CN1524125A - 化合物 - Google Patents

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M·凯勒
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Abstract

本发明提供一种能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物包含胆固醇基团和碳水化合物部分。

Description

化合物
本发明涉及一种化合物。另外，本发明涉及制备所述化合物的方法和所述化合物在治疗、特别是基因治疗(特别是基因转移)中的应用。
基因治疗的一方面涉及将外来的核酸(如DNA)引入细胞中，使得其表达蛋白质可以发挥预期的治疗功能。1a
该种治疗的实例包括植入TK、TSG或ILG基因来治疗癌症，植入CFTR基因来治疗囊性纤维化；植入NGF、TH或LDL基因来治疗神经变性疾病和心血管疾病；插入IL-1拮抗剂基因来治疗类风湿性关节炎；植入HIV抗原和TK基因来治疗AIDS和CMV感染；植入抗原和细胞因子发挥疫苗作用；和植入β-珠蛋白来治疗血红蛋白有关病，如地中海贫血。
很多现有的基因治疗研究利用腺病毒基因载体-如Ad3或Ad5-或其他基因载体。然而，严重的问题与它们的应用有关。2a这促进了危险性较小、非病毒的基因转移方法的开发。3a
一种具有重大潜力的非病毒转移系统涉及利用阳离子脂质体。4a在这点上，阳离子脂质体--通常由天然磷脂和阳离子脂质(lipid)组成--已经用于将DNA4a、mRNA5a、反义低聚核苷酸6a、蛋白质7a和药物8a转移到细胞中。许多阳离子脂质体通过商业渠道获得4a，9a并且很多新的阳离子脂质已于近期合成10a。这些脂质体的功效已通过体外4a和体内11a试验说明。
一种天然的用于制备阳离子脂质体的磷脂是N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵，此外已知称作“DOTMA”。
一种最常用的阳离子脂质体体系由天然脂质体二油酰基磷脂酰基乙醇胺(通常已知称作“DOPE”)和一种阳离子脂质，3β-[(N，N-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(通常已知称作“DC-Chol”)12a，的混合物组成。
尽管阳离子脂质体的功效是已知的，但仍然需要完善阳离子脂质体在人类基因治疗中的基因转移功效10a。随着人类基因组工程项目方案接近完成，如基因治疗中所述，预期，利用基因进行治疗的医疗革命正逐步地到来。在本文中，尽管不如病毒技术有效，但科学界正逐步地认识到，非病毒性输送是人类应用最安全的选择。
近十年，随着复杂的大分子构造包括很多不同的现有技术要素(病毒蛋白质或肽、脂质体、聚合物、靶策略和隐身特性)的神奇出现，本领域已经取得很大的进展。
我们共同未决的申请PCT/GB00/04767中讲授了一种系统，它是由病毒核心肽Mu、质粒DNA和阳离子脂质体(LMD)三种组分构成的。该平台技术给我们提供了良好的体外成功经验并因此预示体内的结果。但就所有现有非病毒技术而言，需要进一步开发以便获得体内治疗水平。
为此，制剂必须达到颗粒在生物液体(血清、肺粘液)中的稳定性并且仍然保持有效的转染能力。
该要求是所有现有技术需要克服的主要障碍之一。现有的稳定的制剂[1，2]几乎无法实现转染并且大多数现有的有效的转染剂由于该不稳定性[3-7]而明显地限制在其应用范围内。
给药(当全身应用时在血液中或者当肺局部给药时在粘液中)后，带电配合物暴露到盐和生物大分子中，结果导致强烈的胶体聚集并在其表面上吸附生物活性因子(调理素)[8-11]。基因载体经历剧烈的变化，该变化可能包括沉淀、导致粒子由巨噬细胞消除的蛋白质结合和表面的干扰导致其破坏。最广泛应用的稳定的制剂涉及表面接枝的聚乙二醇(PEG)链[12，13]。PEG是无毒的天然聚醚，它具有巨大的排斥大多数大分子的排它容积。不幸的是，制剂表明所需水平的稳定作用损失其基因转化能力；这可能是由于其细胞的非特异性亲和力降低或者丧失其所需的核内体的断裂特性[14，15]。
避免生物液对脂肪丛(lipoplexes)破坏作用的另一种方法是试图模拟自然情况并用多糖来包覆脂质双层的表面[16，17]。
本发明改善了现有技术的问题。
本发明一方面提供能够起到阳离子脂质作用的化合物，所述化合物包括胆固醇基团和碳水化合物部分。
本发明另一方面提供制备本发明化合物的方法，该方法包括将包含胆固醇基团和多元胺的化合物与糖类(saccharide)反应。
本发明另一方面提供用于治疗的本发明的化合物或按照本发明方法制备的化合物。
本发明另一方面提供利用本发明的化合物或按照本发明方法制备的化合物在制备治疗遗传性异常(disorder)、状况(condition)或疾病(disease)的药物中的应用。
本发明另一方面提供由本发明的化合物或按照本发明方法制备的化合物形成的阳离子脂质体。
本发明另一方面提供制备阳离子脂质体的方法，该方法包括由本发明的化合物或按照本发明方法制备的化合物形成所述阳离子脂质体。
本发明另一方面提供用于治疗的本发明的阳离子脂质体或按照本发明方法制备的阳离子脂质体。
本发明另一方面提供利用本发明的阳离子脂质体或按照本发明方法制备的阳离子脂质体在制备治疗遗传性异常、状况或疾病的药物中的应用。
本发明另一方面提供核苷酸序列与本发明化合物、按照本发明方法制备的化合物、本发明脂质体或按照本发明方法制备的脂质体中的任何一种或多种物质的组合。
本发明另一方面提供用于治疗的本发明组合。
本发明另一方面提供本发明组合在制备治疗遗传性异常、状况或疾病的药物中的应用。
本发明另一方面提供一种药物组合物，它包含与药物混合的和任选地与可药用稀释剂、载体和赋形剂混合的本发明化合物和按照本发明方法制备的化合物。
本发明另一方面提供一种药物组合物，它包含与药物混合的和任选地与可药用稀释剂、载体和赋形剂混合的本发明阳离子脂质体和按照本发明方法制备的阳离子脂质体。
本发明其他发明在所附权利要求中定义。
确信，本发明化合物的主要优势是它可在阳离子脂质体的制备中用作阳离子脂质(两亲物)，其中，所述阳离子脂质体用于基因治疗中，特别是用于将核苷酸(包括基因和反义DNA/RNA)转移到细胞中(体外、体内和离体)以便产生治疗作用。
碳水化合物具有许多生物学功能。我们已经开发了它们的联合靶向性和稳定性[18-20]。我们基于以前开发的包含胆固醇的阳离子脂质已经设计了糖脂类物质以便适当地插入到双层结构中。为了评价稳定我们的体系所需的碳水化合物基元的最小尺寸，选择化学选择性方法[21- 23]以便于调整糖苷单位的数目[24-26]。关键步骤开发了形成用于脂质与含醛化合物如简单的碳水化合物结合的肟键。与用于合成糖脂的其他方法截然不同，该过程允许保留高效的糖类单位的环特性，比传统的方法更简单并且不要求有用于偶合的每一个新糖的广泛的保护基团操作而只要求有醛形式存在(变旋平衡)。
因此，本发明另一方面提供制备本发明化合物的方法，该方法包括将包含胆固醇基团和多元胺基团的化合物与未保护的糖类反应。
优选的方面
在一个优选的方面中，本发明化合物具有式Chol-L-Carb，其中Chol是胆固醇基团，L是任选的连接基(linker group)，而Carb是碳水化合物部分。
在一个优选的方面中，胆固醇基团为胆固醇。
在一个优选的方面中，将胆固醇基团与任选的连接基通过氨基甲酰基键连接。
在一个非常优选的方面中，本发明化合物具有式Chol-L-Carb，其中Chol是胆固醇，L是多元胺基团，而Carb是葡萄糖，优选D-葡萄糖。
连接基
在一个优选的方面中，连接基是多元胺基团。确信多元胺基团是有利的，因为它增加DNA结合能力和所得到的脂质体的基因转移的功效。
在一个具体实施方案中，优选地，所述多元胺基团是天然存在的多元胺。确信多元胺头基(head-group)是有利的，因为所增加的氨基官能团增加脂质体的总正电荷。另外，已知多元胺强烈地结合和稳定DNA14a。另外，因为多元胺天然存在于细胞中，所以确信毒性问题降低到最小15a。
在另一具体实施方案中，优选地，本发明多元胺基团中的两个或者多个胺基团被一个或者多个非天然的基团所分隔，即天然存在的多元胺化合物的胺基团被分隔(也就是说本发明优选的的多元胺基团具有非天然间隔)。
优选地，本发明多元胺基团包含至少两个被亚乙基(-CH2CH2-)基团相互分隔(相互间隔)的多元胺基团的胺。
优选地，多元胺基团中的每个胺都被亚乙基(-CH2CH2-)基团所分隔(相互间隔)。
合适的多元胺的典型实例包括亚精胺、精胺、caldopentamine、去甲亚精胺(norspermidine)和去甲精胺(norspermine)。优选的多元胺是亚精胺或者精胺，因为已知这些多元胺与单股或者双股DNA相互作用。另一种优选的多元胺是caldopentamine。
在一个优选的方面，连接基是聚乙二醇(PEG)基团。PEG基团大小优选包含4-16个氧亚乙基单位，例如4、6、8、10、12、14或者16个氧亚乙基单位。
