JP2001511113A - ピペラジンベースのサイトフェクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子治療、トランスフェクションおよびワクチン接種のための免疫原性化合物の導入に有用なピペラジンベースの両親媒性陽イオン性脂質に関する。開示化合物は、環上の窒素と結合した親油性部分を有する。さらに、環上の窒素の少なくとも１つは四級化され、少なくとも１つのヘテロ原子を有する炭化水素に結合される。

Description

【発明の詳細な説明】 ピペラジンベースのサイトフェクチン 発明の背景 本発明は、複合両親媒性脂質に関する。本発明は特に、環内の少なくとも１つ の窒素に結合するヘテロ原子および環上の窒素に結合する親油性部分を含む、炭 化水素鎖を有するピペラジン環を包含する複合陽イオン性両親媒性脂質に関する 。 発明の背景 両親媒性分子は、細胞内で治療用または生物活性分子を細胞中に輸送するため に用いられる。例えば、ＷＯ ９５／１４３８１は、高分子の細胞内輸送のため の両親媒性グアニジン誘導体の使用を開示する。陽イオン性脂質は、一般に１つ またはそれ以上の炭化水素またはアルキル基を含む親油性領域、および少なくと も１つの正に荷電した極性末端基を含む親水性領域を有する両親媒性分子である 。陽イオン性脂質は、細胞の形質膜を通して細胞質中への高分子の輸送を促すの に有用である。インビトロならびにインビボで実行し得る方法は、トランスフェ クションとして公知であり、このような技法に用いられる陽イオン性脂質はサイ トフェクチンとして公知である。 トランスフェクション効率を統計学的に有意な程度に増強するサイトフェクチ ンは有益である。ＤＮＡのみを用いて得られるよりも２倍程度この活性が増大す れば有益であるが、好ましくはトランスフェクション効率は５〜１０倍増大し、 さらに好ましくはトランスフェクション効率は１０倍以上増強される。 典型的には、２つの両親媒性脂質種は組合せると、サイトフェクチン単独より もトランスフェクション時に有効である定序脂質二重層を含む小胞を形成し得る ということが判明しているため、サイトフェクチンは中性両イオン性脂質、例え ばリン脂質と組合される。これらの小胞またはリポソームは、それらがポリヌク レオチドまたはその他の陰イオン性分子、例えば負荷電タンパク質と複合体を形 成するのを可能にするため表面上に多数の正電荷を有する。ポリヌクレオチド／ サイトフェクチン／中性脂質複合体の表面に残存する総陽イオン電荷は、細胞膜 表面で優勢な負電荷と強力に相互作用し得る。 両親媒性特性の基本的特徴および極性末端基を除くと、サイトフェクチンは親 油性領域および親水性領域ではかなりの構造的多様性を有する。トランスフェク ションに用いるために多数の異なるサイトフェクチン種が合成されており、現在 市販されている。このようなサイトフェクチンとしては、例えばリポフェクチン^TM 、リポフェクチンＡＣＥ^TM、リポフェクトＡＭＩＮＥ^TM、トランスフィークタ ム^TMおよびＤＯＴＡＰ^TMが挙げられる。サイトフェクチンの構造的多様性が有効 性であるのは、サイトフェクチンの構造−機能−認識の様子が細胞中でそれぞれ の適用に関して異なるという観察結果を、部分的には、反映する。ＤＯＴＭＡ化 合物と構造的に類似のサイトフェクチンを用いた実験は、トランスフェクション 活性が部分的にはトランスフェクトされる細胞型に依っていることを示す(Felgn eret al．，J．Biol．Chem．84:7413-7417，1987；Wheeler et al.，Biochem．B iophys．Acta,1280:1-11(1996))。特に、アンモニウム基をスペルミンで置換し た基を有する陽イオン性脂質は、いくつかの細胞系のトランスフェクションに関 してＤＯＴＭＡより有効であることが分かった。この現象は、有効なトランスフ ェクションは陽イオン性脂質複合体と形質膜の構造的脂質二重層との受動的融合 だけでなく、特異的な細胞特性および細胞成分と個々の陽イオン性脂質種との間 の相互作用にも依っていることを示唆する。 したがって、サイトフェクチン種の中でのこの構造上の変異型は、サイトフェ クチンと細胞との多面的な且つ複雑な相互作用のより高度の理解及び、１つまた はそれ以上のこれらの相互作用を利用する研究者の側の努力を示すものである。 米国特許第５，０４９，３８６号（Epstein）に開示されたＤＯＴＭＡ、即ち Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル アンモニウムは、開発された最初の陽イオン性脂質の１つであって、この群の脂 質は、新規な構造上の変異型の開発において比較したサイトフェクチン能力を評 価する場合の参照化合物になっている。ＤＯＴＭＡ脂質は、分子のプロピル骨格 にエーテル結合される一対のＣ₁₈炭化水素と共に、分子の陽イオン性部位を提供 する第四級窒素を有するプロパナミニウム基を特徴とする。第四級窒素は、比較 的短いアルキル鎖、例えばメチル基により三置換化される。構造的に類似の陽イ オン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモ ニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、エーテル結合したアルキル基よりむしろアシ ル基を包含し、標的細胞により容易に代謝されると考えられる。 陽イオン性脂質のいくつかの種、例えばアルキルまたはアシル基により直接置 換されたアンモニウム塩は、主に経済的理由から開発された(米国特許第５，２ ７９，８３３号(Rose))。他のものは、低毒性効果を提供するために開発された 。例えば、ホスフアチジルコリンおよびスフィンゴミエリンから調製された高生 物適合性サイトフェクチン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチ ルホスフォコリン（Avanti Polar Lipids，Inc．Alabaster，AL，Cat．Nos．890 700-706）がある。 Felgnerらに対する米国特許第５，２６４，６１８号は、ホスホリパーゼＡの ローゼンタール阻害剤（ＲＩ）(Rosenthal et al.，J．Biol．Chem．235:2202 -2206(1960))およびそのジアシルまたはアルキル／アシル種と構造的に類似した サイトフェクチンを開示する。ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチン は、第四級窒素と結合した次式、 の置換基を有することを特徴とする。 ＲＩベースの一連の化合物は、以下のパターンを有する頭字語により公知であ り、ＤＯＲＩＥ(Ｃ₁₈)、ＤＰＲＩＥ（Ｃ₁₆）およびＤＭＲＩＥ（Ｃ₁₄）がある。 これらの頭字語は共通の基本的化学構造を意味する。例えば、ＤＭＲＩＥ（dimy ristoyl Rosenthal inhibitor ether）は１−プロパナミニウム，Ｎ−（２−ヒ ドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）− ，ブロミド，（＋）−（ＣＡＳ登録：１４６６５９）を意味し、他のものは、そ れらの置換アルキル基が異なる。第四級アンモニウム基を極性ヒドロキ シエチルで置換した基を有するこれらのサイトフェクチンは、多くの場合にＤＯ ＴＭＡ型化合物より有効なトランスフェクションを提供する。ＲＩサイトフェク チンのトランスフェクション効能に及ぼすヒドロキシアルキル部分の置換基およ びアルキル鎖長の変動の効果についての研究は、Felgnerら（J．Biol．Chem．26 9:2550−2561，1994）によって示されている。さらにその研究は、最適のヒドロ キシルアルキル鎖長が細胞型依存性であることを示した。 ＤＭＲＩＥのβＡＥ−ＤＭＲＩＥへの転換（Wheeler et al.，1280 Bioche m．Biophys．Acta:1-11(1996)）は、サイトフェクチン活性に有意的な効果を及 ぼすことが判明した。第一アルコールに隣接する第四級窒素を有し、したがって ｐＨ非依存性の正電荷を有するＤＭＲＩＥは、現在公知の最も高活性のサイトフ ェクチンの１つである。しかしながら、βＡＥ−ＤＭＲＩＥを生じるようＤＭＲ ＩＥ上のアルコールを第一アミン基に置換すると、ＤＭＲＩＥの場合とは構造的 に全く別のＤＮＡ複合体を生成することが判明し、βＡＥ−ＤＭＲＩＥはヘルパ ー共脂質の非存在下で有効に多数の細胞系をトランスフェクトし得る。サイトフ ェクチン骨格内での一つの置換がトランスフェクション特性を顕著に変化し得る という観察結果は、他の修飾が遺伝子の輸送におけるほぼ同様の改良をもたらし 得ることを示唆する。 トランスフェクション関連の継続した研究により、陽イオン性脂質が機能性分 子の細胞の細胞質中への進入を促すだけでなく、さらに有益な能力、例えばリソ ソーム分解からの機能性分子の保護、核分画中への進入促進、または細胞質酵素 によるＲＮＡ転写生成物の分解防止をさえ提供し得ることが示されている。陽イ オン性分子のこれらの機能は、特定の構造的特徴に関連すると考えられる。した がって、特定の形の細胞中への外部分子のトランスフェクションに特に適したサ イトフェクチンが必要である。さらに、特定の細胞内機能を行うことのできるサ イトフェクチンを開発する必要がある。 ＷＯ ９５／１４６５１は、親油性炭化水素鎖が短い炭化水素リンカーを介し て各々の窒素と結合したエーテルまたはエステルであるピペラジンベースのサイ トフェクチンを開示する。さらに、窒素が正に荷電されるように、少なくとも１ つの窒素が低級アルキル基とさらに結合する。しかしながら、ＷＯ９５／１４６ ５１に開示されたサイトフェクチンに結合した低級アルキル基は、付加的な生物 活性基をサイトフェクチンに結合させず、それにより、サイトフェクチンに共有 結合でつながっていない活性基に輸送され得る生物活性基を制限する。したがっ て、共有結合でつながった生物活性基を輸送し得るサイトフェクチンが必要とさ れる。さらに、トランスフェクション効率の改良を示すピペラジンベースのサイ トフェクチンが必要とされる。 発明の概要 本発明は、以下の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチンに関する 。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁ 〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシ ル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケ ンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個 の不飽相部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしく はアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原 子を含有し、 Ｒ₃は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、アミノ酸、ペプチド、 ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオ チド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは は以下の構造を有する基であり、（式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換さ れており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかま たは環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０ 〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］ 前記の構造のサイトフェクチンの好ましい一実施態様では、ｍおよびｐは２で ある。この実施態様のさらに非常に好ましい態様は、Ｙ₁およびＹ₂は０である。 非常に好ましい実施態様では、Ｒ₁およびＲ₄は、Ｃ₁₀Ｈ₂₁、Ｃ₁₂Ｈ₂₅およびＣ₁₄ Ｈ₂₉から成る群から選択される。さらに好ましい実施態様では、Ｒ₂は存在しな いか、またはＣＨ₂、（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₃、（ＣＨ₂）₄、（ＣＨ₂）₅、（Ｃ Ｈ₂）₆およびＣＯ−ＣＨ−ＮＨ₂から成る群から選択される。好ましくは、Ｘ₁は 存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される。 前記の実施態様のさらに好ましい態様では、Ｘ₁はＮＨであり、Ｒ₃はＨ、ＣＯ −ＮＨ−ＣＨ₃およびＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ₂から成る群から選択される。前記の実 施態様の別の好ましい態様では、Ｘ₁はＯであり、Ｒ₃はＨである。 前記の実施態様のさらに好ましい態様では、Ｘ₁は存在せず、Ｒ₃はＣＨ₂−Ｃ Ｈ₂−ＮＨ₂である。その他の好ましい化合物は、Ｒ₂が（ＣＨ₂）₂であり、Ｘ₁は Ｏであり、Ｒ₃はＨである。 