DE19736592C2 - Tetraetherlipidderivat, ein oder mehrere Tetraetherlipidderivate enthaltendes Liposom oder Lipidagglomerat und pharmazeutische Zusammensetzung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Tetraetherlipidderivate, die erfindungsgemäßen Te­ traetherlipidderivate enthaltende Liposomen und Lipidagglomerate und pharmazeutische Zusammensetzung.

In der wissenschaftlichen Forschung besteht ein großer Bedarf an Verfahren zur Trans­ fektion von Zellen in Zellkultur und multizellulären Organismen mit Nukleinsäuren. Die herkömmlichen Verfahren wie Elektroporation, DEAE- und "Calciumphosphat"- unterstützte Transfektion, Mikroinjektion oder ballistische Methoden haben den Nachteil, daß sie oft nur geringe Transfektionseffizienzen erreichen, die Zellüberlebensraten sehr gering sind und/oder, daß sie nicht an Mehrzellern durchführbar sind. Virale und retrovi­ rale Transfektionssysteme sind zwar effizienter, bergen aber eigene Risiken, wie z. B. eine erhöhte Immunantwort oder eine unkontrollierte Integration in das Zielgenom. Die Transfektion von nicht-viralen Nukleinsäuren mit Hilfe von Liposomen, auch Lipofektion genannt, stellt daher eine erfolgreiche und bereits häufig angewandte Alternative zu den oben beschriebenen Verfahren dar.

Liposomen sind künstlich hergestellte uni- oder multilamellare Lipidvesikel, die einen wäßrigen Innenraum umschließen. Sie sind im allgemeinen biologischen Membranen ähnlich und werden daher nach Anlagerung an dieselben oftmals leicht in die Membran­ struktur integriert. Bei dieser Membranfusion wird, der Inhalt des Liposomeninnenraums in das von der biologischen Membran umschlossene Lumen entladen. Alternativ werden die Liposomen durch endocytotische Vorgänge in das Cytosol der zu transfizierenden Zeile gebracht; sie werden anschließend entweder im Cytosol zerstört oder treten als solche in Wechselwirkung mit der Kernmembran. Im letzteren Fall sind die im wäßrigen Innenraum des Liposoms enthaltenen Verbindungen weitgehend gegen proteolytische oder nukleolytische Angriffe geschützt.

Liposomen können daher als Transportvehikel für Stoffe, wie z. B. Nukleinsäuren und Pharmazeutika benutzt werden. So stellt z. B. die Kosmetikindustrie Liposomen-haltige Hautcremes her, die Wirkstoffe zielgerichtet in die Epidermis und tiefer gelegene Zell­ schichten transportieren. Zur Herstellung von Liposomen werden hauptsächlich natürliche Lecithine aus Sojabohnen oder Eigelb bzw. definierte natürliche oder künstliche Phospholipide, wie Cardiolipin, Sphingomyelin, Lysolecithin und andere verwendet. Durch Variation der polaren Kopfgruppen (Cholin, Ethanolamin, Serin, Glycerin, Inosit), der Länge und der Sättigungsgrade der Kohlenwasserstoffketten werden Größe, Stabi­ lität und Fähigkeit zur Aufnahme und Freisetzung der assoziierten Moleküle beeinflußt.

Einer der wesentlichen Nachteile der bis heute bekannten Liposomen ist ihre geringe Stabilität. Aus normalen Doppelschicht-bildenden Phopholipiden gebildete Liposomen sind auch im gekühlten Zustand nur kurze Zeit haltbar. Ihre Lagerstabilität läßt sich zwar z. B. durch Einbeziehen von Phosphatidsäure erhöhen, jedoch ist die somit verbesserte Stabilität für viele Zwecke immer noch unzureichend. Außerdem sind herkömmliche Li­ posomen nicht säurestabil und daher weder für den Transport pharmazeutischer Wirk­ stoffe geeignet, die nach oraler Verabreichung den Magen passieren, noch für die Lipo­ somen-unterstützte DNS-Transfektion unter leicht sauren pH-Bedingungen.

Für wissenschaftliche und medizinische Lipofektionen in Säugerzellen werden Liposo­ men-bildende Lipidmischungen, z. B. Lipofectamin®, Lipofectin® oder DOTAP®, häufig benutzt. Neben den bereits erwähnten Nachteilen ist mit ihrer Anwendung die Notwen­ digkeit verbunden, eine Vielzahl von Parametern (z. B. Zelldichte, Nukleinsäuremenge, Anteil der zugesetzten Lipide, Volumen des Liposomenansatzes etc.) genau zu bestim­ men, weil es nur ein sehr enges Parameteroptimum gibt, bei dem ausreichende Trans­ fektionseffizienzen erreicht werden können. Dadurch werden Transfektionen unter Ver­ wendung kommerzieller Lipofektionsreagenzien sehr aufwendig und kostenintensiv. Desweiteren sind bei den obengeannten Produkten große Variationen zwischen den einzelnen Chargen zu beobachten, was sie in der Praxis wenig verläßlich macht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Lipofektionsmittel mit größerer mecha­ nischer und chemischer Stabilität und damit verlängerter Lagerfähigkeit herzustellen, die eine einfache und verläßliche Anwendbarkeit ermöglichen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch das Bereitstellen von Tetraetherlipid­ derivaten (im folgenden auch als "TEL-Derivate" abgekürzt) mit der allgemeinen For­ mel (I):

wobei S¹ und S² gleich oder verschieden sein können und jeweils die folgende Bedeutung haben:

und
Y kann -NR²R³ oder -N^⊕R⁴R⁵R⁶ bedeuten;
X¹ und X² können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unabhän­ gig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die ein verzweig­ tes oder unverzweigtes Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 20 Koh­ lenstoffatomen umfaßt;
R¹ bis R⁶ können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unabhän­ gig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt: Wasserstoff, verzweigte oder unverzweigte Alkyl-, Alkenyl-, Aralkyl- oder Arylgruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei jeweils einer der Reste R² bis R⁶ weiter einen Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle oder einen Liganden für Zelloberflä­ chen-Rezeptoren umfassen kann; und
n kann eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 bedeuten,
sowie durch Bildung von Pentazyklen im Tetraethergrundgerüst gebildete Modi­ fikationen davon.

Das Lipidgerüst der erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate besteht aus einem 72- gliedrigen Makrotetraetherzyklus, dessen Grundgerüst ein Dibiphytanyl-diethyl-tetra­ etherheterozyklus ist. In diesem sind die ω-Kohlenstoffatome der Phytanylketten von je­ weils 2 Diethermolekülen kovalent miteinander verbunden. Tetraetherlipide sind bereits bekannt und bisher ausschließlich in Archaebakterien nachgewiesen worden. In Abhän­ gigkeit z. B. von der Züchtungstemperatur können sich innerhalb der Dibiphytanylketten Pentazyklen ausbilden, die dem Lipid einen spezifischen physiko-chemischen Charakter geben. Mit jeder Pentazyklisierung verliert das Grundgerüst zwei Wasserstoffatome. Ei­ ne Zusammenfassung aller bisher bekannten Basisstrukturen archaebakterieller Lipide ist in Langworthy und Pond (System Appl. Microbiol. 7, 253-257, 1986) enthalten.