在一个优选的方面，连接基包含PEG基团和多元胺基团。在一个优选的方面，连接基是氧亚乙基基团和胺基团的共轭物。在这些优选的方案中，上文所公开的PEG基团和多元胺基团的优选特征平等使用。
碳水化合物
在一个优选的方面，碳水化合物部分是单糖。
在一个优选的方面，碳水化合物部分是糖(sugar)部分。
优选地，碳水化合物部分选自甘露糖、葡萄糖(D-葡萄糖)、半乳糖、葡糖醛酸、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽七糖及其混合物。更优选地，碳水化合物部分是D-葡萄糖。
一方面，本发明化合物包含1-7个碳水化合物部分。优选地，所述化合物包含1个碳水化合物部分。
胆固醇
胆固醇基团可以是胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的实例包括取代的衍生物，其中一个或者多个环状CH2或CH基团和/或一个或者多个直链CH2或CH基团被适当取代。或者，或另外，一个或者多个环状基团和/或一个或多个直链基团可以是不饱和的。
在一个优选的实施方案中，胆固醇基团是胆固醇。相信胆固醇是有利的，因为它稳定所得脂质体的双层。
优选地，胆固醇基团通过氨基甲酰基键连接到任选的连接基上。相信这种连接是有利的，因为所得脂质体具有低的或者最小的细胞毒性。
其他方面
优选地，所述化合物与核苷序列混合或联合(associated)。
核苷序列可以是可用于治疗如基因治疗的部分或者全部表达系统。
在一个优选的方面，本发明的化合物与缩合的多肽/核酸配合物结合以提供非病毒核酸传递载体。缩合的多肽/核酸配合物优选包括在我们的共同未决申请PCT/GB00/04767中所公开的那些。优选地，多肽或其衍生物能够结合核苷酸配合物。优选地，多肽或其衍生物能够缩合核苷酸配合物。优选地，核酸配合物与多肽或其衍生物是异种的。
优选地，本发明方法包括使用分子筛。
优选地，阳离子脂质体由本发明化合物和中性磷脂如DOTMA或DOPE形成。优选地，中性磷脂是DOPE。
一方面，糖类与多元胺基团通过多元胺末端胺结合。换句话说，多元胺的伯胺被取代。
总而言之，本发明提供一种能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物包括胆固醇基团和碳水化合物部分。
本发明的优选实施方案是能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物包括通过多元胺基团与糖类相连的胆固醇基团。
本发明更优选的实施方案是能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物包括通过多元胺基团与葡萄糖相连的胆固醇基团。
本发明尤其优选的实施方案是能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物包括通过多元胺基团与葡萄糖(优选D-葡萄糖)相连的胆固醇。
在本发明的一个方面中，本发明的糖类可以被聚乙二醇类(apolyethylene glycol，PEG)全部或者部分取代。因此，本发明的再一方面提供
·能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物含有胆固醇基团和聚乙二醇类部分。
·能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物含有通过多元胺基团与聚乙二醇类相连的胆固醇基团。
·能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物含有通过多元胺基团与聚乙二醇(polyethylene glycol)相连的胆固醇基团。
·能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物含有通过多元胺基团与聚乙二醇相连的胆固醇。
一方面，本发明的阳离子脂质用糖(sugar)部分或者聚乙二醇(PEG)部分来修饰。另一方面，本发明的配合物还包含能够起阳离子脂质的化合物，该化合物含有具有通过胺基团与之相连的糖部分或聚乙二醇部分的胆固醇基团。如实施例说明的，我们发现这些糖/PEG修饰的阳离子脂质是特别有利的。因此，再一方面本发明提供能够起阳离子脂质的化合物，该化合物含有通过胺基团与其相连的糖部分或聚乙二醇类部分的胆固醇基团。优选地，化合物包含1-7个糖部分或聚乙二醇类部分。化合物可包含糖部分和聚乙二醇部分的混合物。优选地，糖部分是或衍生自葡萄糖或D-葡萄糖。
现通过实施例并参考附图来进一步详细地描述本发明，其中
图1-方案1羟胺脂质11的合成。试剂：(a)CH2Cl2，Et3N，Boc2O，rt，5h，98％；(b)EtOAc，N-羟基琥珀酰亚胺(1eq.)，DCC(1eq.)，10h.，rt；(c)(8)，EtOAC/THF[95/5]，Et3N(pH＝8)，2h.，r.t，90％；(d)CH2Cl2，TFA(15eq)，0℃，N2，5h，86％。
图2-用D-葡萄糖化学选择性糖化O-取代羟胺的原理(尽管示出的是β-异头物，但变旋也发生，并且也产生α-异头物)。
图3-由甘露糖得到的新糖脂的可能的结构。
图4-通过光子相关性光谱学(PCS)分析不同的脂肪丛大小的结果。30分钟后，在[DNA]＝1μg/ml，Optimem+/-10％FCS和37℃下测定脂肪丛的大小。以Optimem(白色)和10％血清(黑色)将标准LMD制剂(LMD)和通过加入7.5摩尔％产物12h和12i修饰的LMD进行比较并且以其比最初测定的180nm大小增加的百分数来表示。
图5-在0％(白色)、50％(黑白)和100％血清(黑色)条件下比较基础LMD和用7.5摩尔％产物12h和12i糖修饰的LMD对海拉细胞的转染效率。结果以就每毫克蛋白而言的相对光单位(n＝4)来表示。
现通过下列实施例来更详细地描述本发明。
实施例
实验部分
新糖脂的合成
概述：室温下，在Brucker DRX400，DRX300或Jeol GX-270Q分光计上记录1H-NMR光谱，残留的非放射性标记的溶剂(例如CHCl3，δH＝7.26)作为内标。在相同范围的分光计上，分别在100、75和68.5MHz下记录13C-NMR光谱，也用残留的非放射性标记的溶剂(例如CHCl3，δc＝77.2)作为内标。在Jasco FT/IR 620上，利用NaCl板来记录红外光谱并且利用VG-7070B或JEOL SX-102仪器记录质谱(阳离子电喷)。色谱法是指闪式柱色谱法，它是在Merck-Kieselge l60(230-400目筛)上用适宜的溶剂进行的。在预涂布的Merck-Kieselgel 60 F254铝支持板进行薄层色谱层析(TLC)并用紫外光、碘、酸性钼酸铵(IV)、酸性乙醇化香草醛或其他合适的试剂进行显色。使用分析性高压液相色谱层析(HPLC)在Hitachi系统用PurospherRP-18封端柱(5μm)评价新糖脂的纯度。以1ml/min的等度流速用CH3CN/H2O(60∶40)进行洗脱，馏分收集前在205nm处进行检测并进行质谱分析。用前使用五氧化二磷蒸馏无水CH2Cl2。所有其他无水溶剂和化学试剂都购自Sigma-Aldrich公司(Poole，Dorset，UK)。
缩写：Boc：叔丁氧基羰基；br：宽的；Chol：胆固醇基团；DMF：N，N-二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；TFA：三氟乙酸；THF：四氢呋喃。
2-(胆固醇氧基羰基)氨基乙醇(2)：在0℃和搅拌下，用2小时的时间将胆固醇氯甲酸酯(99.89g，0.218mol)的CH2Cl2(600ml)溶液加到2-氨基乙醇(29.5ml，0.489mol，2.2当量)的CH2Cl2(450ml)溶液中。反应物温热至室温并连续搅拌14小时。反应混合物用饱和NaHCO3(2×200ml)、水(2×200ml)洗涤，干燥(MgSO4)并减压除去溶剂。所得到的固体重结晶(CH2Cl2/MeOH)得到2的白色固体。收率：99.67g(97％)；m.p.：Rf＝0.26(丙酮/乙醚1∶9)；
                                         IR(CH2Cl2)：vmax＝3353，2942，2870，1693，1674，1562，1467，1382，1264cm-1；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.35(d，J＝6.5Hz，1H，H6′)，5.25-5.29(m，1H，NH)，4.42-4.57(1H，m，H3′)，3.70-3.62(m，2H，H1)，3.25-3.35(m，2H，H2)，3.12(s，1H，OH)，2.28-2.38(m，2H，H4′)，1.77-2.03(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1.59-0.96(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，1(3H，s，H-19′)，0.9(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，.87(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和.67(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝496 [M+Na]+， 474[M+H]+， 369[Chol]+，255，175，145，105，95，81，43.