前記の実施態様の別の好ましい態様では、Ｒ₂は（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁はＮＨ であり、Ｒ₃はＨである。さらに好ましい化合物は、Ｒ₂が（ＣＨ₂）₄であり、Ｘ₁ はＮＨであり、Ｒ₃はＨである。別の好ましい化合物では、Ｒ₂は（ＣＨ₂）₅で あり、Ｘ₁はＮＨであり、Ｒ₃はＨである。好ましい化合物のさらに別の群では、 Ｒ₂は（ＣＨ₂）₆であり、Ｘ₁はＮＨであり、Ｒ₃はＨである。好ましい化合物の さらに別の群は、Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁はＮＨであり、Ｒ₃はＣＯ−ＣＨ₂ −ＮＨ₂であるものである。 さらに別の好ましい化合物では、Ｒ₂は（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁はＮＨであり、 Ｒ₃はＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₃である。好ましい化合物の別の群では、Ｒ₂はＣＯ−Ｃ Ｈ（ＮＨ₂）であり、Ｘ₁は存在せず、Ｒ₃はＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂である。 本発明はさらに、以下の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチンに 関する。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₅は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝 鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル 、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、 アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０ 〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基 もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘ テロ原子を含有し、 Ｒ₃およびＲ₆は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、 アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレ オシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物 活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換さ れており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかま たはは環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は ０〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁およびＸ₂は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃およびＲ₅−Ｘ₂−Ｒ₆は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する ］ 前記の好ましい実施態様では、ｍおよびｐは２である。好ましくは、この好ま しい態様では、Ｙ₁およびＹ₂は０である。さらに好ましい化合物は、Ｒ₅および Ｒ₂は、存在しないか、ＣＨ₂、（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₃、（ＣＨ₂）₄、（ＣＨ₂ ）₅および（ＣＨ₂）₆から成る群から選択される。さらに好ましくは、Ｒ₁および Ｒ₄は、Ｃ₁₀Ｈ₂₁、Ｃ₁₂Ｈ₂₅およびＣ₁₄Ｈ₂₉から成る群から選択される。非常に 好ましい化合物では、Ｘ₁およびＸ₂は存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群か ら選択される。 好ましい化合物の一群では、Ｒ₁およびＲ₄は、Ｃ₁₂Ｈ₂₅であり、Ｒ₂はＣＨ₃で あり、Ｘ₁およびＲ₃は存在せず、Ｒ₅はＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂であり、Ｘ₂はＮＨであ り、そしてＲ₆はＨである。 本発明の別の態様は、細胞中へ分子を輸送する方法であって、 （ａ）有効量の上記の式を有するあらゆる陽イオン性脂質とこの分子とを接触さ せて、脂質との複合体を形成させる工程と、 （ｂ）工程（ａ）で形成された脂質複合体と細胞とを接触させて、それにより生 物学的有効量の分子を細胞中に挿入する工程と、 を含む輸送方法に関する。 前記の方法の好ましい態様では、この分子は陰イオン分子である。 前記の方法の別の態様では、複合体はさらに、上記の一般式で示される構造を 有する陽イオン性脂質の他に、１つまたはそれ以上の脂質を含む。好ましくは、 脂質は、上記の一般式で示される構造を有する陽イオン性脂質の他に、中性脂質 、リン脂質およびコレステロールから成る群から選択される。 本方法の一態様では、細胞はインビトロ条件下で接触させられる。本発明の別 の態様では、細胞はインビボ条件下で接触させられる。好ましくは、細胞は、ネ ズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタ動脈内、 ウサギ動脈内、ランス（Renca）腫瘍または皮下腫瘍検定から成る群から選択さ れる検定にかけられる。 本方法の好ましい実施態様では、陰イオン分子はｍＲＮＡである。本方法の別 の好ましい実施態様では、陰イオン分子はＤＮＡである。 本発明の別の態様は、細胞中に分子を輸送するのに用いるための次式の化合物 である。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁ 〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシ ル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケ ンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個 の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしく はアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原 子を含有し、 Ｒ₃は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、アミノ酸、ペプチド、 ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオ チド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは 以下の構造を有する基であり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換さ れており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかま たは環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０ 〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］ 本発明のさらに別の態様は、細胞中に分子を輸送するのに用いるための次式 の化合物である。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₅は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝 鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル 、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、 アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０ 〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基 もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘ テロ原子を含有し、 Ｒ₃およびＲ₆は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、 アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレ オシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物 活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基 または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基は アルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、 アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されて おり、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかまたは 環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０〜５ 個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁およびＸ₂は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃およびＲ₅−Ｘ₂−Ｒ₆は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する ］ 図面の簡単な説明 図１は、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成を示す。 図２は、Ｍｅ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成を示す。 図３Ａ〜３Ｄは、ＣＯＳ７およびＣ２Ｃ１２細胞の両方におけるＤＭＲＩＥお よびＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率を比較する。 図４は、肺内および腹腔内トランスフェクション検定における数種のピペラジ ンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率の分析を示す。 図５は、肺内トランスフェクション検定における第一アミンを有する数種のピ ペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率の分析である。 図６は、肺内トランスフェクション検定におけるトランスフェクション効率に 及ぼすヘテロ原子部分および親油性部分のアルキル鎖長の変動の影響を示す。 図７は、腹腔内および皮下腫瘍検定におけるＤＮＡ単独の場合と比較して測定 されたＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効 率の分析である。 好ましい態様の詳細な説明 第四級窒素化合物は、それらの特異的構造に起因する有益な特徴を有する有効 なサイトフェクチンである、ということが知られている。本発明は、環上の窒素 の少なくとも１つが四級化されたピペラジンベースのサイトフェクチンに関する 。親油性部分の他に、本発明のサイトフェクチンは少なくとも１つの環上の窒素 と結合した少なくとも一つのヘテロ原子を含む炭化水素鎖を有する。 炭化水素鎖でのヘテロ原子の包含によって、いくつかの利点が提供される。例 えば、本発明の化合物はより特異的に細胞膜に相互作用し、より高いレベルのト ランスフェクションを達成する能力を有するトランスフェクション剤を形成する よう誘導することができる。本発明の化合物は細胞表面上の標的キーレセプター 及び酵素に結合することができ、それ故分子認識における重要な要因の探求、開 発における使用に適している。 本発明の陽イオン性脂質はさらに、特定の生物学的目的を達成するために細胞 内で輸送される物質と結合し得る。官能基、例えばカルバミル、カルボキシル、 ウレイル、チオール、エステル、エーテル、チオウレイル、ホスホリルまたはグ アニジル基は、細胞標的部分または治療的分子をサイトフェクチンに結合させる ために用いられる。種々の種類の標的部分および治療的部分を以下で考察する。 付加的にまたは代替的に、官能基はサイトフェクチンの極性電荷密度を増大さ せ、したがってトランスフェクション効率を増強させ得る基を結合させるための リンカーとして使用できる。 サイトフェクチンの生物活性末端基 （ａ）標的種 本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物学的細胞標的活性を有する分 子種を含み得る。この種に含まれるサイトフェクチンは、細胞受容体特異性分子 を含有する。