で15時間撹拌後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液 （600mL）中に注ぎ入れて、10分間撹拌する。有機層を分離し、水（2×500mL） で洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）して濃縮する。油状残渣をヘキサン（500mL）に溶解 し、0℃に冷却して、白色の固体として化合物3（75g、60％）を得る（融点85〜8 6℃、β−チオ化合物の文献値84〜85℃；Ferrier，R.J.ら，Carbohyd．Res．（1 973）27:55参照）。TLC（EtOAC：ヘキサン＝1：3）Rf 0.6。赤外吸収（KBr）： 3061，3030，2900，2865，1584，1494，1453，1358，1125，1085，1070，1029cm^-1 。¹H NMR（300MHz、CDCl₃）：δ 7.70-7.00(m，25H)，4.90-4.40(m，9H)，3 .80-3.40(m，6H)。元素分析：C₄₀H₄₀O₅Sの計算値：C，75.92; H，6.38，S，5.0 6。実測値：C，75.99; H，6.39，S，5.12。 6．3．フェニル2，3，4，6−テトラ−O−ベンジル−1−チオ−D−グルコピラノ シドS−オキシド ジクロロメタン（400mL）中の3（130g、0．2mol）の冷却（−78℃）した撹拌 溶液に、ジクロロメタン（300mL）中のmCPBA（74％、58．31g、0．25mol）の溶 液を20分間で滴下により添加する。混合物を撹拌して、−30℃まで温度を上昇さ せる。次に混合物を濾過する。瀘液を飽和重亜硫酸ナトリウム水溶液（2×300mL ）、重炭酸ナトリウム（2×400mL）、食塩水（400mL）および水（2×400mL）で 洗浄する。有機層を乾燥（Na₂SO₄）して濃縮する。残渣のフラッシュクロマトグ ラフィー（CH₂Cl₂：EtOAC＝9：1）により、白色の固体としてスルホキシド混合 物4（127g、95％）を得る（融点120〜122℃）。TLC（EtOH：CH₂Cl₂＝1：9）Rf 0.3。赤外吸収（KBr）：3060，3030，2910，2867，1495，1450，1360，1210，11 36，1092，1049cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.72-7.14(m，25H)，5.12-4.42(m ，9H)，4.40-3.30(m，6H)。元素分析：C₄₀H₄₀O₆Sの計算値：C，74.04; H，6.22 ，S，4.93。実測値：C，74.10; H，6.26，S，4.99。 6．4．メチル3α−p−メトキシベンゾエート−5β−コラン−24−酸エステル（5 ） ピリジン（500mL）中のコール酸メチル（42．2g、0．1mol）、塩化p−アニソ イル（20mL、0．133mol）およびDMAP（1g）の溶液を8時間撹拌および還流する。 さらに塩化p−アニソイル（10mL、0．67mol）を添加して12時間撹拌する。反応 混合物を濃縮し、残渣をジクロロメタン（600mL）に溶解する。この溶液を1N H Cl（ 2×500mL）と水（3×500mL）で連続して洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）して、溶媒を留 去する。残渣をEtOAC／ヘキサン（1：1）から結晶化して、白色の固体として5（ 40g、72％）を得る（融点179〜180℃）。TLC（EtOAC：ヘキサン＝7：3）Rf 0.7 。 6．5．メチル3α−p−メトキシベンゾエート−7α，12α−ジ（2’，3’，4’， 6’−テトラ−O−ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸エステ ル（6） トリフル（Triflic）酸無水物（30mL、0．178mol）を、冷却したトルエン（30 0mL、−78℃）に添加して、5分間撹拌する。この溶液に、トルエン（300mL）に 溶解した乾燥（トルエンからの共沸蒸留による）スルホキシド4（97g、0．1495m ol）を滴下により添加する。15分の撹拌後、トルエン（100mL）中の乾燥（トル エンとの共沸蒸留による）2，6−ジ−tert−ブチル−4−メチル−ピリジン（30 ．8g、0．150mol）の溶液をこの反応混合物に添加して、−78℃で10分間撹拌す る。反応混合物に、CH₂Cl₂とトルエン（1：1、200mL）中の乾燥（トルエンとの 共沸蒸留による）コール酸メチル誘導体5（33．36g、0．06mol）を滴下により添 加する。反応の進行をTLCによりモニターする。ゆっくり（45分間で）反応混合 物の温度を−50℃にして、この間にTLC上の5のスポットは完全に消失する。反応 混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（1000mL）中に注ぎ入れて、10分間撹拌す る。有機層を分離し、水層をジクロロメタン（2×100mL）で抽出する。合わせた 有機層を水（3×500mL）で洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）して濃縮する。残渣をフラッ シュクロマトグラフィー（EtOAc：ヘキサン＝1：9〜1：4）により精製して、白 色の泡状物として6（84g、87％）を得る（融点46〜48℃）。TLC（EtOAC：ヘキサ ン＝1：3）Rf 0.3。赤外吸収（KBr）：3084，3062，3028，2936，2867，1735， 1707，1605，1496，1453，1360，1321，1275，1254，1210，1165，1097，1073， 1030cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.60-6.70(m，43H)，5.95(d，1H，J=9Hz)，4 .99(d，1H，J=3.6Hz)，4.93(d，1H，J=6Hz)，4.88-3.29(m，31H)，2.68-0.65(m ，37H)。Fab質量分析：1624(M+Na)⁺。元素分析：C₁₀₁H₁₁₆O₁₇の計算値：C，75.7 1; H，7.30。実測値：C，75.59; H，7.31。 6．6．7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O−ベンジル−1’α−グ ルコシル）−5β−コラン−24−酸（7） 図2に示されるように、THF（150mL）中の6（24g、15mmol）の撹拌溶液に、95 ％エタノール（200mL）中のNaOH（10g、250mmol）を添加し、48時間還流する。 次に反応混合物を濃縮し、残渣を酢酸エチル（300mL）に溶解し、水（2×250mL ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（2×300mL）、食塩水（300mL）で洗浄して、 乾燥（Na₂SO₄）する。溶媒を留去して、生じた化合物7（18．5g、85％）を、さ らに精製することなく次の工程に使用する。TLC（EtOAC：ヘキサン＝1：3）Rf 0.4。 6．7．メチル7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O−ベンジル−1’ α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸エステル（8） エーテル中のジアゾメタンの冷却（−10℃）溶液（100mL、ジアザリド（diaza lid）5．35gから生成される、25mmol）を、エーテル（100mL）中の7（18．5g、1 2．74mmol）の冷却（−10℃）溶液に添加する。1時間後、氷酢酸（2mL）を添加 することにより過剰のジアゾメタンを分解する。この反応混合物を、飽和重炭酸 ナトリウム（2×400mL）、食塩水（300mL）、および水（300mL）で連続して洗浄 し、乾燥（Na₂SO₄）して、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（Et OAC：ヘキサン＝3：17）により精製して、ゴム状物として8（13g、70％）を得る 。TLC（EtOAC：ヘキサン＝1：3）Rf 0.6。赤外吸収（ニート）：3450，2925，2 866，1736，1453，1362，1158，1071，1030cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.40- 6.50(m，40H)，5.10-3.40(m，33H)，2.40-0.71(m，38H)。元素分析：C₉₃H₁₁₀O₁₅ の計算値：C，76.08; H，7.56。実測値：C，74.79; H，7.50。 6．8．メチル3β−アジド−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸エステル ジクロロメタン（50mL）中のコール酸メチル誘導体8（13g、8．87mmol）とピ リジン（2．5mL、31mmol）の冷却（0℃）溶液に、トリフル酸無水物を添加して 、20分間撹拌する。次にこの混合物に、DMF／DMPU（1：1、250mL）中のアジ化ナ トリウム（2．6g、40mmol）の溶液を−20℃で添加する。反応混合物を室温に加 温して、一晩撹拌する。溶媒を留去し、残渣をジクロロメタン（20OmL）に溶解 し、水（3×200mL）で洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）して濃縮する。シリカでの残渣の フラッシュクロマトグラフィー（EtOAC：ヘキサン＝3：17）により、白色の固体 として9（10g、75％）を得る（融点112〜114℃）。TLC（EtOAC：ヘキサン＝1：4 ）Rf 0.6。 赤外吸収（KBr）：3085，3061，3029，2921，2867，2097，1735，1603，1495，1 452，1360，1256，1207，1160，1091，1071，1031cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.37-6.84(m，40H)，5.15(d，1H，J=4Hz)，4.95(d，1H，J=4Hz)，4.86-4.26(m ，15H)，4.08−3.40(m，16H)，2.60-0.71(m，37H)。Fab質量分析：1515(M+Na)⁺ 。元素分析：C₉₃H₁₁₀O₁₄N₃の計算値：C，74.76; H，7.43; N，2.81。実測値： C，74.84; H，7.40; N，2.79。 6．9．メチル3β−アミノ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸エステル（10） 90％THF水溶液（100mL）中の化合物9（11g、7．38mmol）とPh₃P（5．76g、22m mol）の溶液を48時間撹拌および還流する。反応混合物を濃縮し、残渣をフラッ シュクロマトグラフィー（CH₂Cl₂および次にCH₂Cl₂：EtOH＝98：2〜9：1）によ り精製して、白色の固体として3−アミノ化合物10（6g、56％）を得る（融点43 〜45℃）。TLC（EtOH：CH₂Cl₂＝1：19）Rf 0.15。赤外吸収（KBr）：3418，292 2，2868，1736，1496，1453，1362，1161，1071，1032cm^-1。¹H NMR（CDCl₃） ：δ 7.38-6.84(m，40H)，5.10-3.48(m，33H)，2.62-0.70(m，37H)。元素分析 ：C₉₃H₁₁₂O₁₄Nの計算値：C，76.08; H，7.70; N，0.95。実測値：C，75.82; H，7.71; N，0.89。 6．10．メチル3β−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラ ン−24−酸エステル トルエン（50mL）とエタノール（200mL）中の10（14．65g、10mmol）の溶液に 、ギ酸（15mL）と水酸化パラジウム（20％）担持炭素（15g）を添加する。生じ た混合物を水素雰囲気下で40psiで24時間撹拌する。TLCにより水素化分解が不完 全であることが示された。追加のギ酸（4mL）と触媒（4g）を添加し、水素化反 応をさらに24時間進行させる。次に反応混合物をメンブランフィルターで砂によ り濾過して濃縮する。次いで、瀘液を酢酸エチルと混合して沈殿物を形成させる 。（水素化反応からのメタノール溶媒を多少除去する必要があるかもしれない。 ）次に、濾過した沈殿物を脱イオン水25mLに溶解して凍結乾燥する。フラッシュ クロマトグラフィーにより、白色の泡状物として11（2．82g、38％）を得る（融 点170〜172℃、分解）。TLC（MeOH：CH₂Cl₂：イソプロピルアミン＝2：2：1）Rf 0.1 5。赤外吸収（KBr）：3450，2932，1736，1595，1451，1381，1151，1023cm^-1。¹ H NMR（CDCl₃）：δ 5.05(d，1H)，4.80(d，1H)，3.91-3.10(m，15H)，2.50- 0.58(m，37H)。質量分析（Fab）：746(M+H)⁺。元素分析：C₃₇H₆₃O₁₄Nの計算値： C，59.56; H，8.52; N，1.88。実測値：C，54.60; H，8.47; N，2.49。 対応する3α−アミノ化合物は、同様に3β−ヒドロキシ出発物質から得ること ができる。3β−ヒドロキシ出発物質は、例えば、ギ酸とトリフェニルホスフィ ンの存在下でアジドジカルボン酸ジエチルでコール酸メチルを処理して、立体化 学の逆転により3β−O−ホルミルコール酸メチルを得て、これを次に必要に応じ て加水分解または操作することにより、得ることができる。 6．11．メチル3α−ｐ−メトキシベンゾエート−7α，12α−ジ（1’α−グルコ シル）−5β−コラン−24−酸エステル トルエン（50mL）とエタノール（200mL）中の6（10mmol；上記参照）の溶液に 、ギ酸（15mL）と水酸化パラジウム（20％）担持炭素（15g）を添加する。生じ た混合物を水素雰囲気下で40psiで24時間撹拌する。（TLC分析により最初の24時 間の反応後、反応が不完全であることが判れば、必要であれば、追加のギ酸と触 媒を添加することができる。そして2回目の24時間の反応を開始することができ る。）次に、反応混合物をメンブランフィルターで砂により濾過して濃縮する。 次いで、瀘液を酢酸エチルと混合して沈殿物を形成させる。（水素化反応からの メタノール溶媒を多少除去する必要があるかもしれない。）次に、濾過した沈殿 物を脱イオン水25mLに溶解して凍結乾燥する。残渣をフラッシュカラムクロマト グラフィーに付して、約38％収率で標題化合物を得る。 ¹H NMR（CD₃OD）：δ 0.71(s，3H，18-H)，0.90(d，3H，21-H，J=6.6Hz)，0 .93(s，3H，19-H)，1.0−2.6(m)，3.2-3.4(m，2H)，3.55(s，3H，CO₂CH₃)，3.65 (m)，3.76(s，3H，アニソイル−4−メチル)，4.83(d，1H，アノマーH)，5.02(d ，1H，アノマーH)，6.87(d，2H，アニソイル芳香族，J=9Hz)，7.92(d，2H，アニ ソイル芳香族，J=9Hz)。 6．12．デオキシコール酸の活性化エステルの合成 トリエチルアミン（10mL、71．2mmol）を、ジクロロメタン中のデオキシコー ル 酸のナトリウム塩（15g、34．7mmol）、N−ヒドロキシスクシンイミド（7．5g、 65．2mmol）、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（9．3g、68．8mmol、HO BT）および1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド（13. 2g、69．3mmol、EDC）の撹拌溶液に添加する。混合物を12時間撹拌する。次に反 応混合物を水（150mL）で希釈し、ジクロロメタンで2回抽出する。有機層を合わ せて、MgSO₄で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して固体残渣を得る。この残渣を 酢酸エチル−石油エーテルから再結晶して、生成物5．5g（30％）を得る。選択 した¹H共鳴：（270MHz、CDCl₃）：δ 4.00(br s，1H，C12)，3.6(m，1H，C3) ，1.03(d，3H，C17)，0.9と0.68(s，各々3H，ステロイドの核間メチル)。 6．13．デオキシコール酸−スペルミン結合体の合成 スペルミン（0．3g、1．18mmol）を、ジクロロメタン中のデオキシコール酸の 活性化エステル（0．15g、0．28mmol）とトリエチルアミン（0．1mL、0．71mmol ）の撹拌溶液に添加する。混合物を0．5時間撹拌して沈殿物を観察する。固体を ブフナーロートで濾過する。瀘液を水（10mL）で洗浄する。有機層を濃縮して残 渣（0．18g）を得る。残渣をメタノール性トリフルオロ酢酸で酸性にする。生じ た溶液を逆相クロマトグラフィーにより精製して、ステロイド−ポリアミン結合 体0．14g（80％）を得る。選択した¹H共鳴：（270MHz、CD₃OD）：δ 3.98(br s，1H，C12)，3.55(m，1H，C3)，3.4(br t，2H，アミド結合の隣のスペルミン メチレン)，3.0(br t,10H,アミド結合の隣以外のスペルミンメチレン)、1.03(d ，3H，C17)，0.9と0.68(ｓ，各々3H，ステロイドの核間メチル)。高分解能質量 分析により適正な分子量を確認した。 同様に、コール酸またはケノデオキシコール酸を含むがこれらに限定されない 、他の非グリコシル化両親媒性ステロイド化合物は、エチレンジアミン、ジエチ レントリアミン、スペルミジン、他のポリアルキレンポリアミンなどを含むがこ れらに限定されない、ポリアミン分子と結合体を形成することができる。 6．14．3α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラン −24−酸 THF（150mL）中の上記実施例6．11のコール酸メチル生成物（15mmol）の撹拌 溶液に、95％エタノール（200mL）中のNaOH（10g、250mmol）を添加する。反応 混合 物を48時間還流する。次に反応混合物を濃縮し、残渣を酢酸エチル（300mL）に 溶解し、水（2×250mL）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（2×300mL）、食塩水（ 300mL）で洗浄して乾燥（Na₂SO₄）する。溶媒を留去して、80％収率でグリコス テロイド酸生成物を得る。このカルボン酸基の活性化は以下の通り行われる。 6．15．活性化酸を経由するグリコステロイド−スペルミン結合体の合成 トリエチルアミン（120μL、0．8mmol）を、ジクロロメタン中の実施例6．14 のグリコステロイド酸生成物（0．3g、0．2mmol）、N−ヒドロキシスクシンイミ ド（72mg、0．6mmol）、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（112mg、0．8 mmol）および1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド（1 60mg、0．8mmol）の撹拌溶液に添加する。混合物を12時間撹拌する。次に、反応 混合物を水（50mL）で希釈し、ジクロロメタンで2回抽出する。有機相を合わせ て、MgSO₄で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、活性化エステルの固体残渣0． 33g（96％）を得る。 ジクロロメタン中のこの活性化エステル（0．15g、0．089mmol）とトリエチル アミン（50mL、0．35mmol）の撹拌溶液に、スペルミン（0．3g、0．61mmol）を 添加する。混合物を0．5時間撹拌して、沈殿物を観察する。固体をブフナーロー トで濾過する。瀘液を水（10mL）で洗浄する。有機層を濃縮して残渣（0．18g） を得る。残渣をメタノール性トリフルオロ酢酸で酸性にする。生じた溶液を逆相 クロマトグラフィーにより精製して、グリコステロイド−ポリアミン結合体0．1 4g（85％）を得る。 同様に、モノ−、ジ−、またはトリグリコシル化型（適宜）のコール酸、7− デオキシコール酸、またはケノデオキシコール酸を含むがこれらに限定されない 、他のグリコシル化両親媒性ステロイド化合物は、エチレンジアミン、ジエチレ ントリアミン、スペルミン、スペルミジン、他のポリアルキレンポリアミンなど を含むがこれらに限定されない、ポリアミン分子と結合体を形成することができ る。 6．16．保護グリコステロイド−ポリアミン結合体の脱保護 水素化用フラスコに、メタノール（20mL）とベンゼン（4mL）またはTHFの混合 物中の保護グリコステロイド−スペルミン結合体（0．11g、0．06mmol；上記参 照 ）の溶液、続いてPd（OH）₂触媒とギ酸（1mL）または塩酸を充填する。反応混合 物を水素雰囲気下で50psiで40時間振盪する。触媒をセライト（登録商標）で濾 過し、溶媒を減圧下で留去する。生成物をセファデックス−LH−20ゲル（MeOHで 溶出）で精製して、目的のグリコステロイド−スペルミン結合体を得る。 6．17．12α−（O−グルコシル）デオキシコール酸−スペルミン結合体の合成（ 6、図5参照） 6．17．1．3α−O−CBZ−デオキシコール酸、メチルエステル（1） デオキシコール酸メチル（25g、61mmol）、クロロギ酸ベンジル（17．0g、14m L、100mmol）、ジメチルアミノピリジン（1．22g、10mmol）、ピリジン（30mL） およびジオキサン（150mL）の混合物を室温で3時間撹拌し、追加のクロロギ酸ベ ンジル（12．0g、10mL）を2時間で2回添加して反応を終了させる。クロロギ酸ベ ンジルの総量は41．0g（34mL）である。反応混合物を分液ロートに注ぎ入れて、 水（500mL）と酢酸エチル（300mL）を添加する。有機層を水（500mL×2）で洗浄 し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して油状物を得る。生成物をシリカゲルのフ ラッシュクロマトグラフィー（EA：ヘキサン＝1：1）で精製して、粘性の油状物 として化合物1（24．0g、73％収率）を得る。TLC（EA：ヘキサン＝2：5）Rf 0 ．65。赤外吸収（ニート）：3553(OH)，2943，2869(CH)，1742(C=O)，1453，138 9，1263(芳香族)，944，911，789，747，696cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ7.38(s ，5H)，5.15(s，2H)，3.6(s，3H)，2.0-1.0(m，24H)，0.96(d，3H，J=6Hz)，0.8 6(s，3H)，0.65(s，3H)。 6．17．2．3α−O−CBZ−12α−（テトラ−O−ベンジル−O−グルコシル）デ オキシコール酸、メチルエステル（2） トリフル酸無水物（2．08g、1．26mL、7．4mmol）を無水トルエン（100mL）に 添加し、アセトン−ドライアイス浴で−75℃に冷却し、次にフェニルスルフェニ ル＝テトラ−O−ベンジル−グルコピラノシド（グルコスルホキシド）（5．06g 、7．4mmol）を滴下により添加し、10分で2，5−tert−ブチル−4−メチル−ピ リジン、次に3−O−CBZ−デオキシメチルコール酸エステル1を滴下により添加す る。TLCにより反応の終了が示されれば、−25〜−30℃で重炭酸ナトリウム（飽 和溶液、200mL）で反応を停止する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、＋50〜 ＋60℃で 真空下で濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（EA−ヘキサン、EA20 ％）に付して、粘性の無色の油状物として2（1．8g、29％）を得る。TLC（EA： ヘキサン＝2：5）Rf 0.70。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.3(m，24H)，4.4-5.0(m， 10H)，3.6(s，3H)，3.4-4.0(m，7H)，1.0-1.95(m，40H)，0.92(d，3H)，0.82(s ，3H)，0.56(s，3H)。 6．17．3．12α−（O−グルコシル）デオキシコール酸、メチルエステル（3） 化合物2（1．6g、1．47mmol）を、触媒のPd（OH）₂／C（500mg）と共に酢酸エ チル（15mL）とエタノール（50mL）に溶解する。パーのシェーカーを使用して、 反応混合物を水素下で50psiで24時間加圧する。触媒を濾過して、瀘液から溶媒 を留去して結晶性残渣を得る。この残渣をフラッシュクロマトグラフィー（EtOH ：DCM＝2：8）により精製して、白色の結晶（融点186〜188℃）として化合物3（ 0．65g、収率72％）を得る。TLC（EtoH：DCM＝2：8）Rf 0.5。赤外吸収（ニー ト）：3510，2943，2585，1690，1452，1376，1148，1090，1050cm^-1。