Das natürlich vorkommende Lipidgerüst ist nunmehr erfindungsgemäß derivatisiert wor­ den, um für den Einbau in zur Transfektion vorgesehene Liposomen oder Lipidagglome­ rate geeignet zu sein. Dazu werden Seitenketten eingeführt, die entweder per se durch Ausbildung quaternärer Ammoniumsalze oder unter physiologischen Bedingungen, d. h. bei einem pH-Wert von 7,35 bis 7,45, positiv geladen sind. Solcherart derivatisierte Lipide sind besonders gut geeignet, mit negativ geladenen Molekülen, beispielsweise Nukleinsäu­ remolekülen, in Kontakt zu treten und sie z. B. in Liposomen einzuschließen. Da ein mög­ licher Verwendungszweck der erfindungsgemäßen Lipide in der Bildung von Liposomen oder Lipidagglomeraten für gentherapeutische Anwendungen liegt, können die erfin­ dungsgemäßen Lipide zusätzlich mit Molekülen gekoppelt werden, die das spezifische Andocken der Lipide an spezielle Zellen ermöglichen. Beispiele dafür sind Antikörper gegen Zelloberflächenantigene, insbesondere solche, die selektiv auf den Zielzellen ex­ primiert werden. Möglich sind weiter Liganden für Rezeptoren, die auf der Oberfläche bestimmter Zellen selektiv anzutreffen sind, sowie biologisch aktive Peptide, die ein Or­ gan- bzw. Zell-spezifisches Targeting in vivo ermöglichen (Ruoslati, Science 1997, 276(5317): 1345-6). Letztere wurden für die Zwecke dieser Anmeldung ebenfalls als Li­ ganden bezeichnet.

Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate liegt darin, daß ihr Lipidgerüst keine Doppelbindungen enthält und daher unempfindlich gegen Oxidation ist. Weiterhin enthält es statt der in Lipiden aus Eubakterien und Eukaryonten enthaltenen Lipidesterbindungen nur Lipidetherbindungen, die auch bei hohen Protonenkonzentra­ tionen, wie sie z. B. im Magen auftreten, nicht angegriffen werden.

In bevorzugten Ausführungsformen sind die Substituenten S¹ und S² an beiden Enden des Tetraetherlipidgrundgerüstes gleich. Dies ermöglicht, ausgehend von natürlichen Tetraetherlipiden, die Synthese ohne zwischenzeitliche Verwendung von Schutzgruppen. Die Identität der Substituenten S¹ und S² ist besonders bevorzugt in solchen Fällen, in denen keiner der Reste R¹ bis R⁶ einen Antikörper oder Liganden für einen Zelloberflä­ chenrezeptor darstellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivates stellt die Gruppe X¹ sowohl in S¹ als auch in S² ein Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen dar. In ganz besonders bevorzugten Ausfüh­ rungsformen handelt es sich bei X¹ um Propylen.

Die Gruppe X² ist ebenfalls bevorzugt ein Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Auch für X² sind Propylenreste besonders bevorzugt.

n kann 0 bis 10 bedeuten. In bevorzugten Ausführungsformen ist n 0 bis 3, ganz beson­ ders bevorzugt 0.

Die erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate werden bevorzugt aus natürlichen Te­ traetherlipiden hergestellt, die z. B. aus Archaebakterien isolierbar sind. Wie oben bereits erwähnt, treten in den aus natürlichen Quellen isolierten Tetraetherlipiden in einem ge­ wissen Umfang Pentazyklen innerhalb der Dibiphytanylketten auf. Das Ausmaß der Pentazyklisierung kann durch die Züchtungstemperatur beeinflußt werden. Normalerwei­ se finden sich 0 bis 8 Pentazyklen pro Tetraethergrundgerüst, wobei bei einer Züch­ tungstemperatur von 39° die meisten Lipidmoleküle zwischen 1 und 5 Pentazyklen auf­ weisen, während bei einer Züchtungstemperatur von 59° überwiegend 3 bis 6 Pentazy­ klen beobachtet werden. Die folgende Tabelle gibt Auskunft über die Verteilung der Pen­ tazyklisierung bei einer Züchtungstemperatur von 39°C bzw. 59°C:

TABELLE

In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivates bedeu­ tet Y sowohl in S¹ als auch in S² -NR²R³. Dabei sind R² und R³ bevorzugt Wasserstoff, verzweigte oder unverzweigte Alkyl-, Alkenyl-, Aralkyl- oder Arylgruppen besonders be­ vorzugt Wasserstoff-, Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet Y sowohl in S¹ als auch in S² ein quaternäres Ammoniumsalz, dessen Reste R⁴, R⁵ und R⁶ ebenfalls bevorzugt Wasserstoff-, verzweigte oder unver­ zweigte Alkyl-, Alkenyl-, Aralkyl- oder Arylgruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, be­ sonders bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyl sind. Jeweils einer der Reste R² bis R⁶ kann einen Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle oder einen Liganden für Zelloberflächen-Rezeptoren umfassen.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen hat das erfindungsgemäße Tetraetherli­ pidderivat die allgemeine Formel (I) mit den nachstehend angegebenen Substituenten S¹ und S²:
Verbindung A:
S¹ und S²: -CO-NH-(CH₂)₃-NH₂;
Verbindung B:
S¹ und S²: -CO-NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂;
Verbindung C:
S¹ und S²: -CO-NH-(CH₂)₃-N⊕(CH₃)₃

Die erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate können z. B. aus dem Gesamtlipidextrakt von Archaebakterien, z. B. dem Gesamtlipidextrakt des Archaebakteriums Thermoplas­ ma acidophilum gewonnen werden. Thermoplasmen wachsen zwischen pH 1 und 4 und bei Temperaturen von 33 bis 67°C. Thermoplasma acidophilum kann, wie in Beispiel 1 wiedergegeben, kultiviert werden. Üblicherweise wird eine bis zu einer OD₅₇₈ von ca. 0,6 gezüchtete Kultur des Mikroorganismus geerntet und die geernteten Mikroorganismen entweder direkt zur Lipidgewinnung eingesetzt oder gefriergetrocknet und gelagert. Für die Gewinnung der Tetraetherlipide aus dem Gesamtlipidextrakt von Thermoplasma aci­ dophilum wird dieser einer Säurehydrolyse unterzogen, um Tetraether zu produzieren (Beispiel 2 und Abb. 7). Oxidation der freien Hydroxylgruppen am Tetraether zu Dicar­ bonsäureverbindungen, Reaktion dieser Dicarbonsäureverbindungen mit SOCl₂ und Umsetzung der entstandenen Carbonsäurechloride mit Aminen resultiert in der Bildung verschiedener Tetraetherlipidderivate (Beispiel 3 und Abb. 7).

Die erfindungsgemäßen TEL-Derivate können zum Herstellen von Lipofektionsmitteln verwendet werden. Lipofektionsmittel sind z. B. Liposomen oder Lipidagglomerate. Verfahren zum Herstellen von Liposomen sind allgemein bekannt. Generell wird dabei das zur Präparation der Liposomen vorgesehene Lipid zunächst in einem organischen Lösungsmittel gelöst und durch Evaporation ein Lipidfilm gebildet. Der Lipidfilm wird gut getrocknet, um sämtliche Lösungsmittelreste zu entfernen. Anschließend werden die Lipide dieses Filmes in einem geeigneten Puffersystem resuspendiert. Für medizinisch- pharmazeutische Zwecke eignet sich z. B. physiologische Kochsalzlösung, pH 7,4, je­ doch sind andere Puffersysteme (z. B. Mcllvaine-Puffer), oder ungepufferte Lösungen, wie z. B. ungepufferte Kalium- oder Natriumchloridlösungen, ebenfalls verwendbar. Die Puffermenge sollte so berechnet sein, daß sie später eine Liposomendispersion mit ma­ ximal 15-20 mg Lipid/ml Puffer ergibt. Durch Schütteln mit der Hand können zunächst große multilamellare Vesikel mit einer Größenverteilung im µm-Bereich gebildet werden. Die Bildung dieser Vesikel kann durch Verwendung von zwei Glaskügelchen und/oder eines Ultraschallbades mit geringer Schallintensität erleichtert werden. Für die eigentli­ che Präparation von unilamellaren Liposomen definierter Größe wurden folgende Me­ thoden getestet und als für die Herstellung von Liposomen aus erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivaten geeignet befunden:

• a) Ultraschallbehandlung: Die Suspension multilamellarer Liposomen wird bei 20 kHz 5 Minuten beschallt (Branson Sonifer B 15). Es bilden sich Liposomen mit einem Durchmesser um 500 nm.
• b) Extrusion durch eine French Druckzelle: Die Suspension multilamellarer Liposomen wird bei 16000 p. s. i. viermal in der French Druckzelle extrudiert (SLM-Aminco Inc., Urbana IL, USA). Es bilden sich Liposomen mit einem Durchmesser um 120 nm.
• c) Extrusion durch Polycarbonatfilter: Die Suspension multilamellarer Liposomen wird durch Polycarbonatfilter definierter Porengröße extrudiert (LiposoFast^m, Avestin, Ottawa, Kanada). Bei Verwendung von Filtern mit einer Porengröße von 100 oder 200 nm entstehen Liposomen, die in der Größenverteilung geringfügig oberhalb der Porengröße liegen. Die Extrusion durch Filter dieser geringen Porengröße kann gleichzeitig als Sterilfiltration dienen, sofern alle sonstigen Voraussetzungen für eine Sterilfiltration (z. B. exakte Trennung der unsterilen und sterilen Seiten der Filtrationsapparatur) eingehalten werden. Um die eigentliche Filtration zu erleich­ tern, können einige Vorbereitungen getroffen werden:
  • a) Die Suspension multilamellarer Liposomen wird bei 20 kHz zwischen 1 und 5 Minuten beschallt (s. (a))
  • b) Die Suspension multilamellarer Liposomen wird 1-3 mal gefroren und wieder aufgetaut.
  • c) Die Suspension multilamellarer Liposomen nach (ca) oder (cb) wird durch ei­ nen Polycarbonatfilter von 600 bis 800 nm Porengröße vorfiltriert.

Im Anschluß an die Ultraschallbehandlung bzw. Extrusion können die Liposomen in einer Eppendorfzentrifuge 3200 10 Minuten zentrifugiert werden, um nichtliposomales Mate­ rial zu entfernen. Intakte, geschlossene Vesikel bleiben im Überstand.

Liposomen können weiter durch Detergenzsolubilisierung mit anschließender Deter­ genzdialyse hergestellt werden. Dazu wird zunächst wie oben beschrieben ein Lipidfilm gebildet. Dieser wird in einem detergenzhaltigen Puffersystem suspendiert (Beispiele dialysierbarer Detergenzien: Octyl-β-D-Glucopyranosid oder Octyl-β-D- Thioglucopyranosid). Das molare Verhältnis (TEL-Derivat: Detergenz) sollte bei den ge­ nannten Detergenzien zwischen 0,05 und 0,3 liegen und die Puffermenge so berechnet sein, daß sich später eine Liposomendispersion mit maximal 15-20 mg Lipid pro ml Puf­ fer ergibt. Durch Schütteln mit der Hand werden Mischmizellen aus Detergenz und TEL-Derivat gebildet.

Die Suspension der Mischmizellen wird nun in Dialyseschläuche, z. B. in eine Lipoprep®- Dialysezelle oder in eine Mini-Lipoprep® Dialysezelle (Diachema AG, Langnau, Schweiz) übertragen und bei RT 24 Stunden dialysiert. Bei Entzug des Detergenz durch die Dialy­ se bilden sich aus den Mischmizellen Liposomen von etwa 400 nm Durchmesser.

Die Liposomen-Präparation kann in einer Eppendorfzentrifuge 3200 10 Minuten zentri­ fugiert werden, um nichtliposomales Material zu entfernen. Intakte, geschlossene Vesikel bleiben im Überstand.

Die erfindungsgemäßen Lipidagglomerate bestehen aus einer oder mehreren Schichten der erfindungsgemäßen TEL-Derivate. Zwischen jeweils zwei solcher Schichten können sich negativ geladene Moleküle, z. B. Nukleinsäuremoleküle, einlagern.

Lipofektionsmittel, die zu 100% aus erfindungsgemäßen TEL-Derivaten bestehen, haben sich dabei als außergewöhnlich stabil, nahezu unbegrenzt lagerfähig und protonenun­ durchlässig erwiesen. Für viele Anwendungen, darunter die Formulierung von Pharma­ zeutika mit säurelabilen Wirkstoffen, und die Transfektion von Eukaryontenzellen stellen reine TEL-Derivat-Lipofektionsmittel daher das Mittel der Wahl dar.

Als vorteilhaft hat sich auch die Herstellung von Lipofektionsmitteln erwiesen, die neben einem Anteil von TEL-Derivat übliche Doppelschicht-bildende Phospholipide enthalten, wobei dieser Gewichtsprozentanteil auf das Gesamtlipid bezogen ist (Mischliposomen bzw. Mischlipidagglomerate). Die Herstellung von Mischlipofektionsmitteln erfolgt analog der Herstellung von reinen TEL-Derivat-Lipofektionsmitteln.

Bei diesen Doppelschicht-bildenden Phospholipiden kann es sich beispielsweise han­ deln um Sphingomyeline, Cephaline, Lecithine und Cardiolipin. Besonders bevorzugt ist der Zusatz von kationischen Lipiden wie DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammoniumchlorid) (Life Technologies, Gaithersberg, USA) oder DOTAP (N-[1- (2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) (Boehringer Mannheim, FRG) oder DOSPER (1,3-Di-oleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)-propylamid) (Boehringer Mann­ heim). Zur Unterstützung der Transfektionseffizienz können auch neutrale Lipide wie z. B. DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) (Sigma) in die Herstellung der TEL- Derivatliposome einbezogen werden (Beispiel 5). In einer weiteren bevorzugten Ausfüh­ rungsform werden Cholesterin und/oder seine Derivate in die Membran eingebaut. Dar­ über hinaus kann jedes weitere für die Bildung von Liposomen oder Lipidagglomeraten geeignete Lipid herangezogen werden. Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Mischlipofektionsmittel ist ihre durch den TEL-Derivatanteil verbesserte (erhöhte) Stabi­ lität, verglichen z. B. mit Liposomen ohne TEL-Derivatanteil.

In den erfindungsgemäßen Mischlipofektionsmitteln beträgt das Verhältnis von Tetrae­ therlipidderivat zu weiteren Lipiden bevorzugt 5 : 1 bis 1 : 5. In besonders bevorzugten Ausführungsformen beträgt das Verhältnis 1 : 2 bis 1 : 0,5, besonders bevorzugt 1.1. Alle Angaben beziehen sich auf Gewichtsverhältnisse.

Im folgenden beziehen sich die Ausdrücke "TEL-Derivatliposom", "Liposom aus reinem TEL-Derivat" etc. auf Liposomen, deren Lipidanteil zu 100% aus erfindungsgemäßen TEL-Derivaten, bevorzugt TEL aus Thermoplasma acidophilum besteht. Gleiches gilt für die Ausdrücke "Tetraetherlipidderivatagglomerat " und verwandte Ausdrücke.

"Mischliposomen" und "Misch-Lipidagglomerate" umfassen zusätzlich herkömmliche Phospholipide, und die Ausdrücke "Liposom" bzw. "Lipidagglomerat" umfassen sowohl Liposomen bzw. Lipidagglomerate aus reinen TEL-Derivaten als auch Mischliposomen bzw. Misch-Lipidagglomerate.