典型的には、受容体特異性ペプチドまたはアミノ酸はアミドとして 結合される。本発明のサイトフェクチンに連結され得る好ましいペプチドの例と しては、走化性ペプチド、メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン(Ｍｅｔ− Ｌｅｕ−Ｐｈｅ)、およびｐＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓが挙げられる。本発明のサ イトフェクチンと結合され得る細胞表面受容体のためのその他の配位子は、ペプ チド擬似類似体、多数のウイルス付着およびインターナリゼーションペプチド、 ラクトースならびにその他の二および多糖類、アセチルコリン類似体、ならびに 葉酸誘導体を包含する。 （ｂ）治療剤 本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物活性分子種を含み得る。本発 明の化合物と結合し得る好ましい生物活性種の例は、チロトロピン放出ホルモン ｐグルタミン酸−ヒスチジン−プロリンである。 （ｃ）細胞および細胞内標的 本発明のサイトフェクチンは、細胞膜または細胞内標的と特異的に結合して所 望の生理学的反応に影響を与えることのできる配位子を保有する末端基を含む。 適切な配位子は、ウイルスエピトープ、ホルモン、酵素、基質、単糖類、二糖類 、オリゴ糖類、炭水化物、補因子、薬剤、レクチン、オリゴヌクレオチドおよび 核酸であるペプチドを包含し得る。この基の中の好ましい種は、クロロキンおよ びその他のリソソーム親和性剤、核局在性ペプチド、コルチコステロイドおよび ウイルスペプチドまたはタンパク質を包含するサイトフェクチンである。 （ｄ）トランスフェクション効率に影響を及ぼす群 本発明のサイトフェクチンは、それらのトランスフェクション効率に影響を及 ぼす群と結合し得る。このような群は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タ ンパク質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖または多糖類で ある。これらの構成単位をサイトフェクチンに付加するための伝統的および非伝 統的結合法がともに考えられる。さらに、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドま たはタンパク質は、生体中には一般に見出されない異常なまたは修飾されたアミ ノ酸を含み得る。このような異常な又は修飾されたアミノ酸は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２に列挙された異常な又は修飾されたアミノ酸に限られない。さらに 、このようなアミノ酸は天然には見つからない合成アミノ酸である。本特許にお けるサイトフェクチンに対する請求の範囲は、あらゆる部分がヘテロ原子炭化水 素鎖を介してピペラジン骨格に結合した化合物を包含する。したがって、請求の 範囲は、サイトフェクチンを別の部分と組合せるかまたは連結することによって も回避にされない。 さらに、ヘテロ原子基は単独で、トランスフェクション効率に有益に作用し得 る。ＢＡＥ−ＤＭＲＩＥに関して前記したように、ヘテロ原子基の個性は、トラ ンスフェクション効率に有意の影響を及ぼす。 （ｅ）薬剤 本発明の化合物は、インビトロおよびインビボで哺乳類細胞をトランスフェク ションするための薬剤中に用い得る。トランスフェクション用の薬剤は当業者に は公知であって、それらの製造方法と一緒に、例えば米国特許第５，２６４，６ １８号(Felgner)、米国特許第５，３３４，７６１号(Gebeyehuら）、およびFelg ner et al．(J.Biol．Chem．269:2550-2561，1994)に開示されている。これらの 記載内容は、参照により本明細書中に含まれる。本発明の陽イオン性脂質は、リ ン脂質等の両親媒性脂質、ならびにコレステロール等の中性脂質と組合されて脂 質小胞を形成するが、これはリポソーム、単層板小胞、ミセルまたは簡単な薄膜 である。 （ｆ）遺伝子治療、ワクチンおよびトランスフェクションのための請求の範囲の 化合物の使用 陽イオン性リポソームは、血管、循環器系、肺上皮細胞、脳組織およびカエル 胚（xenopus）の細胞中へのポリヌクレオチド、高分子および小分子の進入を促 すのに有用であることが公知である。本発明の陽イオン性脂質は、遺伝子治療を 促進するのに特に有用である。生きている生体、例えば鳥類、哺乳類、魚類およ び両生類を含めた脊椎動物等へのｍＲＮＡまたはＤＮＡの導入を促進するための 開示された陽イオン性脂質の使用が特に考えられる。とりわけヒト及び家畜への 導入が考えられる。この目的ならびにトランスフェクションプロトコールのため の陽イオン性脂質の使用は、Nabelら(Human Gene Therapy 3:399-410，1992) 、米国特許第５，４５９，１２７（Felgner）及びWheelerら、1280 Biochem．Bi ophys．Acta:1-11(1996)に報告されている。 本発明のサイトフェクチンにより導入されるポリヌクレオチドは、好ましくは 免疫原性または治療用ペプチドまたはポリペプチドをコードする。したがって、 本方法は、ポリヌクレオチドワクチン接種ならびに遺伝子治療のために用い得る 。本発明の陽イオン性脂質を用いてＤＮＡを宿主生物中に導入する場合、ＤＮＡ はコード領域の他に、ＣＭＶ、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター等の適切なプ ロモーター、リボソーム結合部位およびポリアデニル化部位のような配列を含有 し得る。 本発明のサイトフェクチンはインビトロで細胞にトランスフェクションを行う のに有用である、ということも注目される。本発明の範囲内の種々の化合物がイ ンビボで多少組織特異性であるが、しかしほとんどまたはすべてがインビトロで の培養細胞のトランスフェクションに有用である。本発明のあらゆる特定の候補 サイトフェクチンに関しては、インビトロおよびインビボでの種々の組織内にお けるその相対的トランスフェクション効能は、例えば実施例２〜１１に開示され たようなスクリーニング検定またはその他の標準的なトランスフェクション検定 を用いて容易に確かめ得る。この情報により、当業者は業界認知の薬剤および用 量を用いて容易に本発明を実行し得る。 （ｈ）代表的ピペラジンベースのサイトフェクチンおよびその命名法 下記の表１は、以下の実施例に用いられる代表的ピペラジンベースのサイトフ ェクチンをその頭字語とともに列挙する。表１に列挙した一つの四級基を有する 化合物は、ｍおよびｐがともに２であり、Ｙ₁およびＹ₂がともに０である下記の 構造を有する。 表１に列挙した二つの四級基を有する化合物は、ｍおよびｐがともに２であり 、Ｙ₁およびＹ₂がともに０である下記の構造を有する。 表１に示された命名法のシステムは、本出願を通して一貫して用いられる。Ｂ Ｐという呼称は、ビス−ピペラジン（bis-piperazine）骨格を示す。頭字語ＭＯ Ｅ、ＬＯＥおよびＤＯＥはそれぞれ、親油性部分、ミリスチルオキシエチル(Ｃ_{1 4} Ｈ₂₉Ｏ（ＣＨ₂）₂)、ラウリルオキシエチル（Ｃ₁₂Ｈ₂₅Ｏ（ＣＨ₂）₂）およびデ シルオキシエチルを示す。その他の頭字語は、少なくとも１つのヘテロ原子を有 する炭化水素鎖に関する。その例を下記に示す。 ＨＥ＝ヒドロキシエチル；ＧＡ＝ガンマアミノ；ＤＡ＝デルタアミノ；ＦＡ＝フ ァンフアミノ(ｆｕｎｆ ａｍｉｎｏ)；ＨＡ＝ヘキシルアミノ；Ｍｅ＝メチル； Ｇｌｙ−Ｇ＝グリシンアミド；ＤＡＢ＝２，４−ジアミノ酪酸アミド；ＤｉＭｅ ＝ジメチル；ＧＭＵ＝ガンマメチルウレア 表１ 一つの四級基を有する化合物 Ｃ−１４アルキル鎖Ｒ₃およびＲ₄＝Ｃ₁₄Ｈ₂₉ ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝Ｏ；Ｒ₃＝Ｈ ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＤＡＢ−Ｇ−ＭＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ₂）；Ｘ₁＝存在せず；Ｒ₃ ＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂ Ｃ−１２アルキル鎖Ｒ₃およびＲ₄＝Ｃ₁₂Ｈ₂₅ Ｍｅ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₃；Ｘ₁＝存在せず；Ｒ₃＝存在せず ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝Ｏ；Ｒ₃＝Ｈ ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＤＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＦＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＨＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃ ＝Ｈ Ｇｌｙ−Ｇ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝ＣＯ− ＣＨ₂−ＮＨ₂ ＧＭＵ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝ＣＯ− ＮＨ−ＣＨ₃ Ｃ−１０アルキル鎖Ｒ₃およびＲ₄＝Ｃ₁₀Ｈ₂₁ ＨＥ−ＤＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝Ｏ；Ｒ₃＝Ｈ ＧＡ−ＤＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＤＡ−ＤＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ 二つの四級基を有する化合物 Ｒ₃およびＲ₄＝Ｃ₁₂Ｈ₂₅ ＤｉＭｅ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂およびＲ₅＝ＣＨ₃；Ｘ₁、Ｘ₂、Ｒ₃およびＲ₆ ＝存在せず Ｍｅ，ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₃；Ｘ₁およびＲ₃＝存在せず；Ｒ₅＝Ｃ Ｈ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₂＝ＮＨ；Ｒ₆＝Ｈ 表１に列挙した化合物は本発明の化合物の代表的なものであって、本発明は表 １の化合物に限定されない、と当業者は理解するだろう。さらに、一つの四級基 を有する化合物に関して表１に列挙した置換基の種々の組合せを有する２つの四 級基を有するピペラジンサイトフェクチンが本発明により特に意図される、と当 業者は理解するだろう。 下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、開示された方法は本発 明の範囲に網羅されるすべての陽イオン性脂質の調製に適用可能であるが、その 例に限定されない。実施例に示した温度はすべて摂氏であり、修正はなされない 。 実施例１ ビス−ピペラジンサイトフェクチンの合成 下記の化学反応は、本発明の陽イオン性脂質の調製への一般的適用に関して開 示される。時折、反応は、前記のように、開示された範囲内の各分子種に適用可 能である訳ではない。これが生じる化合物は、当業者には容易に認識される。こ のような場合はすべて、反応は当業者に公知の慣用的修正により、即ち代替的慣 用試薬に代えることにより首尾よく実行され得るか、または反応条件のルーチン の修正により首尾よく実行される。あるいは、本明細書中にＤＯＴＭＡ化合物（ Felgner et al．，J．Biol．Chem．84:7413-7417，1987）のようなその他の種類 のサイトフェクチンの合成に関して本明細書中に引用された参考文献に、または 慣用的化学文献に開示されたその他の反応は、本発明の化合物の調製に適用可能 である。すべての製造方法において、出発物質はすべて、公知であるかまたは公 知の出発物質から容易に調製可能である。 Ａ．代表的な一つの四級基を有する化合物（ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）の合成 一つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの代表的合成例と して、以下の例を示す。ピペラジン骨格に結合したラウリル以外の基を有するピ ペラジンベースのサイトフェクチンの合成は、単に、所望のアルキルメタンスル ホネート、例えばミリスチルメタンスルホネートまたはデシルメタンスルホネー トを下記の合成のドデシルメタンスルホネートの代わりに置換することにより容 易に成し遂げ得ると、当業者は理解するだろう。同様に、親油性鎖がアミン結合 を介してピペラジン骨格に連接されるピペラジンベースのサイトフェクチンを合 成することが望ましいものは、下記の合成において単にビス−アミノエチルピペ ラジンをビスーヒドロキシエチルピペラジンの代わりに置き換え得る。 Ｎ，Ｎ‘−ビス−（２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジン［ＬＯＥ−ＢＰ］ ： マグネティックスターラーを備えた乾燥フラスコをアルゴン雰囲気にした後、 水素化ナトリウム（油中に６０％、１．