2-[(胆固醇氧基羰基)氨基]乙基甲磺酸酯(3)：在0℃下，向2(25g，52.3mmol)和三乙胺(22ml，0.16mol，3当量)的CH2Cl2(500ml)溶液中滴加甲磺酰氯溶液(10.5ml，0.13mol，2.5当量)。反应混合物在室温下温热并搅拌1.5小时。Tcl分析表明反应已经完成后，加入冰淬灭反应。将反应混合物加到饱和NH4Cl(600ml)中，并用乙醚(3×300ml)提取。合并的有机层用水(2×300ml)、盐水(250ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。减压除去溶剂得到白色固体，通过色谱法纯化(乙醚)得到3。收率：28.3g(98％)；
                                           IR(CH2Cl2)：νmax＝3453，3342，1716，1531，1377，1137&798cm-1；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.34(d，J＝6.5Hz，1H，H6′)，5-5.1(m，1H，NH)，4.41-4.53(1H，m，H3′)，4.29-4.25(t，J＝5Hz，2H，H1)，3.47-3.52(m，2H，H2)，3.01(s，3H，H3)，2.24-2.36(m，2H，H4′)，1.74-2(m，5H，H2′，H7′，H8′)，0.9-1.6(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.98(3H，s，H-19′)，0.84(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，.83(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和.65(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝1104[2M+H]+，574[M+Na]+，552[M+H]+，369[Chol]+，255，175，145，95，81.
4-氮杂-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己醇(4)：在搅拌下，向溶解在最小量THF中的3(28.3g，51mmol)的溶液中加入氨基丙醇(160ml，2mol，38当量)。一旦Tcl表明反应完成(12h)，加入CHCl3(350ml)和K2CO3(20g)并将溶液剧烈搅拌30分钟。然后，将悬浮液通过短的Celite垫过滤，用CHCl3充分洗涤。将其用饱和碳酸氢钠洗涤并干燥(Na2CO3)。除去溶剂得到4的白色固体。收率：26.1g(96％)；
IR(CH2Cl2)：νmax＝3350-3210，2937，2850，1531，1460，1380，1220，1120，1040cm-1；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.33-5.35(m，1H，H6′)，4.92-4.96(m，1H，NH)，4.42-4.51(1H，m，H3′)，3.7-3.83.(m，2H，H5)，3.23-3.29(m，2H，H1)，2.73-2.57(m，6H，H2，H3，H4)，2.2-2.36(m，2H，H4′)，1.7-2(m，5H，H2′，H7′，H8′)，0.85-1.58(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.98(3H，s，H-19′)，0.84(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，.8(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.61(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝543[M+Na]+，530[M+H]+，485[M-CO2]+，369[Chol]+，144[M-Ochol]+，69，55.
4-氮杂-(Boc)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己醇(5)：向4(26.1g，49mmol)的CH2Cl2(200ml)溶液中加入Et3N(8.3ml，1.1当量)和Boc2O(10.7g，1当量)并将所得到的溶液进行Tlc分析。当反应完成后，将反应混合物倾入NH4Cl(100ml)中并用水洗涤，然后干燥(Na2SO4)。真空除去溶剂得到白色固体5。减压除去溶剂得到白色固体，通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 92∶7∶1)进行纯化得到3。收率(27.9g，90％)；
                                                IR(CH2Cl2)：νmax＝3352，3054，2937，1675，1530，1455，1380，1220，1120；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.33-5.35(m，1H，H6′)，4.86(m，1H，NH)，4.42-4.5(1H，m，H3′)，3.62-3.7(m，2H，H5)，3.27-3.38(m，6H，H1，H2，H3)，2.18-2.33(m，2H，H4′)，1.73-2(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1.45(s，9H，Boc)，1-1.65(m，23H，H4，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.97(3H，s，H-19′)，0.93(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.8(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.65(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝654[M+Na]+，543 [M-Boc]+，369[Chol]+， 145，121，95，69，57.
4-氮杂-(Boc)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己基甲磺酸酯(6)：该实验通过与制备2-[(胆固醇氧基羰基)氨基]乙基甲磺酸酯3类似的方法，在44mmol规模下进行得到6。收率(28g，90％)；
             IR(CH2Cl2)：νmax＝3305，2980，2900，2865，1675，1530，1455，1350，1150；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.33-5.35(m，1H，H6′)，4.86(m，1H，NH)，4.35-4.55(m，1H，H3′)，4.22(t，2H，J＝6.5Hz，H5)，3.2-3.4(m，6H，H1，H2，H3)，3.01(s，3H，H6)，2.15-2.33(m，2H，H4′)，1.73-2(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1.44(s，9H，Boc)，1-1.67(m，23H，H4，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.97(3H，s，H-19′)，0.94(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.8(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.65(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝722[M+Na]+， 609[M-Boc]+，369[Chol]+，145，121，95，69，55.