Die erfindungsgemäßen Liposomen einschließlich der Mischliposomen sowie die Li­ pidagglomerate einschließlich der Mischagglomerate können als Transportvehikel für Nukleinsäuren und/oder kosmetische, pharmazeutische Wirkstoffe dienen. Die erfin­ dungsgemäßen Liposomen und Lipidagglomerate ermöglichen darüber hinaus einen zielgerichteten Gentransfer. Dazu werden Nukleinsäuren, z. B. DNS- oder RNS- Sequenzen, die Gene oder Genfragmente enthalten und in linearer Form oder in Form von circulär geschlossenen Vektoren, die weiteres genetisches Material enthalten kön­ nen, vorliegen, in reine TEL-Liposomen oder Mischliposomen, reine Lipidagglomerate und Mischagglomerate verpackt und den zu transfizierenden Zellen in vitro oder in vivo zugesetzt. Wenn die Liposomenmembran bzw. Agglomeratoberfläche darüber hinaus Antikörper enthält, für die entsprechende Proteine oder Peptide auf den mit der Genthe­ rapie zu erreichenden Zellen vorhanden sind, so wird durch den Kontakt zwischen Anti­ gen auf der Zielzelle und Antikörper in der Membran des erfindungsgemäßen Liposomes bzw. Agglomeratoberfläche ein Kontakt zwischen Liposom- bzw. Agglomeratoberfläche und Zielzelle gefördert.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfin­ dungsgemäßen Liposomen oder Lipidagglomerate enthält.

Die erfindungsgemäßen Liposomen und/oder Lipidagglomerate werden bevorzugt bei solchen Wirkstoffen als Transportvehikel eingesetzt, bei denen eine orale Applikation nicht möglich ist, weil diese Wirkstoffe in der sauren Magenflüssigkeit inaktiviert oder durch Lipasen oder Peptidasen im Dünndarm abgebaut werden würden. Die erfindungs­ gemäßen Liposomen und Lipidagglomerate sind jedoch säurestabil und können deshalb ungehindert durch den Magen z. B. in den Dünndarm gelangen und eingeschlossene Wirkstoffe, die nach oraler Applikation normalerweise nicht in die Blutbahn gelangen können, dort zur Resorption bringen. Die Wirkstoffe können im wäßrigen Lumen des Liposoms enthalten sein, zwischen den Schichten der Lipidagglomerate vorliegen oder in diese integriert sein. Sofern es sich bei dem zu transportierenden Wirkstoff um Nu­ kleinsäuren handelt, ist dieser meistens geschützt im Liposom oder zwischen den Ag­ glomeratschichten. In einer weiteren Ausführungsform ist der Wirkstoff kovalent an das im Liposom enthaltene TEL gebunden. Bevorzugte Wirkstoffe sind z. B. Cytostatika, Im­ munsuppressiva, Immunstimulanzien oder Impfstoffe sowie Hormone. Die Lokalisierung des Wirkstoffes im Lumen oder in der Membran ist abhängig von seiner Wasser- bzw. Lipidlöslichkeit und wird vom Öl/Wasser-Verteilungskoeffizienten bestimmt. Viele Wirk­ stoffe haben eine intermediäre Verteilung, d. h. sowohl eine gewisse Wasser- als auch Lipidlöslichkeit, gemäß derer sie sich innerhalb eines Liposomes auf Lumen und Mem­ bran verteilen. Weitere Beispiele für im Lumen gelöste Wirkstoffe sind Impfstoffe, Hor­ mone und wasserlösliche Anteile bzw. Derivate von Daunorubicin und Doxorubicin bzw. von Methylprednisolon. Ein bevorzugtes Methylprednisolonderivat ist dabei das Natrium­ salz des Methylprednisolon-Hydrogensuccinats. Bevorzugte kovalent gebundene Wirk­ stoffe sind dagegen beispielsweise Antikörper, Hormone, Lectine und Interleukine oder aktive Fragmente dieser Stoffgruppen.

Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Liposomen bzw. Lipidagglome­ rate besonders gut mit Zellmembranen wechselwirken können. Nachgewiesen wurde z. B. die Aufnahme von mit dem lipophilen Fluoreszenz-Farbstoff Rhodamin gekoppelten Tetraetherlipidderivaten durch die Zellmembran von Baby Hamster Kidney (BHK)-Zellen (s. Abb. 1 und Beispiel 5.2).

Mit den erfindungsgemäßen Liposomen oder Lipidagglomeraten könnten daher auch Tumoren gezielt bekämpft werden, indem z. B. tumorspezifische Antikörper bzw. Antikör­ perfragmente in die Liposomenmembran eingebaut werden, die die mit Wirkstoffen ge­ füllten Liposomen der Lipidagglomerate zielgerichtet in Tumorzellen lotsen. Eine chemo­ therapeutische Behandlung mit zielgerichtet wirkenden Chemotherapeutika trägt dazu bei, unerwünschte Nebenwirkungen drastisch zu reduzieren.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform dienen die erfindungsgemäßen TEL-Derivate in reiner Form oder als Bestandteil von reinen oder gemischten Liposomen oder Lipidagglomeraten als Grundlage für die Herstellung medizinischer Salben oder Hautcremes.

Ein weiteres mögliches Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen TEL-Derivate, für Liposomen oder Lipidagglomerate aus reinen TEL-Derivaten aus Thermoplasma acido­ philum oder die diese TEL-Derivate enthaltenden Mischliposomen oder Misch- Lipidagglomerate ist die Verwendung dieser Substanzen in der medizinischen Diagno­ stik. Dabei können z. B. Mikrotiterplatten mit TEL-Derivaten, TEL-Derivatliposomen oder TEL-Derivatmischliposomen beschichtet werden, die durch Konjugation mit spezifischen Antikörpern oder Antigenen erhalten worden sind. Solcher Art beschichtete Träger kön­ nen z. B. für die immunometrische Bestimmung von Proteinen, Peptiden oder Stoffwech­ selprodukten eingesetzt werden.

Die folgenden Abbildungen und Beispiele erläutern die Erfindung.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt mikroskopische Aufnahmen von BHK-Zellen, die mit Rhodamin­ gekoppeltem Tetraetherlipidderivat B (10 µg/ml) 70 Min vorinkubiert worden sind.

Abb. 1A ist eine Phasenkontrastaufnahme,

Abb. 1B zeigt die Fluoreszenz, aufgenommen mit roten Emissions- und grünen Extinktionsfiltern.

Abb. 2 zeigt die Ethidiumbromidfluoreszenz von DNS-Tetraetherlipidderivat- Komplexen bei unterschiedlichen DNS: Lipidverhältnissen. Der der Ab­ bildung zugrunde liegende Versuch ist im Beispiel 4.2.2 beschrieben.

Abb. 3 zeigt ein mit Ethidiumbromid angefärbtes Agarosegel (1%), auf dem DNS/Tetraetherlipidderivat-Komplexe mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen von DNS zu Tetraetherlipid elektrophoretisiert worden sind. Bei der aufgetragenen DNS handelt es sich um pSV-lacZ, das verwendete TEL-Derivat war Verbindung B. Mit den Verbindungen A und C sind gleiche Ergebnisse erhalten worden.
Die Spuren zeigen im einzelnen:
Spur 1: Größenmarker (λHindIII: 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 5634 und 125 bp)
Spur 2: molares DNS-Lipidverhältnis von 1 : 0
Spur 3: molares DNS-Lipidverhältnis von 1 : 0,7
Spur 4: molares DNS-Lipidverhältnis von 1 : 1,4
Spur 5: molares DNS-Lipidverhältnis von 1 : 2,1
Spur 6: molares DNS-Lipidverhältnis von 1 : 2,8.