４７ｇ、３７ｍｍｏｌ）を投入した。ド ライヘキサン（４×１５ｍｌ）を用いて粉砕後、無水テトラヒドロフラン（１２ ０ｍｌ）を加え、攪拌を開始して、薄いスラリーを得た。ビス−ヒドロキシエチ ルーピペラジン（２．７９ｇ、１６ｍｍｏｌ）を固体として一度に加え、その後 反応物を還流させて、一夜その温度を維持した。再還流スラリーに、無水テトラ ヒドロフラン（２５ｍｌ）に溶解したドデシルメタンスルホネート（１０．２ｇ ，３８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応物をさらに３日間還流し続けた。反応物を 冷却し、スラリーをセライトの１ｃｍプラグを通して真空濾過し、反応容器およ び濾過装置をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）で洗浄した。濾液を合わせた後 、蒸発させて、残渣をエチルエーテル（２３０ｍｌ）および０．２Ｎ水酸化ナト リウム（５０ｍｌ）に分配した。相を分離し、有機層を水（５０ｍｌ）で２回洗 浄した後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶液を濾紙で濾過し、濾液を蒸 発させて、粗製物質を得た。１：９のエーテル：ヘキサンから純粋なエーテルま で段階勾配溶離させてシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー処理して、ＴＬ Ｃ均質物質（３．６ｇ、４４％）を得た。 （±）−Ｎ−（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシル オキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−Ｂｐ］ アルゴン雰囲気を維持しながら、指定された順序で、乾燥フラスコ中で、ＬＯ Ｅ−ＢＰ(２．１６ｇ、４．２ｍｍｏｌ)、無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ ）およびＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（１．４２ｇ、５．３ｍｍｏ ｌ）を混合した。フラスコにびったり栓をした後、１０５℃に予め平衡化した油 浴中つけ、マグネティックスターラーで攪拌を開始した。溶液は、２分以内に均 一に なった。指示された温度で３日間攪拌後、反応物を冷却し、溶媒を減圧濃縮によ り除去した。シリカゲル（９０：１０：０．２５：０．２５−クロロホルム：メ タノール：水酸化アンモニウム：水、イソクラティク溶離）上で残渣をクロマト グラフィー処理して、ＴＬＣ均一物質（１．７０ｇ、５２％）を得た。 （±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ‘−ビス−（ドデシルオキシエ チル）−ピペラジニウムブロミド［「ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ」］： 無水エタノール（３３ｍｌ）に溶解したγ−ＰＨｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（１．７ ７ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で攪拌して調製した。透明な混合物に 、無水ヒドラジン（１．６ｍｌ、５１ｍｍｏｌ）を一定流で加えた。次にフラス コをアルゴンで置換して、ぴっちり栓をして、室温で一夜攪拌した。この期間の 後、濃スラリーをクロロホルム（６５ｍｌ）で希釈して、約３０分間攪拌し、次 に中間ガラスフリットを通して真空濾過した。反応容器および濾過装置をさらに べつの６５ｍｌのクロロホルムを２回に分けて用いて洗浄した。あわせた濾液を ４０℃未満の温度で減圧濃縮させて、小容積にした。次に残渣をクロロホルム（ ３５０ｍｌ）および０．１Ｎ水酸化ナトリウム（１５０ｍｌ）に分配した。水相 をクロロホルム（１５０ｍｌ、その後１２５ｍｌ）でさらに２回洗浄し、あわせ た有機相を無水硫酸ナトリウムで一夜乾燥した。次に透明溶液を濾紙で濾過し、 蒸発させた。残渣を高真空下で一夜処理した後、クロロホルム（１０ｍｌ）に溶 解して、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発させて、次に残渣 を高真空下で一夜処理して、ＴＬＣ均質生成物１．３７ｇ（９３％）を得た(ア ミン 被覆シリカゲル、８５：１５：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール ：水酸化アンモニウム：水、Ｒ_f＝０．５１)。 ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰに関する合成概略図を図１に示す。 Ｂ．代表的な二つの四級基を有する化合物（Ｍｅ，ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）の合成 Ｎ，Ｎ‘−ビス−（２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジン［ＬＯＥ−ＢＰ ］および（±）−Ｎ−（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２− ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［γ−ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−Ｂ Ｐ］を、前記と同様に合成した。 （＋）−Ｎ−メチル−Ｎ‘(３−フタルイミド)プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２ −ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［Ｍｅ，γ−ｐｈｔｈ−Ｌ ＯＥ−ＢＰ］ 乾燥フラスコ中で、γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ(０．４４ｇ、０．５６ｍｍ ｏｌ)、ジメチルホルムアミド（１．３ｍｌ）およびヨウ化メチル（０．１５ｍ ｌ、０．３４２ｇ、３ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコにびったり栓をした後、１ ０５℃に予め平衡した油浴中につけ、マグネティックスターラーで攪拌を開始し た。指示された温度で３日間攪拌後、反応物を冷却し、溶媒を減圧濃縮により除 去した。シリカゲル（９０：１０：０．２５：０．２５から８５：１５：０．２ ５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、段階勾配 ）上 で残渣をクロマトグラフィー処理して、ＴＬＣ均一物質（０．３３６ｇ、６７％ ）を得た(シリカゲル、８０：２０：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタ ノール：水酸化アンモニウム：水、Ｒ₁＝０．２８)。 （＋）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ‘−メチル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２ −ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド[「ＧＡ，Ｍｅ−ＬＯＥ−Ｂ Ｐ」]： 無水エタノール（１０ｍｌ）およびクロロホルム（５ｍｌ）に溶解したＭｅ， γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（０．３２ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液を、室温 で攪拌して調製した。透明な混合物に、無水ヒドラジン（０．３ｍｌ、９．６ｍ ｍｏｌ）を一定流で加えた。次にフラスコをアルゴンで置換して、ぴっちり栓を して、室温で一夜攪拌した。この期間の後、濃スラリーをクロロホルム（３０ｍ ｌ）で希釈して、約３０分間攪拌し、次に中間ガラスフリットを通して真空濾過 した。反応容器および濾過装置をさらにべつの６０ｍｌのクロロホルムを２回に 分けて用いて洗浄した。あわせた濾液を４０℃未満の温度で減圧濃縮させて、小 容積にした。クロロホルム（１００ｍｌ）を加えた後、真空除去して、残渣は４ 日間高真空下に置いた。その後、白色固体を９：１−クロロホルム：エタノール （２０ｍｌ）に溶解し、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発さ せて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、もろい白色固体を得た。この残渣を クロロホルム：メタノール（１１０ｍｌ、８：３比）中に溶解し、０．２Ｎ水酸 化ナトリウム（３０ｍｌ）で洗浄した。水相をクロロホルム（１５ｍｌ）で洗浄 し、あわせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次に透明な溶液を濾紙を 通して濾過し、蒸発させた。残渣を高真空下で一夜処理し、次に純粋なクロロホ ルム（１０ｍｌ）中に溶解し、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を 蒸発させて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、生成物（０．２３ｇ、５９％ ）を得た。 図２は、代表的な二つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチン Ｍｅ，ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成に関する反応概略図を示す。 前記の方法は、種々の二つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェク チンを調製するために用いうる、と当業者は理解するだろう。四級窒素の各々に 結合した非親油性部分は、同一であっても異なってもよい。本発明の二つの四級 基を有するサイトフェクチンの一実施態様では、四級窒素に結合した非親油性部 分はいずれも、ヘテロ原子である。代替的実施態様では、唯一の非親油性部分は ヘテロ原子である。 もちろん、１つ以上の反応性官能基を有する分子の場合には、特定のカップリ ング反応に関与するよう意図されない１つまたはそれ以上の基をブロックまたは マスクする必要がある、ということに、当業者は気づくだろう。スクリーニング を活用した合成は、特定の適用に最も有効なサイトフェクチンを効率よく選択す るために使用できる。 実施例２ インビトロトランスフェクションに及ぼす薬剤の作用： ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰとＤＭＲＩＥとの比較 サイトフェクチン：クロロホルムに溶解した選択されたサイトフェクチンの溶 液を重量対容量（ｗ／ｖ）ベースで調製した。陽イオン性脂質および中性脂質（ 用 いた場合）のアリコートを、１ｍｌの水性媒体を用いた再構成時に所望される相 対および絶対脂質濃度を提供するように無菌的に、計算した量で滅菌バイアルに 移した。ドライ窒素流で大量のクロロホルムを除去し、バイアルを一夜高真空下 で処理して、残留溶媒をすべて除去した。 ＤＮＡ−脂質複合体：プラスミドＤＮＡの５ｍｇ／リン酸緩衝生理的食塩水（ ＰＢＳ）１ｍｌならびに乾燥した処方済みサイトフェクチン−中性脂質混合物を ＯＰＴＩＭＥＭ^TM（Gibco BRL）中に懸濁し、示されたような所望の質量／モル 比で９６ウエルプレート中で一緒に混合した。ＤＮＡ−脂質複合体を混合後２時 間以内に細胞に加えた。 トランスフェクション 細胞系：使用した細胞系は、アメリカ型培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ，Ro ckville，MD）から入手したＣＯＳ７サル腎臓細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１ )、およびＣ２Ｃ₁₂マウス筋原細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７７２）を用いた。 細胞はすべて、１：５〜１：１０で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびダル ベッコ修正イーグル液（ＤＭＥＭ）中で継代した。全細胞は、受領時に１０回ダ ブリング継代させて広げ、アリコートを凍結保存した。再拡張して、全細胞をト ランスフェクション試験に用い、その後さらに１０回継代した。 トランスフェクション検定：０日目に、１０％ＦＥＢＳ／９０％ＤＭＥＭ １ ００μｌ中２０，０００個の細胞を９６ウエル培養プレート（Nunc）の各ウエル 中に植え付け、５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で一夜培養した。１日目 に、細胞が移動しないように注意深く培地を吸引し、血清無含有ＯＰＴＩＭＥＭ^TM （Gibco BRL）中のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ／ｐＲＳＶ ｌａｃＺ／ＤＯＰＥ １ ００μｌを加えた。