¹H NMR ：δ 5.05(d，1H，J=3Hz)，3.9(s，1H)，3.7-3.8(m，3H)，3.6(s，3H)，2.2-1. 4(m，40H)，0.95(d，3H)，0.90(s，3H)，0.72(s，3H)。 6．17．4．12α−（O−グルコシル）デオキシコール酸、ヒドラジド（4） メチルエステル3（0．6g、1．1mmol）をEtOH−ヒドラジン水和物（10：1）5mL 中で3時間還流する。溶媒を留去し、水（50mL）を添加し、次に過剰のヒドラジ ン水和物を除去するために蒸留する。残渣をトルエンと共沸させて、無色の結晶 のヒドラジド4（0．50g、収率80％、融点180〜182℃）を得る。TLC（EtOH：DCM ＝2：5）Rf 0.15。元素分析：C₃₀H₅₂N₂O₃の計算値：N，5.0。実測値：N，4.81 。赤外吸収（KBr）：3393，2907，2863，1633，1543，1452，1372，1144，1016 ，704cm^-1。 6．17．5．12α−（O−グルコシル）デオキシコール酸、アジド（5） ヒドラジド4（0．5g、0．88mmol）を＋1〜＋3℃で10％HCl 5mLに溶解して透 明な溶液を得る。次に水5mL中のNaNo₂(0．14g、2．0mmol）を、この反応混合物 に＋1〜＋5℃で滴下により添加して、アジド5の沈殿物を得る。このアジドは不 安定であり、純粋な形で単離することができない。赤外吸収（KBr）：3485,-329 0，2928，2866，2270，および2134(CON₃)，1690，1651，1451，1376，1147， 1031cm^-1。TLC（EtOH：DCM＝2：5）Rf 0.35。 6．17．6．12α−（O−グルコシル）デオキシコール酸−スペルミン結合体（6 ） アジド5の沈殿物を孔径40〜60μmのガラスフィルターですばやく濾過して、氷 水（10mL）で洗浄する。湿っているうちに、直ちにアジド5の沈殿物を、水10mL 中のスペルミン（0．5g、2．5mmol）とトリエチルアミン（0．5mL）の溶液中に 移す。生じた混合物を30分間撹拌し、次に10分間60℃に加熱し、室温に冷却し、 酢酸で処理してpH4．5〜5．0にする。スペルミン誘導体6の清澄な溶液を、MeOH −水で逆相カラムCHP20を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製す る。スペルミン誘導体6は、MeOH50〜100％の範囲の溶媒勾配で溶出する。この水 −メタノール画分を合わせて濃縮する。HClでpHを3．5〜3．0に調整する。透明 な溶液を凍結乾燥して、白色で吸湿性の高い結晶性スペルミン誘導体6（0．37g 、ヒドラジド4に基づく収率42％、180℃沈む、200℃分解）。TLC（MeOH：DCM＝2 ：8）Rf 0.1；（MeOH：イソプロピルアミン：DCM＝2：2：6）Rf 0.55。赤外吸 収（KBr）：3450，2943，1690，1452，1376，1148，1091，950cm^-1。¹H NMR（D₂ O）：δ 4.95(d，1H，J=3Hz)，3.9(s，1H)，3.65(m，3H)，3.4(m，3H)，3.0(m ，3H)，1.0-2.4(m，60H)，0.95(d，3H)，0.90(s，3H)，0.62(s，3H)。元素分析 ：C₄₀H₇₄N₄O₈・3HCl・10H₂O計算値：C，46.7; H，8.91; N，5.45; C1，10.2 。実測値：C，56.02; H，8.91; N，5.66; Cl，9.47。分子量：739.5。実測値 ：M+Na⁺=763。 6．18．7α−（O−グルコシル）ケノデオキシコール酸−スペルミン結合体（6） の合成（図6参照） 6．18．1．3α−（O−アニソイル）ケノデオキシコール酸、メチルエステル（ 1） ピリジン（15mL）中のケノデオキシコール酸メチル（5．0g、12．3mmol）、塩 化アニソイル（2．3g、2．0mL、13．5mmol）、ジメチルアミノピリジン（0．8g 、6．5mmol）の混合物を100℃で3時間加熱する。反応混合物を分液ロートに注ぎ 入れて、水（200mL）と酢酸エチル（300mL）を添加する。有機層を5％HCl（100m L）、水（200mL）、重炭酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥する。時 々生 成物の沈殿物が層の間に現われる。沈殿物は濾過して、酢酸エチルの留去後に得 られる生成物と合わせることができる。総量は5．2g（収率78％、EtOHからの融 点188〜190℃）。TLC（EA：ヘキサン＝2:5）Rf 0.6。赤外吸収（KBr）：3513(O H)，2938，2851，1730(COOCH₃)，1712(アニス-CO)，1607，1579，1509，1451，1 279，1165，1100，963，770cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 8.03(d，2H)，7.96(d ，2H)，4.85(s，1H)，3.85(s，3H)，3.65(s，3H)，2.0-1.0(m，24H)，0.96(d，3 H)，0.90(s，3H)，0.66(s，3H)。 6．18．2．3α−（O−アニソイル）−7α−（テトラ−O−ベンジル−O−グル コシル）ケノデオキシコール酸、メチルエステル（2） トリフル酸無水物（2．1g、1．27mL、7．4mmol）を無水トルエン（100mL）に 添加し、アセトン−ドライアイス浴で−72〜−75℃に冷却する。無水トルエン20 mL中のフェニルスルフェニルグルコシド（5．1g、7．4mmol）を滴下により添加 し、次に10分でトルエン（15mL）中の2，6−ジ−tert−ブチル−4−メチル−ピ リジン（1．52g、7.4mmol）を添加し、5分でアニソイル誘導体1（無水トルエン3 0mL中の3．2g、5．9mmol）を滴下により添加する。TLCにより出発物質の消失が 示されたら、重炭酸ナトリウムの飽和溶液（150mL）を注ぎ入れて、混合物を分 液ロートに移し入れる。有機層を水（20mL）、食塩水（50mL）で洗浄し、硫酸ナ トリウムで乾燥し、濃縮して粘性の油状物を得る。これをフラッシュクロマトグ ラフィー（EA−ヘキサン）により精製し；生成物は20％酢酸エチルで溶出する。 粘性の無色の油状物として生成物（4．0g、収率62％）を得る。TLC（EA：ヘキサ ン＝2：5）Rf 0.65。赤外吸収（ニート）：2950，2870，1690，1745，1610，14 50，1275，1160，1050，970，775cm^-1。 6．18．3．3α−（アニソイル）−7α−（O−グルコシル）ケノデオキシコー ル酸、メチルエステル（3） 上記で得られた油状物（4．0g、3．7mmol）を、触媒（Pd（OH）₂／C、2．0g） と共に、酢酸エチル（15mL）とエタノール（75mL）に溶解する。ギ酸（2．0mL） を混合物に添加する。混合物を、0．5Lのパーの装置中で50psiで24時間水素化に 付す。触媒を濾過し、瀘液から溶媒を留去して、3の結晶性残渣（1．8g、収率69 ％）を得る（融点258〜260℃（EtOHから）、分解なし）。TLC（MeOH：DCM＝1：9 ） Rf 0.35。赤外吸収（KBr）：3439(OH)，2863，1742,(COOCH₃)，1684(アニス-CO )，1606，1284，1260，1022，967，773cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.9(d，2H ，J=6Hz)，6.8(d，2H，J=6Hz)，4.95(d，1H，J=3Hz)，4.75(s，1H)，3.80(s，3H )，3.58(s，3H)，3.3-3.5(m，4H)，2.0-1.1(m，30H)，0.92(s，3H)，0.88(d，3H )，0.62(s，3H)。 6．18．4．7α−（O−グルコシル）ケノデオキシコール酸、ヒドラジド（4） メチルエステル3（1．7g、3．0mmol）をEtOH−ヒドラジド水和物混合物（20mL ＋6mL）中で2時間還流する。生成するヒドラジド4の結晶（0．45g、融点238〜24 0℃）を室温で溶液から分離して濾過する。母液を濃縮してさらにヒドラジド4（ 0．65g）を得る。全収量1．1g（70％）。TLC（MeOH：DCM＝2：8）Rf 0.05。赤 外吸収（KBr）：3378(NH，OH)，2927，1697(CONH)，1601，1260，1020，980，77 0cm^-1。 6．18．5．7α−（O−グルコシル）ケノデオキシコール酸、アジド（5） ヒドラジド4（0．8g、1．4mmol）を10％HCl 10mLに溶解し、＋3〜＋5℃に冷 却して、次に水5．0mL中のNaNO₂（0．21g、3mmol）を滴下により添加して、アジ ド5の沈殿物を得る。この化合物は不安定であり、純粋な物質として単離するこ とができない。TLC（EtOH：DCM＝2：8）Rf 0.45。赤外吸収（KBr）：3490-3300 ，2930，2850，2260と2133(CON₃)，1700，1640，1450，1366，1147，1050cm^-1。 6．18．6．7α−（O−グルコシル）ケノデオキシコール酸−スペルミン結合体 （6） アジド5の沈殿物をガラスフィルター（孔径40〜60μm）ですばやく濾過し、氷 水（5mL）で洗浄し、湿ったまま直ちに水10mL中のスペルミン（0．5g、2．5mmol ）とトリエチルアミン（0．5mL）の溶液に移し入れる。混合物を30分間撹拌し、 次に10分間60℃に加熱し、次いで室温に冷却する。酢酸を使用してpHを4．5〜5 ．0に調整する。不溶性の不純物を濾過し、スペルミン6の清澄な瀘液を、逆相カ ラムCHP−20を使用してフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。スペル ミン6は、MeOH40〜100％の範囲の溶媒勾配で溶出する。水−メタノール画分を合 わせて、蒸発乾固する。水（10mL）と濃HCl（0．2mL）を添加し、透明な溶液を 凍結乾 燥して、白色で吸湿性の高い結晶性のスペルミン6（0．50g、ヒドラジド4に基づ く収率42％、融点162〜164℃分解を伴う）。TLC（MeOH：i−PrOH：DCM＝2：2：6 ）Rf 0.6。赤外吸収（KBr）：3347，2934，2865，1652(CONH)，1457，1379，12 56，1026，772cm^-1。¹H NMR（D₂O）：δ 4.85(d，1H，J=3Hz)，3.5-3.8(m，8H )，3.5(m，6H)，3.1(m，2H)，2.9-3.0(m，10H)，2.1-1.0(m，40H)，0.796(m，6H )，0.551(s，3H)。元素分析：C₄₀H₇₄N₄O₃・3HCl・10H₂O計算値：C，46.7; H，9 .44; N，5.45; Cl，10.37。実測値：C，60.8; H，8.97; N，4.60; Cl，6.0 9。分子量：847.5。質量分析（Fab）：M-HCl+H⁺=815。実測値：815。 6．19．3α，7α，12α−トリヒドロキシ−5β−コラン−24−酸、N−オキシス クシンイミド（1）（図7参照） 無水コール酸（8．16g、20mmol）、ジシクロヘキセイルカルボジイミド（4．3 3g、21mmol）およびN−ヒドロキシスクシンイミド（2．417g、21mmol）の混合物 を無水塩化メチレン（200mL）中で室温で6時間撹拌する。反応混合物を濾過し、 瀘液を濃縮する。残渣をフロロシル（florosil）のフラッシュクロマトグラフィ ー（EtOH：CH₂Cl₂＝1：19）により精製して、白色の泡状物として化合物1（8g、 79％収率）を得る（融点92〜95℃）。TLC（EtOH：CH₂Cl₂＝1：19）Rf 0.6。赤 外吸収（KBr）：3385(br)，2933，2861，2118，1814，1783，1738，1376，1208 ，1073cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 3.94(s，1H)，3.81(s，1H)，3.42(m，1H) ，2.82(br，4H)，2.30-1.00(m，24H)，0.99(d，1H，J=5.7Hz)，0.862(s，3H)，0 .67(s，3H)。Fab質量分析：528(M+Na)⁺。 6．19．1．3α，7α，12α−トリヒドロキシ−5β−コラン−24−酸、N−9− ジアザ−12−アミノ−ドデシル）アミド（2） 無水塩化メチレン（20mL）中のスペルミン（303mg、1.5mmol）とトリエチルア ミン（1mL）の撹拌溶液に、無水塩化メチレン（20mL）中のコール酸N−オキシス クシンイミド1（505mg、1mmol）を10分間で滴下により添加する。