Abb. 4: zeigt die Effizienz der Transfektion von BHK-Zellen mit dem Tetraether­ lipidderivat B bei einer konstanten DNS-Konzentration von 1,4 µg/ml, in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration im Medium. Mit den Verbin­ dungen A und C sind gleiche Ergebnisse erhalten worden.

Abb. 5: zeigt den Zeitverlauf der Expression von β-Galactosidase nach Inkuba­ tion von BHK-Zellen mit Tetraetherlipidderivat-Komplexen, die das für β- Galactosidase kodierende Plasmid pSV-lacZ (Promega) enthielten. Es wurden 1,2 µg DNS und 5 µg Tetraetherlipidderivat B pro Transfekti­ onsansatz eingesetzt. Mit den Tetraetherlipidderivaten A und C sind gleiche Ergebnisse erhalten worden.

Abb. 6: zeigt die Transfektionseffizienz von reinen Tetraetherlipidderivat- Liposomen im Vergleich zu Mischliposomen mit DOPE (molares Ver­ hältnis 1 : 1), PC (molares Verhältnis 1 : 1) und MPL (molares Verhältnis Tetraetherlipidderivat B zu MPL wie 1 : 2) (MPL: "main phospholipid" aus Thermoplasma acidophilum, Gesamtphospholipidfraktion, s. PCT/EP97/01011). Die Ergebnisse mit den Derivaten A und B sind ver­ gleichbar.

Abb. 7: zeigt das Reaktionsschema zur Synthese verschiedener TEL- Derivate. Der Tetraethermakrozyklus ist dabei durch das jeder Formel zentrale Rechteck dargestellt. Im einzelnen zeigt:

Abb. 7a die Umsetzung eines natürlichen Tetraetherlipides, z. B. isoliert aus Thermo­ plasma acidophilum, mit 1 molar Salzsäure in Methanol zur Entfernung der Zuckerreste zur Dihydroxylverbindung (2). Verbindung (2) wird anschließend zur Dicarbonsäure (3) umgesetzt.

Abb. 7b zeigt die Umsetzung der Dicarbonsäure (3) zum entsprechenden Dicarbonsäu­ rechlorid (4). Das Dicarbonsäurechlorid dient als Edukt für die Umsetzung mit Aminen. Gemäß Reaktion 4a wird mit 1,3-Diaminopropan zum Tetraetherlipid­ derivat (A) umgesetzt. Gemäß Reaktion Nr. 4b erfolgt die Umsetzung des Di­ carbonsäurechlorides mit 3-Dimethylaminopropylamin zum Tetraetherlipidderi­ vat B.

Abb. 7c Das Tetraetherlipidderivat B reagiert mit Dimethylsulfat zum Tetraetherlipidderi­ vat C.

Beispiel 1 Kultivierung und Konservierung von Thermoplasma acidophilum 1.1 Medium

Das Kulturmedium für Thermoplasma acidophilum setzt sich aus Freundt'schem Medium (Christiansen et al., (1975)), einer 20%igen (w/v) Glucoselösung und einer 20%igen (w/v Hefeextraktlösung (Difco) zusammen. Das Freundt'sche Medium wird in situ bei 120°C sterilisiert, der 10 l-Fermenter 25 min und der 50 l-Fermenter 45 min. Die Gluco­ se- und Hefelösungen werden separat 10 min bei 110°C sterilisiert und erst unmittelbar vor der Inokulation dem Medium beigefügt.
1.1.1 Für die Inokulation mit Gefrierzellen werden 94 Vol.% Freundt'schem Medium 5 Vol.-% Glucoselösung und 1 Vol.-% Hefeextraktlösung zugefügt.
1.1.2 Für die Beimpfung mit einer Suspensionskultur werden 84 Vol.-% Freundt'sches Medium, 5% Glukoselösung und 1% Difcolösung wie oben vereint.

1.2 Inokulation

2.1 Im Fall der Kultur aus Gefrierzellen werden dem in 1.1 beschriebenen Medium 1 ml/l Gefrierzellen zugesetzt. Die lag-Phase beträgt 2 bis 3 Tage.
2.2 Für Kulturen mit Suspensionskultur-Inokulum werden dem in 1.2 beschriebenen Me­ dium 10 Vol.-% Suspensionskultur zugesetzt. Die lag-Phase beträgt in diesem Fall nur wenige Stunden.

1.3 Kultivierung von Thermoplasma acidophilum

Thermoplasma acidophilum wird bevorzugt in 10 l- oder 50 l-Fermentern gezüchtet. Alle Fermenterteile müssen aus Schwefelsäure-festern Material sein, z. B. Braun Biostat S (10 l, Glaskorpus), Braun Biostat 50 D (50 l, Edelstahlkorpus).

Ausgehend von Gefrierzellen, die wie unten beschrieben konserviert worden sind, kann ein 10 l-Fermenter ohne vorherige Flaschenzucht direkt angeimpft werden. Die Nor­ malbedingungen bei der Fermenterzucht sind 59°C und pH 2. Nach Erreichen einer opti­ schen Dichte von 0,4 (bei 578 nm) wird das erste Mal 1 Vol.-% Hefeextraktlösung nach­ geführt, ein weiteres Mal nach weiteren 8 Stunden. Die Zugabe von Hefeextrakt läßt den pH-Wert im Medium ansteigen und wird durch Zugabe entsprechender Mengen von 1 M Schwefelsäure kompensiert. Nach Erreichen einer optischen Dichte (578 nm) von 0,6 bis 0,7 werden 5 l der 10 l-Fermenterkultur als Inokulum für einen 50 l-Fermenter entnom­ men. Dieser wird wie üblich kultiviert, wobei nach 20 und 28 Stunden jeweils 1 Vol.-% Hefeextrakt zugeführt wird. Nach Erreichen der stationären Phase wird 1 Liter als Inoku­ lum für einen weiteren 10 l-Fermenter verwendet.

Thermoplasma acidophilum wächst obligat aerob, hohe Sauerstoffkonzentrationen sind für das Wachstum jedoch nicht vorteilhaft. Die Sauerstoffregulation wird auf 0,02 bis 0,03 vvm (Volumen Belüftung pro Volumen Medium pro Minute) im 10 l-Fermenter und auf 0,04 vvm im 50 l-Fermenter eingestellt. Während des Wachstums nimmt der Sauerstoff­ gehalt des Mediums konstant und rapide bis unter die Grenze der Meßbarkeit ab, muß aber nicht gegenreguliert werden. Der pH-Wert wird während der Kultivierung laufend gemes­ sen und bei pH-Veränderungen reguliert.

1.4 Zellernte

Das Wachstum von Thermoplasma acidophilum erreicht die stationäre Phase nach ca. 40 Stunden (OD₅₇₈ von ca. 0,6). Die Ernte sollte daher nach ca. 40 Stunden bei einer OD₅₇₈ von 0,6, maximal 0,7 erfolgen.

Die Zellkultur aus einem 10 l-Fermenter wird in einer Heraeus-Stockzentrifuge 15 Minu­ ten bei 3000 × g zentrifugiert, der Überstand wird verworfen, der Niederschlag wird in Freundt'scher Lösung resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten in einer Christ­ zentrifuge bei maximaler Umdrehungszahl (4500 Upm, entsprechend in etwa 3000 × g) zentrifugiert, der Vorgang noch mindestens zweimal wiederholt, wobei Freundt'sche Lö­ sung durch schwefelsaures Aqua bidest., pH 2, ersetzt wird, bis das Pellet weiß ist. Schließlich wird die weiße Zellnaßmasse in Aqua bidest. suspendiert, in Metha­ nol/Trockeneis eingefroren und bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet.