ＤＭＲＩＥは、参照標準として用いた。ｌａｃＺ遺伝子は比 色計で検定される酵素β−ガラクトシダーゼをコードする。陽イオン性脂質：Ｄ ＯＰＥ比は、各ウエルに関して変化した。４時間培養後、３０％ＦＢＳ／７０％ ＯＰＴＩＭＥＭ^TM５０μｌを各ウエルに加えた。２日目、各ウエルに１０％ＦＥ ＢＳ／９０％ＯＰＴＩＭＥＭ^TM１００μｌを加えた。３日目、培地を取り出し、 ５０μｌの溶解緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０中の０．１％トリト ン−Ｘ₁００）を加え、このプレートを７０℃で少なくとも２０時間保存した。 解氷後、Felgnerら（J．Biol．Chem．269:2550-2561，1994）にしたがって、ウ エル培地中でのβ−ガラクトシダーゼ酵素活性量を検定した。 結果（図３Ａ〜３Ｄ）は、ＣＯＳ７細胞中のβ−ｇａｌの総発現およびピーク 発現はともに、５０：５０のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ：ＤＯＰＥ比で最適であり、Ｃ ２Ｃ₁₂細胞においては２５：７５のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ：ＤＯＰＥ比で最適であ ったことを示す。ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰは、これらのインビトロ検定では、ＤＭＲ ＩＥに比較してこの好ましかった。これらの実施例は、本発明のピペラジンベー スのサイトフェクチンがインビトロでの細胞膜を通過するＤＮＡの効率のよい輸 送と、その後の細胞内での遺伝子の機能性発現を促進することを示す。これらの 試験に用いたスクリーニング検定は、トランスフェクション活性を実証するのに 、そしてサイトフェクチン／共脂質比を最適化するのに有用である。 実施例３ 肺内および腹腔内トランスフェクション検定における ピペラジンベースのサイトフェクチンの分析 Ａ．肺内トランスフェクション検定 成熟（４〜１６週）雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをメトファンで軽く麻酔し、１００ μｌのＵＳＰ生理的食塩水または水中の１３２μｇのクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ＤＮＡ±陽イオン性脂質を、小型プラスチッ クカテーテル付きの使い捨て滅菌プラスチック製インシュリン注射器を用いて鼻 腔内投与した。陽イオン性脂質をクロロホルム中の１モル当量のＤＯＰＥと混合 し、溶媒を蒸発させた後、残渣を高真空下で処理して、脂質薄膜を得た。この薄 膜に水を加え、約１分間攪拌して、陽イオン性リポソームを調製した。水中の適 切な容量のプラスミドＤＮＡおよび水中の陽イオン性リポソームを室温で混合し 、約３０秒間かき混ぜて、２：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）ヌクレオチド：サイトフェ クチン比で複合体を得た。液体および注射器はすべて、室温に平衡させ、１００ μ ｌ容量のＤＮＡを１回投与するのに要する時間は１分未満であった。投与の２ま たは３日後、ナトリウムペントバルビタールを過剰投与してマウスを屠殺し、下 記のように肺を抽出した。 肺を直に凍結し、−７８℃で保存した。試験管内にぴったり合った可逆ドリル およびビットを用いて１．５ｍｌ試験管内の０．４ｍｌ凍結溶解緩衝液上で磨砕 することにより、凍結肺を独立で微細粉末に粉砕し、粉末を同一試験管中で、抽 出するまで−７８℃で保存した。凍結粉末を解氷し、１００μｌのＲｅｐｏｒｔ ｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号 Ｅ３９７Ａ、promega）を各 々に加えた。標本を１５分間攪拌し、液体窒素と室温水浴を交互に用いて３回凍 結−解氷し、１０，０００ｘｇで３分間遠心分離した。上清を別の１．５ｍｌ試 験管に移し、さらに５００μｌの溶解緩衝液をペレットに加えた後に、抽出工程 を（凍結−解氷せずに）反復した。二番目の上清を最初の上清とあわせて、−７ ８℃で保存した。 使用した陽イオン性ピペラジンベースの脂質は、ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＧＡ− ＭＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰであって、ＧＡＰ ＤＬＲＩＥを比較のために含めた。 Sankaran（Anal．Biochem.，200:180-186，1992）の放射能分配法により、ま たはＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）を 用いて、ＣＡＴ検定を実施した。要するに、ＣＡＴ組織ホモジネートをエタノー ル／ドライアイス浴中で３回凍結−解氷して、破裂させた。遠心分離により細胞 破屑を取り除き、タンパク質抽出物を¹⁴Ｃクロラムフェニコールおよびアセチル ＣｏＡと一緒にインキュベートした。クロラムフェニコールを酢酸エチルで抽出 し、薄層クロマトグラフィーを実施して、抽出細胞タンパク質により転換された¹⁴ Ｃクロラムフェニコールのパーセンテージを確定した。細胞抽出物を２０分間 インキュベートした２μｇのタンパク質に対して標定した。組織抽出物を、４時 間インキュベートした２００μｇのタンパク質に対して標定した。 肺抽出物中にスパイクされた精製酵素（Sigma，St．Louis，MO）またはＥＬＩ ＳＡキットで提供された酵素を用いて、標準曲線を構築した。２つのＣＡＴ検 定法は、同一組の抽出物からの標本当たり等価ｐｇのＣＡＴを生じた。 Ｂ．腹腔内トランスフェクション検定 前記の肺内検定で試験したピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフ ェクション効率を、ネズミ腹腔内モデルで評価した。５００μlのＲＰＭＩ中の ２００，０００個のネズミＢ１６腫瘍細胞を、０日目にＣ５７／Ｂ１６マウスに 腹腔内注射した。７〜１４日目に、ＤＮＡ／サイトフェクチン／生理的食塩水溶 液をマウスに腹腔内注射した。ＤＮＡ ０．５ｍｇを１．５ｍｌの生理的食塩水 中にＤＮＡ：サイトフェクチンのモル比が１０：１となるように種々のサイトフ ェクチンと混合した。ＤＮＡ注入後２日目に、腫瘍を収集し、抽出して、前記の 肺内検定に関する記載と同様に、ＣＡＴ活性に関して検定した。 Ｃ．結果 肺内および腹腔内トランスフェクション検定において、ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ、 ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−Ｌ ＯＥ−ＢＰを用いて得られた結果を、表４に要約する。肺内検定では、ＧＡ−Ｌ ＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥよりも大きいトラン スフェクション効率を提供した。ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰおよ びＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰは、肺内検定ではほとんど有効でなかった。 腹腔内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰは試験したピペラジンベースのサイトフ ェクチンのうち最大のトランスフェクション効率を提供したが、しかしそのトラ ンスフェクション効率は本検定におけるＧＡＰ−ＤＬＲＩＥにより得られた結果 と同じ程に高いわけではなかった。試験した残りのピペラジンベースのサイトフ ェクチンは、腹腔内検定においてほとんど活性がなかった。 ここに報告した試験は、請求の範囲の化合物がトランスフェクションにおいて 活性であることを示すだけでなく、特定の組織のトランスフェクションに対して サイトフェクチンを選択し、最適化する方法を示している。特定の最適構造はこ の検定に関して容易に明らかになるが、しかし、これらの結果は組織特異的であ ると理解される。言い換えれば、この検定で次善的に実施されたサイトフェクチ ンでも、インビトロトランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、 ブタまたはウサギ動脈内、一般的皮下腫瘍またはランス（Renca）腫瘍検定など の他の検定においても有益な活性を有し得る。 実施例４ 第一級アミンを有するピペラジンベースのサイトフェクチンの分析 ＤＭＲＩＥ類サイトフェクチンでは、アルコール基を第一級アミンに置換する と、トランスフェクション効率が増強される(Wheeler et al.，1280 Biochem．B iophys．Acta:1-11(1996))。このために、四級窒素と結合した第一級アミンを有 するピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、肺内 検定においてＤＮＡ単独のトランスフェクション効率に対して評価した。肺内検 定は、前記の実施例３と同様に実施した。対照として、１３２μｇのＤＮＡ単独 で得られたトランスフェクション効率を確定した。 図５は、この比較の結果を示す。各々が第一級アミンを有するＧＡ−ＬＯＥお よびＧｌｙ−Ｇ−ＬＯＥはともに、ＤＮＡ単独より有意に大きいトランスフェク ションレベルを提供した。ＧＭＵ−ＬＯＥを用いて得られたトランスフェクショ ン効率は第一級アミンを有するサイトフェクチンと同様程度には高くはなかった が、しかしＤＮＡ単独で得られた結果に比べて上昇した。 実施例５ トランスフェクション効率に及ぼすヘテロ原子部分 および親油性部分のアルキル鎖長の変動の影響 異なる種類の細胞におけるトランスフェクション効率は、親油性およびヘテロ 原子鎖長の個性により影響される。このために、親油性およびヘテロ原子基の鎖 長が異なるピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を 、肺内検定で比較した。肺内検定は、前記の実施例３に記載したのと同様に実行 し た。図６は結果を示す。 第一級アミン基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの中で、最高ト ランスフェクション効率はＧＡ−ＬＯＥにより得られた。親油性鎖の長さだけが ＧＡ−ＬＯＥと異なるＧＡ−ＭＯＥおよびＧＡ−ＤＯＥは低活性を示したが、し かしＧＡ−ＭＯＥはＤＮＡ単独より有効であった。 同様に、第一級アミンの鎖長が増大すると、トランスフェクション効率は低減 した。ＧＡ−ＬＯＥはＤＡ−ＬＯＥより大きい活性を示したが、一方ＤＡ−ＬＯ ＥはＦＡ−ＬＯＥまたはＨＡ−ＬＯＥより有効であった。試験した第一級アミン を有するピペラジンベースのサイトフェクチンはすべて、ＤＮＡ単独より有効で あった。 ヘテロ原子部分にアルコール基を有するピペラジンベースのサイトフェクチン の中では、ＨＥ−ＬＯＥが最も有効であった。しかしながら、肺内検定では、第 一級アミンを有するサイトフェクチンは、アルコール基を有するものより有効で あった。 実施例６ 一般的皮下腫瘍トランスフェクション検定 特定の腫瘍型に適合性であるマウス系統の側腹に腫瘍細胞の懸濁液を皮下注入 して、腫瘍を調製した。腫瘍を定期的に測定した。それらが注入に適したサイズ に達すると、腫瘍を球形と仮定して測定した直径を基礎にして腫瘍容積を近似さ せた。処置すべき腫瘍の容積と等しい容積の生理的食塩水中の評価されるサイト フェクチンとレポーター遺伝子をコードするプラスミドとの複合体を次に、特定 腫瘍型に最適の流速で注入した。適切な時間後、腫瘍を収集し、凍結した後、粉 砕した。レポーター遺伝子生成物をその後抽出し、前記と同様に活性を定量した 。 実施例７ 皮下腫瘍中および腹腔内トランスフェクション検定における ピペラジンベースのサイトフェクチンの分析 ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率を 、腹腔内および皮下腫瘍検定においてＤＮＡ単独の場合と比較して測定した。腹 腔内検定は、実施例３に記載したように実行した。皮下腫瘍検定は、ネズミＢ１ ６黒色腫細胞を用いて、上記の実施例６と同様に実行した。 結果を図７に示す。皮下腫瘍検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲ ＩＥより大きいトランスフェクション効率を得た。ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧ Ａ−ＬＯＥ−ＢＰの両方で観察されたトランスフェクション効率は、プラスミド 単独で観察されたよりも大きかった。 腹腔内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥより低効率であっ たが、しかしＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＧＡＰ−ＤＬＲＩＥはともに、プラスミ ド単独に比してトランスフェクション効率を増大した。 実施例８ 皮下ランス（Renca）腫瘍モデル ９０％ＲＰＭＩ１６４０／１０％ウシ胎仔血清中で、ランス（Renca）腫瘍を 増殖させた。