4-氮杂-(Boc)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己胺(7)：在氮气环境和搅拌下，向6(25g，35mmol)、叠氮化钠(11.49g，157.7mmol，5当量)和碘化钠(5g，35mmol，1当量)中加入无水DMF(200ml)。安装回流冷凝器，在80℃下加热2h，反应结束。让反应混合物冷却至室温，减压除去DMF，残渣溶解在EtOAc中。用水(2×100ml)、盐水(100ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。通过色谱法(己烷/乙醚1∶1)进行纯化得到白色固体。收率(22g，95％)；
                                                       1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.34-5.36(m，1H，H6′)，4.35-4.55(m，1H，H3′)，4.25(t，2H，J＝6.5Hz，H5)，3.2-3.5(m，6H，H1，H2，H3)，2.25-2.33(m，2H，H4′)，1.7-2.05(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1.45(s，9H，Boc)，1-1.72(m，23H，H4，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.98(3H，s，H-19′)，0.94(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.83(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.64(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝568[M+Na-Boc]+，556[M-Boc]+，369[Chol]+，145，121，95，69，57.
4-氮杂-(Boc)-N6(胆固醇氧基羰基氨基)己胺(8)：向装有7(22.75g，34.6mmol)的THF(230ml)溶液圆底烧瓶中加入三甲基膦的THF溶液(1M，40ml，1.15当量)并通过tlc监测反应。反应结束时，将反应物与水(3ml)和氨水(3ml)一起搅拌1h并减压除去溶剂。通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH392∶7∶1-75∶22∶3)进行纯化得到8的白色结晶。收率(19.1g，88％)；
IR(CH2Cl2)：νmax＝3689，3456，3155，2948，2907，2869，2253，1793，1709，1512，1468，1381，1168；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.32-5.35(m，1H，H6′)，4.35-4.51(m，1H，H3′)，3.45-3.05(m，8H，H1，H2，H3，H5)，2.18-2.4(m，2H，H4′)，1.8-2.1(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1.46(s，9H，Boc)，1.01-1.72(m，23H，H4，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.97(3H，s，H-19′)，0.85(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.82(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.64(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝630[M+H]+，530[M-Boc]+，369[Chol]+，145，121，95，69，57.
(Boc)氨氧基乙酸(9)：将O-(羧甲基)羟胺半盐酸盐(1.16g，5.3mmol)溶解在CH2Cl2(40ml)中并通过加入三乙胺(3ml)调节pH至9。然后加入二叔丁基二碳酸酯(2.36g，10.6mmol，2.0当量)，反应混合物在室温下搅拌直至tlc分析表明反应结束。通过加入稀HCl降低pH。反应混合物在饱和NH4Cl(20ml)和CH2Cl2(30ml)之间分配。水相用CH2Cl2(3×100ml)提取。合并的有机提取物用水(2×100ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。真空除去溶剂得到9的白色固体。收率：(1.86g，97％)；
                                                                  IR(CH2Cl2)：νmax＝3373，2983，2574，2481，1724，141 3，1369，1235；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝4.48(s，2H，CH2)，1.48(s，9H，Boc)；MS(FAB+)：m/z＝214[M+Na]+，192[M+H]+，135，123，109，69.
(Boc)氨氧基化合物(10)：N-羟基琥珀酰亚胺(0.36g，3.13mmol，1当量)、9(0.6g，3.13mmol，1当量)和N，N’二环己基碳化二亚胺(0.68g，3.13mmol，1当量)溶解在EtOAc(90ml)中，该非均相混合物室温下搅拌过夜。然后将混合物通过Celite垫过滤除去二环己基脲，后者作为白色沉淀形成(用60ml EtOAc洗涤)，并加到8(1.97g，3.13mmol，1当量)的THF(10ml)溶液中。通过加入三乙胺(6ml)保持该非均相反应的pH为8。所得到的混合物在室温下搅拌过夜。当反应结束时，过滤混合物并减压除去溶剂，通过闪式色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH392∶7∶1)进行纯化后得到10的白色固体。收率：(2.3g，90％)；
                                               1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.33-5.35(m，1H，H6′)，4.4-4.52(m，1H，H3′)，4.3(s，2H，H90，3.2-3.42(m，8H，H1，H2，H4，H6)，2.23-2.35(m，2H，H4′)，1.7-2.1(m，7H，H2′，H7′，H8′，H5)，1.44-1.46(m，18H，2 Boc)，1-1.73(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.98(3H，s，H-19′)，0.85(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.83(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.65(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝803[M+H]+，703[M-Boc]+，647，603[M-2Boc]+，369，279，255，235，204，145，95，69.
羟胺(11)：在0℃下，向10(1.1g，1.36mmol，1当量)的CH2Cl2(10ml)溶液中加入TFA(2ml，20.4mmol，15当量)。该溶液在室温下搅拌5小时。当反应结束时，加入甲苯与反应混合物中的TFA共沸。真空除去溶剂，通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH392∶7∶1-75∶22∶3)进行纯化后得到11的白色固体(709mg，收率：86％)；
            IR(CHCl3)：νmax＝3306，2948，2850，2246，1698，1647，1541，1467，1253，1133；1H NMR(270MHz，CDCl3)：δ＝5.26-5.4(m，1H，H6′)，4.4-4.52(m，1H，H3′)，4.12(s，2H，H9)，3.34-3.41(m，2H，H2)，3.15-3.3(m，2H，H4)，2.6-2.74(m，4H，H1&H6)，2.14-2.39(m，2H，H4′)，1.62-2.1(m，7H，H2′，H7′，H8′，H5)，1.02-1.6(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H1 7′，H22′-H25′)，0.96(3H，s，H-19′)，0.86(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.83(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.66(s，3H，H18′)；MS(FAB+)：m/z＝603[M+H]+，369[Chol]+，160，137，109，95，81，69，55.
甘露糖基化合物(12a)：将D-甘露糖(266mg，4.8mmol)在乙酸盐缓冲液(乙酸钠/乙酸0.1M，pH4，7ml)中的溶液与11(290mg，0.48mmol，10当量)的DMF(7ml)溶液混合并在室温下搅拌3天。通过冷冻干燥真空除去溶剂并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH375∶22∶3)进行纯化后得到产物21的白色固体(233mg，收率：65％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含β-吡喃糖(82％)形式和α-吡喃糖(18％)形式，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝765[M+H]+、787[M+Na]+、397、369[Chol]+、322、240、121、109、95、81、69、57。β-吡喃糖形式。
                                                                   1H NMR(400MHz，CD3OD/CDCl3[75/25])：δ＝7.64-7.62(d，3J1a-2a＝7Hz，1H，H1a)，5.35-5.36(m，1H，H6′)，4.45-4.5(s，2H，H9)，4.35-4.5(m，1H，H3′)，4.19-4.24(dd，1H，H2a，3J1a-2a＝7.4 Hz，3J2a-3a＝7.7Hz)，3.81-3.9(m，1H，H3a)，3.73-3.8(m，2H，H4a，H6axa)，3.63-3.71(m，2H，H5a，Heq6a)，3.34-3.42(m，2H，H2)，3.27-3.30(m，2H，H4)，3-3.08(m，2H，H1)，2.9-2.98(m，2H，H6)，2.25-2.35(m，2H，H4′)，1.78-2.07(m，7H，H2′，H7′，H8′，H5)，1.03-1.65(m，21H，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，1.01(3H，s，H-19′)，0.91(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.85(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.69(s，3H，H1 8′)；13C NMR(400MHz，CDCl3/CD3OD[25/75])：12.33(C18′)，19.20(C21′)，19.74(C19′)，21.91(C11′)，22.91(C27′)，23.17(C26′)，24.67(C23′)，25.07(C15′)，27.37(C5)，28.85(C25′)，28.96(C2′)，29.07(C12′)，32.76(C7′)，32.87(C8′)，36，38(C2)，36.78(C20′)，37.09(C1)37.76(C22′)，37.95(C1′)， 38.4(C4)，39.36(C4′)，40.41(C24′)，40.76(C16′)，46.16(C6)，51.19(C9′)，57.19(C17′)，57.75(C14′)，64.62(C6a)，70.19(C2a)，70.58(C4a)，72.12(C3a)，72.37(C5a)，73.11(C9)，75.91(C3′)，123.39(C6′)，140.72(C5′)，155.02(C1a)，158.69(NHCOOChol)，173.1(C8)；
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(400MHz，CD3OD/CDCl3[75/25])：δ＝6.90-6.88(d，3J1a-2a＝7Hz，1H，H1a)，5-5.05(dd，1H，H2a，3J1a-2a＝7.3Hz，3J2a-3a＝7.6Hz)；13C-NMR(400MHz，CDCl3/CD3OD[25/75])：65.33(C2a)，155.79(C1a)。1H-NMR(400MHz，CD3OD/CDCl3[75/25])：(m，1H，H3’)缺少，在溶剂峰下面；通过1H-NMR(300MHz，DMSO)证明：δ＝4.67-4.82(m，1H，H3’)。13C NMR(400MHz，CDCl3/CD3OD[25/75])：C1缺少，在MeOH峰下面，通过在400MHz下用1H/13C相互关系证明，大约在49。利用1H梯度型DQF-COSY和TOCSY来证明质子共振赋值。利用1H/13C相互关系和DEPT 135来明确地赋值碳共振。α吡喃糖形式得到1J13Cla-H1a＝177Hz，而β吡喃糖形式得到1J13C1a-H1a＝167Hz。1H敏感段的NOESY证明构象。
葡糖基化合物(12b)：按照类似的方法，用D-葡萄糖(150mg，0.82mmol)和11(100mg，0.16mmol)制备12a，搅拌1天并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到产物12b的白色固体(103mg，收率：82％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含(α-吡喃糖(18％)端基异构体和β-吡喃糖(82％)端基异构体，不必分离，在混合物中即可定性。(FAB+)：m/z＝765[M+H]+、787[M+Na]+、391、369[Chol]+、309、290、171、152、135、123、109、95、81、69；β-吡喃糖形式。
                (300MHz，CDCl3/CD3OD[90/10])：δ＝7.53-7.56(d，J＝5.6Hz，1H，H1a)，5.26-5.36(m，1H，H6′)，4.2-4.45(m，3H，H9，H3′)，4.05-4.15(m，1H，H2a)，3.45-3.85(m，5H，H6a，H3a，H5a，H4a)，2.9-3.4(m，H2，H4，MeOH)，2.9-3.15(m，4H，H1，H6)，2.15-2.3(m，2H，H4′)，1.65-2(m，5H，H2′，H7′，H8′)，0.95-1.55(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.93(3H，s，H-19′)，0.84(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.78(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.62(s，3H，H18′)；
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H-NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD[90/10])：δ＝7.22-7.24(d，J＝6.61Hz，1H，H1a)，4.95-5.07(m，1H，H2a)；1H-NMR(300，CD3OD)：(m，1H，H3’)缺少，推测在溶剂峰下面；通过1H-NMR(300MHz，DMSO)证明：δ＝4.7-4.86(m，1H，H3’)。
半乳糖基化合物(12c)：按照类似的方法，用D-半乳糖(50mg，0.27mmol)和11(40mg，0.066mmol)制备12a，搅拌1天并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到产物12c的白色固体(35mg，收率：70％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含α-吡喃糖(15％)形式和β-吡喃糖(85％)形式，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝765[M+H]+、588、391、369[Chol]+、322、290、165、152、135、121、109、95、81、69；β-吡喃糖形式。
1H NMR(270MHz，DMSO)：δ＝7.78-7.82(m，1H， NHCO of C8)，7.55-7.58(d，J＝7.2Hz，1H，H1a′)，6.95-7.1(m，1H，NHCOOChol)，5.25-5.37(m，1H，H6′)，4.2-4.43(m，3H，H9，H3′)，3.2-3.9(m，H2a，H6a，H3a，H5a，H4a，OH)，2.9-3.18(m，4H， H2，H4)，2.4-2.65(m，4H，H1，H6)，2.15-2.3(m，2H，H4′)，1.67-2(m，5H，H2′，H7′，H8′)，0.92-1.6(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.96(3H，s，H-19′)，0.89(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.84(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.65(s，3H，H18′).
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(270MHz，DMSO)：6.86-6.88(d，J＝6Hz，1H，H1a)。
葡萄糖醛酸化合物(12d)：按照类似的方法，用D-葡萄糖醛酸钠盐一水合物(30mg，0.128mmol，1.5当量)和11(50mg，0.08mmol)制备12a，搅拌1天并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到钠盐12d的白色固体(41mg，收率：60％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含α-吡喃糖(85％)形式和β-吡喃糖(15％)形式，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝779[M+H]+、733、588、411、369[Chol]+、336、290、240、214、159、145、135、121、109、95、81、69、55；β-吡喃糖形式。
                                                                      1H NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD[75/25])：δ＝7.51-7.53(d，J＝5.9Hz，1H，H1a)，5.25-5.33(m，1H， H6′)，4.2-4.45(m，3H，H9，H3′)，3.8-4.1(m，3H，H2a，H3a，H4a)，3.6-3.75(m，1H，H5a)，3.2-3.55(m，H2，H4，MeOH)，2.7-3.15(m，4H，H1，H6)，2.18-2.32(m，2H，H4′)，1.62-2(m，5H，H2′，H7′，H8′)，0.9-1.6(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.93(3H，s，H-19′)，0.83(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.77(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.6(s，3H，H18′))；
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ＝7.22-7.24(d，J＝6.3Hz，1H，H1a)，5-5.1(m，1H，H2a)。
β-D-乳糖基化合物(12e)：在室温下，将含有25-30％α(1.13g，3.3mmol)和11(200mg，0.33mmol)的β-D-乳糖溶液在14ml DMF/乙酸盐缓冲液中搅拌4天。通过冷冻干燥真空除去溶剂并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到12e的白色固体(145mg，收率：47％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含α-吡喃糖(15％)形式和β-吡喃糖(85％)形式(包含其本身大约25％的α乳糖)，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝927[M+h]+、588、482、369[Chol]+、290、243、216、178、152、135、121、109、95、81、69、55；β-吡喃糖形式。
                                                   1H NMR(400MHz，CDCl3/CD3OD[20/80])：δH＝7.69-7.71(d，3J1a-2a＝5.8Hz，1H，H1a的β乳糖)，7.66-7.68(d，3J1a-2a＝6.2Hz，1H，H1a of a lactose)，5.35-5.37(m，1H，H6′)，4.37-4.6(m，4H，H9，H3′，H2a)，4.2-4.37(m，1H，H1b)，3.65-4.05(m，7H，H3a，H4a，H5a，H4b，H5b，H6b)，3.25-3.6(m，8H，H2，H4，H6a，H2b，H3b，MeOH)，3-3.2(m，4H，H1，H6)，2.25-2.42(m，2H，H4′)，1.8-2.15(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1-1.65(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，1.01(3H，s，H-19′)，0.91(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.85(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.69(s，3H，H18′)；13C NMR(400MHz，CDCl3/CD3OD[20/80])：13C NMR(400MHz，CDCl3/CD3OD[20/80])：12.32(C18′)，19.2(C21′)，19.76(C19′)，21.94(C11′)，22.91(C27′)，23.17(C26′)，24.7(C23′)，25.1(C15′)，27.22(C5)，28.89(C25′)，29(C2′)，29.1(C12′)，32.8(C7′)，32.92(C8′)，36.29(C22′)，36.81(C10′)，37.12(C1′)，37.99(C6)，38.11(C1)，39.48(C2)，40.45(C24′)，40.80(C16′)，46.13(C4′)，51.23(C9′)，57.22(C17′)，57.80(C14′)，62.41(C6a)，63.4(C6a)，70.02(C5b)，70.63(C2a)，72.8(C3a)，73(C3′)，73.18(C9)，74，75(C2b)，76.8(C3a)，81(C4b)，92.39(C1b)，105.2(C3′)，123.42(C6′)，140.72(C5′)，154.8(C1a)，156.2(NHCOOChol)，173.17(C8).
