ES2259007T3 - Lipidos que comprenden un grupo aminoxi. - Google Patents
Lipidos que comprenden un grupo aminoxi.Info
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula que comprende hacer reaccionar (i) un compuesto de fórmula; y (ii) un compuesto de fórmula mezclado con, o asociado con una secuencia nucleótida, o un agente farmacéuticamente activo; en el que B es un lípido y A es una fracción de interés (MOI); en el que X es un grupo de engarce opcional; en el que R1 es H o un grupo hidrocarbilo; y en el que R2 es un par solitario o R4, en el que R4 es un sustituyente apropiado.
Description
Lípidos que comprenden un grupo aminoxi.
La presente invención se refiere a un
compuesto.
Un aspecto de la terapia génica implica la
introducción de ácido nucleico extraño (tal como el ADN) en las
células, de manera que su proteína expresada pueda realizar una
función terapéutica deseada.
Ejemplos de este tipo de terapia comprenden la
inserción de los genes TK, TSG o ILG para tratar el cáncer; la
inserción del gen CFTR para tratar la fibrosis quística; la
inserción de los genes NGF, TH o LDL para tratar los trastornos
cardiovasculares y neurodegenerativos; la inserción del gen
antagonista de IL-1 para tratar la artritis
reumatoidea; la inserción de los antígenos de HIV y del gen TK para
tratar las infecciones del SIDA y del CMV; la inserción de antígenos
y citoquinas para actuar como vacunas, y la inserción de la
\beta-globina para tratar situaciones
hemoglobinopáticas, tales como las talasemias.
Muchos estudios habituales de terapia génica
utilizan vectores génicos adenovirales- tales como Ad3 o Ad5 - u
otros vectores génicos. Sin embargo, a su utilización se han
asociado problemas graves. Esto ha propiciado el desarrollo de
estrategias no víricas y menos peligrosas para la transferencia
génica.
Un sistema no vírico de transferencia de gran
potencial implica la utilización de liposomas catiónicos. A este
respecto, los liposomas catiónicos -que están formados habitualmente
por un fosfolípido neutro y un lípido catiónico-, se han utilizado
para transferir a las células ADN, ARNm, oligonucleótidos
antisentido, proteínas y medicamentos. Diversos liposomas
catiónicos están disponibles comercialmente y recientemente, se han
sintetizado muchos nuevos lípidos catiónicos. La eficacia de estos
liposomas se ha mostrado tanto in vitro como in
vivo.
Una citofectina útil en la preparación de un
liposoma catiónico es el cloruro de
N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,
N, N-trimetil amonio, conocido también como
"DOTMA".
Uno de los sistemas liposómicos catiónicos que
se utiliza más habitualmente está formado por una mezcla de una
dioleoilfosfatidiletanolamina fosfolípida neutra (conocida como
"DOPE") y un lípido catiónico,
3\beta-[N,N-dimetilaminoetano)carbamil]colesterol
(conocido habitualmente como "DC-Chol").
A pesar de la eficacia de los liposomas
catiónicos conocidos, es todavía necesario optimizar la eficiencia
de la transferencia génica de los liposomas catiónicos en la terapia
génica humana. Con la próxima finalización del proyecto Genoma
Humano, la utilización de genes con propósitos terapéuticos, que se
describe como terapia génica, se espera cada vez más que revolucione
la medicina. En este contexto, aunque sea todavía incluso menos
efectivo que la tecnología vírica, el suministro no vírico está
siendo reconocido de modo creciente por la comunidad científica como
la opción más segura para la aplicación humana.
Este campo ha evolucionado considerablemente en
la última década con la aparición de constructos macromoleculares
complejos que incluyen muchos elementos de distintas tecnologías
existentes (proteínas o péptidos virales, liposomas, polímeros,
estrategias diana y propiedades indetectables).
La solicitud PCT/GB00/04767 en trámite da a
conocer un sistema basado en un triplex compuesto por un péptido
nuclear vírico Mu, un ADN plasmídico y un liposoma catiónico
(LMD).Esta tecnología de plataforma nos proporcionó un buen éxito
in vitro y resultados prometedores in vivo. Pero como
para toda la tecnología no vírica existente, es necesario más
desarrollo para alcanzar un nivel terapéutico in vivo.
Con este fin, la formulación debe alcanzar la
estabilidad de la partícula en los líquidos biológicos (suero, moco
pulmonar) y conservar todavía capacidades eficientes de
transfección.
Dicho requerimiento constituye uno de los
principales obstáculos de toda la tecnología existente. Las
formulaciones estables habituales alcanzan una transfección escasa y
la mayoría de los agentes transfectantes eficientes que están
presentes están muy limitados en el alcance de su aplicación, debido
a esta inestabilidad.
Después de la administración (en sangre para la
aplicación sistémica o en el moco para la administración tópica
pulmonar), los complejos cargados son expuestos a las macromoléculas
biológicas y salinas que conducen a una intensa agregación coloidal
y a la adsorción de elementos biológicos activos (opsoninas) en su
superficie. Los vehículos génicos experimentan cambios importantes
que pueden incluir la precipitación y la unión de las proteínas, lo
que lleva a la eliminación de las partículas por los macrófagos y a
la perturbación de la superficie, que da lugar a su destrucción.
Con el objetivo de generar sistemas de
suministro génico y medicamentoso para dianas celulares específicas
in vivo e in vitro, son necesarios protocolos para
producir sistemas de suministro estables en los líquidos biológicos,
con actividad suficiente para exhibir beneficios terapéuticos. Por
tanto, debe encontrarse un equilibrio entre estabilidad y actividad
para un vehículo de suministro eficiente medicamento/gen.
Las solicitudes PCT/GB00/04767 en trámite dan a
conocer un sistema basado en lípidos modificados, en el que el
lípido transporta una fracción hidrato de carbono. Se ha
descubierto que estos lípidos modificados son estables y tienen una
baja toxicidad. Dichos sistemas requieren la unión de otra fracción
al lípido para proporcionar asistencia en la provisión de un lípido
modificado que sea estable y posea poca toxicidad. En la técnica, se
desean proporcionar lípidos que comprendan lípidos a los que puedan
unirse fácilmente otras fracciones. Asimismo, en Human Gene Therapy
7: 1701-1717 (1996), y en los documentos
US-A-5283185 y
WO-A-97/45442, se han dado a
conocer lípidos modificados que comprenden un lípido unido a un
grupo amino situado en cabeza, mediante un engarce o un brazo
espaciador.
El documento
WO-A-98/28317 ha sugerido la
utilización de enlaces oxímicos para que un amplio intervalo de
grupos se unan entre ellos, y la utilización de enlaces oxímicos con
lípidos se ha dado conocer en J. Medicinal Chemistry, 17:
396-403 (1974) y J. Heterocycl. Chem. 16:
1459-1463 (1979).
La presente invención palía los problemas de la
técnica anterior.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de
fórmula
que comprende hacer
reaccionar
(i) un compuesto de fórmula
(ii) y un compuesto de fórmula
mezclado con, o asociado con una
secuencia nucleótida, o un agente farmacéuticamente activo; en el
que B es un lípido y A es una fracción de interés (MOI); en el que X
es un grupo de engarce opcional; en el que R_{1} es H o un grupo
hidrocarbilo; y en el que R_{2} es un par solitario o R_{4}, en
el que R_{4} es un sustituyente
apropiado.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una composición que comprende (i) un compuesto de
fórmula
(ii) un compuesto de fórmula
y (iii) una secuencia nucleótida, o
un agente farmacéuticamente
activo;
en el que B es un lípido y A es una fracción de
interés (MOI);
en el que X es un grupo de engarce opcional;
en el que R_{1} es H o un grupo hidrocarbilo;
y
en el que R_{2} es un par solitario o un
sustituyente apropiado.
Una composición de la presente invención puede
utilizarse en la terapia.
Una composición de la presente invención puede
utilizarse en la preparación de un medicamento para tratar un
trastorno, una situación o una enfermedad genéticos.
Puede formarse un liposoma a partir de una
composición de la presente invención.
Un procedimiento para preparar dicho liposoma
comprende la formación de éste a partir de una composición de la
presente invención.
Dicho liposoma puede utilizarse en terapia.
Dicho liposoma puede utilizarse en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno, o
situación o enfermedad genéticos.
Puede formarse una composición farmacéutica que
comprende una composición de la presente invención que se mezcla
con un medicamento, y, opcionalmente, se mezcla con un diluyente,
transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Puede formarse una composición farmacéutica que
comprende un liposoma tal como se ha descrito anteriormente, y
mezclarlo con un medicamento y, opcionalmente, mezclarlo con un
diluyente, transportador o excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Algunos otros aspectos de la invención se
definen en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención da a conocer el suministro
de un lípido que comprende un grupo aminoxi que permite la unión
única de otras fracciones al lípido, a través del grupo
aminoxi. Cuando reacciona con una fracción (MOI) que comprende un
grupo aldehído o cetona, se proporciona un compuesto en el que el
MOI y el lípido se unen mediante un grupo amido. Dicho enlace puede
prepararse simplemente en una reacción "de una sola vez". Esta
metodología mediante una diálisis única del exceso de los reactivos
que no reaccionaron, evita los extensos procedimientos de
purificación.
La metodología de una sola vez de
postrecubrimiento de este procedimiento se basa en la alta y
selectiva reactividad del enlace aminoxi para reaccionar con
aldehídos y cetonas parra formar enlaces covalentes -C=N- (tipo base
de Schiff). De forma importante, la reacción puede llevarse a cabo
en un entorno acuoso a un pH básico o ácido. Además, no existe
rotura parcial del grupo reactivo cuando se expone a las condiciones
acuosas, como es el caso para los carboxilos
NHS-activados y otros ésteres. Por tanto, la
estabilidad de las especies reactivas, por ejemplo, al
aldehído/cetona y el aminoxi, permite el control total de la
reacción superficial sin pérdida de especies reactivas que se deba
a la hidrólisis/degradación.
El compuesto de la presente invención tiene la
fórmula
en la que B es un lípido; y en la
que R_{2} es H o un grupo
hidrocarbilo.
La expresión "grupo hidrocarbilo" tal como
se utiliza en la presente memoria, significa un grupo que comprende
por lo menos C y H, y opcionalmente, puede incluir uno o algunos
otros sustituyentes apropiados. Ejemplos de dichos sustituyentes
pueden incluir grupos halo, alcoxilo, nitro, alquilo, un grupo
cíclico, etc. Además de la posibilidad de sustituyentes que sean un
grupo cíclico, una combinación de sustituyentes puede formar un
grupo cíclico. Si el grupo hidrocarbilo comprende más de un C,
entonces estos carbonos no requieren necesariamente unirse entre
ellos. Por ejemplo, dos de los carbonos, por lo menos, pueden unirse
mediante un elemento o grupo apropiado. Así, el grupo hidrocarbilo
puede contener heteroátomos. Los heteroátomos apropiados serán
evidentes para los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo,
azufre, nitrógeno y oxígeno. Un ejemplo no limitante de un grupo
hidrocarbilo es un grupo acilo.
Un grupo hidrocarbilo típico es un grupo
hidrocarburo. En la presente memoria la expresión
"hidrocarburo" significa cualquiera de los grupos alquilo,
alquenilo o alquinilo, que pueden ser lineales, ramificados o
cíclicos, o un grupo arilo. El término hidrocarburo comprende
asimismo los grupos mencionados anteriormente, pero en los que se
han llevado a cabo opcionalmente sustituciones. Si el hidrocarburo
es una estructura ramificada que posee uno o varios sustituyentes,
la sustitución puede situarse, bien en el esqueleto del hidrocarburo
o en las ramificaciones; alternativamente, las sustituciones pueden
estar en el esqueleto del hidrocarburo y en la ramificación.
Preferentemente, la reacción de la presente
invención se lleva a cabo en un medio acuoso.
En un aspecto preferido, está presente el
engarce X opcional.
En un aspecto preferido, X es un grupo
hidrocarbilo.
En un aspecto preferido, el engarce X comprende
o está unido al lípido mediante un grupo poliamina.
Se cree que el grupo poliamina es ventajoso,
porque aumenta la capacidad de unión del ADN y la eficiencia de la
transferencia génica del liposoma resultante.
En una forma de realización, el grupo poliamina
es preferentemente una poliamina que no se presenta de forma
natural. Se cree que el grupo situado en cabeza de la poliamina es
ventajoso, porque el aumento de la funcionalidad amino aumenta la
carga positiva total del liposoma. Además, se sabe que las
poliaminas se unen intensamente y estabilizan al ADN. Además, las
poliaminas se presentan naturalmente en las células y, por tanto, se
cree que los problemas toxicológicos se minimizan.
En otra forma de realización, dos o más,
preferentemente, de los grupos amino del grupo poliamina de la
presente invención, están separados por uno o varios grupos que no
se encuentran en la naturaleza que separan grupos amino de
compuestos de poliamina que se encuentran de modo natural (es decir,
preferentemente, el grupo poliamina de la presente invención tiene
un espaciador no natural).
Preferentemente, el grupo poliamina contiene por
lo menos dos aminas del grupo poliamina que están separadas
(espaciadas entre ellas) de cualquier otra por un grupo etileno
(-CH_{2}CH_{2}-).
Preferentemente, cada una de las aminas del
grupo poliamina están separadas (espaciadas una de la otra) por un
grupo etileno (-CH_{2}CH_{2}-).
Ejemplos típicos de poliaminas apropiadas
comprenden espermidina, espermina, caldopentamina, norespermidina y
norespermina. Preferentemente, la poliamina es espermidina o
espermina, pues se sabe que estas poliaminas interaccionan con el
ADN mono o bicatenario. Una poliamina preferida alternativa es la
caldopentamina.
R_{1}
En un aspecto preferido, R_{1} es H
\vskip1.000000\baselineskip
C=N
El enlace C=N puede ser ácido lábil o ácido
resistente.
En un aspecto, el enlace C=N es ácido lábil.
En un aspecto, el enlace C=N es ácido
resistente.
\vskip1.000000\baselineskip
MOI
La fracción de interés (MOI) puede ser cualquier
fracción que se desee unir a un lípido.
El MOI puede ser una fracción hidrato de
carbono.
En un aspecto preferido, la fracción hidrato de
carbono es un monosacárido.
En un aspecto preferido, la fracción hidrato de
carbono es una fracción azúcar.
Preferentemente, la fracción hidrato de carbono
es seleccionada de entre manosa, glucosa
(D-glucosa), galactosa, ácido glucurónico, lactosa,
maltosa, maltotriosa, maltotetraosa, maltoheptaosa y sus mezclas.
Más preferentemente, la fracción hidrato de carbono es la
D-glucosa.
En un aspecto, el compuesto de la presente
invención comprende entre 1 y 7 fracciones de hidratos de carbono.
Preferentemente, el compuesto comprende una fracción hidrato de
carbono.
\vskip1.000000\baselineskip
Lípido
En un aspecto preferido, el lípido es o
comprende un grupo colesterol o un esqueleto glicerol/ceramida.
Cualquier estructura de tipo lípido o poliamina es apropiada.
Preferentemente, el grupo colesterol es
colesterol.
Preferentemente, el grupo colesterol está unido
a X mediante un enlace carbamoil.
El grupo colesterol puede ser colesterol o un
derivado suyo. Ejemplos de derivados del colesterol incluyen
derivados sustituidos en los que uno o más de los grupos cíclicos
CH_{2} o CH y/o uno o más de los grupos de cadena recta CH_{2} o
CH es/son apropiadamente sustituidos. Alternativamente, o además,
uno o más de los grupos cíclicos y/o uno o más de los grupos de
cadena recta, pueden estar insaturados.
En una forma de realización preferida, el grupo
colesterol es colesterol. Se cree que el colesterol es ventajoso,
porque estabiliza la bicapa liposómica resultante.
Preferentemente, el grupo colesterol se une al
grupo engarce opcional mediante un enlace carbamoil. Se cree que
este enlace es ventajoso, pues el liposoma resultante tiene una
citotoxicidad baja o mínima.
Preferentemente, R_{2} es H o un grupo
hidrocarbilo.
En un aspecto preferido, el grupo hidrocarbilo
R_{2} contiene heteroátomos opcionales seleccionadas entre O, N y
halógenos.
En un aspecto preferido, R_{2} es H.
Preferentemente, el procedimiento de la presente
invención se lleva a cabo en un medio acuoso o en un medio
totalmente acuoso.
La presente invención proporciona además un
compuesto preparado mediante un procedimiento de la presente
invención que se define en la presente memoria, un compuesto
obtenido mediante un procedimiento de la presente invención que se
define en la presente memoria, y/o un compuesto que puede obtenerse
mediante un procedimiento que se define en la presente memoria.
Preferentemente, el compuesto es una mezcla con,
o está asociado a una secuencia nucleótida.
La secuencia nucleótida puede formar parte o
constituir la totalidad de un sistema de expresión que puede ser
útil en terapia, tal como la terapia génica.
En un aspecto preferido, el compuesto de la
presente invención es una mezcla con un complejo polipéptido/ácido
nucleico condensado, para proporcionar un vector suministrador de un
ácido nucleico no vírico. El complejo polipéptido/ácido nucleico
condensado incluye preferentemente los que se dan a conocer en la
solicitud PCT/GB00/04767 en trámite. Preferentemente, los
polipéptidos o sus derivados son capaces de unirse al complejo ácido
nucleico. Preferentemente, los polipéptidos o sus derivados son
capaces de condensar el complejo del ácido nucleico.
Preferentemente, el complejo del ácido nucleico es heterólogo para
los polipéptidos o sus derivados.
Preferentemente, el procedimiento comprende la
utilización de una lámina cribosa molecular.
Preferentemente, el liposoma catiónico se forma
a partir del compuesto de la presente invención y de un fosfolípido
neutro, tal como DOTMA o DOPE. Preferentemente, el fosfolípido
neutro es DOPE.
La presente invención se describirá a
continuación con mayor detalle a título de ejemplo, haciendo
referencia únicamente a las figuras adjuntas, en las que:
Figura 1 - Esquema 1: Síntesis del lípido
hidroxilamina 11. Reactivos: (a) CH_{2}Cl_{2}, Et_{3}N,
Boc_{2}O, rt, 5h, 98%; (b) EtOAc,
N-hidroxisuccinimida (1 eq), DCC (1 eq), 10 h, rt;
(c) (8), EtOAC/THF [95/5], Et_{3}N (pH = 8), 2 h, rt, 90%; (d)
CH_{2}Cl_{2}, TFA (15 eq), 0ºC, N_{2}, 5h, 86%.
Figura 2 - Principio de glicosilación
quimioselectiva de la hidroxilamina O-sustituida con
D-glucosa (Aunque se muestra el
\beta-anómero, tiene lugar mutarrotación y se
produce asimismo un \alpha-anómero).
Figura 3 - Posibles estructuras de
neoglicolípidos obtenidas a partir de la manosa.
Figura 4 - Resultado del análisis del tamaño de
distintos lipoplexos mediante espectroscopía de correlación fotónica
(PCS). Se midió el tamaño después de 30 min para los lipoplexos con
[ADN] =1 \mug/ml en Optimem +/- FCS al 10%, 37ºC. La comparación
de la formulación del LMD estándar (LMD) y del LMD modificado por la
adición de un% de 7,5 molar del producto 12h y 12i se llevó a cabo
en Optimem (blanco) y en suero al 10% (negro) y se
expresó en porcentaje del aumento del tamaño respecto del tamaño
medido original de 180 nm.
Figura 5 - Comparación entre las eficiencias de
transfección del LMD básico y del LMD glicomodificado con un
porcentaje del 7,5 molar del producto 12h y 12i sobre las células
Hela en condiciones del 0% (blanco), del 50% (negro y
blanco) y del 100% (negro). Los resultados se expresan
como unidades lumínicas relativas por miligramo de proteína (n=
4).
Figura 6 - Estructura de un lípido aminoxi.
Los ejemplos siguientes describen la síntesis de
los compuestos (i) e (ii) en ausencia de una secuencia nucleótida o
de un agente farmacéuticamente activo tal como se requiere mediante
las presentes reivindicaciones.
General: Se registraron los espectros
H^{1} RMN a temperatura ambiente en espectrómetros Brucker DRX400,
DRX300 o Jeol GX-270Q, con un disolvente residual no
marcado isotópicamente (por ejemplo, ChCl_{3},
\delta_{H}=7,26) como una referencia interna. Los espectros
C^{13}-RMN se registraron a 100, 75 y 68,5 MHz
respectivamente en el mismo intervalo de los espectrómetros,
asimismo con el disolvente residual no marcado isotópicamente (por
ejemplo, CHCl_{2}, \delta_{c}= 77,2) como referencia interna.
Se registraron los espectros infrarrojos en Jasco FT/IR 620
utilizando placas NaCl y los espectros de masa (electrorociado de
iones positivos) se registraron instrumentos
VG-7070B o JEOL SX-102. La
cromatografía se refiere a cromatografía instantánea en columna, que
se llevó a cabo mediante Merck-Kieselgel 60 (malla
de 230-400) con un disolvente conveniente. La
cromatografía de capa delgada (Tlc) se llevó a cabo en una columna
Merck-Kieselgel 60 F254 prerrevestida, recubierta
anteriormente de aluminio y revelada con luz ultravioleta (yodo,
molibdato amónico ácido, vanilina etanólica ácida, u otros agentes
apropiados. La pureza de los neoglicolípidos se evaluó utilizando
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en un sistema
Hitachi utilizando una columna Purospher® RP-18 (5
\mum) tapada en su extremo. La elución se llevó a cabo a una tasa
de flujo isocrático de 1 ml/min con CH_{3}CN/H_{2}O (60:40),
detectándose las fracciones a una longitud de onda de 205 nm antes
de su recuperación y del análisis de masa. El CH_{2}Cl_{2} seco
se destiló con pentóxido de fósforo antes de usarlo. Todos los demás
disolventes secos y sustancias químicas se obtuvieron de
Sigma-Aldrich Company LTD (Poole, Dorset, UK).
Abreviaturas: Boc:
tert-butoxicarbonil; br: ancho; Chol: colesterilo;
DMF: N,N-dimetil formamida; DMSO: dimetil sulfóxido;
TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano.
2-(colesteriloxicarbonil)aminoetanol
(2): Una solución de cloroformato de colesterilo (99,89 g, 0,218
mol) en CH_{2}Cl_{2} (600 ml) se añadió a una solución sometida
a agitación de 2-aminoetanol (29,5 ml, 0,489 mol,
2,2 equiv) en CH_{2}Cl_{2} (450 ml) a 0ºC durante 2 horas. Se
dejó que la reacción se calentara hasta la temperatura ambiente,
continuándose la agitación durante otras 14 horas. La mezcla
reactiva se lavó con NaHCO_{3} saturado (2*200 ml), agua (2*200
ml), se secó (MgSO_{4}) y los disolventes se eliminaron bajo
presión reducida. El sólido obtenido se recristalizó
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar lugar a 2 como un sólido
blanco.
Rendimiento: 99,67 g (97%); temperatura de
fusión: 180ºC; R_{f}= 0,26 (acetona/éter 1:9); IR
(CH_{2}Cl_{2}): \nu_{max}= 3353, 2942, 2870, 1693, 1674,
1562, 1467, 1382, 1264 cm^{-1}; ^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}):
\delta=5,35 (d, J=6,5 Hz, 1H, H6'), 5,25-5,29 (m,
1H, NH), 4,42-4,57 (1H, M, H3'),
3,70-3,62 (m, 2H, H1),
3,25-3,35(m, 2H, H2), 3,12 (s, 1H, OH),
2,28-2,38 (m, 2H, H4'), 1,77-2,03
(m, 5H, H2', H7', H8'), 1,59-0,96 (m, 21H, H1', H9',
H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'), 1
(3H, s, H-19'), 0,9 (d, J = 6,5 Hz, 3H,
H21'), 0,87 (d, J=6,5 Hz, 6H, H26'& H27') y 0,67 (s, 3H,
H18'); MS (FAB^{+}):m/z = 496 [M + Na]^{+}, 474 [M +
H]^{+}, 369 [Chol]^{+}, 255, 175, 145, 105, 95,
81,43.
Matanosulfonato de
2-[(colesteriloxicarbonil)amino]etil (3): A una
solución de 2 (25 g, 52,3 mol ) y trietilamina (22 ml, 0,16 mol, 3
equiv) en CH_{2}Cl_{2} (500 ml) a 0ºC, se añadió gota a gota una
solución de cloruro de metanosulfonilo (10,5 ml, 0,13 mol, 2,5
equiv). Se dejó que la mezcla reactiva se calentara a temperatura
ambiente y se agitó durante 1h 30 min. Después de Tlc, el análisis
indicó que la reacción se había completado, añadiéndose hielo para
extinguir la reacción. La mezcla reactiva se añadió al NH_{4}Cl
acuoso saturado (600 ml), y se extrajo con éter (3*300 ml). Las
capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (2*300 ml), salmuera
(250 ml) y se secaron (Na_{2}SO_{4}). El disolvente se eliminó
bajo presión reducida para dar lugar a un sólido blanco, que al
purificarse mediante cromatografía, (éter), produjo 3.
Rendimiento: 28,3 g (98%); IR
(CH_{2}Cl_{2}): \nu_{max} = 3453, 3342, 1716, 1531, 1377,
1137 & 798 cm^{-1}; ^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}):
\delta=5,34 (d, J=6,5 Hz, 1H, H6'), 5,-5,1 (m, 1H, NH),
4,41-4,53 (1H, M,
H3'),4,29-4,25(t, J=5 Hz, 2H, H1),
3,47-3,52 (m, 2H, H2), 3,01 (s, 3H, H3),
2,24-2,36 (m, 2H, H4'), 1,74-2 (m,
5H, H2', H7', H8'), 0,9-1,6 (m, 21H, H1', H9', H11',
H12', H14'-H17', H22'-H25'), 0,98
(3H, s, H-19'), 0,84 (d, J= 6,5 Hz, 3H,
H21'), 0,83 (d, J=6,5 Hz, 6H, H26'& H27') y 0,65 (s, 3H,
H18'); MS (FAB^{+}):m/z = 1104 [2M + H]^{+}, 574
[M+Na]^{+}, 552 [M+H]^{+} 369 [Chol]^{+},
255, 175, 145, 95, 81.
4-aza-N^{6}-(colesteriloxicarbonilamino)hexanol
(4): A una solución sometida a agitación de 3 (28,3 g, 51 mmol)
disuelta en una cantidad mínima de THF, se añadió
amino-propanol (160 ml, 2 mol, 39 equiv). Una vez
que la Tlc indicó la finalización de la reacción, (12 horas), se
añadieron CHCl_{3} (350 ml) y K_{2}CO_{3} (20 g) y se agitó
vigorosamente la solución durante 30 minutos. La suspensión se
filtró entonces a través de una almohadilla de Celita®, lavando a
fondo con CHCl_{3}. Éste se lavó con una solución saturada de
hidrogenocarbonato sódico y se secó (Na_{2}CO_{3}). El
disolvente se eliminó para dar lugar a 4 como un sólido blanco.
Rendimiento: 26,1 g (96%); IR
(CH_{2}Cl_{2}): \nu_{max} = 3350-3210, 2937,
2850, 1531, 1460, 1380, 1220, 1120, 1040 cm^{-1}; ^{1}H RMN
(270 MHz, CDCl_{3}): \delta=5,33-5,35 (m, 1H,
H6'), 4,92-4,96 (m,1H,NH), 4,42-4,51
(1H,m,H3'), 3,7-3,83 (m, 2H, H5),
3,23-3,29 (m, 2H, H1), 2,73-2,57 (m,
6H, H2, H3, H4),2,2-2,36 (M, 2H, H4'),
1,7-2 (m, 5H,H2',H7', H8'),
0,85-1,58 (m, 21H, H1', H9',H11', H12',
H14'-H17', H22-H25'),0,98 (3H, s,
H-19'), 0,84 (d, J=6,5 Hz,3H, H21'), 0,8 (d,
J=6,5 Hz, 6H, H26'&H27'), y 0,61 (s, 3H, H18'); MS
(FAB^{+}): m/z = 543 [M+Na]^{+}, 530 [M+H]^{+}
485[M-CO_{2}]^{+}, 369
[Chol]^{+}, 144 [M-Chol]^{+},
69,55.
4-aza-(Boc)-N^{6}-(colesteriloxicarbonilamino)hexanol
(5): A una solución de 4 (26,1 g, 49 mmol), se añadieron
Et_{3}N (8,3 ml, 1,1 eqiv) y Boc_{2}O_{2} (10,7 g, 1 equiv) en
CH_{2}Cl_{2} (200 ml), realizándose el seguimiento de la
solución resultante mediante tlc. A su finalización, la mezcla
reactiva se vertió en NH_{4}Cl (100 ml), y se lavó con agua y se
secó (NaSO_{4}). El disolvente se eliminó in vacuo para dar
lugar al sólido blanco 5. El disolvente se eliminó bajo presión
reducida para dar un sólido blanco, el cual en la purificación
mediante cromatografía (CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 92:7:1) dio
lugar a 3.
Rendimiento: 27,9 g (90%); IR
(CH_{2}Cl_{2}): \nu_{max}= 3352, 3054, 2937, 1675, 1530,
1455, 1380, 1220, 1120; ^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}):
\delta=5,33-5,35 (m, 1H, H6'), 4,86 (m,1H,NH),
4,42-4,5 (1H,m,H3'), 3,62-3,7 (m,
2H, H5), 3,27-3,38 (m, 6H, H1, H2, H3),
2,18-2,33 (m, 2H, H4'), 1,73,-2 (m, 5H, H2', H7',
H8'), 1,45 (s,9h, Boc), 1-1,65 (m, 23H, H4, H1',
H9', H11', H12', H14'-H17',
H22'-H25'), 0,97 (3H, s, H-19'),
0,93 (d, J=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,8 (d, J= 6,5 Hz, 6H,
H26'& H27') y 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB^{+}):m/z = 654
[M+Na]^{+}, 543 [M-Boc]^{+}, 369
[Chol]^{+}, 145, 121, 95, 69, 57.
4-aza-(Boc)-N^{6}-(colesteriloxicarbonilamino)hexil
metano-sulfonato (6): Este experimento se llevó
a cabo de una manera similar que la preparación de metanosulfonato
de 2-[(colesteriloxicarbonil)amino]etil (3) en una
escala de 44 mmol que da lugar a 6.
Rendimiento: 28 g (90%); IR (CH_{2}Cl_{2}):
\nu_{max} = 3305, 2980, 2900, 2865, 1675, 1530, 1455, 1350,
1150;^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}):
\delta=5,33-5,35 (m, 1H, H6'), 4,86 (m,1H,NH),
4,35-4,55 (m, 1H, H3'), 4,22(t,2H,J=6,5 Hz,
H5), 3,2-3,4 (m, 6H, H1, H2, H3), 3,01 (s, 3H, H6),
2,15-2,33 (m, 2H, H4'), 1,73-2 (m,
5H, H2', H7', H8'), 1,44 (s, 9H, Boc), 1-1,67 (m,
23H, H4, H1', H9', H11', H12', H14'-H17',
H22'-H25'), 0,97 (3H, s, H-19'),
0,94 (d, J=6,5Hz, 3H, H21'), 0,8 (d, J=6,5 Hz, 6H,
H26'&H27') y 0,65 (s, 3H, H18'); MS (FAB^{+}):m/z = 722
[M+Na]^{+}, 609 [M-Boc]^{+} 369
[Chol]^{+}, 145, 121, 95, 69, 55.
4-aza-(Boc)-N^{6}-(colesteriloxicarbonilamino)hexanamina
(7): A 6 (25 g, 35 mmol), azida de sodio (11,49, 175,7 mmol, 5
equiv) y yoduro sódico (5 g, 35 mmol, 1 equiv), bajo nitrógeno, se
añadieron DMF anhidro (200 ml). con agitación. Equipado con un
condensador de reflujo, el calentamiento a 80ºC durante 2 horas, dio
lugar a que la reacción se cumpliera. Se dejó que la mezcla reactiva
se enfriara a la temperatura ambiente, eliminándose el DMF bajo
presión reducida, disolviéndose el residuo en EtOAC. Éste se lavó
con agua (2*100 ml), salmuera (100 ml)y se secó
(Na_{2}SO_{4}), para dar lugar después de purificación mediante
cromatografía (hexano/éter 1:1) 7 como un sólido blanco.
Rendimiento: 22 g (95%);^{1}H RMN (270 MHz,
CDCl_{3}): \delta=5,34-5,36 (m, 1H, H6'),
4,35-4,55 (m, 1H, H3'), 4,25 (t,2H,J=6,5 Hz, H5),
3,2-3,5 (m, 6H, H1, H2, H3),
2,25-2,33 (m, 2H, H4'), 1,7-2,05 (m,
5H, H2', H7', H8'), 1,45 (s, 9H, Boc), 1-1,72 (m,
23H, H4, H1', H9', H11', H12', H14'-H17',
H22'-H25'), 0,98 (3H, s, H-19'),
0,94 (d, J= 6,5Hz, 3H, H21'), 0,83 (d, J=6,5 Hz, 6H,
H26'&H27') y 0,64 (s, 3H, H18'); MS (FAB^{+}):m/z = 568
[M+Na-Boc]^{+}, 556
[M-Boc]^{+} 369 [Chol]^{+}, 145,
121, 95, 69, 57.
4-aza-(Boc)-N^{6}-(colesteriloxicarbonilamino)hexilamina
(8): A un matraz de fondo redondeado cargado con 7 (22,75 g,
34,6 mmol) en THF (230 ml), se añadió trimetilfosfina en THF (1M, 40
ml, 1,15 equiv), controlándose la reacción mediante Tlc. Al
finalizar, la reacción se agitó con agua (3 ml) y amonio acuoso (3
ml) durante 1 hora, eliminándose el disolvente bajo presión
reducida. Después de cromatografía (CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3}
92:7:1 a 75:22:3) se obtuvo 8 como un cristal blanco.
Rendimiento: 19,1 g (88%); IR
(CH_{2}Cl_{2}): \nu_{max} = 3689, 3456, 3155, 2948, 2907,
2869, 2253, 1793, 1709,1512,1468. 1381,1168; ^{1}H RMN (270 MHz,
CDCl_{3}): \delta=5,32-5,35 (m, 1H, H6'),
4,35-4,51 (m, 1H, H3'), 3,45-3,05
(m, 8H, H1, H2, H3, H5), 2,18-2,4 (m,2H, H4'),
1,8-2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'), 1,46 (s, 9H, Boc),
1,01-1,72 (m, 23H, H4, H1', H9', H11', H12',
H14'-H17', H22'-H25'), 0,97 (3H, s,
H-19'), 0,85 (d, J=6,5Hz, 3H, H21'), 0,82 (d,
J=6,5 Hz, 6H, H26'&H27') y 0,64 (s, 3H, H18'); MS
(FAB^{+}):m/z = 630 [M+H]^{+}, 530
[M-Boc]^{+}, 369 [Chol]^{+}, 145,
121, 95, 69, 57.
Ácido (Boc) aminooxiacético (9): El
hemiclorhidrato de O-(-carboximetil)hidroxilamina (1,16 g,
5,3 mmol), se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (40 ml) y el pH se ajustó
a 9 añadiendo trietilamina (3 ml). Entonces, se añadió
di-tert-butil-dicarbonato
(2,36 g, 10,6 mmol, 2,0 equiv) y la mezcla se agitó a temperatura
ambiente hasta que el Tlc indicó que la reacción se había cumplido.
El pH se bajó hasta 3, añadiendo HCl diluído. La mezcla reactiva se
dividió en partes entre el NH_{4}Cl acuoso saturado (20 ml) y el
CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La fase acuosa se extrajo con
CH_{2}Cl_{2} (3 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se
lavaron con H_{2}O (2 x 100 ml) y se secaron (Na_{2}SO_{4}).
El disolvente se eliminó in vacuo para obtener 9 como un
sólido blanco.
Rendimiento: (1,86 g, 97%); IR
(CH_{2}Cl_{2}): \nu_{max} = 3373, 2983, 2574, 2461, 1724,
1413, 1369, 1235 ; ^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}): \delta=4,48
(s,2H,CH_{2}), 1,48 (s, 9H, Boc); MS (FAB^{+}):m/z = 214
[M+Na]^{+}, 192 [M+H]^{+}, 135, 123, 109, 69.
Compuesto (Boc)aminooxilo (10):
N-hidroxisuccinimida (0,36 g, 3,13 mmol, 1 equiv), 9
(0,6 g, 3,13 mmol, 1 equiv), y
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,68 g, 3,13 mmol, 1
equiv), se disolvieron en EtOAc (90 ml), y se dejó que la mezcla
heterogénea fuera agitada a temperatura ambiente por la noche. La
mezcla se filtró entonces a través de una almohadilla de Celita®,
para eliminar la diciclohexilurea, que se formó como un precipitado
blanco (que se enjuagó con 60 ml de EtOAc), y se añadió a una
solución de 8 (1,97 g, 3,13 mmol, 1 equiv) en THF (10 ml). Se
mantuvo un pH de 8 para esta reacción heterogénea, añadiendo
trietilamina (6 ml). La mezcla resultante fue sometida a agitación a
temperatura ambiente por la noche. Al finalizar, la mezcla se filtró
y el disolvente se eliminó bajo presión reducida para dar lugar,
después de purificación mediante cromatografía instantánea
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 92:7:1), a un sólido blanco 10.
Rendimiento: 2,3 g (90%); ^{1}H RMN (270 MHz,
CDCl_{3}): \delta=5,33-5,35 (m, 1H, H6'),
4,4-4,52 (m, 1H, H3'), 4,3 (s,2H, H90,
3,2-3,42 (m, 8H, H1, H2, H4, H6),
2,23-2,35 (m,2H, H4'), 1,7-2,1 (m,
7H, H2', H7', H8', H5),1,44-1,46 (m, 18H, 2 Boc),
1-1,73 (m, 21H, H1', H9', H11', H12',
H14'-H17', H22'-H25'), 0,98 (3H,
s,H-19'), 0,85 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H21') y
0,83 (d, J=6, 5Hz, 6H, H26' & H27') y 0,65 (s, 3H, H18');
MS (FAB^{+}):m/z = 803 [M+H]^{+}, 703
[M-Boc]^{+}, 647, 603
(M-2Boc)]^{+}, 369,279,255, 235, 204, 145, 95,
69.
Hidroxilamina (11): A una solución 10
(1,1 g, 1,36 mmoles, 1 equiv) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml), se añadió
TFA (2 ml, 20,4 mmol, 15 equiv) a 0ºC. Se dejó que la solución fuera
sometida a agitación a temperatura ambiente durante 5 horas. A la
finalización, se añadió tolueno al TFA azeotrópico, a partir de la
mezcla reactiva. Los disolventes se eliminaron in vacuo para
proporcionar, después de purificación mediante cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 92:7:1 a 75:22:3), un sólido blanco
11 (709 mg).
Rendimiento: 86%; IR (CHCl_{3}): \nu_{max}
= 3306, 2948, 2850, 2246, 1698, 1647, 1541, 1467, 1253,1133,;^{1}H
RMN (270 MHz, CDCl_{3}): \delta=5,26-5,4 (m, 1H,
H6'), 4,4-4,52 (m, 1H, H3'), 4,12 (s, 2H, H9),
3,34-3,41 (m,2H, H2), 3,15-3,3 (m,
2H, H4), 2,6-2,74 (m, 4H, H1&H6),
2,14-2,39 (m, 2H, H4'), 1,62-2,1 (m,
7H, H2', H7', H8', H5), 1,02-1,6 (m,21H, H1', H9',
H11', H12', H14'-H17', H22'-H25'),
0,96 (3H ,s, H-19'), 0,86 (d, J=6,5Hz, 3H,
H21'), 0,83 (d, J=6,5 Hz, 6H, H26'& H27') y 0,66 (s, 3H,
H18'); MS (FAB^{+}):m/z = 603 [M+H]^{+}, 369
[Chol]^{+}, 160, 137, 109, 95, 81, 69, 55.
Compuesto manosil (12a): Una solución de
D-manosa (266 mg, 4,8 mmol) en tampón acético acuoso
(acetato sódico/ácido acético 0,1 M, pH, 4,7 ml), y una solución de
11 (290 mg, 0,48 mmol, 10 equiv) en DMF (7 ml), se mezclaron y
agitaron durante 3 días a temperatura ambiente. El disolvente se
eliminó in vacuo mediante liofilización y la cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3) suministró al producto 21,
que era un sólido blanco (233 mg, Rendimiento:65%). La pureza se
confirmó posteriormente mediante HPLC. El producto final contenía la
forma \beta-piranósica (82%) y la
\alpha-piranósica (18%), que no se aislaron, pero
que se caracterizaron en la mezcla.
MS (FAB^{+}):m/z = 765 [M+H]^{+}, 787
[M+Na]^{+}, 397, 369 [Chol]^{+}, 322, 240,121,109,
95, 81, 69, 57). Forma piranósica \beta. ^{1}H RMN (400
MHz, CD_{3}OD/CDCl3) [75/25]:\delta=7,64-7,62
(d, ^{3}J_{1a-2a}= 7Hz, 1H, H1a),
5,35-5,36 (m, 1H, H6'), 4,45-4,5
(s,2H, H9), 4,35-4,5 (m,1H, H3'),
4,19-4,24 (dd, 1H, H2_{a},
J_{1a-2a} = 7,4 Hz,
J2_{1a-3a} = 7,7 Hz),
3,81-3,9 (m, 1H, H3a), 3,73-3,8 (m,
2H, H4a, H6_{ax}a), 3,63-3,71 (m, 2H,
H5a,H_{eq}6a), 3,34-3,42 (m,2H,H2),
3,27-3,30 (m, 2H, H4), 3-3,08
(m,2H,H1), 2,9-2,98 (m, 2H,H6),
2,25-2,35 (m,2H,H4'), 1,78-2,07
(m,7H,H2', H7', H8', H5), 103-1,65 (m,21H,H1',H9',
H11', H12', H14'-H17', H22'-H25',
1,01 (3H, s, H-19'), 0,91 (d, J =6,5 Hz, 3H,
H21'), 0,85 (d, J=6,5 Hz, 6H, H26'& H27') y 0,69 (s, 3H,
H18'); ^{13}C RMN (400 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD [25/75]): 12,33
(C18'),19,20 (C21'), 19,74 (C19'), 21,91 (C11'), 22,91 (C27'),23,17
(C26'), 24,67 (C23'), 25,07 (C15'), 27,37 (C5), 28,85 (C25'),
28,96(C2'), 29,07 (C12'), 32,76 (C7'), 32,87 (C8'), 36,38
(C2), 36,78 (C20'), 37,09 (C1), 37,76 (C22'), 37,95 (C1'), 38,4
(C4), 39,36 (C4'), 40,41 (C24'), 40,76 (C16'), 46,16 (C6), 51,19
(C9'), 57,19 (C17'), 57,75 (C14'), 64,62 (C6a), 70,19 (C2a), 70,58
(C4a), 72,12 (C3a), 72,37 (C5a), 73,11 (C9), 75,91 (C3'), 123,39
(C6'), 140,72 (C5'), 155,02 (C1a), 158,69 (NHCOOChol), 173,1 (C8);
Forma \alpha-piranósica: datos idénticos,
excepto ^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD/CDCl3) [75/25]:
\delta=6,90-6,88,(d,^{3}J_{1a-2a}=
7Hz, 1H, H1a), 5-5,05 (dd,1H,H2a,
^{3}J_{1a-2a} = 7,3 Hz),
^{3}J_{2a-3a} = 7,6 Hz); ^{13}C RMN
(400 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD [25/75]): 65,33 (C2a), 155,79
(C1a),^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD/CDCl_{3}) [75/25]: falta
(m,1H,H3'), por debajo del pico del disolvente; confirmado mediante
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO):\delta=4,67-4,82
(m,1H,H3'). ^{13}C RMN (400 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) [25/75]:
falta C1, por debajo del pico de MeOH, confirmado mediante
correlación ^{1}H/^{13}C a 400 MHz, alrededor de 49. Las
asignaciones de la resonancia protónica se confirmaron utilizando un
tipo de gradiente ^{1}H DQF-COSY y TOCSY; la
correlación ^{1}H/^{13}C y DEPT 135 se utilizaron para asignar
de forma no ambigua las resonancias del carbono. La forma \alpha
piranosa dio ^{1}J^{13}C1a-H1a = 177 Hz y
la forma \beta piranosa dio
^{1}J^{13}C1a-H1a = 167 Hz. La etapa
sensible H^{1} NOESY confirmó la conformación.
Compuesto glucosilo (12b): Éste se
preparó con una solución de D-glucosa (150 mg,
0,82 mmol) y 11 (100 mg, 0,16 mmol) de forma similar a la
preparación de 12a, agitándose durante 1 día y purificándose
mediante cromatografía (CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3) para
obtener el producto 12b como un sólido blanco (103 mg, Rendimiento:
82%). La pureza se confirmó posteriormente mediante HPLC. El
producto final contenía el anómero de la
\alpha-piranosa y el anómero de la
\beta-piranosa 189%, que no se aislaron pero se
caracterizaron en la mezcla.
(FAB^{+}):m/z = 765 [M+H]^{+}, 787
[M+Na]^{+}, 391, 369 [Chol]^{+}, 309, 290,171,152,
135,123, 109, 95, 81, 69; Forma piranósica \beta.(300 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD) [90/10]:\delta=7,53-7,56
(d, J= 5,6 Hz, 1H, H1a), 5,26-5,36 (m, 1H,
H6'), 4,2-4,45 (m,3H, H9, H3'),
4,05-4,15 (m, 1H, H2a), 3,45-3,85
(m, 5H, H6a, H3a, H5a, H4a), 2,9-3,4 (m,H2,H4,MeOH),
2,9-3,15 (m,4H,H1, H6), 2,15-2,3
(m,2H, H4'), 1,65-2 (m,5H,H2',H7', H8'),
0,95-1,55 (m, 23H, H5, H1', H9',H11', H12',
H14'-H17', H22'-H25') 0,93 (3H, s,
H-19'), 0,84 (d, J=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78
(d, J = 6,5 Hz, 6H, H26'& H27') y 0,62 (s, 3H, H18');
Forma \alpha-piranósica: datos idénticos,
excepto ^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) [90/10]:
\delta=7,22-7,24, (d, J= 6,61 Hz, 1H, H1a),
4,95-5,07 (m, 1H, H2a);^{1}H RMN (300 MHz,
CD_{3}OD): (m,1H,H3') falta por debajo del pico del disolvente;
confirmado mediante ^{1}H RMN (300 MHz,
DMSO):\delta=4,7-4,86 (m,1H,H3').
Compuesto galactosilo (12c): Éste se
preparó con una solución de D-galactosa (50 mg, 0,27
mmol) y 11 (40 mg, 0,066 mmol) de manera similar a la preparación de
12a, agitándose durante 1 día y purificándose mediante cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3) para obtener el producto
12c como un sólido blanco (35 mg, Rendimiento:70%). La pureza se
confirmó posteriormente mediante HPLC. El producto final contenía un
15% de la forma \alpha-piranósica y un 85% de la
\beta-piranósica (85%), que no se aislaron, pero
se caracterizaron en la mezcla.
MS(FAB^{+}):m/z = 765
[M+H]^{+}, 588, 391, 369 [Chol]^{+}, 322, 290,165,
152, 135, 121, 109, 95, 81, 69; Forma piranósica
\beta.H^{1} RMN 270 MHz, DMSO:\delta=7,78-7,82
(m, 1H,NHCO de C8), 7,55-7,58 (d,J= 7,2 Hz, 1H,
H1a), 6,95-7,1 (m,1H, NHCOOChol),
5,25-5,37 (m,1H, H6'), 4,2-4,43
(m,3H,H9, H3'), 3,2-3,9 (m,H2a, H6a, H3a, H5a, H4a,
OH), 2,9-3,18 (m,4H, H2, H4),
2,4-2,65 (m,4H, H1, H6), 2,15-2,3
(m,2H, H4'), 1,67-2 (m,5H, H2', H7', H8'),
0,92-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12',
H14-H17', H22'-H25'), 0,96 (3H, s,
H-19'), 0,89 (D, J=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,84
(d, J=6,5Hz, 6H, H26'&H27') y 0,65 (s,3H,H18'). Forma
\alpha-piranósica: datos idénticos, excepto
^{1}H RMN (270 MHz, DMSO):6,86 -6,88 (d, J=6Hz, 1H,
H1a).
Ácido glucurónico (12d): Éste se preparó
con una solución de ácido D-glucurónico, monohidrato
de sal sódica (30 mg, 0,128 mmol, 1,5 equiv) y 11 (50 mg, 0,08 mmol)
de una forma similar a la preparación de 12a, se agitó durante 1
día, purificándose mediante cromatografía
(CH^{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22.3) para obtener la sal sódica
de 12d como un sólido blanco (41 mg, Rendimiento:60%). La pureza se
confirmó posteriormente mediante HPLC. El producto final contenía
un 15% de la forma \beta-piranósica y un 85% de la
\alpha-piranósica (85%), que no se aislaron, pero
se caracterizaron en la mezcla.
MS(FAB^{+}):m/z = 779
[M+H]^{+}, 733, 588, 411, 369[Chol]^{+},
336, 290, 240, 214, 159, 145,135, 121, 109, 95, 81, 69, 55. Forma
piranósica \beta.H^{1} RMN 300 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD
[75/25]:\delta=7,51-7,53 (d, J= 5,9 Hz, 1H,
H1a), 5,25-5,33 (m, 1H, H6'),
4,2-4,45 (m, 3H, H9, H3'), 3,8-4,1
(m, 3H, H2a, H3a, H4a), 3,6-3,75 (m,1H, H5a),
3,2-3,55 (m,H2, H4, MeOH), 2,7-3,15
(m, 4H, H1, H6), 2,18-2,32 (m, 2H, H4'),
1,62-2 (m,5H, H2', H7', H8'),
0,9-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12',
H14-H17', H22'-H25'), 0,93
(3H,s,H19'), 0,83 (d, J=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,77 (d,
J=6,5 Hz, 6H, H26'&H27') y 0,6 (s,3H, H18'); Forma
\alpha-piranósica: datos idénticos, excepto
^{1}H RMN (300 MHz, CD_{3}OD):\delta= 7,22 -7,24 (d,J=6,3Hz,
1H, H1a), 5-5,1 (m, 1H, H2a).
Compuesto
\beta-D-lactosilo (12e): Una
solución de \beta-D-lactosa que
contenía 25 a 30% de \alpha (1,13 g, 3,3 mmol) y 11 (200 mg, 0,33
mmol) en 14 ml de tampón acuoso DMF/ácido acético, se agitó durante
4 días a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó in
vacuo mediante liofilización y la cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3) suministró al producto 12e,
como un sólido blanco (145 mg, Rendimiento:47%). La pureza se
confirmó posteriormente mediante HPLC. El producto final contenía la
forma \beta-piranósica (85%) (que contenía ella
misma alrededor del 25% de \alpha lactosa), y la
\alpha-piranósica (15%), que no se aislaron, pero
que se caracterizaron en la mezcla.
MS (FAB^{+}):m/z = 927 [M+H]^{+},
588, 482, 369 [Chol]^{+}, 290, 243, 216, 178, 152, 135,
121, 109, 95, 81, 69, 55). Forma piranósica \beta.^{1}H
RMN (400 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD) [20/80]:\delta_{H} =
7,69-7,71
(d,^{3}J_{1a-2a}= 5,8Hz, 1H, H1a de
\beta lactosa), 7,66-7,68
(d,^{3}J_{1a-2a}= 6,2Hz, 1H, H1a de
\alpha lactosa), 5,35-5,37 (m, 1H, H6'),
4,37-4,6 (m,4H, H9, H3', H2a),
4,2-4,37 (m, 1H, H1b), 3,65-4,05 (m,
7H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,25-3,6 (m,8H,
H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH), 3-3,2 (m,4H, H1, H6),
2,25-2,42(m,2H, H4'),
1,8-2,15 (m,5H, H2', H7', H8'),
1-1,165 (m,23H, H5, H1', H9', H11', H12',
H14'-H17', H22'-H25'), 101, (3H, s,
H-19'), 0,91 (d,J= 6,5Hz, 3H, H21'), 0,85 (d, J=6,5
Hz, 6H, H26'&H27') y 0,69 (s,3H, H18');^{13}C RMN (400 MHz,
CDCL_{3}/CD_{3}OD [20/80]): ^{13}C RMN (400 MHz,
CDCL_{3}/CD_{3}OD:12,32 (C18'),19,2 (C21'), 19,76 (C19'), 21,94
(C11'), 22,91 (C27'), 23,17 (C26'), 24,7 (C23'), 25,1 (C15'), 27,22
(C5), 28,29 (C25'), 29(C2'), 29,1 (C12'), 32,8 (C7'), 32,92
(C8'), 36,29 (C22'), 36,81 (C10'), 37,12 (C1'), 37,99 (C6), 38,11
(C1), 39,48 (C2), 40,45 (C24'), 40,80 (C16'), 46,13 (C4'), 51,23
(C9'), 57,22 (C17'), 57,80 (C14'), 62,41 (C6a), 63,4 (C6a), 70,02
(C5b), 70,63 (C2a), 72,8 (C3a), 73 (C3'), 73,18 (C9), 74,75 (C2b),
76,8 (C3a), 81 (C4b), 92,39 (C1b), 105,2 (C3'), 123,42 (C6'), 140,72
(C5'), 154,8 (C1a), 156,2 (NHCOOChol), 173,1 (C8); Forma
\alpha-piranósica: datos idénticos, excepto
^{1}H RMN (400 MHz, CD_{3}OD/CDCl3) [80/20]:
\delta_{H}=7,04-7,05,(d,
^{3}J_{1a-2a}= 5,6 Hz, 1H, H1a),
5,05-5,07 (m,1H,H2a), 4,09-4,11
(m,1H, H3a); ^{1}H RMN (270 MHz, CD_{3}OD: falta (m,1H,H3'), por
debajo presumiblemente del pico del disolvente; confirmado mediante
^{1}H RMN (300 MHz, DMSO):\delta=4,7-4,85
(m,1H,H3'). Las asignaciones de la resonancia protónica se
confirmaron utilizando un tipo de gradiente ^{1}H
DQF-COSY y TOCSY; la correlación ^{1}H/^{13}C y
DEPT 135 se utilizaron para asignar de forma no ambigua las
resonancias del carbono. La etapa sensible H^{1} NOESY confirmó la
conformación.
Compuesto maltosilo (12f): Éste se
preparó con una solución de monohidrato de D-maltosa
(30 mg, 1,8 mmol, 5 equiv) y 11 (100 mg, 0,16 mmol) de manera
similar a la preparación de 12e, agitándose durante 1 día y
purificándose mediante cromatografía
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3) para obtener el producto
12f como un sólido blanco (100 mg, Rendimiento:65%). La pureza se
confirmó posteriormente mediante HPLC. El producto final contenía un
87% de la forma \alpha-piranósica y un 13% de la
\beta-piranósica que no se aislaron, pero se
caracterizaron en la mezcla.
MS(FAB^{+}):m/z = 927
[M+H]^{+}, 765, 588, 559, 484, 369 [Chol]^{+},
322, 290, 213, 167, 161, 143, 135, 121, 109, 95, 81, 69, 55.
Forma piranósica \beta. H^{1} RMN (300 MHz,
CDCl_{3}/CD_{3}OD [80/20] :\delta=7,55-7,57
(d,^{3}J_{1}_{a-2a} 5,3 Hz, 1H, H1a),
5,3 (s,1H, H6'), 4,85-5,02 (m, 1H, H3'),
4,09-4,22 (m,1H, H1b), 3,57-4
(m,7H, H3a, H4a, H5a, H4b, H5b, H6b), 3,2-3,6 (m,
8H, H2, H4, H6a, H2b, H3b, MeOH), 2,8-3,1 (m, 4H,
H1, H6), 2,1-2,36 (m, 2H, H4'),
1,6-2,05 (m,5H,H2,H7', H8'), 1-1,6
(m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12',
H14'-H17',H22'-H25'), 0,93 (3H, s,
H-19'), 0,83 (d,_{J}=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78 (d,
_{J} = 6,5 Jz, 6H, H26'& H27') y 0,6 (s, 3H, H18'); Forma
\alpha-piranósica: datos idénticos, excepto
^{1}H RMN (300 MHz, CD_{3} OD/CDCl_{3}
[80/20]:\delta=6,92-6,94 (d, J= 4,62 Hz,
1H, H1a), 5,02-5,15 (m,1H,H2a),
4,04-4,08 (m, 1H, H3a).
Compuesto maltotriosil (12g): Éste se
preparó con una solución de maltotriosa (246,4 mg, 0,46 mmol, 7
equiv) y 11 (40 mg, 0,066 mmol) de manera similar a la preparación
de 12e, agitándose durante 5 días y purificándose mediante
cromatografía (CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3) para obtener
el producto 12f como un sólido blanco (61 mg, Rendimiento:85%). La
pureza se confirmó posteriormente mediante HPLC. El producto final
contenía un 15% de la forma \alpha-piranósica y un
85% de la \beta-piranósica que no se aislaron,
pero se caracterizaron en la mezcla.
MS(FAB^{+}):m/z = 1111
[M+Na]^{+}, 1089 [M+H]^{+}, 588, 423, 391, 369
[Chol]^{+}, 240, 171, 159, 145, 121, 105, 95, 81, 69.
Forma piranósica \beta. H^{1} RMN (300 MHz,
CDCl_{3}/MeOH [20/80] :\delta=7,56-7,58 (d,
J=6Hz, 1H, H1a), 5,2-5,27 (m,1H, H6'),
4,9-4,95 (m, 1H, H3'), 4,2-4,45
(m,4H,H9, H3', H2a), 4,05-4,2 (m,2H, H1b,H1c),
2,95-4 (m, 21H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a,
H2b-6b, H2c-6c, MeOH),
2,85-2,95 (m,4H, H1,H6), 2,2-2,3
(m,2H, H4'), 1,8-2,1 (m,5H, H2'), H7', H8'),
0,98-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12',
H14'-H17', H22'-H25'), 0,94 (3H, s,
H-19'), 0,84 (d, J=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78
(d, J=6,5 Hz, 6H, H26'&H27') y 0,61 (s, 3H, H18');
Forma \alpha-piranósica: datos idénticos,
excepto ^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}/MeOH [20/80]:\delta=6,85
(d, J= 5,6 Hz, 1H, H1a).
Compuesto maltotetraosil (12h): Éste se
preparó con una solución de D maltotetraosa (200 mg, 0,3030 mmol) y
11 (80 mg, 0,133 mmol), agitándose durante 5 días y purificándose
mediante cromatografía (CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3) para
obtener el producto 12h como un sólido blanco (67,5 mg,
Rendimiento:41%). La pureza se confirmó posteriormente mediante
HPLC. El producto final contenía un 15% de la forma
\alpha-piranósica y un 85% de la
\beta-piranósica que no se aislaron, pero se
caracterizaron en la mezcla.
MS(FAB^{+}):m/z = 1251
[M+H]^{+}, 1273 [M+Na]^{+}, 369
[Chol]^{+}, 159, 145, 121, 109, 95, 81, 69; HRMS
(FAB^{+}) C_{55}H_{102}N_{4}O_{24}Na: [M+Na]^{+}
calculado, 1273.6782, encontrado 1273.6821. Forma piranósica
\beta. ^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}/MeOH [20/80]
:\delta=7,56-7,58 (d, 1H, H1a),
5,15-5,25 (m,1H, H6'), 4,95-5,1 (m,
1H, H3'), 4,38-4,5 (m,4H,H9, H3', H2a),
4,04-4,22 (m, 3H, H1b, H1c, H1d),
3,1-3,95 (m, 27H, H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a,
H2b-6b, H2c-6c,
H2d-6d, MeOH), 2,85-3,1(m,4H,
H1, H6), 2,2-2,33 (m,2H, H4'),
1,75'-2,1 (m,5H, H2', H7', H8'),
1-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9,H11', H12',
H14'-H17', H22'-H25'), 0,92 (3H, s,
H-19'), 0,82 (d, J=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,78
(d, J=6,5 Hz, 6H, H26'& H27') y 0,68 (s, 3H, H18');
Forma \alpha-piranósica: datos idénticos,
excepto ^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}/MeOH [20/80]:\delta=7 (d,
1H, H1a).
Compuesto maltoheptaosilo (12i): Éste se
preparó con una solución de D maltoheptaosa (100 mg, 0,08673 mmol) y
11 (30 mg, 0,0497 mmol), agitándose durante 7 días y purificándose
mediante cromatografía (CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{3} 75:22:3)
para obtener el producto 12i como un sólido blanco (46 mg,
Rendimiento:53%). La pureza se confirmó posteriormente mediante
HPLC. El producto final contenía un 15% de la forma
\alpha-piranósica y un 85% de la
\beta-piranósica que no se aislaron, pero se
caracterizaron en la mezcla.
MS(FAB^{+}):m/z = 1759
[M+Na]^{+}, 1737 [M+H]^{+}, 369
[Chol]^{+}, 145, 121, 109, 95, 81. Forma piranósica
\beta. H^{1} RMN (300 MHz, CDCl_{3}/MeOH [20/80]
:\delta=7,53-7,58 (d, 1H, H1a),
5,35-5,37 (m,1H, H6'), 4,97-5,12 (m,
1H, H3'), 4,45-4,6 (m,4H,H9, H3', H2a), 4,-4,5 (m,
6H, H1b, H1c-g), 3,1-3,9 (m, 45H,
H2, H4, H6a, H3a, H5a, H4a, H2b-6b,
H2c-6c, H2d-6d,
H2e-6e,H2f-6f,H2g-6g,MeOH),
2,7-3 (m,4H, H1, H6), 2,15-2,35
(m,2H, H4'), 1,7-2,1 (m, 5H, H2', H7', H8'),
1-1,6 (m, 23H, H5, H1', H9', H11', H12',
H14'-H17', H22'-H25'), 0,94 (3H, s,
H-19'), 0,84 (d, J=6,5 Hz, 3H, H21'), 0,77 (d,
J=6,5 Hz, 6H, H26'& H27') y 0,63 (s, 3H, H18'); Forma
\alpha-piranósica: datos idénticos, excepto
^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}/MeOH [20/80]:\delta=6,9 (d, 1H,
H1a).
Los ejemplos siguientes describen la preparación
de composiciones que comprende una secuencia nucleótida.
General: La
dioleoilfosfatidil-etanolamina (DOPE) se obtuvo de
Avanti Lipid (Alabaster, AL, USA). El plásmido pCMV\beta fue
producido por Bayou Biolabs (Harahan, LA, USA).
DC-Chol fue sintetizado en nuestro laboratorio. El
péptido Mu se sintetizó por M. Keller mediante química peptídica en
fase sólida Merrifield basada en la Fmoc estándar, sobre
resina Wang. Todos las demás sustancias químicas eran de
grado reactivo.
Preparación de los liposomas:
DC-Chol (7,5 mg, 15 \mumol) y DOPE (7,5 mg, 10
\mumol) se combinaron en diclorometano. La solución se transfirió
a un matraz de fondo redondeado (de 50 ml típicamente) eliminando el
disolvente orgánico bajo presión reducida (evaporador rotatorio), lo
que dio lugar a una fina película lipídica que se secó durante 2 a 3
horas in vacuo (al vacío). Después de esto, 4 mM de tampón
HEPES, pH 7,2, (3 ml), se añadieron al matraz de fondo redondeado,
de modo que la película lipídica pudiera hidratarse. Después de
someterla a un breve tratamiento con ultrasonidos, (de 2 a 3
minutos), bajo argón, la suspensión de liposomas catiónicos
resultante (concentración lipídica de 5 mg/ml), se extruyó (forzó
hacia afuera) mediante un dispositivo de extrusión (lípidos
Northern). Inicialmente, tres veces a través de dos filtros
amontonados de policarbonato (0,2 \mum), y diez veces entonces a
través de dos filtros amontonados de policarbonato (0,1 \mum),
para formar pequeños liposomas catiónicos unilamelares (diámetro
promedio de 105 nm según el análisis PCS). Las
concentraciones de lípidos (de 4 a 4,8 mg/ml aproximadamente), se
determinaron mediante el ensayo Stewart.
Preparación de complejos Liposoma: Mu:
ADN (LMD) y Liposoma:ADN (LD): Inicialmente, se prepararon
partículas mu:ADN (MD), haciendo mezclas de la siguiente manera. Se
añadieron soluciones de almacenamiento de ADN plasmídico
(típicamente 1,2 mg/ml) a una solución diluida mezclada en vórtice,
del péptido mu (1 mg/ml) en tampón 4 mM HEPES, pH 7,2. La
proporción final mu:ADN fue de 0,6:1 peso/peso, a menos que se
establezca otra cosa, y la concentración final del ADN plasmídico
fue de 0,27 mg/ml. Las soluciones que contenían MD se añadieron
entonces lentamente bajo condiciones vórtice, a suspensiones de
liposomas catiónicos que se habían sometido a extrusión
(típicamente 4,5 mg/ml aproximadamente), preparadas como se ha
descrito anteriormente, dando lugar a la formación de pequeñas
partículas LMD con una estrecha distribución del tamaño (120 \pm
30 nm), tal como se mide mediante PCS. Proporción Lípidos finales:
mu:ADN, 12:0,6:1 peso/peso/peso. Una solución de sacarosa (100%,
peso/vol) en tampón 4 mM HEPES, pH 7,2, se añadió entonces para
obtener suspensiones de partículas LMD en tampón 4mM HEPES, pH 7,2,
que contenían sacarosa al 10% peso/vol a la deseada concentración de
ADN (concentración final del ADN típicamente de 0,14 mg/ml),
almacenándose la totalidad a -80ºC. Se prepararon complejos
Liposoma:ADN (LD) (lipoplexos) para experimentos con una proporción
lípidos:ADN de 12:1 (peso/peso) siguiendo el mismo protocolo, sin
añadir el péptido Mu.
Mediciones del tamaño de las partículas:
Los tamaños de los lipoplexos se evaluaron después de 30 minutos de
exposición a 37ºC a los medios biológicos mediante Espectroscopía de
Correlación Protónica (N4 Plus, Coulter). La concentración
particular escogida del ADN era compatible con la condición in
vitro (1 \mug/ml de ADN). Los parámetros utilizados fueron:
20ºC, 0,089 cP, índice de reflexión de 1,33, ángulo de 90ºC, 632,8
nm. Se utilizó el análisis unimodal para evaluar el tamaño promedio
de la partícula en Optimem. El programa de distribución del tamaño
utilizando el algoritmo CONTIN se utilizó para separar la
subpoblación de pequeñas partículas séricas inferiores a 50 nm y
extractar el tamaño calculado de los lipoplexos en Optimem + FCS al
10%.
Transfección de las células HeLa: Se
sembraron las células en una placa de cultivo de 24 pocillos en un
medio DMEM suplementado con FCS al 10% y se dejaron crecer hasta
aproximadamente una confluencia del 70% durante 24 horas a 37ºC en
presencia de CO_{2} al 5%. Las células se lavaron en PBS antes que
se administrara a cada pocillo el medio de transfección (0,5 ml de
solución de 0,50 o 100% de Suero Fetal de Ternera en medio OptiMem
Dubelco. Se transfectaron 5 \mul en 100 \mug/ml de ADN (nls
\betagal) de LMD a células HeLa durante 30 minutos. Las células se
enjuagaron entonces 3 veces con PBS y se incubaron durante otras 48
horas en medio DMEM suplementado con FCS al 10%, antes de procesar
la expresión de \beta-Gal utilizando el equipo de
ensayo estándar del gen informador quimioluminiscente (Roche
Diagnostics, GmbH Cat nº 1758241).
Síntesis de los neoglicolípidos: Cada
miembro de la familia diana de los neoglicolípidos consistía en un
lípido que transportaba colesterol y una molécula oligosacárida
unida conjuntamente mediante un engarce. El enfoque sintético total
se dividió en dos partes: en primer lugar, la síntesis de un lípido
que contiene el engarce y en segundo lugar, el acoplamiento
quimioselectivo de este lípido con moléculas escogidas de azúcar. La
clave para esta estrategia es la formación de una hidroxilamina
(Figura 1).
Esta síntesis del lípido protegido por Boc (8),
se diseñó originariamente basándose en una metodología convergente
utilizando aminoalcoholes fácilmente disponibles como materiales de
inicio con una estrategia complementaria de bloqueo del grupo
amino. Esta metodología publicada previamente permitió la
preparación de este lípido basado en la poliamida para la
transferencia génica con pequeñas modificaciones.
Tal como se ha mencionado, la glicosilación de
los derivados hidroxilamínicos ofrece una solución elegante para
nuestros requerimientos sintéticos. El clorhidrato de
O-(Carboximetil)hidroxiamina disponible comercialmente fue
primero protegido con Boc y reaccionó entonces con la
N-hidroxisuccinimida y la
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), dando lugar al
correspondiente éster activado. Este compuesto se trató
inmediatamente in situ con el lípido (8) en THF a pH 8, permitiendo
(produciendo) una hidroxilamina protegida. Después de una
desprotección muy sencilla con ácido trifluoroacético acuoso, se
completó la síntesis del lípido hidroxilamino (11).
En este estadio, se investigó el potencial de
nuestro acoplamiento quimioselectivo haciendo reaccionar el lípido
(11) con diversos oligosacáridos no protegidos disponibles
comercialmente. Esta reacción se llevó a cabo bajo condiciones
suaves utilizando un sistema disolvente de DMF y un tampón de ácido
acético acuoso pH 4 (1:1), que facilita la solubilidad de ambos, el
azúcar y el lípido. Tal como se aprecia en la Figura 2, los
reaccionantes están en un equilibrio dinámico con el intermediario
protónico de cadena abierta. Para forzar el equilibrio a la
formación del producto, se añadió un exceso de azúcar. Debido a la
naturaleza anfifílica del producto neoglicolípido, se encontró que
el aislamiento durante el proceso era difícil como resultado de la
formación de micelas y de espuma. Los problemas de solubilidad
dificultaron asimismo el aislamiento, purificación y el
procedimiento analítico. Los tiempos de reacción y los rendimientos
variaron dependiendo del hidrato de carbono utilizado (Tabla
1).
\vskip1.000000\baselineskip
| Producto | Azúcar | Tiempos (días) | Rendimiento (%) | \beta/\alpha |
| 12a | Manosa | 3 | 65 | 82/18 |
| 12b | Glucosa | 1 | 80 | 89/11 |
| 12c | Galactosa | 1 | 70 | 85/15 |
| 12d | Ácido glucorínico | 1 | 60 | 85/15 |
| 12e | Lactosa | 4 | 50 | 85/15 |
| 12f | Maltosa | 1 | 65 | 87/13 |
| 12g | Maltotriosa | 5 | 85 | 85/15 |
| 12h | Maltotetraosa | 5 | 40 | 85/15 |
| 12i | Maltoheptaosa | 7 | 55 | 85/15 |
Conformación neoglicolípida: Las
conformaciones de los hidratos de carbono pueden determinarse
mediante RMN en solución. El dato más útil para la conformación en
el centro anomérico (C1a) es probablemente ^{1}J^{13}
C1a-H1a. El valor absoluto de esta constante de
acoplamiento depende de la orientación del enlace
carbono-hidrógeno respecto a los pares solitarios
del anillo de oxígeno, de la electronegatividad del sustituyente en
C1 y de la naturaleza de los sustituyentes electronegativos unidos
al resto de la molécula. La diferencia de ^{1}J^{13}
C1-H1 entre el anómero \alpha y \beta de las
piranosas puede utilizarse para determinar la configuración
anomérica. Está firmemente establecido que
^{1}J(C1-H1eq) es > a
^{1}J(C1-H1ax), con una diferencia
aproximada de 10 Hz. ^{1}J(C1-H1eq) es
habitualmente de aproximadamente 170 Hz y
^{1}J(C1-H1ax) a aproximadamente 160 Hz.
Valores más altos se observan cuando O-1 se
intercambia con elementos más electronegativos como el cloro o el
fluoro, pero se observa habitualmente una diferencia de 10 Hz. Se
han investigado las constantes de conjugación
carbono-hidrógeno de los furanósidos y
^{1}J(C1-H1eq) es > a
^{1}J(C1-H1ax), pero la diferencia es mucho
más pequeña (1 a 3 Hz).
Se considerará la caracterización basándose en
el ejemplo de la manosa, pero el mismo procedimiento de análisis se
utilizó para los otros sacáridos cuando las condiciones del análisis
RMN eran favorables. Pueden concebirse cuatro estructuras distintas
de anillo (Figura 3). Puede esperarse razonablemente que las formas
piranósicas se vean favorecidas respecto a los anillos de furanosa,
debido a razones estéricas. Por tanto, fuera de los dos compuestos
que se observan en la RMN, el principal es probablemente una
piranosa. El compuesto secundario que se observa podría no
atribuirse a un equilibrio mutarotatorio, porque la etapa sensible
NOESY no mostró un pico cruzado entre las dos señales C1a (probando
que es una molécula distinta). Por tanto, este compuesto no se
atribuyó a una forma furanósica, debido a que no se observó un
cambio de ^{13}C5a, y ^{13}C1a no se desprotegió, tal como se ha
demostrado para los equivalentes relacionados sustituidos de
furanosa.
Medimos ^{1}J^{13}C1a-H1a=
167 Hz para el principal compuesto y
^{1}J^{13}C1a-H1a= 177 Hz ara el secundario. El
valor absoluto de dichos ^{1}J^{13}C1-H1 es 10
Hz superior al esperado para la conformación clásica de
^{4}C_{1}, pero esto se explica por la extrema
electronegatividad del grupo hidroxilamina
O-sustituido que podría deformar ligeramente la
estructura de la cadena. Para los anillos de piranosa se ha
establecido que [^{1}J(C1-H1eq) -
^{1}J(C1-H1ax)] = 10 Hz, pudiéndose
concluir, por tanto, fácilmente, que el principal compuesto es el
anómero \beta(H1ax) y el compuesto secundario es el anómero
\alpha (H1eq).
La etapa ^{1}H sensible NOESY confirmó esta
conclusión. El efecto nuclear Overhauser se observó entre H1a y H2a
& H3a para el compuesto principal. Considerando la estructura
detallada anteriormente, este compuesto no podía ser el anómero
\alpha piranosilo, porque el H1 ecuatorial no puede interaccionar
en el espacio con H3, mientras que el anómero \beta es
perfectamente capaz de generar dichas interacciones. No se observó
el efecto nuclear Overhauser para H1a del compuesto secundario, pero
esto pudo deberse a una falta de sensibilidad. Por tanto, según los
datos procedentes de ^{1}J^{13}C1-H1 y los
análisis NOESY, conluímos que se produjeron dos formas
\alpha/\beta piranósicas de manosa (20/80).
La proporción muy similar de los isómeros
anoméricos (\beta/\alpha) que se obtuvo para los neoglicolípidos
no sorprende (Tabla 1), con la totalidad de los azúcares presentando
un hidroxilo ecuatorial en C2, excepto la manosa.
La proporción obtenida para este último
compuesto es sorprendente, porque del anómero \beta se informa
habitualmente como estéricamente menos favorable que el \alpha.
Una posible explicación es que esta reacción podría ser gobernada
por algunas interacciones secundarias (enlace hidrógeno) entre el
azúcar y el engarce hidroxilamina, estabilizando el anómero \beta
(de acuerdo con la observación de que la señal RMN del anómero
\beta está siempre mucho más desprotegida que la de \alpha). No
se espera que esta mezcla anomérica de glicolípidos sintetizados
afecte en gran medida a las propiedades biológicas investigadas de
los constructos liposómicos, por lo que no intentamos la tediosa
separación de estos diasteroisómeros mediante cromatografía líquida
preparativa de alta resolución.
Aplicación biológica: La
glicomodificación de LMD se basó en la capacidad natural de la
suspensión micelar para incorporarse a las membranas lipídicas. En
primer lugar, los LMD se formularon siguiendo el protocolo estándar
y en segundo lugar, una suspensión de micelas de neoglicolípidos
sintetizados en Tampón Hepes 4 mM pH 7, se añadieron a los LMD y se
incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, antes del
almacenamiento habitual a -80ºC. Distintos porcentajes de todos los
neoglicolípidos producidos se ensayaron respecto al efecto de
estabilización, pero sólo la cadena más larga (maltotetraosa 12h y
maltoheptaosa 12i) mostró propiedades significativas en menos del
10% (datos no representados).
El efecto de estabilización del LMD modificado
por los neoglicolípidos, se demostró por la incorporación de un
porcentaje 7,5 molar del compuesto 12h o 12i. Se sabe que las capas
lipídicas de la formulación que se basa en los liposomas, se
agregan después de exposición a la sal o al suero. Puede hacerse el
seguimiento de este fenómeno midiendo el aumento del tamaño
promedio de las partículas después de un tiempo que se fija;
cualquier estabilización de la partícula LMD se reflejará en una
reducción de este parámetro. Se escogió para medir el tamaño de los
lipoplexos mediante Espectroscopía de correlación fotónica (PCS)
después de 30 minutos de exposición a 37ºC a OptiMem o OptiMem + FCS
al 10%, para simular las condiciones estándar in vitro. No se
pudo analizar el efecto con PCS a porcentajes séricos más altos,
siendo las condiciones demasiado extremas para permitir la toma de
mediciones significativas. La Figura 4 describe el porcentaje del
aumento del tamaño de estos lipoplexos.
Los resultados indican una clara estabilización
de las partículas entre el LMD y la formulación liposómica estándar.
La introducción de neoglicolípidos con un porcentaje del 7,5% se
demostró significativamente beneficiosa en OptiMem y en el suero al
10%. La incorporación de 12i mostró ser la más eficiente. Este
resultado indica la necesidad de largas cadenas de hidratos de
carbono para crear cepillos moleculares eficientes en la parte
superior de estas capas lipídicas catiónicas.
Incluso si se demuestra algún grado de
estabilización, da lugar habitualmente a una reducción de la
afinidad del LMD cargado positivamente respecto a la membrana
celular cargada negativamente, induciendo una disminución en la
capacidad de transfección del constructo. Sin embargo, en este caso,
los resultados de la transfección in vitro indicaron una
potenciación de la eficiencia de la transfección, debida a la
modificación neoglicolípida en ambas condiciones séricas, del 0% y
del 50% (Figura 5). Este resultado se atribuyó a un efecto protector
de alcance corto debido a estos neoglicolípidos que dificultan las
interacciones basadas en las fuerzas de van der waals de alcance
corto entre las bicapas lipídicas de polaridades similares, pero que
no afectan a las interacciones de carga, de alcance más largo, entre
membranas cargadas de forma opuesta. Basándose primariamente la
agregación inducida por el suero en la interacción de LMD con las
proteínas cargadas negativamente, el efecto beneficioso de nuestros
neoglicolípidos disminuyó asimismo con un porcentaje creciente del
suero (sin beneficio significativo en suero al 100%).
Claims (19)
1. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula
que comprende hacer
reaccionar
(i) un compuesto de fórmula; y
(ii) un compuesto de fórmula
mezclado con, o asociado con una
secuencia nucleótida, o un agente farmacéuticamente
activo;
en el que B es un lípido y A es una fracción de
interés (MOI);
en el que X es un grupo de engarce opcional;
en el que R_{1} es H o un grupo hidrocarbilo;
y
en el que R_{2} es un par solitario o R_{4},
en el que R_{4} es un sustituyente apropiado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la reacción se lleva a cabo en un medio acuoso.
3. Composición que comprende
(i) un compuesto de fórmula
(ii) un compuesto de fórmula
y
(iii) una secuencia nucleótida, o un agente
farmacéuticamente activo;
en el que B es un lípido y A es una fracción de
interés (MOI);
en el que X es un grupo de engarce opcional;
en el que R_{1} es H o un grupo hidrocarbilo;
y
en el que R_{2} es un par solitario o un
sustituyente apropiado.
4. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que X está presente.
5. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que X es un grupo hidrocarbilo.
6. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que R_{2} es un grupo
hidrocarbilo.
7. Invención según la reivindicación 6, en la
que R_{2} es un grupo hidrocarbilo que contiene heteroátomos
opcionales seleccionados de entre O, N y halógenos.
8. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que R_{2} es H.
9. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que R_{1} es H.
10. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que el enlace C=N es ácido lábil o
ácido resistente.
11. Invención según la reivindicación 10, en la
que el enlace C=N es ácido lábil.
12. Invención según la reivindicación 10, en la
que el enlace C=N es ácido resistente.
13. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el lípido es o comprende un
grupo colesterol.
14. Invención según la reivindicación 13, en la
que el grupo colesterol es colesterol.
15. Invención según la reivindicación 13, en la
que el grupo colesterol está unido a X mediante un enlace carbamoil
o un enlace éter.
16. Invención según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en la que el lípido está unido a X mediante
un grupo poliamina.
17. Invención según la reivindicación 16, en la
que el grupo poliamina no es una poliamina que se encuentra
naturalmente.
18. Invención según la reivindicación 16 ó 17,
en la que el grupo poliamina contiene por lo menos dos aminas del
grupo poliamina, que están espaciadas una de otra mediante un grupo
etileno (-CH_{2}CH_{2}-).
19. Invención según la reivindicación 16, en la
que la poliamina es cualquiera de entre la espermidina, la espermina
o la caldopentamina.
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