約１０⁶個細胞／組織培地１ｍｌを含有する懸濁液７５μｌで腫瘍 を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの側腹に皮下注射した。腫瘍が直径４．５〜７ｍｍに達 した時に、球形腫瘍と想定して、腫瘍の直径を測定して、各々の個々の腫瘍の容 積を算出した。個々の腫瘍の各々に関して、腫瘍の算出容積と等しい容積の生理 的食塩水中サイトフェクチン／ＣＡＴプラスミド複合体を、２ｍｌ／分の速度で 腫瘍に注入した。４８時間後、腫瘍を収集し、凍結し、すり砕いて、実施例３に 記載したように、１．５ｍｌの抽出緩衝液で抽出した。実施例３に記載したよう に、ＣＡＴ活性を定量した。 実施例９ 動脈内検定 動脈遺伝子転移を、以下のように、ヨークシャーブタまたはウサギで実行した 。動脈遺伝子転移を、Nabel，Science 249:1285-1288（1990）に記載されたよう に、各ブタの右および左腸骨大腿骨動脈で実行した。要するに、麻酔後、右およ び左腸骨大腿骨動脈を外科的技法により曝露し、二重バルーンカテーテル（ＵＳ ＣＩ）を各動脈に配置した。１分間に５００ｍｍＨｇに近位バルーンを膨張させ て動脈を損傷させた。次に、動脈の損傷領域で遺伝子転移を実行するために、カ テーテルを再配置した。動脈セグメントを、試験されるサイトフェクチン、ベク ターＤＮＡおよびｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Gibco/BRL）から成るベクター溶液で洗い 流した。１００μｇのＤＮＡおよび３００μｇの脂質の混合物を滴注した。ベク ター溶液を、１５０ｍｍＨｇで２０分間、損傷部位中に滴注した。滴注後、カテ ーテルを除去し、動物を回復させた。トランスフェクションの４８時間後、動脈 を取り出した。ガラス乳棒で組織を押し潰し、その後３回、凍結解氷した。標本 を６５℃で１０分間インキュベートして、内因性アセチラーゼを不活性化した。 タンパク質を抽出し、比色検定（Bio-Rad，Hercules，CA）を用いてそれらの濃 度を確定した。各検定では、４時間のインキュベーシヨン時間を用いて、実施例 ３で前記した手順にしたがって、ＣＡＴ活性に関して、２００μｇの総タンパク 質を検定した。 実施例１０ ブタ動脈およびアテローム硬化症ウサギ動脈中への遺伝子転移 ブタまたはウサギ動脈のリポソームトランスフェクションを、前記（Nabel et al.，Science，249:1285-1288，1990）のように腸骨大腿骨動脈の麻酔、挿管お よび滅菌曝露により実行した。二重バルーンカテーテルを腸骨大腿骨動脈中に挿 入し、近位バルーンを５分間で５００ｍｍＨｇに膨張させた。バルーンをしぼま せ、近位および遠位バルーン間の中心間隙がヘパリン化生理的食塩水で洗浄され るように、カテーテルを進行させた。ＣＡＴ ＤＮＡ溶液（ＣＡＴ ＤＮＡ±サ イトフェクチン）をカテーテルの中心間隙に２０分間滴注した。カテーテルを除 去し、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分 析した。陽イオン性脂質の存在下でＣＡＴ ＤＮＡでトランスフェクション を行った動脈は、ＤＮＡ単独に接触した動脈と比較して、ＣＡＴ遺伝子発現の有 意の増大を示した。 アテローム硬化症ウサギ腸骨動脈の遺伝子転移を、Faxonら（Arteriosclerosi s，4:189-195，1984）が記載した二重損傷モデルを用いて実行した。２回の血管 形成術損傷完了後、カテーテルの末端保持注入口が損傷の近位端にくるように、 血管形成バルーンをわずかに引き抜いた。損傷の遠位端に結紮を置き、損傷セグ メントをヘパリン化生理的食塩水で洗って、ＣＡＴ ＤＮＡ±陽イオン性脂質リ ポソーム溶液を単離損傷セグメント中に２０分間滴注した。カテーテルを除去し 、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分析し た。この検定は、特定の組織での使用のための特定のサイトフェクチンの構造を 最適化するための別のスクリーニング検定を説明する。 実施例１１ 筋肉内検定 ２８Ｇ １／２針(Becton-Dickinson)、および黄色Eppendorfマイクロピペッ ト先端から切断したプラスチックカラーを備えた使い捨て滅菌プラスチック製イ ンシュリン注射器を用いて、５０μｌのＵＳＰ生理的食塩水中の５０μｇのルシ フェラーゼまたはＣＡＴ ＤＮＡ±サイトフェクチンを、拘束覚醒マウスの四頭 筋に注射した。カラー長を調整して、直径３ｍｍの大腿直筋の中心部に約２ｍｍ の深さまでに針孔貫通を制限した。注射液および注射器を室温に平衡させ、５０ μｌ容量の生理的食塩水−ＤＮＡの１回の注射に要する時間は数秒であった。四 頭筋群全体（重量１４０〜１８０ｍｇ）を注射後の種々の時間に各マウス足から 収集した。実施例３に記載したように、筋肉を凍結させ、溶解した。 自動マイクロプレート発光計（Dynatech Model ML2250）を用いて、ルシフェ ラーゼ活性を検定した。１００μｌのルシフェラーゼ基質を、発光計の注入系に より２０μｌ抽出物に加え、標本の光単位(light unit)を記録した。標本のル シフェラーゼ含量は、非注射筋肉抽出物の存在下で実施した精製ホタルルシフェ ラーゼの標準曲線を用いて相対光単位(light unit)から算出した。注射筋肉 抽出物中に存在するルシフェラーゼ活性は、非注射筋肉抽出物の場合より非常に 高かった。 この検定は、特定組織に用いるための特定のサイトフェクチンの構造を最適化 するための別のスクリーニング検定を説明する。 これ以上詳細に説明しなくても、前述の説明を用いて、当業者は本発明を十二 分に利用し得ると考えられる。本発明は、本質的な特徴を有するその精神を逸脱 しない限り、その他の特定の形態で具体化され得る。説明してきた実施態様は本 発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではなく、本発明の 範囲は添付の請求の範囲に示されている。請求の範囲の合法的等価物の意味およ び範囲内にある修正はすべて、本発明の範囲内に含まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月２３日（１９９８．１１．２３） 【補正内容】 ［第１３頁の翻訳文］ 表１に示された命名法のシステムは、本出願を通して一貫して用いられる。Ｂ Ｐという呼称は、ビスーピペラジン（bis-piperazine）骨格を示す。頭字語ＭＯ Ｅ、ＬＯＥおよびＤＯＥはそれぞれ、親油性部分、ミリスチルオキシエチル(Ｃ_{1 4} Ｈ₂₉Ｏ（ＣＨ₂）₂)、ラウリルオキシエチル（Ｃ₁₂Ｈ₂₅Ｏ（ＣＨ₂）₂）およびデ シルオキシエチルを示す。その他の頭字語は、少なくとも１つのヘテロ原子を有 する炭化水素鎖に関する。その例を下記に示す。 ＨＥ＝ヒドロキシエチル；ＧＡ＝ガンマアミノ；ＤＡ＝デルタアミノ：ＦＡ＝フ ァンフアミノ(ｆｕｎｆ ａｍｉｎｏ)； ＨＡ＝ヘキシルアミノ；Ｍｅ＝メチル ；Ｇｌｙ−Ｇ＝グリシンアミド；ＤＡＢ＝２，４−ジアミノ酪酸アミド；ＤｉＭ ｅ＝ジメチル；ＧＭＵ＝ガンマメチルウレア 表１ 一つの四級基を有する化合物 Ｃ−１４アルキル鎖Ｒ₁およびＲ₄＝Ｃ₁₄Ｈ₂₉ ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝Ｏ；Ｒ₃＝Ｈ ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＤＡＢ−Ｇ−ＭＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝（ＣＨ₂）₃；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝ＣＯＣＨ（ ＮＨ₂）ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂ Ｃ−１２アルキル鎖Ｒ₁およびＲ₄＝Ｃ₁₂Ｈ₂₅ Ｍｅ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₃；Ｘ₁＝存在せず；Ｒ₃＝存在せず ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝Ｏ；Ｒ₃＝Ｈ ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＤＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＦＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＨＡ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃ ＝Ｈ Ｇｌｙ−Ｇ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝ＣＯ− ＣＨ₂−ＮＨ₂ ＧＭＵ−ＬＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝ＣＯ− ＮＨ−ＣＨ₃ Ｃ−１０アルキル鎖Ｒ₁およびＲ₄＝Ｃ₁₀Ｈ₂₁ ＨＥ−ＤＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝Ｏ；Ｒ₃＝Ｈ ＧＡ−ＤＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ ＤＡ−ＤＯＥ−ＢＰ Ｒ₂＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂；Ｘ₁＝ＮＨ；Ｒ₃＝Ｈ 請求の範囲 １．次式の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチン。 ［式中、Ｒ₁およびＲ₄は独立で、直鎖のＣ₁₀〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁₀〜Ｃ₂₃ 基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁₀〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシル、ア ルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまた はヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不 飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはア リール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を 含有し、 Ｒ₂は、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖 のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアル キル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、 置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５ 個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはアリール基を含有し、前記 の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｒ₃は、Ｈ、上記で定義したＲ₂、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパ ク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシ ド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤または次式の構造を有する基で あり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換 されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか または環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は ０〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁はＯ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである］ ２．ｍおよびｐが２である請求項１記載のピペラジンベースのサイトフェクチ ン。 ３．Ｙ₁およびＹ₂がＯである請求項２記載のピペラジンベースのサイトフェク チン。 ４．Ｒ₁およびＲ₄が、Ｃ₁₀Ｈ₂₁、Ｃ₁₂Ｈ₂₅およびＣ₁₄Ｈ₂₉から成る群から選択 される請求項３記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ５．Ｒ₂は存在しないか、またはＣＨ₂、（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₃、（ＣＨ₂）₄ 、（ＣＨ₂）₅および（ＣＨ₂）₆から成る群から選択される請求項４のピペラジン ベースのサイトフェクチン。 ６．Ｘ₁はＮＨおよびＯから成る群から選択される請求項５記載のピペラジン ベースのサイトフェクチン。 ７．Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨ、ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₃およびＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ₂ から成る群から選択される請求項６のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ８．Ｘ₁がＯであり、Ｒ₃がＨである請求項６記載のピペラジンベースのサイト フェクチン。 ９．Ｒ₃がＨである請求項６記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １０．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₂であり、Ｘ₁がＯであり、Ｒ₃がＨである請求項６記載 のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １１．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １２．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₄であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １３．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₅であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １４．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₆であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １５．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ₂ である請求項６記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １６．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₃で ある請求項６記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １７．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＣＯ−ＣＨ（ＮＨ₂） ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂である請求項６記載のピペラジンベースのサイトフェクチ ン。 １８．次式の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチン。 ［式中、Ｒ₁およびＲ₄は独立で、直鎖のＣ₁₀〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁₀〜Ｃ₂₃ 基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁₀〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシル、ア ルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまた はヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不 飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはア リール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を 含有し、 Ｒ₂およびＲ₅は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基で あって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシル、アルケ ンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘ テロアルキル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不飽和 部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはアリー ル基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を含有 し、 Ｒ₃およびＲ₆は各々独立で、Ｈ、上記で定義したＲ₂、アミノ酸、ペプチド、 ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオ チド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤または次 式の構造を有する基であり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換 されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか または環状基もしくはアリール基を含有し、前記環状基もしくはアリール基は０ 〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あ り、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁およびＸ₂は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであり、 Ｘ₁もしくはＸ₂のいずれか一方が存在するか又はＸ₁およびＸ₂の両方が存在す る］ １９．Ｘ₁およびＸ₂の両方が存在する請求項１８記載のピペラジンベースのサ イトフェクチン。 ２０．両方ではなく、Ｘ₁もしくはＸ₂のいずれか一方が存在するある請求項１ ８記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２１．ｍおよびｐが２である請求項１８記載のピペラジンベースのサイトフェ クチン。 ２２．Ｙ₁およびＹ₂がＯである請求項２１記載のピペラジンベースのサイトフ ェクチン。 ２３．Ｒ₅およびＲ₂が存在しないか、ＣＨ₂、（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₃、（Ｃ Ｈ₂）₄、（ＣＨ₂）₅および（ＣＨ₂）₆から成る群から選択される請求項２２記載 のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２４．Ｒ₁およびＲ₄がＣ₁₀Ｈ₂₁、Ｃ₁₂Ｈ₂₅およびＣ₁₄Ｈ₂₉から成る群から選択 される請求項２３記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２５．Ｘ₁およびＸ₂が存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される 請求項２４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２６．Ｒ₁およびＲ₄がＣ₁₂Ｈ₂₅であり、Ｒ₂がＣＨ₂であり、Ｘ₁は存在せず、 Ｒ₃がＨであり、Ｒ₅がＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂であり、Ｘ₂がＮＨであり、そしてＲ₆が Ｈである請求項２５記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２７．細胞中へ分子を導入する方法であって、 （ａ）有効量の請求項１または請求項１８記載のいずれか１つの陽イオン性 脂質のいずれかと分子とを接触させて脂質との複合体を形成させる工程と、 （ｂ）工程（ａ）で形成された脂質複合体と細胞とを接触させて、それによ り生物学的有効量の分子を細胞中に挿入する工程と、 を含む導入する方法。 ２８．前記分子が陰イオン性分子である請求項２７記載の方法。 ２９．前記複合体が請求項１または請求項１８記載の前記陽イオン性脂質の他 にさらに１つまたはそれ以上の脂質を含む請求項２７記載の方法。 ３０．前記脂質が請求項１または請求項１８記載の前記陽イオン性脂質の他に 、中性脂質、リン脂質およびコレステロールから成る群から選択される請求項２ ９記載の方法。 ３１．前記細胞がインビトロ条件下で接触させられる請求項２７記載の方法。 ３２．前記細胞がインビボ条件下で接触させられる請求項２７記載の方法。 ３３．前記細胞がネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ 筋肉内、ブタ動脈内、ウサギ動脈内、ランス（Renca）腫瘍または皮下腫瘍の検 定から成る群から選択される検定にかけられる請求項３２記載の方法。 ３４．前記陰イオン性分子がｍＲＮＡである請求項２８記載の方法。 ３５．前記陰イオン性分子がＤＮＡである請求項２８記載の方法。 ３６．細胞中に分子を導入するのに用いる請求項１記載の化合物。 ３７．細胞中に分子を導入するのに用いる請求項１８記載の化合物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次式の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチン。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁ 〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシ ル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケ ンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６ 個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もし くはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ 原子を含有し、 Ｒ₃は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、アミノ酸、ペプチド、 ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオ チド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは 次式の構造を有する基であり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、 アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は置換されていないか又は置換されて おり、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかまたは 環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０〜５ 個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］ ２．ｍおよびｐが２である請求項１記載のピペラジンベースのサイトフェクチ ン。 ３．Ｙ₁およびＹ₂がＯである請求項２記載のピペラジンベースのサイトフェク チン。 ４．Ｒ₁およびＲ₄が、Ｃ₁₀Ｈ₂₁、Ｃ₁₂Ｈ₂₅およびＣ₁₄Ｈ₂₉から成る群から選択 される請求項３記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ５．Ｒ₂は存在しないか、またはＣＨ₂、（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₃、（ＣＨ₂）₄ 、（ＣＨ₂）₅、（ＣＨ₂）₆およびＣＯ−ＣＨ−ＮＨ₂から成る群から選択される 請求項４のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ６．Ｘ₁は存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される請求項５記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ７．Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨ、ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₃およびＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ₂ から成る群から選択される請求項６のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ８．Ｘ₁がＯであり、Ｒ₃がＨである請求項６記載のピペラジンベースのサイト フェクチン。 ９．Ｘ₁が存在せず、Ｒ₃がＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂である請求項６記載のピペラ ジンベースのサイトフェクチン。 １０．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₂であり、Ｘ₁がＯであり、Ｒ₃がＨである請求項６記載 のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １１．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １２．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₄であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １３．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₅であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １４．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₆であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＨである請求項６記 載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １５．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ₂ である請求項６記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １６．Ｒ₂が（ＣＨ₂）₃であり、Ｘ₁がＮＨであり、Ｒ₃がＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₃で ある請求項６記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １７．Ｒ₂がＣＯ−ＣＨ（ＮＨ₂）であり、Ｘ₁が存在せず、Ｒ₃がＣＨ₂−ＣＨ₂ −ＮＨ₂である請求項６記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 １８．次式の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチン。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₅は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝 鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル 、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、 アルケンまたはヘテロアルキル基は置換されていないか又は置換されており、０ 〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基 も しくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテ ロ原子を含有し、 Ｒ₃およびＲ₆は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、 アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレ オシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物 活性剤、薬剤もしくは次式の構造を有する基であり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換 されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか または環状基もしくはアリール基を含有し、前記環状基もしくはアリール基は０ 〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁およびＸ₂は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₃−Ｘ₁−Ｒ₃およびＲ₅−Ｘ₂−Ｒ₆は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する ］ １９．Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃およびＲ₅−Ｘ₂−Ｒ₆がともにヘテロ原子である請求項１ ８記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２０．Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃またはＲ₅−Ｘ₂−Ｒ₆が両方でなく、いずれかがヘテロ原 子である請求項１８記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２１．ｍおよびｐが２である請求項１８記載のピペラジンベースのサイトフェ クチン。 ２２．Ｙ₁およびＹ₂がＯである請求項２１記載のピペラジンベースのサイトフ ェクチン。 ２３．Ｒ₅およびＲ₂が存在しないか、ＣＨ₂、（ＣＨ₂）₂、（ＣＨ₂）₃、（Ｃ Ｈ₂）₄、（ＣＨ₂）₅および（ＣＨ₂）₆から成る群から選択される請求項２２記載 のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２４．Ｒ₁およびＲ₄がＣ₁₀Ｈ₂₁、Ｃ₁₂Ｈ₂₅およびＣ₁₄Ｈ₂₉から成る群から選択 される請求項２３記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２５．Ｘ₁およびＸ₂が存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される 請求項２４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２６．Ｒ₁およびＲ₄がＣ₁₂Ｈ₂₅であり、Ｒ₂がＣＨ₃であり、Ｘ₁およびＲ₃は存 在せず、Ｒ₅がＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂であり、Ｘ₂がＮＨであり、そしてＲ₆がＨである 請求項２５記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。 ２７．細胞中へ分子を導入する方法であって、 （ａ）有効量の請求項１または請求項１８記載のいずれか１つの陽イオン性 脂質のいずれかと分子とを接触させて脂質との複合体を形成させる工程と、 （ｂ）工程（ａ）で形成された脂質複合体と細胞とを接触させて、それによ り生物学的有効量の分子を細胞中に挿入する工程と、 を含む導入する方法。 ２８．前記分子が陰イオン性分子である請求項２７記載の方法。 ２９．前記複合体が請求項１または請求項１８記載の前記陽イオン性脂質の他 にさらに１つまたはそれ以上の脂質を含む請求項２７記載の方法。 ３０．前記脂質が請求項１または請求項１８記載の前記陽イオン性脂質の他に 、中性脂質、リン脂質およびコレステロールから成る群から選択される請求項２ ９記載の方法。 ３１．前記細胞がインビトロ条件下で接触させられる請求項２７記載の方法。 ３２．前記細胞がインビボ条件下で接触させられる請求項２７記載の方法。 ３３．前記細胞がネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ 筋肉内、ブタ動脈内、ウサギ動脈内、ランス（Renca）腫瘍または皮下腫瘍の検 定から成る群から選択される検定にかけられる請求項３２記載の方法。 ３４．前記陰イオン性分子がｍＲＮＡである請求項２８記載の方法。 ３５．前記陰イオン性分子がＤＮＡである請求項２８記載の方法。 ３６．細胞中に分子を導入するのに用いるための次式の化合物。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝鎖のＣ₁ 〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル、アシ ル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケ ンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６ 個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もし くはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ 原子を含有し、 Ｒ₃は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、アミノ酸、ペプチド、 ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオ チド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは 次式の構造を有する基であり、（式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖Ｃ₁〜Ｃ₂₃基 はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル 、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換さ れており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかま たは環状基もしくはアリール基を含有し、前記環状基もしくはアリール基は０〜 ５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］ ３７．細胞中に分子を導入するのに用いるための次式の化合物。 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₅は独立で、Ｈ、直鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基または分枝 鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基がアルキル 、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、 アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換されており、 ０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状 基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個の ヘ テロ原子を含有し、 Ｒ₃およびＲ₆は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ₁、 アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレ オシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物 活性剤、薬剤もしくは次式の構造を有する基であり、 （式中、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポ リヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ₁〜Ｃ_{2 3} 基または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₂₃ 基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキ ル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されていないか又は置換 されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか または環状基もしくはアリール基を含有し、前記環状基もしくはアリール基は０ 〜５個のヘテロ原子を含有し、 Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ₁で あり、 ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、 ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである） Ｙ₁およびＹ₂は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 Ｘ₁およびＸ₂は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、 ｍおよびｐは独立で１〜６であり、 Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、 Ｒ₂−Ｘ₁−Ｒ₃およびＲ₅−Ｘ₂−Ｒ₆は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する ］