次にこの溶液 を室温で3時間撹拌する。反応混合物を濾過して瀘液を濃縮する。残渣をCHP−20 逆相樹脂を使用してフラッシュクロマトグラフィー（水および次に75％MeOH）に より精製して、白色の泡状物として2（360mg、52％収率）を得る（融点140〜145 ℃ ）。TLC（MeOH：CH₂Cl₂：イソプロピルアミン＝4．5：4．5：1）Rf 0.4。赤外 吸収（KBr）：3350(br)，2934，2859，1685，1644，1547，1449，1377，1234，1 207，1078，1046cm^-1。¹H NMR（DMSO−d₆とD₂O 2滴）：δ 3.78(s，1H)，3.61 (s，1H)，3.40-2.80(m，9H)，2.42-0.77(m，42H)，0.55(s，3H)。Fab質量分析： 615(M+Na)⁺。 6．20．3α，12α−ジヒドロキシ−7−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N−オ キシスクシンイミド（3）（図8参照） 無水デオキシコール酸（2．356g、6mmol）、ジシクロヘキセイルカルボジイミ ド（1．444g、7mmol）およびN−ヒドロキシ−スクシンイミド（0．806g、7mmol ）の混合物を無水塩化メチレン（200mL）中で室温で6時間撹拌する。反応混合物 を濾過し、瀘液を濃縮する。残渣をフロロシル（florosil）のフラッシュクロマ トグラフィー（EtOH：CH₂Cl₂＝1：9）により精製して、白色の泡状物として化合 物3（1．764g、60％収率）を得る（融点75〜80℃）。TLC（EtOH：CH₂Cl₂＝1：19 ）Rf0.5。赤外吸収（KBr）：3364(br)，2934，2862，1814，1783，1738，1655， 1627，1449，1376，1208，1068cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 3.97(s，1H)，3.6 2(m，1H)，2.82(br，4H)，2.70-0.83(m，30H)，0.67(s，3H)。Fab質量分析：512 (M+Na)⁺。 6．20．1．3α，12α−ジヒドロキシ−7−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N −（12−アミノドデカン）アミド（4） 無水塩化メチレン（25mL）中のドデカン−1，12−ジアミン（600mg、3mmol） とトリエチルアミン（1mL）の撹拌溶液に、無水塩化メチレン（25mL）中のデオ キシコール酸N−オキシスクシンイミド（3）（980mg、2mmol）を10分間で滴下に より添加する。内容物を室温で14時間撹拌する。反応混合物を濾過し、瀘液を濃 縮する。残渣をCHP−20逆相樹脂を使用してフラッシュクロマトグラフィー（20 ％、40％、60％、80％MeOHおよび次にMeOH）により精製して、白色の泡状物とし て7（575mg、50％収率）を得る（融点118〜120℃）。TLC（MeOH：CH₂Cl₂：イソ プロピルアミン＝4．5：4．5：1）Rf 0.8。赤外吸収（KBr）：3365(br)，2928 ，2857，1654，1647，1534，1449，1376，1044cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 3. 97(s，1H)，3.62(m，1H)，3.21(q，1H，J=6.6Hz)，2.70-1.00(m，48H)， 0.98(d，1H，J=6.0Hz)，0.90(d，1H)，0.67(s，3H)。Fab質量分析：622(M+2Na)⁺ 。 6．21．3α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O−ベ ンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−オキシスクシンイミ ド（5）（図9参照） 無水塩化メチレン中の無水7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸（1．452g、1mmol）、N −ヒドロキシスクシンイミド（126mg、1．1mmol）およびDCC（226mg、1．1mmol ）の溶液を室温で3時間撹拌する。この反応混合物を濾過して瀘液を濃縮する。 残渣をフロロシル（florosil）のカラムによるフラッシュクロマトグラフィー（ EtOH：CH₂Cl₂＝1：19）により精製して、白色の泡状物として化合物5（1．40g、 90％収率）を得る（融点63〜65℃）。TLC（EtOH：CH₂Cl₂＝1：19）Rf 0.5。赤 外吸収（KBr）：3062，3030，2928，2863，2117，1813，1784，1740，1685，149 6，1453，1363，1206，1070cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.40-6.90(m，40H)， 5.10-3.10(m，33H)，2.80(br s，4H)，2.62-0.84(m，30H)，0.73(s， 3H)。Fa b質量分析：1572(M+Na)⁺。 6．21．1．3α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ− O−ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ −12−アミノドデカン）アミド（6） 無水塩化メチレン（50mL）中のスペルミン（0．808g、4mmol）とトリエチルア ミン（3mL）の撹拌溶液に、塩化メチレン（50mL）中の化合物5（5．16g、3．33m mol）を添加して4時間撹拌する。反応混合物を濾過し、瀘液を水（2×50mL）で 洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）して濃縮する。残渣をCHP−20逆相樹脂のカラムによる フラッシュクロマトグラフィー（水、次にメタノール）により精製して、白色の 泡状物として化合物6（4．9g、85％収率）を得る（融点58〜60℃）。TLC（MeOH ：CH₂Cl₂：イソプロピルアミン＝4．5：4．5：1）Rf 0.2。赤外吸収（KBr）：3 063，3030，2928，2863，1655，1628，1496，1452，1362，1208，1147，1070，1 028cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.40−6.90(m，40H)，6.62(br s，1H)，5.03 -3.20(m，33H)，3.00-0.86(m，55H)，0.72(s，3H)。Fab質量分析：1659 (M+Na)⁺。元素分析：C₁₀₂H₁₃₂O₁₄N₄・H₂Oの計算値：C，74.16; H，8.19; N，3 .35。実測値：C，73.53; H，8.24; N，3.72。 6．21．2．3α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コ ラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（7） THF（50mL）中の化合物6（2．455g、1．5mmol）と1N HCl（25mL）の溶液に、 20％水酸化パラジウム担持炭素（2g、パールマン（Perlman）触媒）を添加する 。混合物を50psiで6時間水素化分解に付す。反応混合物を砂とメンブランフィル ターで濾過して濃縮する。残渣を水（5mL）に溶解して濾過する。瀘液をCHP−20 逆相カラムによるフラッシュクロマトグラフィー（水、次にMeOH：水（1：9）） により精製して、白色の泡状物として7（1．078g、70％収率）を得る（融点83〜 85℃）。TLC（トリフルオロ酢酸：水＝1：9）Rf 0.35。赤外吸収（KBr）：3365 (br)，2938，2867，1638，1629，1561，1545，1459，1150，1075，1048，1025cm^-1 。¹H NMR（D₂O）：δ 5.06(d，1H，J=3.6Hz)，4.85(d，1H，J=3.6Hz)，3.95 (br s，1H)，3.78-2.88(m，21H)，2.28-0.76(m，46H)，0.64(s，3H)。Fab質量 分析：940(M+Na)⁺。元素分析：C₃₆H₈₄O₁₄N₄・3HCl・5H₂Oの計算値：C，49.66; H，8.52; N，5.04; Cl，9.44。実測値：C，49.68; H，8.60; N，5.06; Cl ，9.65。 6．22．種々のデオキシコール酸およびケノデオキシコール酸のポリ（アミノア ルキレン）アミドの調製（図10参照） 6．22．1．3α，12α−ジヒドロキシ−7−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N −（3，6，9−トリアザ−11−アミノウンデシル）アミド（1） DMF（5mL）中のテトラエチレンペンタミン（0．378g、2．5mmol）とトリエチ ルアミン（0．3mL）の溶液に、DMF5mL中のデオキシコール酸N−オキシスクシン イミド（1．0g、2mmol）を10分間で滴下により添加する。この溶液を室温で一晩 撹拌して水（20mL）中に注ぎ入れる。得られた沈殿物を冷水（5OmL）で洗浄し、 2％HCl10mLに溶解して濾過する。溶液をCHP−20逆相カラムに注ぎ入れて、40〜8 0％MeOHの溶媒勾配系を使用して溶出して、凍結乾燥後、白色の粉末として標題 化合物の三塩酸塩、五水和物1．1g（72％収率）を得る（融点130〜132℃）。TLC （MeOH：i−PrNH₂：DCM＝2：2：6）Rf 0.6。赤外吸収（KBr）：3419，2934，16 42(C ONH-)，1553，1454，1038cm^-1。¹H NMR（D₂O）：δ 3.88(s，1H)，2.9-3.3(m ，16H)，1.2-2.4(m，42H)，0.88(d，3H)，0.78(s，3H)，0.55(s，3H)。Fab質量 分析：696(ベース-3HCl+Na⁺)。元素分析：C₃₂H₆₁N₅O₃・3HCl・5H₂Oの計算値：C ，50.3; H，9.69; N，9.17; Cl，13.95。実測値：C，51.5; H，9.04; N，1 0.1; Cl，10.9。 6．22．2．3α，12α−ジヒドロキシ−7−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N −（3，6，9，12−テトラアザ−14−アミノテトラデシル）アミド（2） DMF（5mL）中のペンタエチレンヘキサミン（0．58g、2．5mmol）とトリエチル アミン（0．3mL）の溶液に、DMF5mL中のデオキシコール酸N−オキシスクシンイ ミド（1．0g、2mmol）を10分間で滴下により添加する。この溶液を室温で一晩撹 拌し、次に水（50mL）に注ぎ入れて沈殿物を得る。液相をデカントする。半固体 の沈殿物を冷5％NaOH（10mL×2）と水（10mL）で連続して洗浄し、10％酢酸10mL に溶解し、40〜100％MeOHの溶媒勾配系を使用してCHP−20逆相カラムでのフラッ シュクロマトグラフィーにより精製する。生成物を含有する画分を合わせて、減 圧下で溶媒を留去し、2％HClに溶解し、凍結乾燥して、白色の粉末として標題化 合物0．75g（42％収率）を得る（融点140〜142℃）。TLC（MeOH：i−PrNH₂：DCM ＝2：2：6）Rf 0.65。赤外吸収（KBr）：3425，2932，1770(COOH)，1643(CONH) ，1552(COO^-)，1454，1032cm^-1。¹H NMR（D₂O）：δ 3.92(s，1H)，2.6-3.6(m ，20H)，1.0-1.6(m，30H)，0.83(d，3H)，0.75(s，3H)，0.55(s，3H)。Fab質量 分析：863(M+H⁺)。元素分析：C₃₄H₆₆N₆O₃・2HCl・3AcOHの計算値：C，55.8; H ，9.28; N，9.70; Cl，8.2。実測値：C，59.0; H，9.40; N，8.3; Cl，6.6 。 6．22．3．3α，7α−ジヒドロキシ−12−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N −（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（3） DMF5mL中のスペルミン（0．8g、2mmol）とトリエチルアミン（0．3mL）の溶液 に、DMF5mL中のケノデオキシコール酸N−オキシスクシンイミド（1．0g、2mmol ）を滴下により添加する。混合物を室温で一晩撹拌し、次にDCM（100mL）中に注 ぎ入れる。ヒドロキシスクシンイミドの沈殿物を濾過し、瀘液から溶媒を留去し て液相を得て、これを水（100mL）中に注ぎ入れる。生成物の沈殿物が得られる 。こ れをMeOH（5mL）に溶解して、CHP−20逆相カラムを通す。30％MeOHの溶媒系を使 用して生成物を溶出する。溶媒を蒸発により除去し、残渣をトリフルオロ酢酸1m Lに溶解する。生じた溶液を水で10mLまで希釈し、濾過し、次に瀘液を凍結乾燥 して、固体0．9g（50％収率）を得る（融点96〜100℃）。生成物は水に可溶性で ある。ケノデオキシコール酸−スペルミン結合体のトリフルオロ酢酸塩の5％溶 液は室温で約12〜24時間安定であり、その後塩基の沈殿物がスラリーとして分離 する。TLC（MeOH：i−PrNH₂：DCM）Rf 0.7。赤外吸収（KBr）：3406，2939，28 69，1778(COOH)，1680(CONH-)，1553，1458，1196，834，722cm^-1。¹H NMR（D₂ O）：δ 3.75(s，1H)，3.4(s，1H)，2.8-3.15(m，12H)，2.2-1.2(m，39H)，0.9 (d，3H)，0.86(s，3H)，0.55(s，3H)。Fab質量分析：(M+Na⁺)=598。元素分析：C₃₄ H₆₄N₄O₃・3CF₃COOHの計算値：C，52.5; H，7.29; N，6.09。実測値：C，53. 5; H，7.20; N，4.95。 6．23．3β−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラン−24 −酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド・HCl塩、4（図11参照 ）の調製 6．23．1．3β−アジド−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−オキシスクシンイ ミド（1） 無水塩化メチレン中の無水3β−アジド−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’ −テトラ−O−ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸（4．443g 、3mmol）、N−ヒドロキシスクシンイミド（406mg、3．5mmol）およびDCC（722m g、3．5mmol）の溶液を室温で3時間撹拌する。反応混合物を濾過し、瀘液を濃縮 する。残渣をフロロシル（florosil）カラムによるフラッシュクロマトグラフィ ー（EtOAc：ヘキサン＝1：3）により精製して、白色の泡状物として化合物1（4g 、80％収率）を得る（融点64〜66℃）。TLC（EtOAc：ヘキサン＝3：7）Rf 0.3 。赤外吸収（KBr）：3325，3088，3062，3030，2924，2867，2099，1815，1785 ，1742，1206，1070cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7.40-6.90(m，40H)，5.02(q ，2H，J=3.6Hz)，4.90-3.42(m，31H)，2.80(br s，4H)，2.62-0.90(m，30H)，0 .75(s，3H)。 6．23．2．3β−アジド−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−1 2−アミノドデシル）アミド（2） 無水塩化メチレン（75mL）中のスペルミン（0．303g、1．5mmol）とトリエチ ルアミン（3mL）の撹拌溶液に、塩化メチレン（75mL）中の化合物1（1．579g、1 mmol）を添加して4時間撹拌する。この反応混合物を濾過して、瀘液を水（2×50 mL）で洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）して濃縮する。残渣をCHP−20逆相樹脂によるフ ラッシュクロマトグラフィー（溶離液：水および次にメタノール）により精製し て、白色の泡状物として化合物2（1.46g、86％収率）を得る（融点60〜62℃）。 TLC（MeOH：CH₂Cl₂：イソプロピルアミン＝4．5：4．5：1）Rf 0.5。赤外吸収 （KBr）：3432(br)，3087，3062，3030，2925，2865，2098，1670，1663，1656 ，1640，1630，1496，1452，1364，1071，1028cm^-1。¹H NMR（CDCl₃）：δ 7. 40-6.90(m，40H)，6.30-6.10(m，1H)，5.04-3.10(m，33H)，2.80-0.83(m，55H) ，0.73(s，3H)。 6．23．3．3β−アミノ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−1 2−アミノドデシル）アミド（3） エタノール（10mL）中の2（0．999g、0．6mmol）とラネーNi（500mg）の撹拌 混合物に、エタノール（10mL）中のヒドラジン水和物（0．2mL、4mmol）を10分 間で滴下により添加する。混合物を2時間撹拌し、次いで濾過する。瀘液を真空 下（アスピレーターポンプ）で濃縮する。残渣を水（3×50mL）で洗浄し、真空 下で乾燥して、白色の泡状物として3−アミノ化合物3（920mg、94％）を得る（ 融点55〜57℃）。TLC（MeOH：CH₂Cl₂：イソプロピルアミン＝4．5：4．5：1）Rf 0.5。赤外吸収（KBr）：3415(br)，3087，3062，3029，2925，2864，1669，16 62，1654，1647，1630，1496，1453，1362，1086，1070，1028cm^-1。¹H NMR（C DCl₃）：δ 7.40-6.90(m，40H)，6.30-6.10(m，1H)，5.00-3.00(m，33H)，2.80 -0.78(m，55H)，0.66(s，3H)。 6．23．4．3β−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラン −24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド・HCl塩（4） THF（25mL）と水（10mL）中の化合物3（0．91g、0．56mmol）と1N HCl（8mL 、8mmol）の溶液に、20％水酸化パラジウム担持炭素（0．9g、パールマン（Perl man）触媒）を添加し、混合物を50psiで14時間水素化分解に付す。反応混合物を 砂とメンブランフィルターで濾過して、次に濃縮する。残渣を水（5mL）に溶解 して濾過する。瀘液をCHP−20逆相カラムによるフラッシュクロマトグラフィー （溶離液：水、次に2％MeOH）により精製して、白色の粉末として4（260mg、44 ％収率）を得る（融点125〜127℃）。TLC（トリフルオロ酢酸：水＝1：9）Rf 0 .3。赤外吸収（KBr）：3395(br)，2940，1640，1630，1450，1150，1075，1047 ，1023cm^-1。¹H NMR（D₂O）：δ 5.09(br s，1H)，4.87(br s，1H)，3.98(b r s，1H)，3.78-2.88(m，21H)，2.60-1.00(m，40H)，0.91(s，3H)，0.82(d，3H ，J=5.1Hz)，0.66(s，3H)。 ここで、本発明はまた、詳しくは、3α，12α−ジヒドロキシ−7−デオキシ− 5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（デオ キシコール酸−スペルミン結合体）；3α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（1’α −グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシ ル）アミド（ビス（グリコシル化）コール酸−スペルミン結合体）；3α−ヒド ロキシ−12α−（1’α−グルコシル）−7−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N −（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド（12α−（O−グルコシル）デ オキシコール酸−スペルミン結合体）；3α−ヒドロキシ−7α−（1’α−グル コシル）−12−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミ ノドデシル）アミド（7α−（O−グルコシル）ケノデオキシコール酸−スペルミ ン結合体）；3α，7α，12α−トリヒドロキシ−5β−コラン−24−酸、N−（4 ，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド；3α，12α−ジヒドロキシ−7−デ オキシ−5β−コラン−24−酸、N−（12−アミノドデカン）アミド；3α−ヒド ロキシ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O−ベンジル−1’α− グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデカン ）アミド；3α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラ ン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル）アミド；3α，12α−ジ ヒドロキシ−7−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N−（3，6，9−トリアザ−11 −アミノウンデシ ル）アミド；3α，12α−ジヒドロキシ−7−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N −（3，6，9，12−テトラアザ−14−アミノテトラデシル）アミド；3α，7α− ジヒドロキシ−12−デオキシ−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12− アミノドデシル）アミド；3β−および3α−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グ ルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジアザ−12−アミノドデシル） アミド；3β−および3α−アミノ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テト ラ−O−ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸、N−（4，9−ジ アザ−12−アミノドデシル）アミド、本明細書に記載されるこれらの合成中間体 、およびこれらの薬剤学的に許容しうる塩を含む、非グリコシル化、モノグリコ シル化、およびビス（グリコシル化）胆汁酸−ポリ（アミノアルキレン）または アミノアリーレン結合体から選択される種々の化合物をも包含する。 6．24．ケノデオキシコール酸、ペンタアミノテトラエチレンアミド、塩酸塩（H ）の調製 DCM100mL中のテトラエチレンペンタアミン塩基（1．90g、10mmol）とトリエチ ルアミン（1．0g、10mmol）の溶液に、DCM（ジクロロメタン、50mL）中のN−（ ケノデオキシコロイルオキシ）スクシンイミド（2．46g、5mmol）を添加し、こ の溶液を室温で48時間撹拌する。反応混合物をDCM100mLで希釈し、水（2×100mL ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して蒸発乾固する。残渣を10％酢酸25mLに溶 解して濾過する。透明な瀘液をMeOH−水でCHP−20カラムで精製する。40％〜80 ％のMeOHで生成物は溶出する。合わせた画分を10％HCl（5mL）で酸性にする。真 空下でメタノールを留去し；水溶液の残りを凍結乾燥して、ケノデオキシコール 酸のペンタアミノテトラエチレンアミド2．84g（収率77％、融点200〜203℃分解 ）を得 る。TLC Rf（MeOH：i−PrNH₂：DCM）0.8。赤外吸収（KBr）：3350，2974，1665 ，1635，1551，1539，1460，1470，1377，1077，978，766cm^-1。¹HNMR（D₂O）： 3.78(s，1H)，2.9-3.4(m，16H)，1.8-1.2(m，39H)，0.85(d，3H)，0.76(s，3H) ，0.55(s，3H)。Fab質量分析：(M+H⁺)：564。ケノデオキシコール酸、ペンタア ミノテトラエチルアミドの質量スペクトルは563である。元素分析：C₃₂H₆₁N₅O₃ ・4HCl・2H₂Oの計算値：C，51.54; H，9.26; N，9.39; Cl，19.06。実測値： C，50.48; H，8.84; N，8.86; Cl，19.7。 6．25．ケノデオキシコール酸、ヘキサアミノペンタエチレンアミド、塩酸塩（I ） DCM50mL中のペンタエチレンヘキサミン（2．32g、10mmol）とトリエチルアミ ン（1．0g、10mmol）の溶液に、DCM（50mL）中のN−（ケノデオキシコロイルオ キシ）スクシンイミド（2.45g、5mmol）を添加する。透明な溶液を室温で48時間 撹拌する。反応混合物をDCM（150mL）で希釈し、水（2×100mL）で洗浄し、硫酸 ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発乾固し、残渣を10％酢酸（25mL）に溶解して 、CHP−20（水−MeOH）で精製する。30％〜80％のMeOHで生成物が流出する。合 わせた画分を10％HClで酸性にし、凍結乾燥して、白色の吸湿性粉末2．1g（収率 60％）を得る（融点168〜170℃）。TLC、Rf 0.30（MeOH：i−PrNH₂：DCM＝1：1 ：3）。赤外吸収：3450，3350，3267，2974，1665，1649，1635，1539，1460 ，1377，1077，978cm^-1。¹H NMR（D₂O）：3.78(s，1H)，3.2-3.5(m，20H)，1.8 -1.2(m，28H)，0.85(d，3H)，0.79(s，3H)，0.55(s，3H)。Fab質量分析：(M+H₂O⁺ )622。元素分析：C₃₄H₆₆N₆O₃・3HCl・H₂Oの計算値：C，55.5; H，9.66; N，1 1.4; Cl，14.4。実測値：C，55.7; H，9.08; N，9.36; Cl，15.6。 6．26．コール酸、ペンタアミノテトラエチレンアミド、塩酸塩（J）の調製 DCM（25mL）中のテトラエチレンペンタミン（0．8g、5mmol）とTEA（0．3g、3 mmol）の溶液に、N−（コロイルオキシ）−スクシンイミド（1．0g、2．0mmol） を添加する。透明な溶液を室温で48時間撹拌し、反応混合物をDCM（100mL）で希 釈し、冷水（20mL）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して蒸発乾固する。残渣を 5％AcOH20mLに溶解する。CHP−20逆相カラムでMeOH−水で精製を行う。生成物は MeOH40％〜80％で溶出する。目的化合物の画分を合わせて、メタノールを留去し 、10％HCl 10mLを添加する。凍結乾燥により、純粋な物質0．70g（収率50％） を得る（融点135〜140℃）。TLC Rf（MeOH：i−PrNH₂：DCM＝1：1：3）0.8。赤 外吸収（KBr）：3406，2937，1640(C=O)，1556，1453，1376，1023cm^-1。NMR ¹ H（D₂O）：3.8(s，1H)，3.65(s，1H)，3.0-3.3(m，16H)，2.0-1.1(m，26H)，0.7 8(d，3H)，0.72(s，3H)，0.48(s，3H)。Fab質量分析：(M+H⁺)580。質量スペクト ルは579である。元素分析：C₃₂H₆₁N₅O₄・5HClの計算値：C，50.4; H，8.66; N，9.18; Cl，23.29。実測値：C，47.27; H，8.31; N，8.57; Cl ，25.63。 6．27．コール酸、ヘキサアミノペンタエチレンアミド、塩酸塩（K）の調製 DCM（10mL）中のペンタエチレンヘキサミン（0．9g、5．5mmol）とトリエチル アミン（0．3g、3mmol）の溶液に、そのままのN−（コロイルオキシ）スクシン イミド（1．0g、2．0mmol）を室温で撹拌しながら添加する。この反応混合物を 撹拌しながら室温で48時間維持する。48時間経過後、反応混合物は半固体混合物 に変化し、これをDCM150mLで希釈し、冷水（2×50mL）で洗浄し、乾燥して乾固 するまで蒸留し、10％AcOH 10mLに溶解し、不溶性物質から濾過し、逆相カラム CHP−20でメタノール−水により精製する。生成物は40〜70％のメタノールで流 出する。合わせた妥当な画分をメタノールから蒸留して、10％HCl（5mL）を添加 する。凍結乾燥後、0．96g（55％収率）が得られた。融点230℃（分解）。TLC、 Rf 0.85（DCM：MeOH：iPrNH₂＝5：1：1）。赤外吸収：3393，2937，1646(C=O) ，1550，1483，1376，1072，1028，774cm^-1。¹H NMR（D₂O）：3.83(s，1H)，3. 67(s，1H)，3.1-3.5(m，21H)，2.0-1.4(m，26H)，0.78(d，3H)，0.68(s，3H)，0 .48(s，3H)。Fab質量分析：(M+H⁺)623。元素分析：C₃₂H₆₁N₅O₄・5HClの計算値： C，50.4; H，8.66; N，9.18; Cl，23.29。実測値：C，47.27; H，8.31; N ，8.57; Cl，25.63。 6．28．リトコール酸、ヘキサアミノペンタエチレンアミド、酢酸塩（L）の調製 N−（リトコロイルオキシ）スクシンイミド（1．0g、2．1mmol）を、DCM（50m L）中のペンタエチレンヘキサミン（0．73g、3．2mmol）とトリエチルアミン（0 ．21g、2．1mmol）に添加する。反応混合物を撹拌しながら室温で48時間維持し 、DCM（100mL）で希釈し、水（2×100mL）で洗浄して乾燥する。溶媒を留去する 。残渣を、激しく撹拌しながら5時間で10％AcOH 50mLに溶解する。この濁った 溶液をMeOH−水での逆相カラムの精製に付す。凍結乾燥後、生成物1．1g（収率6 0％）が得られる。融点94℃。TLC、Rf 0.65（DCM：MeOH：iPrNH₂＝5：1：1）。 赤外吸収（KBr）：3390，2933，2862，1648(C=O)，1555，1402，1075，656cm^-1 。NMR ¹H（D₂O）：3.2-2.6(m，19H)，1.7-1.0(m，29H)，0.70(s，6H)，0.42(s ，3H)。Fab質量分析：(597)。元素分析：C₃₄H₆₆N₆O₂・5AcOHの計算値：C，59.3; H，9.66; N，9.44。実測値：C，58.2; H，9.51; N，10.9。 6．29．3−α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸−N−［3，6，9，12−テ トラ−アザ−15−アミノ−ペンタデカン］−アミド（2）の調製 無水塩化メチレン（50mL）中のペンタエチレン−ヘキサミン（367mg、1．5mmo l）とトリエチルアミン（2mL）の撹拌溶液に、塩化メチレン（50mL）中の化合物 1（1．549g、1mmol）を滴下により添加して48時間撹拌する。反応混合物を濾過 し、瀘液を濃縮する。残渣をCHP−20逆相樹脂のフラッシュクロマトグラフィー （溶離液：水から徐々に90％メタノールまで上昇させる）で精製する。生成物は 90％メタノール水溶液画分から得られ、白色の泡状物として化合物2（950mg、57 ％収率）を得る（融点78〜80℃）。TLC Rf（溶媒／MeOH：CH₂Cl₂：イソプロピ ルアミン＝4：4：2）0.1。赤外吸収（KBr）：3500(br)，3086，3061，3030，292 9，2864，1699，1652，1453，1363，1155，1071，1028cm^-1。¹H NMR（CDCl₃） ：δ 7.40-6.90(m，40H)，5.03-3.10(m，33H)，2.90-0.66(m，65H)。Fab質量分 析：1674(M+Na)⁺。 6．30．3−α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラ ン−24−酸−N−［3，6，9，12−テトラ−アザ−15−アミノ−ペンタデカン］− アミド（M、上記）の調製 THFと水（2：1、30mL）中の化合物2（333mg、0．2mmol）と1N HCl（3mL、3mm ol）の溶液に、20％水酸化パラジウム担持炭素（300mg、パールマン触媒）を添 加して、混合物を50PSIで15時間水素化分解に付す。反応混合物を砂とメンブラ ンフィルターで濾過して濃縮する。残渣を水（5mL）に溶解して濾過する。瀘液 をCHP−20逆相カラムのフラッシュクロマトグラフィー（水、次にMeOH：水＝1： 19、1：4および2：3；生成物は20％メタノール水溶液画分に見い出される）で精 製する。この方法により白色の泡状物としてM（110mg、49％収率）を得る（融点 180〜82℃）。TLC Rf（溶媒／トリフルオロ酢酸：水＝1：9）0.3。赤外吸収（K Br）：3394(br)，2934，2867，1652，1647，1636，1558，1541，1027cm^-1。¹H NMR（D₂O）：5.09(d，1H，J=3.6Hz)，4.86(d，1H，J=3.6Hz)，3.95(brs，1H)，3 .80-2.55(m，15H)，2.30-0.65(m，56H)。Fab質量分析：970(M+Na)⁺。元素分析： C₄₆H₈₆O₁₄N₆・4HClの計算値：C，50.55; H，8.30; N，7.69; Cl，12.97。実 測値：C，50.67; H，8.71; N，6.70; Cl，11.65。 6．31．3−α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（2’，3’，4’，6’−テトラ−O− ベンジル−1’α−グルコシル）−5β−コラン−24−酸−N−［3，6，9−トリ− アザ−12−アミノ−ウンデカン］−アミド（4）の調製 無水塩化メチレン（50mL）中のテトラエチレン−ペンタミン（285mg、1．5mmo l）とトリエチルアミン（2mL）の撹拌溶液に、塩化メチレン（50mL）中の化合物 1（1．549g、1mmol）を滴下により添加して48時間撹拌する。反応混合物を濾過 し、瀘液を濃縮する。残渣をCHP−20逆相樹脂のフラッシュクロマトグラフィー （溶離液：水から徐々に90％メタノールまで上昇させる；生成物は90％メタノー ル水溶液画分から得られる）で精製して、白色の泡状物として化合物4（1g、63 ．8％収率）を得る（融点74〜76℃）。TLC Rf（溶媒／MeOH：CH₂Cl₂：イソプロ ピルアミン＝4：4：2）0.1。赤外吸収（KBr）：3365(br)，3086，3061，3029，2 925，2864，1699，1653，1496，1453，1155，1070，1028cm^-1。¹H NMR（CDCl₃ ）：δ 7.40-6.95(m，40H)，5.10-3.20(m，33H)，2.82-0.82(m，57H)，0.72(s ，3H)。Fab質量分析：1651(M+Na)⁺。 6．32．3−α−ヒドロキシ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コラ ン−24−酸−N−［3，6，9−トリ−アザ−12−アミノ−ウンデカン］−アミド（ N、上記） THFと水（2：1、30mL）中の化合物4（486mg、0．3mmol）と1N HCl（4mL、3mm ol）の溶液に、20％水酸化パラジウム担持炭素（400mg、パールマン触媒）を添 加して、混合物を50PSIで15時間水素化分解に付す。反応混合物を砂とメンブラ ンフィルターで濾過して濃縮する。残渣を水（5mL）に溶解して濾過する。瀘液 をCHP−20逆相カラムのフラッシュクロマトグラフィー（水、次にMeOH：水＝1： 19、1：4および2：3；生成物は20％メタノール水溶液画分に見い出される）で精 製して、白色の泡状物としてN（160mg、51％収率）を得る（融点151〜53℃）。T LC Rf（溶媒／トリフルオロ酢酸：水＝1：9）0.3。赤外吸収（KBr）：3390(br) ，2938，2869，1652，1647，1636，1541，1457，1251，1150，1073，1026cm^-1。¹ H NMR（D₂O）：5.09(br s，1H)，4.86(br s，1H)，4.00(m，2H)，3.85-2.60 (m，16H)，2.30-0.75(m，49H)および0.66(s，3H)。Fab質量分析：927(M+Na)⁺。 元素分析：C₄₄H₈₁O₁₄N₅・3HClの計算値：C，52.14; H，8.35; N，6.91; Cl， 10.49。実測値：C，52.41; H，8.75; N，5.21; Cl，9.49。 6．33．トランスフェクションと測定法 細胞：トランスフェクション測定の前日に、COS−7（SV40形質転換アフリカミ ドリサル）細胞を、DMEM＋10％FBSを含有する24ウェルのマルチウェルプレート に、3×10⁴細胞／ウェルで蒔く。トランスフェクションの直前に細胞を無血清Op ti−MEMで1回洗浄する。 トランスフェクション測定法：試験化合物：DOPE（1，2−ジオレオイル−sn− グリセロール−3−ホスホエタノールアミン）複合体（1：1）またはリポフェク チンを、DNAに対する適当な電荷比で、pSVβプラスミドDNA（5μg/mL）とともに 混合する。すべての溶液は、無血清Opti−MEM中で作成する。混合物を室温で15 分間インキュベートする。トランスフェクション混合物を、Opti−MEMで1μg/mL DNAに希釈し、あらかじめ洗浄したCOS−7細胞に加える。COS−7細胞をトランス フェクション混合物と共に37℃で6時間インキュベートする。トランスフェクシ ョン混合物を取り出し、DMEM＋10％FBSで置換する。細胞を37℃で48時間インキ ュベートし、次にX−GALまたはONPG測定法のいずれかによりβ−ガラクトシダー ゼ活性を測定する。 ONPG測定法：COS−7細胞をリン酸緩衝化生理食塩水pH7．2（PBS）で3回洗浄す る。水中で細胞を溶解し、そして凍結融解を3回行う。細胞抽出物またはβ−ガ ラクトシダーゼ標準物質のいずれかに、等量のO−ニトロフェニルピラノガラク トシド（ONPG）試薬（100mMのリン酸緩衝液pH7．5中、1．76mg/mLONPG、2mM Mg Cl₂、90mM β−メルカプトエタノール）を加える。混合物を37℃で30分間イン キュベートする。各混合物について410nmで吸光度を測定し、標準曲線からβ− ガラクトシダーゼ活性の単位数を求める。バイオラッド（Bio-Rad）蛋白測定法 により、細胞抽出物の蛋白含有量も測定する。mU β−ガラクトシダーゼ／mg蛋 白の比活性を測定する。 X−GAL測定法：COS−7細胞をPBSで3回洗浄し、次にPBS中の2％ホルムアルデヒ ド＋0．2％グルタルアルデヒドで15分間固定する。細胞をPBSでさらに3回洗浄し 、X−GAL染色液（PBS中、5mM K₄Fe（CN）₆、5mM K₃Fe（CN）₆、2mM MgCl₂、0 .1％X−GAL）で染色する。プレートを24時間インキュベートし、染色された細胞 数を求める。 6．34 追加の考察 結果的に、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール 酸、およびこれらの種々のモノおよびビスグリコシル化誘導体の選択されたポリ アミン誘導体を調製した（例えば、図12〜14を参照）。細胞中に核酸の導入を促 進するこれらの化合物の能力（例えば、図15を参照）を調べた。例えば図16に示 すように、結果は、試験化合物のポリアミン側鎖中に存在するアミンの数と観察 されたトランスフェクション効率が正比例することを示唆している。すなわち、 本試験は、スペルミン側鎖（アミド結合を含む4つのアミン）からペンタアミン 側鎖そしてヘキサアミン側鎖へと進むに連れてトランスフェクション効率が次第 に上昇することを証明した。具体的なトランスフェクション実験の結果は、図16 および以下の表6と7に示す。 結果はまた、各化合物が化合物対DNA電荷比に依存する最大トランスフェクシ ョン効率を示すことを示唆する。例えば図17に示すように、化合物Eは、化合物E 対DNA電荷比が約96でリポフェクチンに対して4倍優れており、化合物Mは、化合 物M対DNA電荷比約49でリポフェクチンに対して約12倍トランスフェクションを促 進する。 図18の結果に例示されるように、ONPG測定法とX−gal測定法はいずれも、本発 明の化合物の形質転換効率の有効な尺度である。別に記載するように、ONPG測定 法は、形質転換された細胞の蛋白産生の直接の尺度であり、X−gal測定法は、異 種β−ガラクトシダーゼを発現する染色細胞の密度を与える。X−gal測定法の結 果の見本を図19に示す。 驚くべきことに、化合物M／DOPE複合体を用いるCOS−7細胞のトランスフェク ションは、血清蛋白の存在により大して影響を受けないことも発見された。実際 図20に示すように、化合物M対DNA電荷比約49においては、血清の非存在下で測定 したβ−ガラクトシダーゼ活性に比較して、1％血清の存在下でβ−ガラクトシ ダーゼ活性の上昇が観察される。リポフェクチンのトランスフェクション効率は 血清添加により悪影響を受けることが知られているため、この結果は注目すべき である。 またゲルシフト／DNA結合実験は、グリコシル化コール酸メチルエステル（化 合物1）とスペルミンは、単独でゲル内のDNAの移動を別々に遅延させることは不 可能であることを示している（図21を参照）。本発明の結果は、驚くべきことに 、 グリコシル化化合物とスペルミンの構造上の特徴を取り込んだ本発明の化合物が 、実質的にまたは化合物対DNA比が約10対1という小さい値で、DNAの移動を完全 に遅延させることができることを証明している。従って本発明の化合物がDNAに 結合できる能力、従って細胞の形質転換を促進することができる能力は、個々の ビスグリコシル化コール酸メチルエステルおよびスペルミン分子の物理化学的挙 動から示唆されることは不可能であった。 6．35 追加の化合物 6．35．1 デオキシコール酸、テトラエチレンペンタアミド（O） DMF（5ml）中のテトラエチレンペンタミン（0．378g、2．5mmol）とトリエチ ルアミン（0．3mL）の溶液に、DMF5mL中のデオキシコール酸N−オキシスクシン イミド（1．0g、2mmol）を、10分間で滴下により添加する。溶液を室温で一晩撹 拌して、次に水（20mL）中に注ぎ入れる。生成物の沈殿物を冷水（50mL）で洗浄 し、2％HCl 10mLに溶解し、濾過する。この溶液をCHP−20逆相カラムに注ぎ入 れ、M eOH−水溶媒系で精製する。生成物は40〜80％MeOHの溶媒範囲で溶出して、白色 の粉末としてデオキシコール酸テトラエチレンペンタアミド、三塩酸塩、五水和 物（化合物Q）1．1g（収率72％、融点130〜132℃）を与える（凍結乾燥後）。TL C Rf（MeOH：i−PrNH₂；DCM＝2：2：6）0.6。赤外吸収（KBr）：3419，2934，1 642(CONH-)，1553，1454，1038cm^-1。¹H NMR（D₂O）：3.88(s，1H)，2.9-3.3(M ，16H)，1.2-2.4(m，42H)，0.88(d，3H)，0.78(s，3H)，0.55(s，3H)。Fab質量 分析：696(ベース3HCl+Na⁺)。元素分析：C₃₂H₆₁N₅O₃・3HCl・5H₂Oの計算値：C， 50.3; H，9.69; N，9.17; Cl，13.95。実測値：C，51.5; H，9.04; N，10. 1; Cl，10.9。 6．35．2 デオキシコール酸、ペンタエチレンヘキサミド（R） DMF（5mL）中のペンタエチレンヘキサミン（0．58g、2．5mmol）とトリエチル アミン（0．3mL）の溶液に、DMF5mL中のデオキシコール酸N−オキシスクシンイ ミド（1．0g、2mmol）を10分間で滴下により添加する。生じた溶液を室温で一晩 撹拌する。この溶液を水（50mL）に注いで沈殿物を得る。液相をデカントする。 半固体の沈殿物を冷5％NaOH（10mL×2）と水（10mL）で洗浄し、10％酢酸10mLに 溶解し、MeOH−水溶媒系でCHP−20逆相カラムのフラッシュクロマトグラフィー により精製する。生成物は40〜100％までのMeOHで溶出する。生成物を有する画 分を合わせ、減圧下で溶媒を蒸発させ、2％HClに溶解し、凍結乾燥して、白色粉 末として化合物R（0．75g、収率44％、融点）を得る。融点140〜142℃。TLC Rf （MeOH：i−PrNH₂：DCM＝2：2：6）0.65。赤外吸収（KBr）：3425，2932，1770( COOH)，1643(CONH)，1552(COO)，1454，1032cm^-1。¹H NMR（D₂O）：3.92(s，1H )，2.6-3.6(m，20H)，1.0−1.6(M，30H)，0.83(D，3H)，0.75(s，3H)，0.55(s， 3H)。Fab質量分析：863(M+H⁺)。元素分析：C₃₄H₆₆N₆O₃・2HCl・3AcOHの計算値： C，55.8; H，9.28; N，9.70; Cl，8.2。実測値：C，59.0; H，9.40; N，8. 3; Cl，6.6。 6．35．3 ケノデオキシコール酸、スペルミド、トリフルオロ酢酸塩（S） DMF5mL中のスペルミン（0．8g、2mmol）とトリエチルアミン（0．3mmL）の溶 液に、DMF5mL中のデオキシコール酸N−オキシスクシンイミド（1．0g、2mmol） を滴下により添加する。この混合物を室温で一晩撹拌する。溶液をDCM（100mL） 中に 注ぎ入れ、生じたヒドロキシスクシンイミドの沈殿物を濾過する；濾液から溶媒 を留去して液相を得て、これを水（100mL）中に注ぎ入れる。生成物の沈殿物を 得る。これをMeOH（5mL）に溶解し、CHP−20逆相カラムに入れる。MeOH−水溶媒 系を使用する。MeOH30％で生成物が溶出する。溶媒を蒸発させ、残渣をトリフル オロ酢酸1mLに溶解し、水で10mLまで希釈し、濾過し、濾液を凍結乾燥して、0． 9g（収率50％）を得る（融点96〜100℃）。この生成物を水に溶解して、ケノデ オキシコール酸スペルミドのトリフルオロ酢酸塩の5％溶液を得る。この溶液は 、室温で約12〜24時間安定であり、その後塩基の沈殿物がスラリーとして分離す る。TLC Rf（MeOH：i−PrNH₂：DCM）0.7。赤外吸収（KBr）：3406，2939，2869 ，1778(COOH)，1680(CONH-)，1553，1458，1196，834，722cm^-1。¹H NMR（D₂O ）：3.75(s，1H)，3.4(s，1H)，2.8-3.15(m，12H)，2.2-1.2(m，39H)，0.9(d，3 H)，0.86(s，3H)，0.55(s，3H)。Fab質量分析：(M+Na⁺)=598。元素分析：C₃₄H₆₄ N₄O₃・3CF₃COOHの計算値：C，52.5; H，7.29; N，6.09。実測値：C，53.5; H ，7.20; N，4.95。 前述の具体例以外の態様も当業者には明らかであろうが、それらも本発明の範 囲と精神に包含される。ここに具体的に記載した態様は、決して本発明を限定す るものではなく、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／３３６，６７５ (32)優先日 1994年11月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．細胞に核酸を導入する方法であって： （a）融合原性脂質および式（I） （式中、 R₁は、H、OH、OR₅、NH₂、NHR₆、またはNR₆R₇でもよく； R₂とR₃は同じであるかまたは異なってもよく、H、OHまたはOR₅であってよく； R₄は、CONH₂、C0NHR₆、CONR₆R₇、CH₂NH₂、CH₂NHR₆、CH₂NR₆R₇、CO₂−Y−NH₂、 CO₂−Y−NHR₆、またはCO₂−Y−NR₆R₇であってよく； R₅は、1〜10個の単糖単位を含む保護または非保護グリコシル残基であり、こ こで各単糖単位のアノマー炭素原子におけるグリコシド結合は、独立にアルファ またはベータであり； NH₂、NHR₆、およびNR₆R₇は、それぞれ非置換アミノ基、モノ置換アミノ基、お よびジ置換アミノ基であり、ここでR₆とR₇は同じであるかまたは異なってもよく 、1つまたはそれ以上の非置換、モノ置換またはジ置換アミノ基で置換された1〜 15個の炭素原子を含む、炭化水素基であってよく； Yは、1〜10個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキレン基であり； nは0〜10までの整数（好適には0〜3）である）の化合物； またはその酸付加塩もしくは四級アンモニウム塩の存在下で、細胞に導入する 核酸を接触させ； （b）該細胞に該核酸を導入するのに充分な時間、該化合物の存在下で細胞に核 酸を接触し続けることを含む、方法。 2．導入により核酸または少なくともその一部が細胞の遺伝子構成内に組み込ま れる、請求の範囲1の方法。 3．核酸または少なくともその一部が細胞の染色体内に組み込まれる、請求の範 囲2の方法。 4．核酸または少なくともその一部が、染色体外物質として細胞により保持され る、請求の範囲2の方法。 5．脂質が極性である、請求の範囲1の方法。 6．脂質がリン脂質である、請求の範囲1の方法。 7．リン脂質がホスファチジルエタノールアミン頭部基を含有する、請求の範囲6 の方法。 8．リン脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求の範 囲7の方法。 9．リン脂質が、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミンまた はジミリストイルホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される、 請求の範囲7の方法。 10．リン脂質がリソリン脂質を含む、請求の範囲6の方法。 11．リン脂質がリジニルホスファチジルエタノールアミンである、請求の範囲6 の方法。 12．陽イオン性脂質を含う第2の脂質もまた接触段階に存在する、請求の範囲1の 方法。 13．陽イオン性脂質が、N−［1−（2，3−ジオレオイルオキシ）プロ−ピル］− N，N，N−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、1，2−ジミリストイル− 3−トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、および1，2−ジミリストイル− 3−ジメチルアンモニウムプロパン（DODAP）よりなる群から選択される、請求の 範囲12の方法。 14．接触段階がさらにジエチルアミノエチルデキストラン（DEAE）の存在下で行 われる、請求の範囲1の方法。 15．脂質が、糖の脂肪酸エステル、グリコシルジアシルグリセロール、プラスマ ロゲン、アフィンゴミエリン、ガングリオシド、グリセロ脂質、スフィンゴ脂質 またはカルジオリピンを含む、請求の範囲1の方法。 16．核酸が該細胞との接触の前にあらかじめ化合物と混合される、請求の範囲1 の方法。 17．R₆が、結合している窒素原子とともに生物起源のポリアミンを表す、請求の 範囲1の方法。 18．化合物が少なくとも2つの陽性電荷を保有することができる、請求の範囲1の 方法。 19．化合物が少なくとも3つの陽性電荷を保有することができる、請求の範囲1の 方法。 20．R₆またはR₇が、3−アミノプロピル、4−アミノプロピル、5−アミノプロピ ル、N−（4−アミノブチル）−3−アミノプロピル、またはN−［N−（3−アミノ プロピル）−4−アミノブチル］−3−アミノプロピルである、請求の範囲1の方 法。 21．核酸が内因性である、請求の範囲1の方法。 22．核酸が外因性である、請求の範囲1の方法。 23．核酸がDNAを含む、請求の範囲1の方法。 24．核酸がRNAを含む、請求の範囲1の方法。 25．核酸が遺伝子をコードする、請求の範囲1の方法。 26．遺伝子が哺乳動物性である、請求の範囲1の方法。 27．式（I）： （式中、 R₁は、H、OH、OR₅、NH₂、NHR₆、またはNR₆R₇でもよく； R₂とR₃は同じであるかまたは異なってもよく、H、OHまたはOR₅であってよく； R₄は、CONHR₆、CONR₆R₇、CH₂NHR₆、CH₂NR₆R₇、CO₂−Y−NH₂、CO₂−Y−NHR₆、 またはCO₂−Y−NR₆R₇であってよく； R₅は、1〜10個の単糖単位を含む保護または非保護グリコシル残基であり、こ こで各単糖単位のアノマー炭素原子におけるグリコシド結合は、独立にアルファ またはベータであり； NH₂、NHR₆、およびNR₆R₇は、それぞれ非置換アミノ基、モノ置換アミノ基、お よびジ置換アミノ基であり、ここでR₆とR₇は同じであるかまたは異なってもよく 、1つまたはそれ以上の非置換、モノ置換またはジ置換アミノ基で置換された1〜 15個の炭素原子を含む、炭化水素基であってよく； Yは、1〜10個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキレン基であり； nは0〜3までの整数である）の化合物； またはその酸付加塩もしくは四級アンモニウム塩（ただし、該化合物は、少な くとも1つの非置換アミノ基で置換された、前記で定義した少なくとも1つのR₆基 を含む）。 28．R1がベータ配置を有する、請求の範囲27の化合物。 29．R1がアルファ配置を有する、請求の範囲27の化合物。 30．R₁、R₂およびR₃の少なくとも1つがOHである、請求の範囲27の化合物。 31．R₁、R₂およびR₃の少なくとも2つがOHである、請求の範囲27の化合物。 32．R₁、R₂およびR₃の3つすべてがOHである、請求の範囲27の化合物。 33．R₁とR₂がOR₅でありR₃がOHである、請求の範囲27の化合物。 34．R₁とR₃がOR₅でありR₂がOHである、請求の範囲27の化合物。 35．R₂とR₃がOR₅でありR₁がOHである、請求の範囲27の化合物。 36．R₆が、結合している窒素原子とともに、生物起源のポリアミンを表す、請求 の範囲27の化合物。 37．少なくとも3つの陽性電荷を保有することができる、請求の範囲27の化合物 。 38．R₆またはR₇が、3−アミノプロピル、4−アミノプロピル、5−アミノプロピ ル、N−（4−アミノブチル）−3−アミノプロピル、またはN−［N−（3−アミノ プロピル）−4−アミノブチル］−3−アミノプロピルである、請求の範囲27の化 合物 。 39．細胞に核酸を導入するための組成物であって、核酸、有効量の融合原性脂質 、および有効量の式（I） （式中、 R₁は、H、OH、OR₅、NH₂、NHR₆、またはNR₆R₇でもよく； R₂とR₃は同じであるかまたは異なってもよく、H、OHまたはOR₅であってよく； R₄は、CONH₂、CONHR₆、CONR₆R₇、CH₂NH₂、CH₂NHR₆、CH₂NR₆R₇、CO₂−Y−NH₂、 CO₂−Y−NHR₆、またはCO₂−Y−NR₆R₇であってよく； R₅は、1〜10個の単糖単位を含む保護または非保護グリコシル残基であり、こ こで各単糖単位のアノマー炭素原子におけるグリコシド結合は、独立にアルファ またはベータであり； NH₂、NHR₆、およびNR₆R₇は、それぞれ非置換アミノ基、モノ置換アミノ基、お よびジ置換アミノ基であり、ここでR₆とR₇は同じであるかまたは異なってもよく 、1つまたはそれ以上の非置換、モノ置換またはジ置換アミノ基で置換された1〜 15個の炭素原子を含む、炭化水素基であってよく； Yは、1〜10個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキレン基であり； nは0〜10までの整数である）の化合物； またはその酸付加塩もしくは四級アンモニウム塩を含む組成物。 40．化合物が、少なくとも1つの非置換アミノ基で置換された請求の範囲39記載 で定義された少なくとも1つのR₆基を含む、請求の範囲39記載の組成物。 41．脂質担体をさらに含む、請求の範囲40の組成物。 42．脂質をさらに含む、請求の範囲40の組成物。 43．融合原性脂質と緩衝剤をさらに含む、請求の範囲40の組成物。 44．核酸と式（I） （式中、 R₁は、H、OH、OR₆、NH₂、NHR₆、またはNR₆R₇でもよく； R₂とR₃は同じであるかまたは異なってもよく、H、OHまたはOR₅であってよく； R₄は、CONH₂、CONHR₆、CONR₆R₇、CH₂NH₂、CH₂NHR₆、CH₂NR₆R₇、CO₂−Y−NH₂、 CO₂−Y−NHR₆、またはCO₂−Y−NR₆R₇であってよく； R₅は、1〜10個の単糖単位を含む保護または非保護グリコシル残基であり、こ こで各単糖単位のアノマー炭素原子におけるグリコシド結合は、独立にアルファ またはベータであり； NH₂、NHR₆、およびNR₆R₇は、それぞれ非置換アミノ基、モノ置換アミノ基、お よびジ置換アミノ基であり、ここでR₆とR₇は同じであるかまたは異なってもよく 、1つまたはそれ以上の非置換、モノ置換またはジ置換アミノ基で置換された1〜 15個の炭素原子を含む、炭化水素基であってよく； Yは、1〜10個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキレン基であり； nは0〜10までの整数である）の化合物； またはその酸付加塩もしくは四級アンモニウム塩を、薬剤学的に許容される担 体中に含む薬剤組成物（ただし、該化合物は前記で定義した少なくとも１つのR₆ 基を含む）。 45．化合物が、少なくとも1つの非置換アミノ基で置換された少なくとも1つのR₆ 基 を含む、請求の範囲44の薬剤組成物。 46．核酸が遺伝子をコードする、請求の範囲材の薬剤組成物。 47．核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む、請求の範囲44の薬剤組 成物。 48．宿主細胞の形質転換性を向上させる方法であって、宿主細胞に式（I） （式中、 R₁は、H、OH、OR₅、NH₂、NHR₆、またはNR₆R₇でもよく； R₂とR₃は同じであるかまたは異なってもよく、H、OHまたはOR₅であってよく； R₄は、CONH₂、CONHR₆、CONR₆R₇、CH₂NH₂、CH₂NHR₆、CH₂NR₆R₇、CO₂−Y−NH₂、 CO₂−Y−NHR₆、またはCO₂−Y−NR₆R₇であってよく； R₅は、1〜10個の単糖単位を含む保護または非保護グリコシル残基であり、こ こで各単糖単位のアノマー炭素原子におけるグリコシド結合は、独立にアルファ またはベータであり； NH₂、NHR₆、およびNR₆R₇は、それぞれ非置換アミノ基、モノ置換アミノ基、お よびジ置換アミノ基であり、ここでR₆とR₇は同じであるかまたは異なってもよく 、1つまたはそれ以上の非置換、モノ置換またはジ置換アミノ基で置換された1〜 15個の炭素原子を含む、炭化水素基であってよく； Yは、1〜10個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキレン基であり； nは0〜10までの整数である）の化合物； またはその酸付加塩もしくは四級アンモニウム塩（ただし、該化合物は前記で 定義した少なくとも1つのR₆基を含む）を接触させ； （b）宿主細胞を形質転換性核酸に暴露しながら、該化合物を宿主細胞に接触し 続けることを含む、方法。 49．胆汁酸、またはコール酸、3−アミノ−5β−コール酸、リトコール酸、デオ キシコール酸、ケノデオキシコール酸 、3−デオキシコール酸、もしくはC3側 鎖、C17側鎖ないしその両方に結合した1つないしそれ以上の第2の化合物に直接 ないし間接に共有結合したその塩、エステル、もしくはアミドよりなる群から選 択されるその類似体を含む結合体（ただし、第2の化合物は該結合体内に、胆汁 酸またはその類似体の第2の分子を導入しない）。 50．3−アミノ−5β−コール酸が3β−アミノ異性体である、請求の範囲49の結 合体。 51．3−アミノ−5β−コール酸が3α−アミノ異性体である、請求の範囲49の結 合体。 52．3−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コール酸、または C3側鎖、C17側鎖もしくはその両方に結合した1つもしくはそれ以上の第2の化合 物に直接もしくは間接に共有結合したその塩、エステル、もしくはアミドを含む 結合体（ただし、第2の化合物は該結合体内に3−アミノ−7α，12α−ジ（1’α −グルコシル）−5β−コール酸、その塩、エステル、またはアミドを導入しな い）。 53．3−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コール酸が3β− アミノ異性体である、請求の範囲52の結合体。 54．3−アミノ−7α，12α−ジ（1’α−グルコシル）−5β−コール酸が3α− アミノ異性体である、請求の範囲52の結合体。 55．第2の化合物がアミン化合物である、請求の範囲49の結合体。 56．アミン化合物がポリアミン化合物である、請求の範囲55の結合体。 57．ポリアミン化合物がアルキレンジアミンである、請求の範囲49の結合体。 58．ポリアミン化合物がスペルミンである、請求の範囲49の結合体。 59．ポリアミン化合物がスペルミジンである、請求の範囲49の結合体。 60．炭化水素基が直鎖又は分岐鎖の脂肪族基を含む、請求の範囲1の方法。 61．炭化水素基が環状である、請求の範囲1の方法。 62．炭化水素基が直鎖又は分岐鎖の脂肪族基を含む、請求の範囲27の化合物。 63．炭化水素基が環状である、請求の範囲27の化合物。 64．炭化水素基が直鎖又は分岐鎖の脂肪族基を含む、請求の範囲39の組成物。 65．炭化水素基が環状である、請求の範囲39の組成物。 66．炭化水素基が直鎖又は分岐鎖の脂肪族基を含む、請求の範囲44の薬剤組成物 。 67．炭化水素基が環状である、請求の範囲44の薬剤組成物。 68．炭化水素基が直鎖又は分岐鎖の脂肪族基を含む、請求の範囲48の方法。 69．炭化水素基が環状である、請求の範囲48の方法。