Die Zellkultur des 50 l-Fermenters wird mittels eines Pelicon-Tangentialfluß-Filtersystems zur Ernte auf ein Volumen von 2 l konzentriert. Dieses Konzentrat wird mit schwefelsau­ rem destilliertem Wasser, pH 2, gewaschen, bis das Filtrat klar und ungefärbt ist. Nun wird die konzentrierte Zellsuspension zentrifugiert (s. o.), das Pellet in Aqua bidest. re­ suspendiert, rezentrifugiert, resuspendiert, eingefroren und bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet.

1.5 Optische Kontrolle der Reinheit der Thermoplasma acidophilum-Kultur

Im Lichtmikroskop erscheint Thermoplasma acidophilum nach obiger Kultur mit einer Zelldichte von 10⁷ Zellen/ml in meist isodiametrischer Form mit einem Durchmesser zwischen 1 und 3 µm, einige Zellen haben pleiomorphes Aussehen. Nach Laserlicht- Streumessungen im Malvern particle sizer liegt das Maximum der Größenverteilung bei 2,3 µm. Gefrierbruch-elektronenmikroskopisch erscheinen die Zellen meist rund, pleio­ morphe Zellen weisen Längsachsen zwischen 1,1 und 2,7 µm und Querachsen um 0,6 µm auf. Die Zellen zeigen ein typisches Bruchverhalten, das sie von den meisten ande­ ren Zellen unterscheidet: sie brechen senkrecht (quer) zur Membranebene, entlang der Kohlenwasserstoffketten und nicht entlang der inneren Grenzfläche der Doppelschicht (tangential).

Bei den gegebenen Wachstumsbedingungen (59°C, pH 2) können nur wenige Organis­ men in die Kultur einwachsen, z. B. Bacillus acidocaldarius. Züchtung bei pH 1,5 verhin­ dert auch dies, ist allerdings mit einem Ausbeuteverlust hinsichtlich der gewünschten Lipidkomponente verbunden. Somit liegt das Züchtungsoptimum bei pH 2 unter Einhal­ tung möglichst steriler ("keimreduzierter") Bedingungen.

1.6 Konservierung

Die Konservierung von Thermoplasma acidophilum erfolgt bei -80°C oder in flüssigem N₂. Zur Konservierung wird eine aktive Kultur (8-10 l) durch Zugabe von Calciumcarbo­ nat auf pH 5,0-5,5 eingestellt. Nach Sedimentation von Calciumsulfat und überschüssi­ gem Calciumcarbonat (mindestens 30 min ruhig stehenlassen) wird der Überstand ab­ gehoben und unter sterilen Bedingungen 15 min bei 3000 × g zentrifugiert. Der Über­ stand wird verworfen, und die Thermoplasma acidophilum-Zellen des Pellets werden in frisch zubereiteten 10 mM Natriumcitratpuffer, pH 5,5, resuspendiert. Die Suspension wird auf Eis in Cryocups auf 0,5 bis 3,0 ml portioniert, die Cryocups werden eine Stunde in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend darin oder bei -80°C aufbewahrt.

Zur Kultivierung werden die Cryocups mit den Zellen im Wasserbad bei 37°C aufgetaut.

Es ist unbedingt notwendig, daß die Konservierungsschritte steril durchgeführt werden, da der pH-Wert von 1-2, der bei der Kultivierung das Einwachsen der meisten Mikroorganis­ men verhindert, nicht eingehalten wird.

Beispiel 2 Extraktion und Reinigung der Tetraetherlipide aus Thermoplasma acidophilum 2.1 Extraktion von Gesamtlipid

Die Extraktion von Gesamt-Lipid wird mit gefriergetrocknetem Material durchgeführt. Da­ zu werden 8 bis 10 g gefriergetrocknete Zellmasse mit 300 ml eines Petrolether(Fraktion 60 bis 80°C)/2-Propanol-Gemisches (77 : 23 v/v) in einer Soxhletapparatur (rekurrierendes, geschlossenes System) 40 Stunden unter Rückfluß kontinuierlich ex­ trahiert. Die beschriebene Extraktion ist nahezu quantitativ und führt zu ca. 1 g reiner Gesamtlipidfraktion.

750 mg der Gesamtlipidfraktion aus Thermoplasma acidophilum werden in 800 ml einer 1 M HCl-Lösung in Methanol 10 h unter Rückflußkühlung gekocht. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 100 ml CHCl₃ gelöst und mit H₂O gewaschen (5 × 100 ml). Die CHCl₃-Fraktion wird verdampft und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel (Kieselgel, Merck; Elutionsmittel CHCl₃) aufgetrennt. Die Fraktionen wer­ den gesammelt und auf TLC-Platten analysiert (Laufmittel: CHCl₃/Methanol 9 : 1), wobei bereits isolierte Tetraether als Standard dienen (Freisleben et al., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 745-52). Nach Verdampfen des Elutionsmittels beträgt die Ausbeute ca. 390 mg Tetraetherlipide.

Beispiel 3 Herstellung der Tetraetherlipidderivate A, B und C 3.1 Herstellen von Dicarbonsäureverbindungen

80 mg Tetraetherlipide werden unter Rühren in einer Lösung von 1 mg 4-Methoxy- TEMPO Radikal in 2 ml CH₂Cl₂ bei 4°C gelöst (J. Org. Chem., 1985, 50, S. 1332). 5 ml Natriumhypochlorid (0,35 M, pH 8,6) werden der Lösung zugesetzt und die Mischung für 5 Min bei 4°C kräftig gerührt. Nach Zugeben von 30 ml CHCl₃ wird die organische Phase 5 mal mit 30 ml 0,25 M HCl gewaschen. Die organische Phase wird verdampft und der Rückstand auf Silicagel chromatographisch aufgetrennt (Elutionsmittel: CHCl₃/Metha­ nol/Essigsäure 100 : 5 : 0,1). Die Fraktionen werden gesammelt und auf TLC-Platte analy­ siert (Laufmittel: CHCl₃/Methanol/Essigsäure 100 : 5 : 01). Nach Verdampfen des Eluti­ onsmittels werden ca. 47 mg Dicarbonsäure-Verbindung aus den entsprechenden Frak­ tionen gewonnen (ca. 50% Ausbeute).

3.2 Herstellen von Dicarbonsäurechlorid

45 mg der Dicarbonsäure-Verbindung werden in einer Lösung von Thionylchlorid (100 µl) in 5 ml trockenem CH₂Cl₂ gelöst und refluxiert. Nach ca. 6 Stunden ist das Lö­ sungsmittel verdampft. Das entstandene Dicarbonsäurechlorid kann ohne weitere Reini­ gungsschritte eingesetzt werden.

3.3. Herstellen von TEL-Derivaten 3.2.1 Tetraetherlipidderivat B

50 µl 3-Dimethylaminopropylamin werden einer Lösung von ca. 45 mg Dicarbonsäu­ rechlorid in 5 ml trockenem CH₂Cl₂ zugesetzt. Nach 5 Min wird die Mischung fünfmal mit 30 ml Wasser gewaschen, das Lösungsmittel evaporiert und der Rückstand chromato­ graphisch auf Kieselgel aufgetrennt (Elutionsmittel: CHCl₃/Methanol/Essigsäure, 80 : 20 : 0,5). Die Fraktionen werden gesammelt und auf TLC-Platten mit dem gleichen Laufmittel wie oben genannt analysiert. Aus den Fraktionen, in denen das Tetraetherli­ pidderivat A festgestellt wird, wird das Lösungsmittel verdampft. Das Verfahren führt zu ca. 35 mg Derivat B.