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(400MHz，CD3OD/CDCl3[80/20])：δH＝7.04-7.05(d，3J1a-2a＝5.6Hz，1H，H1a)，5.05-5.07(m，1H，H2a)，4.09-4.11(m，1H，H3a)；1H NMR(270MHz，CD3OD)：(m，1H，H3’)缺少，推测在溶剂峰下面；通过1H NMR(300MHz，DMSO)证明：δ＝4.7-4.85(m，1H，H3’)。利用1H梯度型DQF-COSY和TOCSY来证明质子共振赋值。利用1H/13C相互关系和DEPT 135来明确地赋值碳共振。1H敏感段的NOESY证明构象。
麦芽糖基化合物(12f)：按照类似的方法，用D-麦芽糖一水合物(30mg，1.8mmol，5当量)和11(100mg，0.16mmol)制备12e，搅拌1天并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到12f的白色固体(100mg，收率：65％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含α-吡喃糖(87％)形式和β-吡喃糖(13％)形式，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝927[M+H]+、765、588、559、484、369[Chol]+、322、290、213、167、161、143、135、121、109、95、81、69、55；β-吡喃糖形式。
                                                   1H NMR(300MHz，CDCl3/CD3OD[80/20])：δ＝7.55-7.57(d，3J1a-2a＝5.3Hz，1H，H1a)，5.3(s，1H，H6′)，4.85-5.02(m，1H，H3′)，4.09-4.22(m，1H，H1b)，3.57-4(m，7H，H3a，H4a，H5a，H4b，H5b，H6b)，3.2-3.6(m，8H，H2，H4，H6a，H2b，H3b，MeOH)，2.8-3.1(m，4H，H1，H6)，2.1-2.36(m，2H，H4′)，1.6-2.05(m，5H，H2′，H7′，HB′)，1-1.6(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.93(3H，s，H-19′)，0.83(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.78(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.6(s，3H，H18′)；
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(300MHz，CD3OD/CDCl3[80/20])：δ＝6.92-6.94(d，J＝4.62Hz，1H，H1a)，5.02-5.15(m，1H，H2a)，4.04-4.08(m，1H，H3a)。
麦芽三糖基化合物(12g)：按照类似的方法，用麦芽三糖(246.4mg，0.46mmol，7当量)和11(40mg，0.066mmol)制备12e，搅拌5天并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到12f的白色固体(61mg，收率：85％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含α-吡喃糖(15％)形式和β-吡喃糖(85％)形式，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝1111[M+Na]+、1089[M+H]+、588、423、391、369[Chol]+、240、171、159、145、121、105、95、81、69；β-吡喃糖形式。
                          1H NMR(300MHz，CDCl3/MeOH[20/80])：δ＝7.56-7.58(d，J＝6Hz，1H，H1a)，5.2-5.27(m，1H，H6′)，4.9-4.95(m，1H，H3′)，4.2-4.45(m，4H，H9，H3′，H2a)，4.05-4.2(m，2H，H1b，H1c)，2.95-4(m，21H，H2，H4，H6a，H3a，H5a，H4a，H2b-6b，H2c-6c，MeOH)，2.85-2.95(m，4H，H1，H6)，2.2-2.3(m，2H，H4′)，1.8-2.1(m，5H，H2′，H7′，H8′)，0.98-1.6(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.94(3H，s，H-19′)，0.84(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.78(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.61(s，3H，H18′)；
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(300MHz，CDCl3/MeOH[20/80])：δ＝6.85(d，J＝5.6Hz，1H，H1a)。
麦芽四糖化合物(12h)：按照类似的方法，用D-麦芽四糖(200mg，0.3030mmol)和11(80mg，0.133mmol)制备，搅拌5天并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到12h的白色固体(67.5mg，收率：41％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含α-吡喃糖(15％)形式和β-吡喃糖(85％)形式，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝1273[M+Na]+、1251[M+H]+、588、369[Chol]+、159、145、121、109、95、81、69；HRMS(FAB+)C59H102N4O24Na：[M+Na]+计算值1273.6782，实测值1273.6821。β-吡喃糖形式。
                                                                    1H NMR(300MHz，CDCl3/MeOH[20/80])：δ＝7.56-7.58(d，1H，H1a)，5.15-5.25(m，1H，H6′)，4.95-5.1(m，1H，H3′)，4.38-4.5(m，4H，H9，H3′，H2a)，4.04-4.22(m，3H，H1b，H1c，H1d)，3.1-3.95(m，27H，H2，H4，H6a，H3a，H5a，H4a，H2b-6b，H2c-6c，H2d-6d，MeOH)，2.85-3.1(m，4H，H1，H6)，2.2-2.33(m，2H，H4′)，1.75-2.1(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1-1.6(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.92(3H，s，H-19′)，0.82(d，J＝6.5Hz，3H，H21′)，0.78(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.68(s，3H，H18′)；
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(300MHz，CDCl3/MeOH[20/80])：δ＝7(d，1H，H1a)。
麦芽七糖基化合物(12i)：按照类似的方法，将D-麦芽七糖(100mg，0.08673mmol)和11(30mg，0.0497mmol)搅拌7天并通过色谱法(CH2Cl2/MeOH/NH3 75∶22∶3)进行纯化后得到12i的白色固体(46mg，收率：53％)。进一步通过HPLC确定该纯度。终产物包含α-吡喃糖(15％)形式和β-吡喃糖(85％)形式，不必分离，在混合物中即可定性。MS(FAB+)：m/z＝1759[M+Na]+、1737[M+H]+、369[Chol]+、145、121、109、95、81。β-吡喃糖形式。
                                            1H NMR(300MHz，CDCl3/MeOH[20/80])：δ＝7.53-7.58(d，1H，H1a)，5.35-5.37(m，1H，H6′)，4.97-5.12(m，1H，H3′)，4.45-4.6(m，4H，H9，H3′，H2a)，4-4.5(m，6H，H1b，H1c-g)，3.1-3.9(m，45H，H2，H4，H6a，H3a，H5a，H4a，H2b-6b，H2c-6c，H2d-6d，H2e-6e，H2f-6f，H2g-6g，MeOH)，2.7-3(m，4H，H1，H6)，2.15-2.35(m，2H，H4′)，1.7-2.1(m，5H，H2′，H7′，H8′)，1-1.6(m，23H，H5，H1′，H9′，H11′，H12′，H14′-H17′，H22′-H25′)，0.94(3H，s，H-19′)0.84(d，J＝6.5 Hz，3H，H21′)，0.77(d，J＝6.5Hz，6H，H26′&H27′)和0.63(s，3H，H18′)；
α-吡喃糖形式：相同的数据除外，1H NMR(300MHz，CDCl3/MeOH[20/80])：δ＝6.9(d，1H，H1a)。
生物学和生物物理学评价
概述：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)购自Avanti Lipid(Alabaster，AL，USA)。质粒pCMVβ由Bayou Biolabs(Harahan，LA，USA)生产。DC-Chol由我们实验室合成[27]。噬菌体(Mu)-肽由M.Keller通过标准Fmoc基Merrifield固相肽化学合成方法在Wang树脂合成[43]。所有其他化学物质都是试剂级的。
脂质体的制备：在二氯甲烷中合并DC-Chol(7.5mg，15μmol)和DOPE(7.5mg，10μmol)。将溶液转移到圆底烧瓶(通常为50ml)中并减压除去有机溶剂(旋转蒸发)获得脂质薄膜，真空干燥2-3小时。此后，在圆底烧瓶中加入4mM HEPES缓冲液(pH＝7.2，3ml)以便水合脂质薄膜。在氩气下简单进行声处理后，所得阳离子脂质体悬浮液(脂质浓度为5mg/ml)通过挤出装置(Northern脂质)挤出。起初，3次通过两组套聚碳酸酯滤膜(0.2μm)，然后10次通过两组套聚碳酸酯滤膜(0.1μm)形成小单层阳离子脂质体(按PCS分析，平均直径为105nm)。通过Stewart测定法[44]测定脂质浓度(大约4-4.8mg/ml)。
脂质体：Mu∶DNA(LMD)和脂质体：DNA(LD)复合物的制备：起初，通过如下混合制备Mu∶DNA(MD)颗粒。将质粒DNA储备液(通常为1.2mg/ml)加到在4mM HEPES缓冲液(pH7.2)中的涡旋混合的噬菌体肽稀释溶液(1mg/ml)中。最终mu∶DNA的比例为0.6∶1w/w(除非另有说明)并且最终质粒DNA浓度为0.27mg/ml。然后在涡旋条件下，将含有MD的溶液缓慢加入到按上文所述方法制备的挤出阳离子脂质体悬浮液(通常大约为4.5mg/ml)中，通过PCS测定，结果形成具有窄粒度分布的LMD小颗粒(120±30nm)。最终脂质：mu∶DNA的比为12∶0.6∶1w/w/w。然后加入蔗糖的4mM HEPES缓冲液(pH7.2)溶液(100％，w/v)获得在4mM HEPES缓冲液(pH7.2)中的含有10％w/v蔗糖和所需DNA浓度(最终DNA浓度通常为0.14mg/ml)的LMD颗粒悬浮液并在-80℃整体储存。按上述方法只是不加入噬菌体肽来制备用于试验的脂质体：DNA(LD)复合物(脂肪丛)，脂质：DNA的比为12∶1(w/w)。
颗粒大小的测量：在37℃暴露于生物介质30分钟后通过光子相关性光谱学(N4 plus，Coulter)评价脂肪丛的大小。在体外条件下所选DNA具体浓度是相容的(1μg/ml的DNA)。所使用的参数为：20℃、0.089cP、反射指数1.33、角度90°、632.8nm。使用单峰分析来评价Optimem中的平均颗粒大小。利用CONTIN算法的大小分布程序分离小于50nm的小血清颗粒亚群并提取Optimem+10％FCS中计算大小的脂肪丛。
转染海拉细胞：在存在有DMEM培养基的24孔培养板中接种细胞，其中所述的培养基中补充有10％FCS，并在37℃、5％CO2存在下生长24小时以达到约70％融合。在转染介质(0.5ml的0、50或100％胎牛血清在Dubelco OptiMem中的溶液)加到各孔之前，在PBS中洗涤细胞。将5μl的100μg/ml DNA(nls βgal)的LMD在海拉细胞上转染30分钟。然后用PBS漂洗细胞3次并在补充有10％FCS的DMEM培养基中进一步培养48小时，然后使用标准化学发光报告基因测定试剂盒(RocheDiagnostics，GmbH Cat No.1758241)进行β-Gal表达。
结果和讨论
新糖脂的合成：目标类新糖脂中的各个成员都由携带脂质的胆固醇和通过连接基结合在一起的寡糖分子组成。整个合成过程分为两个部分：首先合成含有连接基的脂质，然后将该脂质与选择的糖分子进行化学选择性偶合。该方法中的关键是形成羟胺(图1)。
Boc保护的脂质(8)的这种合成方法最初是基于会聚方法学设计的，该方法使用易于获得的氨基醇作为原料并采用胺基团的互补阻断基团策略。以前公开了该方法用于制备很少修饰的用于基因转化的这种基于聚酰胺的脂质[27]。
如上所述，羟胺衍生物的糖基化为我们合成的要求提供了很好的解决办法。商购O-(羧甲基)羟胺盐酸盐首先进行Boc-保护，然后与N-羟基琥珀酰亚胺和N，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)反应产生相应的活化酯。在THF中于pH8之下立即用脂质(8)原位处理该化合物，获得保护的羟胺。用三氟乙酸水溶液非常直接地脱保护后，完成了羟氨基脂质(11)的合成。
在该阶段，我们研究了通过脂质(11)与各种可商购的未保护的寡糖反应进行我们的化学选择偶合的潜力。该反应在温和的条件下使用有利于糖和脂质溶解的DMF和乙酸水溶液pH4缓冲液(1∶1)作为溶剂系统来进行。如图2所示，反应物与开放的椅式质子化的中间体是动态平衡的。为了与产物的形成达到平衡，加入过量的糖。由于新糖脂产物的两亲特性，发现后处理期间进行分离是困难的，这是由胶束和泡沫的形成导致的。溶解性问题也妨碍分离、纯化和分析过程。反应时间和产率随使用的碳水化合物不同而发生变化(表1)。
表1产物11糖基化的产率、反应时间和非对映选择性
    产物     糖 时间(天数)   产率(％)     β/α
    12a   甘露糖     3     65     82/18
    12b   葡萄糖     1     80     89/11
    12c   半乳糖     1     70     85/15
    12d   葡糖醛酸     1     60     85/15
    12e   乳糖     4     50     85/15
    12f   麦芽糖     1     65     87/13
    12g   麦芽三糖     5     85     85/15
    12h   麦芽四糖     5     40     85/15
    12i   麦芽七糖     7     55     85/15
新糖脂构型：碳水化合物构型可在溶液中通过NMR来确定[28-33]。异头中心(C1a)对构型最有用的数据可能是1J13C1a-H1a[34，35]。该偶合常数的绝对值取决于碳-氢键相对于孤对环氧的定位，C1位取代基的电负性和与分子的其余部分结合的电负性取代基的特性。吡喃糖α和β异头物之间1J13C1-H1的不同可用于确定异头物的构型。确实证明1J(C1-H1eq)＞1J(C1-H1ax)具有大约10Hz的差别。1J(C1-H1eq)通常约170Hz而1J(C1-H1ax)大约为160Hz。0-1用电负性更强的元素氯或氟交换时，观察到更高的值，但通常观察到10Hz的差别[36]。已经研究了呋喃糖苷的碳-氢偶合常数并且1J(C1-H1eq)＞1J(C1-H1ax)但差别小得多(1-3Hz)。
特征化将基于甘露糖作为例子来讨论，但NMR分析条件有利时，相同的分析方法也用于其他糖类。设想有4个不同的环结构(图3)。出于空间原因，吡喃糖形式被合理地期望是比呋喃糖环有利的。所以在NMR两个观察的化合物中，主要的一个可能是吡喃糖。第二个观察的化合物可不被归因于变旋平衡，因为相敏感NOESY不显示两个C 1a信号之间的交叉峰(证明是有区别的分子)。所以，这个化合物不被归因于呋喃糖形式，因为未观察到13C5a的迁移并且13C1a未被去屏蔽，由相关的取代呋喃糖的当量证明[33]。
我们测量主化合物的1J13C1a-H1a＝167Hz并且第二个化合物的1J13C1a-H1a＝177Hz。那些1J13C1-H1的绝对值比经典4C1构型的预期值高10Hz但这通过O-取代的羟胺基团的极端电负性来解释，羟胺基团可轻微改变椅式结构的形式。对于吡喃糖环，已证实[1J(C1-H1eq)-1J(C1-H1ax)]≈10Hz，所以，可容易地断定主化合物是β异头物(H1ax)并且第二个化合物是α异头物(H1eq)。
1H相敏感NOESY证实这个结论。观察了主化合物H1a和H2a&H3a之间的核极化效应。考虑以上详细结构，该化合物不是α吡喃糖基异头物，因为平展H1在空间上不能与H3相互作用，而β异头物完全能够产生这种相互作用。未观察到第二个化合物H1a的核极化效应但这可能是由于缺乏敏感性。因此，根据来自1J13C1-H1和NOESY分析数据，我们断定产生两个甘露糖吡喃糖α/β形式(20/80)。
获得的新糖脂有非常类似的异头物(β/α)异构体比是不奇怪的(表1)，所有糖都具有C2平展羟基，只有甘露糖除外。获得后一化合物的比例是出人意料的，因为通常报告β异头物在空间上比α更不利。可能的解释是反应由糖和羟胺连接基之间的某些二级相互作用(氢键)驱使，稳定了β异头物(这与β异头物的NMR信号总是远比α易于去屏障的观察是一致的)。预计合成糖脂的这种异头物混合物不会极大地影响脂质体结构生物学特性的研究，所以，我们不打算通过制备性高压液相色谱来对那些非对映异构体进行冗长的分离。
生物学应用：LMD的糖修饰基于混合细胞悬浮液与脂质膜结合的天然能力[37，38]。首先，将LMD按标准方法配制，然后将合成的新糖脂混合细胞的Hepes缓冲液(4mM pH7)悬浮液加到LMD中并在室温下培养30分钟，然后在通常的-80℃下储存。试验所有产生的新糖脂不同百分比的稳定作用，但只有较长链(麦芽四糖12h和麦芽七糖12i)在低于10％时显示明显的特性(数据未示出)。
通过7.5摩尔％化合物12h或12i的混合表明新糖脂修饰的LMD的稳定作用。已知与盐或者血清接触后，脂质体基制剂的脂质层发生凝聚[11，39，40]。这种现象通过在特定时间后测量平均颗粒大小增加而显示；LMD颗粒的任何稳定作用可通过该参数反映出来。选择在37℃下暴露于模拟标准体外条件的OptiMem或OptiMem+10％FCS中30分钟后通过光子相关性光谱学来测量脂肪丛的大小。不可能分析PCS在较高血清百分浓度下的作用，进行有意义测量的条件过于极端。图4描述了那些脂肪丛大小增加的百分数。
结果表明LMD和标准脂质体制剂之间颗粒的明显稳定作用。证明在OptiMem和10％血清中引入7.5％新糖脂是明显有益的。证明12i的混合是最有效的。该结果表明需要长的碳水化合物链来对那些阳离子脂质层产生有效的分子丛[41，Sheiko，2001#119]。
即使表明了一点稳定作用，但通常导致荷正电的LMD于荷负电的细胞膜亲和力的减小，导致结构的转染能力下降。然而，在这种情况下，体外转染结果表明由于新糖脂在0％和50％血清条件下的修饰而增强了转染效率(图5)。该结果归因于小范围的保护作用，这种保护作用是由于这些新糖脂妨碍类似极性的脂质双层之间的小范围的范德瓦耳斯相互作用但不影响相反电荷膜之间大范围的电荷的相互作用。由血清诱导的凝聚主要是基于LMD与荷负电的蛋白质之间的相互作用[42]，我们的新糖脂的有利作用也因血清百分浓度的增加而降低(在100％的血清中没有明显的有利作用)。
以上说明书中所提及的所有出版物都引入本文供参考。本发明所述方法和体系的不脱离本发明范围和精神的各种修饰和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管本发明通过具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解本发明所要求保护范围不受这些具体实施方案的限制。的确，为实施对化学或相关领域技术人员来说显而易见的本发明而描述的实施方式的各种修饰方案都包括在下列权利要求的范围之内。
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Claims (30)

1.一种能够起阳离子脂质作用的化合物，该化合物包含胆固醇基团和碳水化合物部分。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物由式Chol-L-Carb表示，其中Chol为胆固醇基团，L为任选的连接基，而Carb为碳水化合物部分。
3.权利要求1或2的化合物，其中所述胆固醇基团为胆固醇。
4.权利要求2的化合物，其中所述胆固醇基团通过氨基甲酰基键与任选的连接基团连接。
5.权利要求1-4任一项的化合物，其中所述连接基团是多元胺基团。
6.权利要求4的化合物，其中所述多元胺基团是天然存在的多元胺。
7.权利要求4或5的化合物，其中所述多元胺基团包含至少两个胺并且它们彼此通过亚乙基(-CH2-CH2-)基团间隔开。
8.权利要求5的化合物，其中所述多元胺是精脒、精胺或caldopentamine中的任何一种。
9.权利要求1-8任一项的化合物，其中所述碳水化合物部分是单糖。
10.权利要求1-8任一项的化合物，其中所述碳水化合物部分是糖部分。
11.权利要求1-8任一项的化合物，其中所述碳水化合物部分选自甘露糖、葡萄糖(D-葡萄糖)、半乳糖、葡糖醛酸、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽七糖及其混合物。
12.权利要求1-8任一项的化合物，其中所述碳水化合物部分是D-葡萄糖。
13.权利要求1-12任一项的化合物，其中所述化合物包含1-7个碳水化合物部分。
14.权利要求13的化合物，其中所述化合物包含一个碳水化合物部分。
15.权利要求1的化合物，其中所述化合物由式Chol-L-Carb表示，其中Chol为胆固醇，L为多元胺基团，而Carb为葡萄糖，优选D-葡萄糖。
16.与核苷酸序列混合的或与核苷酸序列相联合的权利要求1-15任一项的化合物。
17.制备权利要求1-15任一项的化合物的方法，该方法包括将包含胆固醇基团和多元胺的化合物与糖类反应。
18.用于治疗的权利要求1-15任一项的化合物或通过权利要求17的方法制备的化合物。
19.权利要求1-15任一项的化合物或通过权利要求17的方法制备的化合物在制备治疗遗传性异常、状况或疾病的药物中的应用。
20.由权利要求1-15任一项的化合物或者由权利要求17的方法制备的化合物形成的阳离子脂质体。
21.一种制备阳离子脂质体的方法，包括由权利要求1-15任一项的化合物或者由权利要求17的方法制备的化合物形成阳离子脂质体。
22.用于治疗的权利要求20的阳离子脂质体或者由权利要求21的方法制备的阳离子脂质体。
23.权利要求20的阳离子脂质体或者由权利要求21的方法制备的阳离子脂质体在制备治疗遗传性异常、状况或疾病的药物中的应用。
24.核苷酸序列与权利要求1-15任一项的化合物、由权利要求17的方法制备的化合物、权利要求20的阳离子脂质体或者由权利要求21的方法制备的阳离子脂质体中的任何一种或多种的组合。
25.用于治疗的权利要求24的组合。
26.权利要求24的组合在制备治疗遗传性异常、状况或疾病的药物中的应用。
27.药物组合物，含有与药物混合的权利要求1-15任一项的化合物或由权利要求17的方法制备的化合物，以及任选的可药用稀释剂、载体或赋形剂。
28.药物组合物，含有与药物混合的权利要求20的阳离子脂质体或者由权利要求21的方法制备的阳离子脂质体，以及任选的可药用稀释剂、载体或赋形剂。
29.基本上按本文所描述的并参考任一附图的化合物或者阳离子脂质体。
30.基本上按本文所描述的并参考任一附图的方法。
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