3.2.2 Tetraetherlipidderivat A

Derivat A wird durch ein ähnliches Verfahren gewonnen, bei dem anstelle von 100 µl 3- Dimethylaminopropylamin 100 µl 1,3-Diaminpropan eingesetzt werden.

3.2.3 Tetraetherlipidderivat C

Derivat C wird gewonnen, indem Derivat B in einer Lösung aus 10 µl Dimethylsulfat in CH₂Cl₂ (5 ml) gelöst wird. Nach 20 h wird das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in 10 ml CHCl₃ gelöst und dreimal in je 20 ml 0,1 M HCl gewaschen. Nach Evaporieren der organischen Lösung werden ca. 10 mg Derivat C gewonnen (Ausbeute ca. 95%).

3.4 Herstellen eines Fluoreszenz-markierten Tetraetherlipidderivates

Zur Klärung der Frage, ob die erfindungsgemäßen positiv geladenen Tetraetherlipidderi­ vate in Zellen eindringen können, ist ein neues fluoreszierendes Tetraetherlipidderivat synthetisiert worden.

Fluoreszenz-markiertes Tetraetherlipidderivat wird gewonnen, indem 2 mg Rhodamin­ isothiocyanat und 5 µl Triethylamin einer Lösung von 2 mg Derivat A in 2 ml trockenem CH₂Cl₂ zugesetzt werden. Nach 15 h wird die Lösung fünfmal mit 30 ml Wasser gewa­ schen, das Lösungsmittel evaporiert und der Rückstand chromatographisch auf Kiesel­ gel aufgetrennt (Elutionsmittel: CHCl₃/Methanol/Essigsäure, 80 : 20 : 0,5). Die Fraktionen werden gesammelt und Proben davon auf TLC-Platten analysiert. Die Fraktionen, die das fluoreszierende Lipid enthalten, werden vereint und das Lösungsmittel verdampft. Das Verfahren führt zu ungefähr 2 mg Tetraetherlipid-Rhodamin.

Beispiel 4 Herstellung von Lipofektionsmittel 4.1 Leeres Lipofektionsmittel

Für die Herstellung von Lipofektionsmittel werden die Tetraetherlipidderivate A, B oder C verwendet. Zur Bildung von Lipofektionsmittel wird das Tetraetherlipidderivat jeweils in Chloroform/Methanol (1/1, v/v) gelöst (2 mg/ml). Durch Verdampfen des Lösungsmittels entsteht ein Lipidfilm. Der Lipidfilm wird in Puffer A (150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7,4) bei Raumtemperatur für 48 h hydratisiert (Endkonzentration 0,5-2 mg Lipid/500 µl Puffer A), anschließend in einem Ultraschallbad (Branson 1210) 15 Min beschallt und schließlich 10 Min bei Raumtemperatur mit einer Ultraschallspitze (Branson 815, "cycle mode", Position 40) beschallt. Die Lipidlösung in Puffer A erscheint trüb ohne Aggregate oder erkennbare Präzipitate.

4.2 DNS-Lipofektionsmittelkomplexe 4.2.1 Verfahren

Zum Herstellen von DNS-Lipofektionsmittelkomplexen werden 3-5 µl in Puffer A supen­ dierte Lipide (1 mg/ml) in 100 µl serumfreiem Medium gelöst. 1-2 µg DNS (1 mg/ml) wer­ den in 100 µl serumfreiem Medium verdünnt. Die beiden Lösungen werden vorsichtig gemischt und 15 Min bei Raumtemperatur inkubiert, um DNS-Lipidkomplexe zu bilden. Typischerweise treten keine Aggregate bei der Komplexbildung auf. Vor jeder Transfek­ tion werden 800 µl serumfreies Medium zugesetzt, so daß ein Endvolumen von 1 ml er­ reicht wird.

4.2.2 Nachweis der Bildung der DNS-Lipofektionsmittelkomplexe

Die Bildung der DNS-Lipofektionsmittelkomplexe wurde fluorometrisch untersucht. Es ist bekannt, daß die Bildung von Komplexen aus DNS und kationischen Lipiden die Bin­ dung von Ethidiumbromid an DNS verhindert (Gershon et al., Biochemistry 32, 7143-7151, 1993). Da die Fluoreszenz von Ethidiumbromid-DNS-Komplexen der Menge freier DNS in Lösung proportional ist, kann dieses Verfahren verwendet werden, um DNS- Lipidkomplexe zu quantifizieren. Dazu wurden DNS-Lipidkomplexe aus Tetraetherlipid­ derivat B und pSV-lacZ mit unterschiedlichen Tetraetherlipidderivat : DNS-Verhältnissen in 1 ml 150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7,4, vorgebildet. Anschließend wurde Ethidium­ bromid bis zu einer Endkonzentration von 10^-7 M zugefügt. Die Fluoreszenz von Ethidi­ umbromid-DNS-Komplexen wurde durch Anregen bei 518 nm und Messen der Emission bei 605 nm verfolgt. Die Ergebnisse sind in Abb. 2 gezeigt und weisen daraufhin, daß die Bildung von DNS-Tetraetherlipidderivat-Komplexen bei einem molaren Verhält­ nis von 1 : 1 auftritt.

Die Bildung der Komplexe wurde außerdem unter Verwendung von 1%-igen Agarose­ gelen gezeigt. In diesem unabhängigen Test wird die Bildung von DNS- Tetraetherlipidderivat-Komplexen durch das Verschwinden freier DNS sichtbar gemacht (Abb. 3, Spur 4).

Diese Ergebnisse, die mit zwei voneinander unabhängigen Versuchen erhalten worden sind, weisen darauf hin, daß die Bildung von Tetraetherlipidderivat-DNS-Komplexen bei einem molaren Verhältnis von 1 : 1 auftritt.

Beispiel 5 Transfektion mit Tetraetherlipidderivat-enthaltendem Lipofektionsmittel 5.1 Transfektion mit pSV-lacZ

Transfektionen werden mit einem pSV-lacZ-Plasmid (Promega) als Reportergenkon­ strukt durchgeführt. 1 × 10⁵ BHK (Baby Hamster Kidney)-Zellen werden auf Platten mit 6 Vertiefungen plattiert. Nach 24 h Inkubation bei 37°C in CO₂-begaster Atmosphäre errei­ chen die Zellen eine Dichte von 25-50% und können für die Transfektion eingesetzt wer­ den. Direkt vor der Transfektion werden die Zellen mit 2 ml serumfreiem Medium gewa­ schen. 1 ml der den DNS-Lipidkomplex enthaltenden Lösung (s. Beispiel 4.2) wird zuge­ setzt. Nach 5 h wird das die DNS enthaltende Medium durch normales Wachstumsme­ dium, das 10% Serum enthält, ersetzt. Kürzere Inkubationszeiten (2-4 h) führen eben­ falls zu erfolgreichen Transfektionen.

19 h nach der Transfektion werden die Zellen einmal in PBS gewaschen, mit eiskaltem Methanol (-20°C) fixiert, dreimal mit PBS gewaschen und für 16 h in einer Lösung aus 4 mM Ferrycyanid (Hexacyanoferrat (III); Sigma), 1 mM MgCl₂, 0,1% X-gal (Roth) in PBS, pH 7,4 inkubiert, um die Expression von β-Galactosidase nachzuweisen.

Die Transformationseffizienz der Tetraetherlipidderivate A, B und C wurde mit den kom­ merziell erhältlichen Transfektionsmitteln Lipofectin® und Lipofectamin® (Gibco/BRL) verglichen. Die Transfektionseffizienz wurde dabei als Prozentsatz blauer Zellen, bezo­ gen auf die Gesamtzellzahl, angegeben. Der Vergleich zeigte, daß die Transformationseffizienz für alle erfindungsgemäßen Verbindungen in der gleichen Größenordnung wie für die kommerziellen Agenzien lag.

Unter Verwendung des Plasmides pSV-lacZ wurde ferner das optimale Verhältnis von DNS zu Lipid bestimmt. Dabei wurden die besten Transfektionsergebnisse mit einem molaren Verhältnis von 1 : 1 DNS/Lipid erhalten (Abb. 4). Das Maximum der β- Galactosidase-Expression wurde 19 h nach dem Beginn der gemeinsamen Inkubation der Zellen mit den DNS-Lipidkomplex beobachtet. Wie in Abb. 5 gezeigt wird, be­ trug unter diesen Bedingungen die Transfektionseffizienz 12%, bezogen auf die Ge­ samtzahl der eingesetzten Zellen.

5.2 Transfektion mit fluoreszierenden Tetraetherlipidderivaten

Eine Fluoreszenz-markierte Lipofektionsmittelsuspension wird hergestellt durch Be­ schallen von 1 mg einer Mischung aus Tetraetherlipidderivat A, B oder C und Tetraether­ lipid-Rhodamin (s. Beispiel 3.3) (100 : 1 molares Verhältnis) in 1 ml eines Puffers aus 150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7,4. Die Lipidkonzentrationen von Rhodamin-markierten Liposomen oder DNS-Lipidkomplexen reicht von 10-100 µg/ml. Die Zellen werden 70 Min bei 38°C mit dem Rhodamin-markierten Lipofektionsmittel inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und anschließend in einem "reverse fluorescent microscope" analysiert.

Die Analyse zeigte eine diffuse Fluoreszenz, die im Zytoplasma der Zellen zu beobach­ ten war (Abb. 1). Dieses Ergebnis erlaubt die Schlußfolgerung, daß die erfindungs­ gemäßen Tetraetherlipidderivate die Zellmembran durchqueren.

6. Transfektionseffizienz von Mischlipofektionsmittel

In der Literatur ist gezeigt worden (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 7413-7417, 1987), daß durch Mischen von Lipofectin® mit DOPE (Sigma) (1 : 1, w/w) erhöhte Trans­ fektionsraten erzielt werden können. Deshalb wurde der Einfluß des Zusatzes verschie­ dener Lipide zu den erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivaten auf die Effizienz der Zelltransfektion untersucht.

Im einzelnen wurde zugesetzt: MPL (Gesamtphospholipidfraktion aus Thermoplasma acidophilum), PC (Phosphatidylcholin) und DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin). Da­ bei wurde beobachtet, daß das Mischen der erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate A, B bzw. C mit MPL in einem Verhältnis von 1 : 1 (w/w) die Transfektionseffizienz nicht beeinträchtigt, während die Mischung der erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate mit MPL bei einem Mischungsverhältnis von 1 : 2 (molares Verhältnis Tetraetherlipidderi­ vat/MPL) die Transfektionseffizienz stark beeinträchtigt. Eine Mischung aus erfindungs­ gemäßen Tetraetherlipidderivaten mit DOPE (molares Verhältnis von 1 : 1) erhöht die Transfektionseffizienz, während eine Mischung von Tetraetherlipidderivat mit PG (molares Verhältnis von 1 : 1) sie erniedrigt.

Aus diesen Versuchen geht hervor, daß DOPE ein vielversprechender Zusatz zum Tetraetherlipidderivat A ist. Die Ergebnisse sind in Abb. 6 graphisch dargestellt.

Claims (22)

1. Tetraetherlipidderivat der allgemeinen Formel I:
wobei S¹ und S² gleich oder verschieden sein können und jeweils die folgen­ de Bedeutung haben:
Y kann -NR²R³ oder -N^⊕R⁴R⁵R⁶ bedeuten;
X¹ und X² können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unab­ hängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen umfaßt;
R¹ bis R⁶ können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unab­ hängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die um­ faßt: Wasserstoff, verzweigte oder unverzweigte Alkyl-, Al­ kenyl-, Aralkyl- oder Arylgruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffa­ tomen, wobei jeweils einer der Reste R² bis R⁶ weiter einen Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle oder einen Li­ ganden für Zelloberflächen-Rezeptoren umfassen kann; und
n kann eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 bedeuten,
sowie durch Bildung von Pentazyklen im Tetraethergrundgerüst gebildete Modifikationen davon.

2. Tetraetherlipidderivat nach Anspruch 1, wobei S¹ und S² gleich sind.

3. Tetraetherlipidderivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei X¹ ein Alkylen oder Al­ kenylen mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

4. Tetraetherlipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X² ein Alky­ len oder Alkenylen mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

5. Tetraetherlipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei n 0 bis 3, bevorzugt 0 ist.

6. Tetraetherlipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Y jeweils -NR²R³ ist und wobei R² und R³ aus der Gruppe ausgewählt sind, die umfaßt:
-H, -CH₃, -C₂H₅ und -C₃H₇.

7. Tetraetherlipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Y jeweils -N^⊕R⁴R⁵R⁶ ist und wobei R⁴, R⁵ und R⁶ gleich oder verschieden sein können und aus der Gruppe ausgewählt sind, die umfaßt:
-H, -CH₃, -C₂H₅ und -C₃H₇.

8. Tetraetherlipidderivat nach Anspruch 1 mit der Formel A:
wobei S¹ = S² ist und bedeutet

9. Tetraetherlipidderivat nach Anspruch 1 mit der Formel B:
wobei S¹ = S² ist und bedeutet

10. Tetraetherlipidderivat nach Anspruch 1 mit der Formel C:
wobei S¹ = S² ist und bedeutet

11. Liposom, enthaltend ein oder mehrere Tetraetherlipidderivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

12. Liposom nach Anspruch 11, enthaltend weitere Doppelschicht-bildende ka­ tionische oder neutrale Lipide.

13. Liposom nach Anspruch 12, enthaltend das kationische Lipid DOTMA (N-[1-(2,3- Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) und/oder DOTAP (N-[1-(2,3- Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid)und/oder DOSPER (1,3-Di­ oleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)-propylamid) (Boehringer Mannheim).

14. Liposom nach einem der Ansprüche 11 bis 13, enthaltend das neutrale Lipid DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) und/oder Cholesterin.

15. Lipidagglomerat, enthaltend ein oder mehrere Schichten einer oder mehrerer Tetraetherlipidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

16. Lipidagglomerat nach Anspruch 15, enthaltend weitere Doppelschicht­ bildende kationische oder neutrale Lipide.

17. Lipidagglomerat nach Anspruch 16, enthaltend das kationische Lipid DOTMA und/oder DOTAP und/oder DOSPER.

18. Lipidagglomerat nach Anspruch 16, enthaltend das neutrale Lipid DOPE und/oder Cholesterin.

19. Liposom nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder Lipidagglomerat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das Gew.-Verhältnis von Tetraetherli­ pidderivat zu weiteren Lipiden 5 : 1 bis 1 : 5 beträgt.

20. Liposom oder Lipidagglomerat nach Anspruch 19, wobei das Gew.-Verhältnis von Tetraetherlipidderivat zu weiterem Lipid zwischen 1 : 2 und 1 : 0,5, bevor­ zugt 1 : 1 beträgt.

21. Liposom nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder Lipidagglomerat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, enthaltend weiterhin Nukleinsäuremoleküle.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Liposomen nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder Lipidagglomerate nach einem der Ansprüche 15 bis 18, und physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel.