EP1005466A1 - Tetraetherlipidderivate und tetraetherlipidderivate enthaltende liposomen und lipidagglomerate sowie deren verwendung - Google Patents

Tetraetherlipidderivate und tetraetherlipidderivate enthaltende liposomen und lipidagglomerate sowie deren verwendung

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Publication number
EP1005466A1
EP1005466A1 EP98946380A EP98946380A EP1005466A1 EP 1005466 A1 EP1005466 A1 EP 1005466A1 EP 98946380 A EP98946380 A EP 98946380A EP 98946380 A EP98946380 A EP 98946380A EP 1005466 A1 EP1005466 A1 EP 1005466A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lipid
derivative
tetraetheriipid
liposomes
tetraether
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98946380A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
H.-J. Freisleben
Emmanouil Antonopoulos
Maxim Balakirev
Larissa Balakirev
Klaus Hartmann
Felix Gropp
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bernina Biosystems GmbH
Original Assignee
Syrinx Diagnostika GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Syrinx Diagnostika GmbH filed Critical Syrinx Diagnostika GmbH
Publication of EP1005466A1 publication Critical patent/EP1005466A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D323/00—Heterocyclic compounds containing more than two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to tetraether lipid derivatives, the liposomes and lipid agglomerates containing the tetraether lipid derivatives according to the invention and their use.
  • Liposomes are artificially produced uni- or multilamellar lipid vesicles that enclose an aqueous interior. They are generally similar to biological membranes and are therefore often easily integrated into the membrane structure after being attached to them. With this membrane fusion, the contents of the liposome interior are discharged into the lumen enclosed by the biological membrane. Alternatively, the liposomes are brought into the cytosol of the cell to be transfected by endocytotic processes; they are then either destroyed in the cytosol or, as such, interact with the core membrane. In the latter case, the compounds contained in the aqueous interior of the liposome are largely protected against proteolytic or nucleolytic attacks.
  • Liposomes can therefore be used as transport vehicles for substances such as nucleic acids and pharmaceuticals.
  • the cosmetics industry produces liposome-containing skin creams that target active ingredients into the epidermis and deeper cell layers.
  • liposomes mainly natural Before soybean or egg yolk lecithins or defined natural or artificial phospholipids such as cardiolipin, sphingomyelin, lysolecithin and others are used.
  • polar head groups choline, ethanolamine, serine, glycerol, inositol
  • the length and the degree of saturation of the hydrocarbon chains, size, stability and ability to take up and release the associated molecules are influenced.
  • Liposomes formed from normal double-layer forming phopholipids can only be kept for a short time even in the cooled state.
  • Their storage stability can be e.g. by including phosphatidic acid, but the stability thus improved is still insufficient for many purposes.
  • conventional liposomes are not acid-stable and are therefore unsuitable for the transport of active pharmaceutical ingredients that pass through the stomach after oral administration, nor for liposome-assisted DNA transfection under slightly acidic pH conditions.
  • liposome-forming lipid mixtures e.g. Lipofectamin®, Lipofectin® or DOTAP®
  • their use also means the need to precisely determine a large number of parameters (e.g. cell density, nucleic acid amount, proportion of lipids added, volume of liposome preparation, etc.) because there is only a very narrow parameter optimum with sufficient Trans Stammio ⁇ seffizienzen can be achieved.
  • This makes transfections using commercial lipofection reagents very complex and cost-intensive.
  • large variations between the individual batches can be observed with the above-mentioned products, which makes them less reliable in practice.
  • TEL derivatives tetraether lipid derivatives
  • S 1 and S 2 may be the same or different and each has the following meaning:
  • Y can mean -NR ⁇ R J or -N ⁇ R 4 0 T5rR-> 6 ";
  • X 1 and X 2 may be the same or different and are each independently selected from the group comprising a branched or unbranched alkylene or alkenylene having 2 to 20 carbon atoms;
  • R 1 to R ⁇ may be the same or different and are each independently selected from the group consisting of: hydrogen, branched or unbranched alkyl, alkenyl, aralkyl or aryl groups having 1 to 12 carbon atoms, where in each case one of the radicals R 2 to R 6 can further comprise an antibody against cell surface molecules or a ligand for cell surface receptors; and
  • ⁇ can be an integer between 0 and 10,
  • the lipid structure of the tetraether lipid derivatives according to the invention consists of a 72-membered macrotetraether cycle, the basic structure of which is a dibiphytanyl-diethyl-tetraether heterocycle.
  • the ra carbon atoms of the phytanyl chain of 2 diether molecules are covalently linked to one another.
  • Tetraether lipids are already known and have so far only been found in archaebacteria.
  • pentacycles can form within the dibiphytanyl chains, which give the lipid a specific physico-chemical character. With every pentacyclization, the basic structure loses two hydrogen atoms.
  • a summary of all previously known basic structures of archaebacterial lipids is contained in Langworthy and Pond (System Appl. Microbiol. 7, 253-257, 1986).
  • lipid structure has now been derivatized according to the invention in order to be suitable for incorporation into liposomes or lipid agglomerates intended for transfection.
  • side chains are introduced which are positively charged either per se through the formation of quaternary ammonium salts or under physiological conditions, ie at a pH of 7.35 to 7.45.
  • Lipids derivatized in this way are particularly suitable for contacting negatively charged molecules, for example nucleic acid molecules, and for example enclosing them in liposomes.
  • the lipids according to the invention can additionally be coupled with molecules which enable the lipids to be specifically docked onto special cells. Examples are antibodies against cell surface antigens, especially those that are selectively expressed on the target cells. Also possible are ligands for receptors that can be found selectively on the surface of certain cells, and biologically active peptides that enable organ or cell-specific targeting in vivo (Ruoslati, Science, 1997). The latter were also referred to as ligands for the purposes of this application.
  • tetraether lipid derivatives according to the invention contains no double bonds and is therefore insensitive to oxidation. Furthermore, instead of the lipid ester bonds contained in lipids from eubacteria and eukaryotes, it only contains lipid ether bonds which are also present at high proton concentrations, as e.g. occur in the stomach, not be attacked.
  • the substituents ⁇ S 1 and S 2 are the same at both ends of the tetraether lipid backbone. Based on natural tetraetheriipids, this enables synthesis without the interim use of protective groups.
  • the identity of the substituents S 1 and S 2 is particularly preferred in those cases in which none of the radicals R 1 to R 6 is an antibody or ligand for a cell surface receptor.
  • the group X 1 in both S 1 and S 2 is an alkylene or alkylene having 2 to 10, preferably 3 to 6, carbon atoms. In very particularly preferred embodiments, X 1 is Propylene.
  • the group X 2 is also preferably an alkylene or alkenylene with 2 to 10, preferably with 3 to 6, carbon atoms. Propylene radicals are also particularly preferred for X 2 .
  • n can mean 0 to 10. In preferred embodiments, n is 0 to 3, very particularly preferably 0.
  • the tetraether lipid derivatives according to the invention are preferably produced from natural tetraether lipids which can be isolated, for example, from archaebacteria.
  • pentacycles within the dibiphytanyl chains occur to a certain extent in the tetraetheriipids isolated from natural sources.
  • the extent of Pentacyclization can be influenced by the growth temperature. There are normally 0 to 8 pentacycles per tetraether backbone, with most lipid molecules having between 1 and 5 pentacycles at a cultivation temperature of 39 °, while predominantly 3 to 6 pentacycles are observed at a cultivation temperature of 59 °.
  • the following table provides information on the distribution of the pentacyclization at a cultivation temperature of 39 ° C or 59 ° C:
  • Y means both in S 1 and in S 2 -NR 2 R 3 .
  • R 2 and R 3 are preferably hydrogen, branched or unbranched alkyl, alkenyl, araikyl or aryl groups, particularly preferably hydrogen, methyl, ethyl or propyl groups.
  • Y in both S and S 2 is a quaternary ammonium salt, the radicals R 4 , R 5 and R 6 of which are preferably also hydrogen, branched or unbranched alkyl, alkenyl, araikyl or aryl groups with 1 to 12 carbon atoms, particularly preferably hydrogen, methyl, ethyl or propylene.
  • one of the radicals R 2 to R 6 can comprise an antibody against cell surface molecules or a ligand for cell surface receptors.
  • the tetraether lipid derivative according to the invention has the general formula (I) with the substituents S 1 and S 2 given below: Connection A:
  • the tetraether lipid derivatives according to the invention can be obtained, for example, from the total lipid extract of archaebacteria, for example the total lipid extract of the archaebacterium Thermoplasmic acidophilum.
  • Thermoplasmas grow between pH 1 and 4 and at temperatures from 33 to 67 ° C.
  • Thermoplasma acidophilum can, as shown in Example 1, be cultivated.
  • a culture of the microorganism grown up to an OD 57 a of about 0.6 is harvested and the harvested microorganisms are either used directly for lipid production or freeze-dried and stored.
  • tetraether lipids from the total lipid extract of Thermoplasma acidophilum, the latter is subjected to acid hydrolysis in order to produce tetraethers (Example 2 and Fig. 7).
  • the TEL derivatives according to the invention can be used to produce lipofection agents.
  • Lipofection agents are, for example, liposomes or lipid agglomerates. Methods of making liposomes are well known.
  • the lipid intended for the preparation of the liposomes is first dissolved in an organic solvent and a lipid film is formed by evaporation. The lipid film is dried well to remove all solvent residues. Then the Lipids of this film are resuspended in a suitable buffer system.
  • physiological saline pH 7.4
  • buffer systems for example Mcllvaine buffer
  • unbuffered solutions such as, for example, unbuffered potassium or sodium chloride solutions
  • the amount of buffer should be calculated so that it later results in a liposome dispersion with a maximum of 15-20 mg lipid / ml buffer.
  • large multilamellar vesicles with a size distribution in the ⁇ m range can first be formed. The formation of these vesicles can be facilitated by using two glass spheres and / or an ultrasound bath with low sound intensity.
  • the following methods were tested for the actual preparation of unilameilar liposomes of a defined size and were found to be suitable for the production of liposomes from tetraether lipid derivatives according to the invention:
  • Liposomes with a diameter of around 500 nm are formed.
  • the liposomes can be centrifuged in a 3200 Eppendorf centrifuge for 10 minutes in order to remove non-liposomal material. Intact, closed vesicles remain in the supernatant.
  • Liposomes can be further produced by detergent solubilization with subsequent detergent dialysis.
  • a lipid film is first formed as described above. This is suspended in a detergent-containing buffer system (examples of dialysable detergents: octyl- ⁇ -D-glucopyranoside or octyl- ⁇ -D-thioglucopyranoside).
  • the molar ratio (TEL derivative: detergent) for the detergents mentioned should be between 0.05 and 0.3 and the amount of buffer should be calculated in such a way that a liposome dispersion with a maximum of 15-20 mg lipid per ml buffer results later.
  • Mixing micelles from detergent and TEL derivative is formed by shaking by hand.
  • the suspension of the mixed micelles is now in dialysis tubes, e.g. transferred into a Lipoprep® dialysis cell or into a Mini-Lipoprep® dialysis cell (Diachema AG, Langnau, Switzerland) and dialyzed at RT for 24 hours.
  • the mixed micelles form liposomes with a diameter of approximately 400 nm.
  • the liposome preparation can be centrifuged in a 3200 Eppendorf centrifuge for 10 minutes to remove non-liposomal material. Intact, closed vesicles remain in the supernatant.
  • the lipid agglomerates according to the invention consist of one or more layers of the TEL derivatives according to the invention. Negatively charged molecules, for example nucleic acid molecules, can be sandwiched between two such layers.
  • Lipofection agents which consist 100% of TEL derivatives according to the invention, have proven to be exceptionally stable, storable almost indefinitely and permeable to protons. For many applications, including the formulation of pharmaceuticals with acid-labile active ingredients and the transfection of eukaryotic cells, pure TEL-derivative lipofection agents are therefore the means of choice.
  • lipofection agents which, in addition to a proportion of TEL derivative, contain conventional double-layer-forming phospholipids, this percentage by weight being based on the total lipid (mixed liposomes or mixed lipid agglomerates).
  • the production of mixed lipofection agents is carried out analogously to the production of pure TEL derivative lipofection agents.
  • These double-layer-forming phospholipids can be, for example, sphingomyeline, cephaline, lecithin and cardioiipin.
  • cationic lipids such as DOTMA (N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride) (Life Technologies, Gaithersberg, USA) or DOTAP (N- [1- (2,3-Dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride) (Boehringer Mannheim, FRG) or DOSPER (Boehringer Mannheim).
  • neutral lipids such as e.g.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • cholesterol and / or its derivatives are incorporated into the membrane.
  • any other lipid suitable for the formation of liposomes or lipid agglomerates can be used.
  • the particular advantage of the mixed lipofection agents according to the invention is their improved (increased) stability due to the TEL derivative component, compared e.g. with liposomes without TEL derivative content.
  • the ratio of tetraether lipid derivative to further lipids is preferably 5: 1 to 1: 5. In particularly preferred embodiments, the ratio is 1: 2 to 1: 0.5, particularly preferably 1.1. All information relates to weight ratios.
  • TEL derivative liposome refers to liposomes whose lipid content is 100% from the invention TEL derivatives, preferably TEL consists of Thermoplasma acidophilum. The same applies to the terms “tetraether lipid derivative agglomerate” and related terms.
  • “Mixed liposomes” and “mixed lipid agglomerates” additionally include conventional phospholipids, and the terms “liposome” and “lipid agglomerates” include both liposomes and lipid agglomerates from pure TEL derivatives as well as mixed liposomes and mixed lipid agglomerates.
  • the liposomes according to the invention including the mixed liposomes and the lipid agglomerates including the mixed agglomerates can serve as transport vehicles for nucleic acids and / or cosmetic, pharmaceutical active substances.
  • the liposomes and lipid agglomerates according to the invention also enable targeted gene transfer.
  • nucleic acids e.g. DNA or RNA sequences which contain genes or gene fragments and are present in linear form or in the form of closed circular vectors which may contain further genetic material, packed in pure TEL liposomes or mixed liposomes, pure lipid agglomerates and mixed agglomerates and the ones to be transfected Cells added in vitro or in vivo.
  • the liposome membrane or aggiomerate surface also contains antibodies for which corresponding proteins or peptides are present on the cells to be reached by gene therapy, the contact between antigen on the target cell and antibodies in the membrane of the liposome according to the invention or Aggiomerate surface promoted contact between the liposome or aggiomerate surface and the target cell.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which contains the liposomes or lipid agglomerates according to the invention.
  • the liposomes and / or lipid agglomerates according to the invention are preferably used as transport vehicles in the case of active substances in which oral administration is not possible because these active substances would be inactivated in the acidic gastric fluid or would be broken down in the small intestine by lipases or peptidases.
  • the liposomes and lipid agglomerates according to the invention are acid-stable and can therefore pass freely through the stomach, for example into the small intestine, and included active substances which normally do not enter the bloodstream after oral administration can bring about resorption there.
  • the active substances can be contained in the aqueous lumen of the liposome, be present between the layers of the lipid agglomerates or be integrated into them.
  • the active substance to be transported is nucleic acids, it is usually protected in the liposome or between the agglomerate layers.
  • the active ingredient is covalently bound to the TEL contained in the liposome.
  • Preferred active ingredients are, for example, cytostatics, immunosuppressants, immunostimulants or vaccines and hormones.
  • the localization of the active substance in the lumen or in the membrane depends on its water or lipid solubility and is determined by the oil / water distribution coefficient. Many active substances have an intermediate distribution, ie both a certain water and lipid solubility, according to which they are distributed within a liposome on the lumen and membrane.
  • active ingredients dissolved in the lumen are vaccines, hormones and water-soluble components or derivatives of daunorubicin and doxorubicin or of methylprednisolone.
  • a preferred methylprednisolone derivative is the sodium salt of methylprednisolone hydrogen succinate.
  • preferred covalently bound active ingredients are, for example, antibodies, hormones, lectins and interleukins or active fragments of this group of substances.
  • the liposomes or lipid agglomerates according to the invention can interact particularly well with cell membranes.
  • tumors could therefore also be targeted, for example by tumor-specific antibodies or antibody fragments are built into the liposome membrane, which guide the liposomes of the lipid agglomerates filled with active substances into tumor cells in a targeted manner.
  • Chemotherapy with targeted chemotherapy helps to drastically reduce unwanted side effects.
  • the TEL derivatives according to the invention serve in pure form or as a constituent of pure or mixed liposomes or lipid agglomerates as the basis for the manufacture of medical ointments or skin creams.
  • TEL derivatives for liposomes or lipid agglomerates from pure TEL derivatives from Thermoplasma acidophilum or the mixed liposomes or mixed lipid agglomerates containing these TEL derivatives is the use of these substances in medical diagnostics.
  • Microtiter plates are coated with TEL derivatives, TEL derivative liposomes or TEL derivative mixed liposomes, which have been obtained by conjugation with specific antibodies or antigens.
  • Such coated substrates can e.g. be used for the immunometric determination of proteins, peptides or metabolic products.
  • Figure 1 shows microscopic images of BHK cells that have been pre-incubated with rhodamine-coupled tetraether lipid derivative B (10 ⁇ g / ml) for 70 min.
  • Figure 1A is a phase contrast image
  • Figure 1 B shows the fluorescence, recorded with red emission and green extinction filters.
  • Figure 2 shows the ethidium bromide fluorescence of DNA tetraether lipid derivative complexes with different DNA: lipid ratios. The experiment on which the figure is based is described in Example 4.2.2.
  • Figure 3 shows an agarose gel (1%) stained with ethidium bromide, on which DNA / tetraether lipid derivative complexes with different molar ratios of DNA to tetraether lipid have been electrophoresed.
  • the DNA applied is pSV-lacZ, the TEL derivative used was Compound B. Similar results were obtained with Compounds A and C.
  • Track 1 size marker ( ⁇ Hindlll: 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 5634 and 125 bp)
  • Lane 2 molar DNA lipid ratio of 1 0
  • Lane 3 molar DNA lipid ratio of 1 0.7
  • Lane 4 molar DNA lipid ratio of 1 1, 4
  • Lane 5 molar DNA lipid ratio of 1 2.1
  • Lane 6 molar DNA lipid ratio of 1 2.8.
  • Figure 4 shows the efficiency of transfection of BHK cells with the tetraetheriipid derivative B at a constant DNA concentration of 1.4 ⁇ g / ml, depending on the lipid concentration in the medium. The same results have been obtained with the compounds A and C.
  • Figure 5 shows the time course of the expression of ⁇ -galactosidase after incubation of BHK cells with tetraether lipid derivative complexes which contained the plasmid pSV-lacZ (Promega) coding for ⁇ -galactosidase.
  • 1.2 ⁇ g of DNA and 5 ⁇ g of tetraetheriipid derivative B were used per transfection approach. The same results have been obtained with the tetraetheriipid derivatives A and C.
  • Figure 6 shows the transfection efficiency of pure tetraether lipid derivative
  • Fig. 7a the implementation of a natural tetraether lipid, e.g. isolated from Thermoplasma acidophilum, with 1 molar hydrochloric acid in methanol to remove the sugar residues for dihydroxyl compound (2). Compound (2) is then converted to dicarboxylic acid (3).
  • a natural tetraether lipid e.g. isolated from Thermoplasma acidophilum
  • Fig. 7b shows the conversion of the dicarboxylic acid (3) to the corresponding dicarboxylic acid chloride (4).
  • the dicarboxylic acid chloride serves as a starting material for the reaction with amines.
  • 1,3-diaminopropane is reacted to give the tetraetheriipid derivative (A).
  • reaction no. 4b the dicarboxylic acid chloride is reacted with 3-dimethylaminopropylamine to give the tetraetheriipid derivative B.
  • tetraetheriipid derivative B reacts with dimethyl sulfate to give the tetraetheriipid derivative C.
  • the culture medium for Thermoplasma acidophilum is composed of Freundt's medium (Christiansen et al., (1975)), a 20% (w / v) glucose solution and a 20% (w / v) yeast extract solution (Difco).
  • Freundt's medium is sterilized in situ at 120 ° C, the 10 l fermenter 25 min and the 50 l fermenter 45 min.
  • the glucose and yeast solutions are sterilized separately at 110 ° C for 10 min and are only added to the medium immediately before the inoculation. 1.1.1
  • For the inoculation with freezer cells, 94 vol.% Freundt's medium, 5 vol.% Glucose solution and 1 vol.% Yeast extract solution are added.
  • Thermoplasma acidophilum is preferably grown in 10 l or 50 l fermenters. All Ferme ⁇ termaschine must be made of sulfuric acid-resistant material, e.g. Braun Biostat S (10 I, glass body), Braun Biostat 50 D (50 I, stainless steel body).
  • All Ferme ⁇ termaschine must be made of sulfuric acid-resistant material, e.g. Braun Biostat S (10 I, glass body), Braun Biostat 50 D (50 I, stainless steel body).
  • a 10 l fermenter can be inoculated directly without prior bottle cultivation.
  • the normal conditions for fermenter cultivation are 59 ° C and pH 2.
  • 1% by volume of yeast extract solution is added for the first time, and again after another 8 hours.
  • the addition of yeast extract causes the pH in the medium to rise and is compensated for by adding appropriate amounts of 1 M sulfuric acid.
  • 578 nm optical density
  • 5 l of the 10 l fermenter culture are removed as inoculum for a 50 l fermenter. This is cultivated as usual, with 1 vol.% Yeast extract being added after 20 and 28 hours.
  • Thermoplasma acidophilum grows aerobically, but high oxygen concentrations are not beneficial for growth.
  • the oxygen regulation is set to 0.02 to 0.03 vvm (volume of aeration per volume of medium per minute) in the 10 l fermenter and to 0.04 vvm in the 50 l fermenter.
  • the pH is continuously measured during cultivation and regulated when there are changes in pH.
  • Thermoplasma acidophilum reaches the stationary phase after approx. 40 hours (OD 57 8 of approx. 0.6). The harvest should therefore take place after approx. 40 hours with an OD 5 78 of 0.6, maximum 0.7.
  • the cell culture from a 10 l fermenter is centrifuged in a Heraeus stock centrifuge at 3000 x g for 15 minutes, the supernatant is discarded, the precipitate is resuspended in Freundt's solution.
  • the suspension is centrifuged for 10 minutes in a Christian centrifuge at maximum speed (4500 rpm, corresponding to about 3000 xg), the process is repeated at least twice, with Freu ⁇ dt's solution being replaced by sulfuric acid aqua bidest, pH 2, until the Pellet is white. Finally, the white wet cell mass is bidistilled in aqua. suspended, frozen in methanol / dry ice and freeze-dried to constant weight.
  • the cell culture of the 50 l fermenter is concentrated to a volume of 2 l using a Pelicon tangential flow filter system. This concentrate is washed with sulfuric acid distilled water, pH 2, until the filtrate is clear and undyed. Now the concentrated cell suspension is centrifuged (see above), the pellet in double-distilled water. resuspended, recentrifuged, resuspended, frozen and freeze-dried to constant weight.
  • Thermoplasma acidophilum appears in the light microscope after the above culture with a cell density of 10 7 cells / ml in mostly isodiametric form with a diameter between see 1 and 3 ⁇ m, some cells have pleio orphes appearance. According to laser light scatter measurements in the Malvern particle sizer, the maximum size distribution is 2.3 ⁇ m.
  • the cells usually appear round by freeze-fracture electron microscopy, pleio-morphic cells have longitudinal axes between 1, 1 and 2.7 ⁇ m and transverse axes around 0.6 ⁇ m.
  • the cells show a typical fracture behavior that distinguishes them from most other cells: they break perpendicular (transverse) to the membrane plane, along the hydrocarbon chains and not along the inner interface of the double layer (tangential).
  • Thermoplasma acidophilum is preserved at -80 ° C or in liquid N 2 .
  • an active culture (8-10 l) is adjusted to pH 5.0-5.5 by adding calcium carbonate.
  • the supernatant is removed and centrifuged under sterile conditions for 15 min at 3000 xg.
  • the supernatant is discarded and the Thermoplasma acidophilum cells of the pellet are resuspended in freshly prepared 10 mM sodium citrate buffer, pH 5.5.
  • the suspension is portioned on ice in cryocups to 0.5 to 3.0 ml, the cryocups are frozen in liquid nitrogen for one hour and then stored therein or at -80.degree.
  • cryocups are thawed with the cells in a water bath at 37 ° C.
  • Total lipid extraction is performed with freeze-dried material.
  • 8 to 10 g of freeze-dried cell mass are extracted with 300 ml of a petroleum ether (fraction 60 to 80 ° C.) / 2-propanol mixture (77:23 v / v) in a Soxhlet apparatus (recurrent, closed system) under reflux for 40 hours .
  • the extraction described is almost quantitative and leads to approx. 1 g of pure total lipid fraction.
  • tetraether lipids 80 mg are dissolved with stirring in a solution of 1 mg of 4-methoxy-TEMPO radical in 2 ml of CH 2 Cl 2 at 4 ° C. (J. Org. Chem., 1985, 50, p. 1332). 5 ml of sodium hypochlorite (0.35 M, pH 8.6) are added to the solution and the mixture is stirred vigorously at 4 ° C. for 5 minutes. After adding 30 ml of CHCI 3 , the organic phase Washed 5 times with 30 ml 0.25 M HCI. The organic phase is evaporated and the residue is chromatographed on silica gel (eluent: CHCIs / methanol / acetic acid 100: 5: 0.1).
  • Derivative A is obtained by a similar process, in which 100 ⁇ l of 1,3-diaminopropane are used instead of 100 ⁇ l of 3-dimethylaminopropylamine.
  • Derivative C is obtained by dissolving derivative B in a solution of 10 ⁇ l dimethyl sulfate in CH 2 CI 2 (5 ml). After 20 h the solvent is evaporated, the residue is dissolved in 10 ml of CHCl 3 and washed three times in 20 ml of 0.1 M HCl. After evaporation of the organic solution, about 10 mg of derivative C are obtained (yield about 95%).
  • Fluorescence-labeled tetraetheriipid derivative is obtained by adding 2 mg rhodamine isothiocyanate and 5 ⁇ l triethylamine to a solution of 2 mg derivative A in 2 ml dry CH 2 CI 2 . After 15 h, the solution is washed five times with 30 ml of water, the solvent is evaporated and the residue is chromatographically separated on silica gel (eluent: CHCl / methanol / acetic acid, 80: 20: 0.5). The fractions are collected and samples thereof are analyzed on TLC plates. The fractions containing the fluorescent lipid are combined and the solvent is evaporated. The process leads to approximately 2 mg of tetraether lipid rhodamine.
  • the tetraether lipid derivatives A, B or C are used for the production of lipofection agents.
  • the tetraetheriipid derivative is dissolved in chloroform / methanol (1/1, v / v) (2 mg / ml). Evaporation of the solvent creates a lipid film.
  • the lipid film is hydrated in buffer A (150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7.4) at room temperature for 48 h (final concentration 0.5-2 mg lipid / 500 ⁇ l buffer A), then in an ultrasonic bath (Branson 1210) Sonicated for 15 min and finally 10 min at room temperature with an ultrasound tip (Branson B15, "cycle mode ", position 40).
  • the lipid solution in buffer A appears cloudy without aggregates or recognizable precipitates.
  • DNA-lipofection agent complexes 3-5 ⁇ l of lipids (1 mg / ml) suspended in buffer A are dissolved in 100 ⁇ l of serum-free medium. 1-2 ⁇ g DNA (1 mg / ml) are diluted in 100 ⁇ l serum-free medium. The two solutions are mixed gently and incubated for 15 min at room temperature to form DNA-lipid complexes. Typically, no aggregates occur during complex formation. 800 ⁇ l of serum-free medium are added before each transfection, so that a final volume of 1 ml is reached.
  • DNA lipofection agent complexes were examined fluorometrically. It is known that the formation of complexes from DNA and cationic lipids prevents the binding of ethidium bromide to DNA (Gershon et al., Biochemistry 32, 7143-7151, 1993). Since the fluorescence of ethidium bromide-DNA complexes is proportional to the amount of free DNA in solution, this method can be used to quantify DNA-lipid complexes. For this purpose, DNA-lipid complexes of tetraetheriipid derivative B and pSV-lacZ with different tetraetheriipid derivative: DNA ratios in 1 ml of 150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7.4 were pre-formed.
  • Ethidium bromide was then added to a final concentration of 10 '7 M.
  • the fluorescence of ethidium bromide-DNA complexes was monitored by excitation at 518 nm and measurement of the emission at 605 nm.
  • the results are shown in Figure 2 and indicate that the formation of DNA tetraether lipid derivative complexes occurs at a molar ratio of 1: 1.
  • Transfections are carried out with a pSV-lacZ plasmid (Promega) as a reporter gene construct.
  • 1 x 10 5 BHK (Baby Hamster Kidney) cells are plated on 6-well plates. After 24 h incubation at 37 ° C in a CO 2 -gassed atmosphere, the cells reach a density of 25-50% and can be used for transfection.
  • the cells are washed with 2 ml of serum-free medium immediately before the transfection. 1 ml of the solution containing the DNA lipid complex (see Example 4.2) is added. After 5 h the medium containing the DNA is replaced by normal growth medium containing 10% serum. Shorter incubation times (2-4 h) also lead to successful transfections.
  • the cells are washed once in PBS, fixed with ice-cold methanol (-20 ° C.), washed three times with PBS and for 16 h in a solution of 4 mM Ferrycyanid (Sigma), 1 mM MgCl 2 , 0, 1% X-gal (Roth) incubated in PBS, pH 7.4 to detect the expression of ⁇ -galactosidase.
  • the transformation efficiency of the tetraether lipid derivatives A, B and C was compared with the commercially available transfection agents Lipofectin® and Lipofectamin® (Gibco / BRL).
  • the transfection efficiency was given as a percentage of blue cells, based on the total number of cells. The comparison showed that the transforma- efficiency for all compounds according to the invention was in the same order of magnitude as for the commercial agents.
  • the optimal ratio of DNA to lipid was also determined using the plasmid pSV-lacZ.
  • the best transfection results were obtained with a molar ratio of 1: 1 DNA / üpid ( Figure 4).
  • the maximum of the ⁇ -galactosidase expression was observed 19 h after the start of the common incubation of the cells with the DNA-lipid complex.
  • the trafection efficiency under these conditions was 12%, based on the total number of cells used.
  • a fluorescence-labeled lipofection agent suspension is prepared by sonicating 1 mg of a mixture of tetraetheriipid derivative A, B or C and tetraether lipid-rhodamine (see Example 3.3) (100: 1 molar ratio) in 1 ml of a buffer made of 150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7.4.
  • the lipid concentration of rhodamine-labeled liposomes or DNA-lipid complexes ranges from 10-100 ⁇ g / ml.
  • the cells are incubated for 70 min at 38 ° C. with the rhodamine-labeled lipofection agent, washed three times with PBS and then analyzed in a “reverse fluorescent microscope”.

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Abstract

Herkömmliche Liposomen, die zum Transport von pharmazeutischen Wirkstoffen in eukaryontische Zellen oder zur Lipofektion verwendet werden, sind nur begrenzt haltbar, nicht säurestabil und erfordern die Bestimmung einer Vielzahl von Parametern, damit zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden können. Die Entwicklung weniger empfindlicher Liposomen ist daher wünschenswert. Erfindungsgemäss werden Tetraetherlipidderivate bereitgestellt, die sehr stabil und gut zur Lipofektion geeignet sind.

Description

Tetraetherlipidderivate und Tetraetherlipidderivate enthaltende Liposomen und Lipidagglomerate sowie deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Tetraetherlipidderivate, die erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate enthaltende Liposomen und Lipidagglomerate und deren Verwendung.
In der wissenschaftlichen Forschung besteht ein großer Bedarf an Verfahren zur Trans- fektion von Zellen in Zellkultur und multizellulären Organismen mit Nukleinsäuren. Die herkömmlichen Verfahren wie Elektroporation, DEAE- und "Calciumphosphat"- unterstützte Transfektion, Mikroinjektion oder ballistische Methoden haben den Nachteil, daß sie oft nur geringe Transfektionseffizieπzen erreichen, die Zellüberlebeπsraten sehr gering sind und/oder, daß sie nicht an Mehrzellem durchführbar sind. Virale und retrovi- rale Transfektioπssysteme sind zwar effizienter, bergen aber eigene Risiken, wie z.B. eine erhöhte Immunantwort oder eine unkontrollierte Integration in das Zielgenom. Die Transfektion von nicht-viralen Nukleinsäuren mit Hilfe von Liposomen, auch Lipofektion genannt, stellt daher eine erfolgreiche und bereits häufig angewandte Alternative zu den oben beschriebenen Verfahren dar.
Liposomen sind künstlich hergestellte uni- oder multilamellare Lipidvesikel, die einen wäßrigen Innenraum umschließen. Sie sind im allgemeinen biologischen Membranen ähnlich und werden daher nach Anlagerung an dieselben oftmals leicht in die Membranstruktur integriert. Bei dieser Membranfusion wird der Inhalt des Liposomeninnenraums in das von der biologischen Membran umschlossene Lumen entladen. Alternativ werden die Liposomen durch endocytotische Vorgänge in das Cytosol der zu transfiziereπden Zelle gebracht; sie werden anschließend entweder im Cytosol zerstört oder treten als solche in Wechselwirkung mit der Kernmembran. Im letzteren Fall sind die im wäßrigen Innenraum des Liposoms enthaltenen Verbindungen weitgehend gegen proteolytische oder nukleolytische Angriffe geschützt.
Liposomen können daher als Transportvehikel für Stoffe, wie z.B. Nukleinsäuren und Pharmazeutika benutzt werden. So stellt z.B. die Kosmetikindustrie Liposomen-haltige Hautcremes her, die Wirkstoffe zielgerichtet in die Epidermis und tiefer gelegene Zellschichten transportieren. Zur Herstellung von Liposomen werden hauptsächlich πatürli- ehe Lecithine aus Sojabohnen oder Eigelb bzw. definierte natürliche oder künstliche Phospholipide, wie Cardiolipin, Sphingomyelin, Lysolecithin und andere verwendet. Durch Variation der polaren Kopfgruppen (Cholin, Ethanolamiπ, Serin, Glycerin, Inosit), der Länge und der Sättigungsgrade der Kohlenwasserstoffketten werden Größe, Stabilität und Fähigkeit zur Aufnahme und Freisetzung der assoziierten Moleküle beeinflußt.
Einer der wesentlichen Nachteile der bis heute bekannten Liposomen ist ihre geringe Stabilität. Aus normalen Doppelschicht-bildeπden Phopholipiden gebildete Liposomen sind auch im gekühlten Zustand nur kurze Zeit haltbar. Ihre Lagerstabilität läßt sich zwar z.B. durch Einbeziehen von Phosphatidsäure erhöhen, jedoch ist die somit verbesserte Stabilität für viele Zwecke immer noch unzureichend. Außerdem sind herkömmliche Liposomen nicht säurestabil und daher weder für den Transport pharmazeutischer Wirkstoffe geeignet, die nach oraler Verabreichung den Magen passieren, noch für die Lipo- somen-unterstützte DNA-Transfektion unter leicht sauren pH-Bedingungen.
Für wissenschaftliche und medizinische Lipofektionen in Säugerzellen werden Liposo- men-bildende Lipidmischuπgen, z.B. Lipofectamin®, Lipofectin® oder DOTAP®, häufig benutzt. Neben den bereits erwähnten Nachteilen ist mit ihrer Anwendung die Notwendigkeit verbunden, eine Vielzahl von Parametern (z.B. Zelldichte, Nukleinsäuremenge, Anteil der zugesetzten Lipide, Volumen des Liposomenansatzes etc.) genau zu bestimmen, weil es nur ein sehr enges Parameteroptimum gibt, bei dem ausreichende Trans- fektioπseffizienzen erreicht werden können. Dadurch werden Transfektionen unter Verwendung kommerzieller Lipofektionsreagenzien sehr aufwendig und kostenintensiv. Desweiteren sind bei den obeπgeanπten Produkten große Variationen zwischen den einzelnen Chargen zu beobachten, was sie in der Praxis wenig verläßlich macht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Lipofektionsmittel mit größerer mechanischer und chemischer Stabilität und damit verlängerter Lagerfähigkeit herzustellen, die eine einfache und verläßliche Anwendbarkeit ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch das Bereitstellen von Tetraetherlipid- derivaten (im folgenden auch als "TEL-Derivate" abgekürzt) mit der allgemeinen Formel (I): S 1
wobei S1 und S2 gleich oder verschieden sein können und jeweils die folgende Bedeutung haben:
und
Y kann -NR^RJ oder -N^R 40T5rR->6" bedeuten;
X1 und X2 können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen umfaßt;
R1 bis Rδ können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt: Was- serstoff, verzweigte oder unverzweigte Alkyl-, Alkenyl-, Aralkyl- oder Arylgruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei jeweils einer der Reste R2 bis R6 weiter einen Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle oder einen Liganden für Zelloberflächen-Rezeptoren umfassen kann; und
π kann eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 bedeuten,
sowie durch Bildung von Pentazyklen im Tetraethergrundgerüst gebildete Modifikationen davon.
Das Lipidgerüst der erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate besteht aus einem 72- gliedrigen Makrotetraetherzyklus, dessen Grundgerüst ein Dibiphytanyl-diethyl-tetra- etherheterozyklus ist. In diesem sind die ra-Kohleπstoffatome der Phytanylketteπ von jeweils 2 Diethermolekülen kovalent miteinander verbunden. Tetraetherlipide sind bereits bekannt und bisher ausschließlich in Archaebakterien nachgewiesen worden. In Abhängigkeit z.B. von der Züchtungstemperatur können sich innerhalb der Dibiphytanylketten Pentazyklen ausbilden, die dem Lipid einen spezifischen physiko-chemischen Charakter geben. Mit jeder Pentazyklisierung verliert das Grundgerüst zwei Wasserstoffatome. Eine Zusammenfassung aller bisher bekannten Basisstrukturen archaebakterieller Lipide ist in Langworthy und Pond (System Appl. Microbiol. 7, 253-257, 1986) enthalten.
Das natürlich vorkommende Lipidgerüst ist nunmehr erfindungsgemäß derivatisiert worden, um für den Einbau in zur Transfektion vorgesehene Liposomen oder Lipidagglomerate geeignet zu sein. Dazu werden Seitenketten eingeführt, die entweder per se durch Ausbildung quaternärer Ammoniumsalze oder unter physiologischen Bedingungen, d.h. bei einem pH von 7,35 bis 7,45, positiv geladen sind. Solcherart derivatisierte Lipide sind besonders gut geeignet, mit negativ geladenen Molekülen, beispielsweise Nukleiπsäu- remoiekülen, in Kontakt zu treten und sie z.B. in Liposomen einzuschließen. Da ein möglicher Verwendungszweck der erfindungsgemäßen Lipide in der Bildung von Liposomen oder Lipidagglomeraten für geπtherapeutische Anwendungen liegt, können die erfindungsgemäßen Lipide zusätzlich mit Molekülen gekoppelt werden, die das spezifische Andocken der Lipide an spezielle Zellen ermöglichen. Beispiele dafür sind Antikörper gegen Zelloberflächenantigene, insbesondere solche, die selektiv auf den Zielzellen exprimiert werden. Möglich sind weiter Ligaπden für Rezeptoren, die auf der Oberfläche bestimmter Zellen selektiv anzutreffen sind, sowie biologisch aktive Peptide, die ein Organ- bzw. Zeil-spezifisches Targeting in vivo ermöglichen (Ruoslati, Science, 1997). Letztere wurden für die Zwecke dieser Anmeldung ebenfalls als Liganden bezeichnet.
Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate liegt darin, daß ihr Lipidgerüst keine Doppelbindungen enthält und daher unempfindlich gegen Oxidation ist. Weiterhin enthält es statt der in Lipiden aus Eubakterieπ und Eukaryonten enthaltenen Lipidesterbindungen nur Lipidetherbindungen, die auch bei hohen Protonenkonzentrationen, wie sie z.B. im Magen auftreten, nicht angegriffen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Substituenteπ S1 und S2 an beiden Enden des Tetraetherlipidgrundgerüstes gleich. Dies ermöglicht, ausgehend von natürlichen Tetraetheriipiden, die Synthese ohne zwischenzeitliche Verwendung von Schutzgruppen. Die Identität der Substituenten S1 und S2 ist besonders bevorzugt in solchen Fällen, in denen keiner der Reste R1 bis R6 einen Antikörper oder Liganden für einen Zeiloberflächenrezeptor darstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivates stellt die Gruppe X1 sowohl in S1 als auch in S2 ein Alkylen oder Alkeπylen mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen dar. In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei X1 um Propylen.
Die Gruppe X2 ist ebenfalls bevorzugt ein Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Auch für X2 sind Propylenreste besonders bevorzugt.
n kann 0 bis 10 bedeuten. In bevorzugten Ausführungsformen ist n 0 bis 3, ganz besonders bevorzugt 0.
Die erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate werden bevorzugt aus natürlichen Tetraetheriipiden hergestellt, die z.B. aus Archaebakterien isolierbar sind. Wie oben bereits erwähnt, treten in den aus natürlichen Quellen isolierten Tetraetheriipiden in einem gewissen Umfang Pentazyklen innerhalb der Dibiphytanylketten auf. Das Ausmaß der Pentazyklisierung kann durch die Züchtuπgstemperatur beeinflußt werden. Normalerweise finden sich 0 bis 8 Pentazyklen pro Tetraethergrundgerüst, wobei bei einer Züchtungstemperatur von 39° die meisten Lipidmoleküle zwischen 1 und 5 Pentazyklen aufweisen, während bei einer Züchtungstemperatur von 59° überwiegend 3 bis 6 Pentazyklen beobachet werden. Die folgende Tabelle gibt Auskunft über die Verteilung der Pentazyklisierung bei einer Züchtungstemperatur von 39°C bzw. 59°C:
TABELLE
In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßenTetraetherlipidderivates bedeutet Y sowohl in S1 als auch in S2 -NR2R3. Dabei sind R2 und R3 bevorzugt Wasserstoff, verzweigte oder uπverzweigte Alkyl-, Alkenyl-, Araikyl- oder Arylgruppen besonders bevorzugt Wasserstoff-, Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet Y sowohl in S als auch in S2 ein quaternäres Ammoniumsalz, dessen Reste R4, R5 und R6 ebenfalls bevorzugt Wasserstoff-, verzweigte oder unverzweigte Alkyl-, Alkenyl-, Araikyl- oder Arylgruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyi sind. Jeweils einer der Reste R2 bis R6 kann einen Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle oder einen Liganden für Zelloberflächen-Rezeptoreπ umfassen.
In besonders bevorzugten Ausführuπgsformen hat das erfindungsgemäße Tetraetherli- pidderivat die allgemeine Formel (I) mit den nachstehend angegebenen Substituenten S1 und S2: Verbindung A:
S1 und S2: -CO-NH-(CH2)3-NH2;
Verbindung B:
S1 und S2: -CO-NH-(CH2)3-N(CH3)2:
Verbindung C:
S1 und S2: -CO-NH-(CH2)3-NΘ(CH3)3
Die erfindungsgemäßeπ Tetraetherlipidderivate können z.B. aus dem Gesamtlipidextrakt von Archaebakterien, z.B. dem Gesamtlipidextrakt des Archaebakteriums Thermoplas- ma acidophilum gewonnen werden. Thermoplasmen wachsen zwischen pH 1 und 4 und bei Temperaturen von 33 bis 67°C. Thermoplasma acidophilum kann, wie in Beispiel 1 wiedergegeben, kultiviert werden. Üblicherweise wird eine bis zu einer OD57a von ca. 0,6 gezüchtete Kultur des Mikroorganismus geerntet und die geerπteten Mikroorganismen entweder direkt zur Lipidgewinnung eingesetzt oder gefriergetrocknet und gelagert. Für die Gewinnung der Tetraetherlipide aus dem Gesamtlipidextrakt von Thermoplasma acidophilum wird dieser einer Säurehydrolyse unterzogen, um Tetraether zu produzieren (Beispiel 2 und Abb. 7). Oxidation der freien Hydroxylgruppen am Tetraether zu Dicar- bonsäureverbindungen, Reaktion dieser Dicarbonsäureverbindungen mit SOCI2 und Umsetzung der entstandenen Carbonsäurechloride mit Amineπ resultiert in der Bildung verschiedener Tetraetherlipidderivate (Beispiel 3 und Abb. 7).
Die erfindungsgemäßen TEL-Derivate können zum Herstellen von Lipofektionsmitteln verwendet werden. Lipofektionsmittel sind z.B. Liposomen oder Lipidagglomerate. Verfahren zum Herstellen von Liposomen sind allgemein bekannt. Generell wird dabei das zur Präparation der Liposomen vorgesehene Lipid zunächst in einem organischen Lösungsmittel gelöst und durch Evaporation ein Lipidfilm gebildet. Der Lipidfilm wird gut getrocknet, um sämtliche Lösungsmittelreste zu entfernen. Anschließend werden die Lipide dieses Filmes in einem geeigneten Puffersystem resuspendiert. Für medizinischpharmazeutische Zwecke eignet sich z.B. physiologische Kochsalzlösung, pH 7,4, jedoch sind andere Puffersysteme (z.B. Mcllvaine-Puffer), oder ungepufferte Lösungen, wie z.B. ungepufferte Kalium- oder Natriumchloridlösuπgen, ebenfalls verwendbar. Die Puffermenge sollte so berechnet sein, daß sie später eine Liposomendispersion mit maximal 15-20 mg Lipid/ml Puffer ergibt. Durch Schütteln mit der Hand können zunächst große multilamellare Vesikel mit einer Größenverteiluπg im μm-Bereich gebildet werden. Die Bildung dieser Vesikel kann durch Verwendung von zwei Glaskügelchen und/oder eines Ultraschallbades mit geringer Schallintensität erleichtert werden. Für die eigentliche Präparation von unilameilaren Liposomen definierter Größe wurden folgende Methoden getestet und als für die Herstellung von Liposomen aus erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivaten geeignet befunden:
(a) Ultraschallbehandlung: Die Suspension multiiamellarer Liposomen wird bei 20 kHz 5
Minuten beschallt (Braπson Sonifer B 15). Es bilden sich Liposomen mit einem Durchmesser um 500 nm.
(b) Extrusion durch eine French Druckzelle: Die Suspension multiiamellarer Liposomen wird bei 16000 p.s.i. viermal in der French Druckzelle extrudiert (SLM-Aminco Inc., Urbana IL, USA). Es bilden sich Liposomen mit einem Durchmesser um 120 nm.
(c) Extrusion durch Polycarbonatfilter: Die Suspension multiiamellarer Liposomen wird durch Polycarbonatfilter definierter Poreπgröße extrudiert (LiposoFasf1, Avestin, Ottawa, Kanada). Bei Verwendung von Filtern mit einer Porengröße von 100 oder 200 nm entstehen Liposomen, die in der Größenverteilung geringfügig oberhalb der Porengröße liegen. Die Extrusion durch Filter dieser geringen Porengröße kann gleichzeitig als Sterilfiltration dienen, sofern alle sonstigen Voraussetzungen für eine Sterilfiltration (z.B. exakte Trennung der uπsterilen und sterilen Seiten der Filtrationsapparatur) eingehalten werden. Um die eigentliche Filtration zu erleichtern, können einige Vorbereitungen getroffen werden:
(ca) Die Suspension multiiamellarer Liposomen wird bei 20 kHz zwischen 1 und 5 Minuten beschallt (s. (a)) (cb) Die Suspension multiiamellarer Liposomen wird 1-3 mal gefroren und wieder aufgetaut.
(cc) Die Suspension multiiamellarer Liposomen nach (ca) oder (cb) wird durch einen Polycarbonatfilter von 600 bis 800 nm Porengröße vorfiltriert.
Im Anschluß an die Ultraschallbehandlung bzw. Extrusion können die Liposomen in einer Eppendorfzentrifuge 3200 10 Minuten zentrifugiert werden , um nichtliposomales Material zu entfernen. Intakte, geschlossene Vesikel bleiben im Überstand.
Liposomen können weiter durch Detergenzsolubilisierung mit anschließender Deter- genzdialyse hergestellt werden. Dazu wird zunächst wie oben beschrieben ein Lipidfilm gebildet. Dieser wird in einem detergenzhaltigen Puffersystem suspendiert (Beispiele dialysierbarer Detergeπzien: Octyl-ß-D-Glucopyranosid oder Octyl-ß-D- Thioglucopyranosid). Das molare Verhältnis (TEL-Derivat: Detergenz) sollte bei den genannten Detergenzien zwischen 0,05 und 0,3 liegen und die Puffermenge so berechnet sein, daß sich später eine Liposomendispersion mit maximal 15-20 mg Lipid pro ml Puffer ergbibt. Durch Schütteln mit der Hand werden Mischmizellen aus Detergenz und TEL-Derivat gebildet.
Die Suspension der Mischmizellen wird nun in Dialyseschläuche, z.B. in eine Lipoprep®- Dialysezelle oder in eine Mini-Lipoprep® Dialysezelle (Diachema AG, Langnau, Schweiz) übertragen und bei RT 24 Stunden dialysiert. Bei Entzug des Detergenz durch die Dialyse bilden sich aus den Mischmizellen Liposomen von etwa 400 nm Durchmesser.
Die Liposomen-Präparation kann in einer Eppendorfzentrifuge 3200 10 Minuten zentrifugiert werden, um nichtliposomales Material zu entfernen. Intakte, geschlossene Vesikel bleiben im Überstand.
Die erfindungsgemäßen Lipidagglomerate bestehen aus einer oder mehreren Schichten der erfindungsgemäßen TEL-Derivate. Zwischen jeweils zwei solcher Schichten können sich negativ geladene Moleküle, z.B. Nukleinsäuremoleküle, einlagern. Lipofektionsmittel, die zu 100% aus erfindungsgemäßen TEL-Derivaten bestehen, haben sich dabei als außergewöhnlich stabil, nahezu unbegrenzt lagerfähig und protonenuπ- durchlässig erwiesen. Für viele Anwendungen, darunter die Formulierung von Pharma- zeutika mit säurelabilen Wirkstoffen, und die Transfektion von Eukaryontenzellen stellen reine TEL-Derivat-Lipofektionsmittel daher das Mittel der Wahl dar.
Als vorteilhaft hat sich auch die Herstellung von Lipofektionsmitteln erwiesen, die neben einem Anteil von TEL-Derivat übliche Doppelschicht-bildende Phospholipide enthalten, wobei dieser Gewichtsprozentanteil auf das Gesamtlipid bezogen ist (Mischliposomen bzw. Mischlipidagglomerate). Die Herstellung von Mischlipofektiσnsmitteln erfolgt analog der Herstellung von reinen TEL-Derivat-Lipofektionsmitteln.
Bei diesen Doppelschicht-bildenden Phospholipiden kann es sich beispielsweise handeln um Sphingomyeline, Cephaline, Lecithine und Cardioiipin. Besonders bevorzugt ist der Zusatz von kationischen Lipiden wie DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammoniumchlorid) (Life Technologies, Gaithersberg, USA) oder DOTAP (N-[1- (2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) (Boehringer Mannheim, FRG) oder DOSPER (Boehringer Mannheim). Zur Unterstützung der Transfektionseffizienz können auch neutrale Lipide wie z.B. DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) (Sigma) in die Herstellung der TEL-Derivatliposome einbezogen werden (Beispiel 5). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Cholesterin und/oder seine Derivate in die Membran eingebaut. Darüber hinaus kann jedes weitere für die Bildung von Liposomen oder Lipidagglomeraten geeignete Lipid herangezogen werden. Der besondere Vorteil der erfiπdungsgemäßen Mischlipofektioπsmittel ist ihre durch den TEL- Derivatanteil verbesserte (erhöhte) Stabilität, verglichen z.B. mit Liposomen ohne TEL- Derivatanteil.
In den erfindungsgemäßen Mischiipofektionsmittelπ beträgt das Verhältnis von Tetrae- therlipidderivat zu weiteren Lipiden bevorzugt 5:1 bis 1 :5. In besonders bevorzugten Ausführungsformen beträgt das Verhältnis 1 :2 bis 1 :0,5, besonders bevorzugt 1.1. Alle Angaben beziehen sich auf Gewichtsverhältnisse.
Im folgenden beziehen sich die Ausdrücke "TEL-Derivatliposom", "Liposom aus reinem TEL-Derivat" etc. auf Liposomen, deren Lipidanteil zu 100% aus erfindungsgemäßen TEL-Derivaten, bevorzugt TEL aus Thermoplasma acidophilum besteht. Gleiches gilt für die Ausdrücke "Tetraetherlipidderivatagglomerat " und verwandte Ausdrücke.
"Mischliposomen" und "Misch-Lipidagglomerate" umfassen zusätzlich herkömmliche Phospholipide, und die Ausdrücke "Liposom" bzw. "Lipidagglomerat" umfassen sowohl Liposomen bzw. Lipidagglomerate aus reinen TEL-Derivaten als auch Mischliposomen bzw. Misch-Lipidagglomerate.
Die erfindungsgemäßen Liposomen einschließlich der Mischliposomen sowie die Lipidagglomerate einschließlich der Mischagglomerate können als Transportvehikel für Nukleinsäuren und/oder kosmetische, pharmazeutische Wirkstoffe dienen. Die erfindungsgemäßen Liposomen und Lipidagglomerate ermöglichen darüber hinaus einen zielgerichteten Gentransfer. Dazu werden Nukleinsäuren, z.B. DNA- oder RNA- Sequenzen, die Gene oder Genfragmeπte enthalten und in linearer Form oder in Form von circulär geschlossenen Vektoren, die weiteres genetisches Material enthalten können, vorliegen, in reine TEL-Liposomen oder Mischliposomen, reine Lipidagglomerate und Mischagglomerate verpackt und den zu transfizierenden Zellen in vitro oder in vivo zugesetzt. Wenn die Liposomenmembran bzw. Aggiomeratoberfläche darüber hinaus Antikörper enthält, für die entsprechende Proteine oder Peptide auf den mit der Gentherapie zu erreichenden Zellen vorhanden sind, so wird durch den Kontakt zwischen Anti- gen auf der Zielzelle und Antikörper in der Membran des erfindungsgemäßen Liposomes bzw. Aggiomeratoberfläche ein Kontakt zwischen Liposom- bzw. Aggiomeratoberfläche und Zielzelle gefördert.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Liposomen oder Lipidagglomerate enthält.
Die erflnduπgsgemäßeπ Liposomen und/oder Lipidagglomerate werden bevorzugt bei solchen Wirkstoffen als Transportvehikel eingesetzt, bei denen eine orale Applikation nicht möglich ist, weil diese Wirkstoffe in der sauren Magenflüssigkeit inaktiviert oder durch Lipasen oder Peptidasen im Dünndarm abgebaut werden würden. Die erfindungsgemäßen Liposomen und Lipidagglomerate sind jedoch säurestabil und können deshalb ungehindert durch den Magen z.B. in den Dünndarm gelangen und eingeschlossene Wirkstoffe, die nach oraler Applikation normalerweise nicht in die Blutbahn gelangen können, dort zur Resorption bringen. Die Wirkstoffe können im wäßrigen Lumen des Liposoms enthalten sein, zwischen den Schichten der Lipidagglomerate vorliegen oder in diese integriert sein. Sofern es sich bei dem zu transportierenden Wirkstoff um Nukleinsäuren handelt, ist dieser meistens geschützt im Liposom oder zwischen den Ag- glomeratschichteπ. In einer weiteren Ausführungsform ist der Wirkstoff kovalent an das im Liposom enthaltene TEL gebunden. Bevorzugte Wirkstoffe sind z.B. Cytostatika, Im- muπsuppressiva, Immunstimulanzien oder Impfstoffe sowie Hormone. Die Lokalisierung des Wirkstoffes im Lumen oder in der Membran ist abhängig von seiner Wasser- bzw. Lipidlöslichkeit und wird vom Öl/Wasser-Verteilungskoeffizieπten bestimmt. Viele Wirkstoffe haben eine intermediäre Verteilung, d.h. sowohl eine gewisse Wasser- als auch Lipidlöslichkeit, gemäß derer sie sich innerhalb eines Liposomes auf Lumen und Membran verteilen. Weitere Beispiele für im Lumen gelöste Wirkstoffe sind Impfstoffe, Hormone und wasserlösliche Anteile bzw. Derivate von Daunorubicin und Doxorubicin bzw. von Methylprednisolon. Ein bevorzugtes Methylprednisolonderivat ist dabei das Natriumsalz des Methylprednisolon-Hydrogensuccinats. Bevorzugte kovalent gebundene Wirkstoffe sind dagegen beispielsweise Antikörper, Hormone, Lectine und Interleukine oder aktive Fragmente dieser Stoffgruppeπ.
Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Liposomen bzw. Lipidagglomerate besonders gut mit Zellmembranen wechselwirken können. Nachgewiesen wurde z.B. die Aufnahme von mit dem lipophilen Fluoreszenz-Farbstoff Rhodamin gekoppelten Tetraetheriipidderivaten durch die Zellmembran von Baby Hamster Kidney (BHK)-Zellen (s. Abb. 1 und Beispiel 5.2).
Mit den erfindungsgemäßen Liposomen oder Lipidagglomeraten könnten daher auch Tumoren gezielt bekämpft werden, indem z.B. tumorspezifische Antikörper bzw. Antikörperfragmente in die Liposomenmembran eingebaut werden, die die mit Wirkstoffen gefüllten Liposomen der Lipidagglomerate zielgerichtet in Tumorzellen lotsen. Eine chemotherapeutische Behandlung mit zielgerichtet wirkenden Chemotherapeutika trägt dazu bei, unerwünschte Nebenwirkungen drastisch zu reduzieren.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform dienen die erfinduπgsgemäßen TEL-Derivate in reiner Form oder als Bestandteil von reinen oder gemischten Liposomen oder Lipidagglomeraten als Grundlage für die Herstellung medizinischer Salben oder Hautcremes.
Ein weiteres mögliches Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen TEL-Derivate, für Liposomen oder Lipidagglomerate aus reinen TEL-Derivaten aus Thermoplasma acidophilum oder die diese TEL-Derivate enthaltenden Mischliposomen oder Misch- Lipidagglomerate ist die Verwendung dieser Substanzen in der medizinischen Diagnostik. Dabei können z.B. Mikrotiterplatten mit TEL-Derivaten, TEL-Derivatliposomeπ oder TEL-Derivatmischliposomen beschichtet werden, die durch Konjugation mit spezifischen Antikörpern oder Antigenen erhalten worden sind. Solcher Art beschichtete Träger können z.B. für die immunometrische Bestimmung von Proteinen, Peptiden oder Stoffwechselprodukten eingesetzt werden.
Die folgenden Abbildungen und Beispiele erläutern die Erfindung.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 : zeigt mikroskopische Aufnahmen von BHK-Zellen, die mit Rhodamin- gekoppeltem Tetraetherlipidderivat B (10 μg/ml) 70 Min voriπkubiert worden sind.
Abbildung 1A ist eine Phasenkontrastaufnahme,
Abbildung 1 B zeigt die Fluoreszenz, aufgenommen mit roten Emissions- und grünen Extinktionsfiltern.
Abbildung 2 zeigt die Ethidiumbromidfluoreszenz von DNA-Tetraetherlipidderivat- Komplexen bei unterschiedlichen DNA:Lipidverhältnissen. Der der Abbildung zugrunde liegende Versuch ist im Beispiel 4.2.2 beschrieben.
Abbildung 3 zeigt ein mit Ethidiumbromid angefärbtes Agarosegel (1 %), auf dem DNA/Tetraetherlipidderivat-Komplexe mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen von DNA zu Tetraetherlipid elektrophoretisiert worden sind. Bei der aufgetragenen DNA handelt es sich um pSV-lacZ, das verwendete TEL-Derivat war Verbindung B. Mit denVerbindungen A und C sind gleiche Ergebnisse erhalten worden.
Die Spuren zeigen im einzelnen:
Spur 1 : Größenmarker (λHindlll: 23130, 9416, 6557, 4361 , 2322, 2027, 5634 und 125 bp)
Spur 2: molares DNA-Lipidverhältnis von 1 0 Spur 3: molares DNA-Lipidverhältnis von 1 0,7 Spur 4: molares DNA-Lipidverhältnis von 1 1 ,4 Spur 5: molares DNA-Lipidverhältnis von 1 2,1 Spur 6: molares DNA-Lipidverhältnis von 1 2,8.
Abbildung 4: zeigt die Effizienz der Transfektion von BHK-Zellen mit dem Tetraetheriipidderivat B bei einer konstanten DNA-Konzentration von 1 ,4 μg/ml, in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration im Medium. Mit den Verbindungen A und C sind gleiche Ergebnisse erhalten worden.
Abbildung 5: zeigt den Zeitverlauf der Expression von ß-Galactosidase nach Inkubation von BHK-Zellen mit Tetraetherlipidderivat-Komplexen, die das für ß- Galactosidase kodierende Plasmid pSV-lacZ (Promega) enthielten. Es wurden 1 ,2 μg DNA und 5 μg Tetraetheriipidderivat B pro Transfekti- oπsansatz eingesetzt. Mit den Tetraetheriipidderivaten A und C sind gleiche Ergebnisse erhalten worden.
Abbildung 6: zeigt die Transfektioπseffizienz von reinen Tetraetherlipidderivat-
Liposomen im Vergleich zu Mischliposomen mit DOPE (molares Verhältnis 1 :1), PC (molares Verhältnis 1 :1) und MPL (molares Verhältnis Tetraetheriipidderivat B zu MPL wie 1 :2) (MPL: "main phospholipid" aus Thermoplasma acidophilum, Gesamtphospholipidfraktion, s. PCT/EP97/01011). Die Ergebnisse mit den Derivaten A und B sind vergleichbar. Abbildung 7: zeigt das Reaktionsschema zur Synthese verschiedener TEL- Derivate. Der Tetraethermakrozyklus ist dabei durch das jeder Formel zentrale Rechteck dargestellt. Im einzelnen zeigt:
Abb. 7a die Umsetzung eines natürlichen Tetraetherlipides, z.B. isoliert aus Thermoplasma acidophilum, mit 1 molar Salzsäure in Methanol zur Entfernung der Zuckerreste zur Dihydroxylverbinduπg (2). Verbindung (2) wird anschließend zur Dicarbonsäure (3) umgesetzt.
Abb. 7b zeigt die Umsetzung der Dicarbonsäure (3) zum entsprechenden Dicarbonsäu- rechlorid (4). Das Dicarboπsäurechlorid dient als Edukt für die Umsetzung mit Amiπen. Gemäß Reaktion 4a wird mit 1 ,3-Diaminopropan zum Tetraetheriipidderivat (A) umgesetzt. Gemäß Reaktion Nr. 4b erfolgt die Umsetzung des Di- carboπsäurechlorides mit 3-Dimethylaminopropylamin zum Tetraetheriipidderivat B.
Abb. 7c Das Tetraetheriipidderivat B reagiert mit Dimethylsulfat zum Tetraetheriipidderivat C.
Beispiel 1
Kultivierung und Konservierung von Thermoplasma acidophilum
1.1 Medium
Das Kulturmedium für Thermoplasma acidophilum setzt sich aus Freundt'schem Medium (Christiansen et al., (1975)), einer 20%igen (w/v) Glucoselösung und einer 20%igen (w/v) Hefeextraktlösuπg (Difco) zusammen. Das Freundt'sche Medium wird in situ bei 120°C sterilisiert, der 10 I-Fermeπter 25 min und der 50 I-Fermenter 45 min. Die Gluco- se- und Hefelösungen werden separat 10 min bei 110°C sterilisiert und erst unmittelbar vor der Inokulation dem Medium beigefügt. 1.1.1 Für die Inokulation mit Gefrierzellen werden 94 Vol.-% Freundt'schem Medium 5 Vol.-% Glucoselösung und 1 Vol.-% Hefeextraktlösung zugefügt.
1.1.2 Für die Beimpfung mit einer Suspensionskultur werden 84 Vol.-% Freundt'sches Medium, 5% Glukoselösung und 1 % Difcolösung wie oben vereint.
1.2 Inokulation
2.1 Im Fall der Kultur aus Gefrierzellen werden dem in 1.1 beschriebenen Medium 1 ml/l Gefrierzellen zugesetzt. Die lag-Phase beträgt 2 bis 3 Tage.
2.2 Für Kulturen mit Suspensionskultur-Inokulum werden dem in 1.2 beschriebenen Medium 10 Vol.-% Suspensioπskultur zugesetzt. Die lag-Phase beträgt in diesem Fall nur wenige Stunden.
1.3 Kultivierung von Thermoplasma acidophilum
Thermoplasma acidophilum wird bevorzugt in 10 I- oder 50 I-Fermentem gezüchtet. Alle Fermeπterteile müssen aus Schwefelsäure-festem Material sein, z.B. Braun Biostat S (10 I, Glaskorpus), Braun Biostat 50 D (50 I, Edelstahlkorpus).
Ausgehend von Gefrierzellen, die wie unten beschrieben konserviert worden sind, kann ein 10 I-Fermenter ohne vorherige Flaschenzucht direkt angeimpft werden. Die Normalbedingungen bei der Fermenterzucht sind 59°C und pH 2. Nach Erreichen einer optischen Dichte von 0,4 (bei 578 nm) wird das erste Mal 1 Vol.-% Hefeextraktlösung nachgeführt, ein weiteres Mal nach weiteren 8 Stunden. Die Zugabe von Hefeextrakt läßt den pH im Medium ansteigen und wird durch Zugabe entsprechender Mengen von 1 M Schwefelsäure kompensiert. Nach Erreichen einer optischen Dichte (578 nm) von 0,6 bis 0,7 werden 5 I der 10 I-Fermenterkultur als Inokulum für einen 50 I-Fermenter entnommen. Dieser wird wie üblich kultiviert, wobei nach 20 und 28 Stunden jeweils 1 Vol.-% Hefeextrakt zugeführt wird. Nach Erreichen der stationären Phase wird 1 Liter als Inokulum für einen weiteren 10 I-Fermenter verwendet. Thermoplasma acidophilum wächst obligat aerob, hohe Sauerstoffkonzentrationen sind für das Wachstum jedoch nicht vorteilhaft. Die Sauerstoffregulation wird auf 0,02 bis 0,03 vvm (Volumen Belüftung pro Volumen Medium pro Minute) im 10 I-Fermenter und auf 0,04 vvm im 50 I-Fermenter eingestellt. Während des Wachstums nimmt der Sauerstoffgehalt des Mediums konstant und rapide bis unter die Grenze der Meßbarkeit ab, muß aber nicht gegenreguliert werden. Der pH wird während der Kultivierung laufend gemessen und bei pH-Veränderungen reguliert.
1.4 Zellernte
Das Wachstum von Thermoplasma acidophilum erreicht die stationäre Phase nach ca. 40 Stunden (OD578 von ca. 0,6). Die Ernte sollte daher nach ca. 40 Stunden bei einer OD578 von 0,6, maximal 0,7 erfolgen.
Die Zellkultur aus einem 10 I-Fermenter wird in einer Heraeus-Stockzeπtrifuge 15 Minuten bei 3000 x g zentrifugiert, der Überstand wird verworfen, der Niederschlag wird in Freundt'scher Lösung resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten in einer Christ- zeπtrifuge bei maximaler Umdrehungszahl (4500 Upm, entsprechend in etwa 3000 x g) zentrifugiert, der Vorgang noch mindestens zweimal wiederholt, wobei Freuπdt'sche Lösung durch schwefelsaures Aqua bidest, pH 2, ersetzt wird, bis das Pellet weiß ist. Schließlich wird die weiße Zellnaßmasse in Aqua bidest. suspendiert, in Methanol/Trockeneis eingefroren und bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet.
Die Zellkultur des 50 I-Fermenters wird mittels eines Pelicon-Tangentialfluß-Filtersystems zur Ernte auf ein Volumen von 2 I konzentriert. Dieses Konzentrat wird mit schwefelsaurem destilliertem Wasser, pH 2, gewaschen, bis das Filtrat klar und ungefärbt ist. Nun wird die konzentrierte Zellsuspension zentrifugiert (s.o.), das Pellet in Aqua bidest. resuspendiert, rezentrifugiert, resuspendiert, eingefroren und bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet.
1.5 Optische Kontrolle der Reinheit der Thermoplasma acidophilum-Kultur
Im Lichtmikroskop erscheint Thermoplasma acidophilum nach obiger Kultur mit einer Zelldichte von 107 Zellen/ml in meist isodiametrischer Form mit einem Durchmesser zwi- sehen 1 und 3 μm, einige Zellen haben pleio orphes Aussehen. Nach Laserlicht- Streumessungen im Malvern particle sizer liegt das Maximum der Größenverteilung bei 2,3 μm. Gefrierbruch-elektronenmikroskopisch erscheinen die Zellen meist rund, pleio- morphe Zellen weisen Längsachsen zwischen 1 ,1 und 2,7 μm und Querachsen um 0,6 μm auf. Die Zellen zeigen ein typisches Bruchverhalten, das sie von den meisten anderen Zellen unterscheidet: sie brechen senkrecht (quer) zur Membranebene, entlang der Kohlenwasserstoffketten und nicht entlang der inneren Grenzfläche der Doppelschicht (tangential).
Bei den gegebenen Wachstumsbedingungen (59°C, pH 2) können nur wenige Organismen in die Kultur einwachsen, z.B. Bacillus acidocaldarius. Züchtung bei pH 1 ,5 verhindert auch dies, ist allerdings mit einem Ausbeuteverlust hinsichtlich der gewünschten Lipidkomponente verbunden. Somit liegt das Züchtungsoptimum bei pH 2 unter Einhaltung möglichst steriler ("keimreduzierter") Bedingungen.
1.6 Konservierung
Die Konservierung von Thermoplasma acidophilum erfolgt bei -80°C oder in flüssigem N2. Zur Konservierung wird eine aktive Kultur (8-10 I) durch Zugabe von Calciumcarbo- nat auf pH 5,0-5,5 eingestellt. Nach Sedimentation von Calciumsulfat und überschüssigem Calciumcarbonat (mindestens 30 min ruhig stehenlassen) wird der Überstand abgehoben und unter sterilen Bedingungen 15 min bei 3000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und die Thermoplasma acidophilum-Zellen des Pellets werden in frisch zubereiteten 10 mM Natriumeitratpuffer, pH 5,5, resuspeπdiert. Die Suspension wird auf Eis in Cryocups auf 0,5 bis 3,0 ml portioniert, die Cryocups werden eine Stunde in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend darin oder bei -80°C aufbewahrt.
Zur Kultivierung werden die Cryocups mit den Zellen im Wasserbad bei 37°C aufgetaut.
Es ist unbedingt notwendig, daß die Konservierungsschritte steril durchgeführt werden, da der pH von 1-2, der bei der Kultivierung das Einwachsen der meisten Mikroorganismen verhindert, nicht eingehalten wird. Beispiel 2
Extraktion und Reinigung der Tetraetherlipide aus Thermoplasma acidophilum
2.1 Extraktion von Gesamtlipid
Die Extraktion von Gesamt-Lipid wird mit gefriergetrocknetem Material durchgeführt. Dazu werden 8 bis 10 g gefriergetrocknete Zellmasse mit 300 ml eines Petrolether(Fraktion 60 bis 80°C)/2-Propanol-Gemisches (77:23 v/v) in einer Soxhletapparatur (rekurrierendes, geschlossenes System) 40 Stunden unter Rückfluß kontinuierlich extrahiert. Die beschriebene Extraktion ist nahezu quantitativ und führt zu ca. 1 g reiner Gesamtlipidfraktion.
750 mg der Gesamtlipidfraktion aus Thermoplasma acidophilum werden in 800 ml einer 1 M HCI-Lösung in Methanol 10 h unter Rückflußkühlung gekocht. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 100 ml CHCI3 gelöst und mit H2O gewaschen (5 x 100 ml). Die CHCI3-Fraktion wird verdampft und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel (Kieselgel, Merck; Elutionsmittel CHCI3) aufgetrennt. Die Fraktionen werden gesammelt und auf TLC-Platteπ analysiert (Laufmittel: CHCIs/Methanol 9:1 ), wobei bereits isolierte Tetraether als Standard dienen (Freisleben et al., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 745-52). Nach Verdampfen des Elutionsmitteis beträgt die Ausbeute ca. 390 mg Tetraetherlipide.
Beispiel 3
Herstellung der Tetraetherlipidderivate A, B und C
3.1 Herstellen von Dicarbonsäureverbindunqen
80 mg Tetraetherlipide werden unter Rühren in einer Lösung von 1 mg 4-Methoxy- TEMPO Radikal in 2 ml CH2CI2 bei 4°C gelöst (J. Org. Chem., 1985, 50, S. 1332). 5 ml Natriumhypochlorid (0,35 M, pH 8,6) werden der Lösung zugesetzt und die Mischung für 5 Min bei 4°C kräftig gerührt. Nach Zugeben von 30 ml CHCI3 wird die organische Phase 5 mal mit 30 ml 0,25 M HCI gewaschen. Die organische Phase wird verdampft und der Rückstand auf Silicagel chromatographisch aufgetrennt (Elutionsmittel: CHCIs/Metha- noI/Essigsäure 100:5:0,1). Die Fraktionen werden gesammelt und auf TLC-Platte analysiert (Laufmittel: CHCIs Methanol/Essigsäure 100:5:01 ). Nach Verdampfen des Eluti- onsmittels werden ca. 47 mg Dicarbonsäure-Verbindung aus den entsprechenden Fraktionen gewonnen (ca. 50% Ausbeute).
3.2 Herstellen von Dicarbonsäurechlorid
45 mg der Dicarbonsäure-Verbindung werden in einer Lösung von Thionylchlorid (100 μl) in 5 ml trockenem CH2CI2 gelöst und refluxiert. Nach ca. 6 Stunden ist das Lösungsmittel verdampft. Das entstandene Dicarbonsäurechlorid kann ohne weitere Reinigungsschritte eingesetzt werden.
3.3. Herstellen von TEL-Derivaten
3.2.1 Tetraetheriipidderivat B
50 μl 3-Dimethylaminopropylamiπ werden einer Lösung von ca. 45 mg Dicarbonsäurechlorid in 5 ml trockenem CH2CI zugesetzt. Nach 5 Min wird die Mischung fünfmal mit 30 ml Wasser gewaschen, das Lösungsmittel evaporiert und der Rückstand chromatographisch auf Kieselgel aufgetrennt (Elutionsmittel: CHCIs/Methanol/Essigsäure, 80:20:0,5). Die Fraktionen werden gesammelt und auf TLC-Platten mit dem gleichen Laufmittel wie oben genannt analysiert. Aus den Fraktionen, in denen das Tetraetheriipidderivat A festgestellt wird, wird das Lösungsmittel verdampft. Das Verfahren führt zu ca. 35 mg Derivat B.
3.2.2 Tetraetheriipidderivat A
Derivat A wird durch ein ähnliches Verfahren gewonnen, bei dem anstelle von 100 μl 3- Dimethylaminopropylamin 100 μl 1 ,3-Diaminproρan eingesetzt werden.
3.2.3 Tetraetheriipidderivat C Derivat C wird gewonnen, indem Derivat B in einer Lösung aus 10 μl Dimethylsulfat in CH2CI2 (5 ml) gelöst wird. Nach 20 h wird das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand in 10 ml CHCI3 gelöst und dreimal in je 20 ml 0,1 M HCI gewaschen. Nach Evaporieren der organischen Lösung werden ca. 10 mg Derivat C gewonnen (Ausbeute ca. 95%).
3.4 Herstellen eines Fluoreszenz-markierten Tetraetherlipidderivates
Zur Klärung der Frage, ob die erfindungsgemäßen positiv geladenen Tetraetherlipidderivate in Zellen eindringen können, ist ein neues fluoreszierendes Tetraetheriipidderivat synthetisiert worden.
Fluoreszenz-markiertes Tetraetheriipidderivat wird gewonnen, indem 2 mg Rhodamin- isothiocyanat und 5 μl Triethylamin einer Lösung von 2 mg Derivat A in 2 ml trockenem CH2CI2 zugesetzt werden. Nach 15 h wird die Lösung fünfmal mit 30 ml Wasser gewaschen, das Lösungsmittel evaporiert und der Rückstand chromatographisch auf Kieselgel aufgetrennt (Elutionsmittel: CHCIs/Methanol/Essigsäure, 80:20:0,5). Die Fraktionen werden gesammelt und Proben davon auf TLC-Platten analysiert. Die Fraktionen, die das fluoreszierende Lipid enthalten, werden vereint und das Lösungsmittel verdampft. Das Verfahren führt zu ungefähr 2 mg Tetraetherlipid-Rhodamiπ.
Beispiel 4
Herstellung von Lipofektionsmittel
4.1 Leeres Lipofektionsmittel
Für die Herstellung von Lipofektionsmittel werden die Tetraetherlipidderivate A, B oder C verwendet. Zur Bildung von Lipofektionsmittel wird das Tetraetheriipidderivat jeweils in Chloroform/Methanol (1/1 , v/v) gelöst (2 mg/ml). Durch Verdampfen des Lösungsmittels entsteht ein Lipidfilm. Der Lipidfilm wird in Puffer A (150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7,4) bei Raumtemperatur für 48 h hydratisiert (Endkonzentration 0,5-2 mg Lipid/500 μl Puffer A), anschließend in einem Ultraschallbad (Branson 1210) 15 Min beschallt und schließlich 10 Min bei Raumtemperatur mit einer Ultraschallspitze (Branson B15, "cycle mode", Position 40) beschallt. Die Lipidlösung in Puffer A erscheint trüb ohne Aggregate oder erkennbare Präzipitate.
4.2 DNA-Lipofektionsmittelkomplexe
4.2.1 Verfahren
Zum Herstellen von DNA-Lipofektionsmittelkomplexen werden 3-5 μl in Puffer A supen- dierte Lipide (1 mg/ml) in 100 μl serumfreiem Medium gelöst. 1-2 μg DNA (1 mg/ml) werden in 100 μl serumfreiem Medium verdünnt. Die beiden Lösungen werden vorsichtig gemischt und 15 Min bei Raumtemperatur inkubiert, um DNA-Lipidkomplexe zu bilden. Typischerweise treten keine Aggregate bei der Komplexbiidung auf. Vor jeder Transfektion werden 800 μl serumfreies Medium zugesetzt, so daß ein Endvolumen von 1 ml erreicht wird.
4.2.2 Nachweis der Bildung der DNA-Lipofektionsmittelkomplexe
Die Bildung der DNA-Lipofektionsmittelkomplexe wurde fluorometrisch untersucht. Es ist bekannt, daß die Bildung von Komplexen aus DNA und kationischen Lipiden die Bindung von Ethidiumbromid an DNA verhindert (Gershon et al., Biochemistry 32, 7143- 7151 , 1993). Da die Fluoreszenz von Ethidiumbromid-DNA-Kσmplexen der Menge freier DNA in Lösung proportional ist, kann dieses Verfahren verwendet werden, um DNA- Lipidkomplexe zu quantifizieren. Dazu wurden DNA-Lipidkomplexe aus Tetraetheriipidderivat B und pSV-lacZ mit unterschiedlichen Tetraetheriipidderivat: DNA-Verhältnissen in 1 ml 150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7,4, vorgebildet. Anschließend wurde Ethidiumbromid bis zu einer Endkonzentration von 10'7 M zugefügt. Die Fluoreszenz von Ethidi- umbromid-DNA-Komplexen wurde durch Anregen bei 518 nm und Messen der Emission bei 605 nm verfolgt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 gezeigt und weisen daraufhin, daß die Bildung von DNA-Tetraetherlipidderivat-Komplexen bei einem molaren Verhältnis von 1 :1 auftritt.
Die Bildung der Komplexe wurde außerdem unter Verwendung von 1 %-igen Agarosege- leπ gezeigt. In diesem unabhängigen Test wird die Bildung von DNA- Tetraetherlipidderivat-Komplexen durch das Verschwinden freier DNA sichtbar gemacht (Abbildung 3, Spur 4).
Diese Ergebnisse, die mit zwei voneinander unabhängigen Versuchen erhalten worden sind, weisen darauf hin, daß die Bildung von Tetraetherlipidderivat-DNA-Komplexen bei einem molaren Verhältnis von 1 :1 auftritt.
Beispiel 5
Transfektion mit Tetraetherlipidderivat-enthaltendem Lipofektionsmittel
5.1 Transfektion mit pSV-lacZ
Transfektionen werden mit einem pSV-lacZ-Plasmid (Promega) als Reportergenkon- strukt durchgeführt. 1 x 105 BHK (Baby Hamster Kidney)-Zellen werden auf Platten mit 6 Vertiefungen plattiert. Nach 24 h Inkubation bei 37°C in CO2-begaster Atmosphäre erreichen die Zellen eine Dichte von 25-50% und können für die Transfektion eingesetzt werden. Direkt vor der Transfektion werden die Zellen mit 2 ml serumfreiem Medium gewaschen. 1 ml der den DNA-Lipidkomplex enthaltenden Lösung (s. Beispiel 4.2) wird zugesetzt. Nach 5 h wird das die DNA enthaltende Medium durch normales Wachstumsmedium, das 10% Serum enthält, ersetzt. Kürzere Inkubationszeiten (2-4 h) führen ebenfalls zu erfolgreichen Transfektionen.
19 h nach der Transfektion werden die Zellen einmal in PBS gewaschen, mit eiskaltem Methanol (-20°C) fixiert, dreimal mit PBS gewaschen und für 16 h in einer Lösung aus 4 mM Ferrycyanid (Sigma), 1 mM MgCI2, 0,1 % X-gal (Roth) in PBS, pH 7,4 iπkubiert, um die Expression von ß-Galactosidase nachzuweisen.
Die Transformationseffizienz der Tetraetherlipidderivate A, B und C wurde mit den kommerziell erhältlichen Transfektionsmitteln Lipofectin® und Lipofectamin® (Gibco/BRL) verglichen. Die Transfektionseffizienz wurde dabei als Prozentsatz blauer Zellen, bezogen auf die Gesamtzellzahl, angegeben. Der Vergleich zeigte, daß die Transformati- onseffizienz für alle erfiπdungsgemäßen Verbindungen in der gleichen Größenordnung wie für die kommerziellen Agenzien lag.
Unter Verwendung des Plasmides pSV-lacZ wurde ferner das optimale Verhältnis von DNA zu Lipid bestimmt. Dabei wurden die besten Transfektionsergebnisse mit einem molaren Verhältnis von 1:1 DNA/üpid erhalten (Abbildung 4). Das Maximum der ß- Galactosidase-Expression wurde 19 h nach dem Beginn der gemeinsamen Inkubation der Zellen mit den DNA-Lipidkomplex beobachtet. Wie in Abbildung 5 gezeigt wird, betrug unter diesen Bedingungen die Traπsfektionseffizienz 12%, bezogen auf die Gesamtzahl der eingesetzten Zellen.
5.2 Transfektion mit fluoreszierenden Tetraetheriipidderivaten
Eine Fluoreszenz-markierte Lipofektionsmittelsuspension wird hergestellt durch Beschallen von 1 mg einer Mischung aus Tetraetheriipidderivat A, B oder C und Tetraetherlipid- Rhodamin (s. Beispiel 3.3) (100:1 molares Verhältnis) in 1 ml eines Puffers aus 150 mM NaCl, 50 mM Hepes, pH 7,4. Die Lipidkonzeπtrationeπ von Rhodamin-markierten Liposomen oder DNA-Lipidkomplexen reicht von 10-100 μg/ml. Die Zellen werden 70 Min bei 38°C mit den Rhodamin-markierten Lipofektionsmittel inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und anschließend in einem "reverse fluorescent microscope" analysiert.
Die Analyse zeigte eine diffuse Fluoreszenz, die im Zytoplasma der Zellen zu beobachten war (Abbildung 1). Dieses Ergebnis erlaubt die Schlußfolgerung, daß die erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate die Zellmembran durchqueren.
6. Transfektionseffizienz von Mischlipofektionsmittel
In der Literatur ist gezeigt worden (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 7413-7417, 1987), daß durch Mischen von Lipofectin® mit DOPE (Sigma) (1 :1 , w/w) erhöhte Trans- fektionsraten erzielt werden können. Deshalb wurde der Einfluß des Zusatzes verschiedener Lipide zu den erfindungsgemäßenTetraetherlipidderivaten auf die Effizienz der Zelltransfektion untersucht. Im einzelnen wurde zugesetzt: MPL (Gesamtphospholipidfraktion aus Thermoplasma acidophilum), PC (Phosphatidylcholin) und DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin). Dabei wurde beobachtet, daß das Mischen der erfindungsgemäßen Tetraetherlipidderivate A, B bzw. C mit MPL in einem Verhältnis von 1 :1 (w/w) die Transfektionseffizienz nicht beeinträchtigt, während die Mischung der erfiπdungsgemäßen Tetraetherlipidderivate mit MPL bei einem Mischungsverhältnis von 1 :2 (molares Verhältnis Tetraetherlipidderi- vat/MPL) die Transfektionseffizienz stark beeinträchtigt. Eine Mischung aus erfindungsgemäßen Tetraetheriipidderivaten mit DOPE (molares Verhältnis von 1 :1) erhöht die Transfektionseffizienz, während eine Mischung von Tetraetheriipidderivat mit PC (molares Verhältnis von 1 :1) sie erniedrigt.
Aus diesen Versuchen geht hervor, daß DOPE ein vielversprechender Zusatz zum Tetraetheriipidderivat A ist. Die Ergebnisse sind in Abbildung 6 graphisch dargestellt.

Claims

Patentansprüche
Tetraetheriipidderivat der allgemeinen Formel I:
wobei S1 und S2 gleich oder verschieden sein können und jeweils die folgende Bedeutung haben:
Y kann -NR RJ oder -N*R4DR53ΓRÖ bedeuten;
X1 und X2 können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen umfaßt;
R1 bis R6 können gleich oder verschieden sein und sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt: Was- serstoff, verzweigte oder unverzweigte Alkyl-, Alkenyl-, Aralkyl- oder Arylgruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei jeweils einer der Reste R2 bis R6 weiter einen Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle oder einen Liganden für Zelloberflächen-Rezeptoren umfassen kann; und n kann eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 bedeuten,
sowie durch Bildung von Pentazyklen im Tetraethergrundgerüst gebildete Modifikationen davon.
2. Tetraetheriipidderivat nach Anspruch 1 , wobei S1 und S2 gleich sind.
3. Tetraetheriipidderivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei X1 ein Alkylen oder Alkeny- len mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
4. Tetraetheriipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X2 ein Alkylen oder Alkenylen mit 2 bis 10, bevorzugt mit 3 bis 6 Kohleπstoffatomen ist.
5. Tetraetheriipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei n 0 bis 3, bevorzugt 0 ist.
6. Tetraetheriipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Y jeweils -NR2R3 ist und wobei R2 und R3 aus der Gruppe ausgewählt sind, die umfaßt:
-H, -CH3, -C2H5 und -C3H7.
7. Tetraetheriipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Y jeweils -NΘR4R5R6 ist und wobei R4, R5 und Rs gleich oder verschieden sein können und aus der Gruppe ausgewählt sind, die umfaßt:
-H, -CH3, -C2H5 und -C3H7.
8. Tetraetheriipidderivat nach Anspruch 1 mit der Formel A:
wobei S ?11 - = S θ2 : ist und bedeutet
O
C -N - (CH2), -NH (A)
H
9. Tetraetheriipidderivat nach Anspruch 1 mit der Formel B:
wobei S1 = S ist und bedeutet O
N - (CH2)3 - N (CH3 )2 (B) H
10. Tetraetheriipidderivat nach Anspruch 1 mit der Formel C:
wobei S = S ist und bedeutet
O
C - N - (CH2)3 - N ©(,CH3)3 (C)
H
11. Liposom, enthaltend ein oder mehrere Tetraetherlipidderivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Liposom nach Anspruch 11 , enthaltend weitere Doppelschicht-bildende kationische oder neutrale Lipide.
13. Liposom nach Anspruch 12, enthaltend das kationische Lipid DOTMA und/oder DOTAP und/oder DOSPER.
14. Liposom nach einem der Ansprüche 11 bis 13, enthaltend das neutrale Lipid DOPE und/oder Cholesterin.
15. Lipidagglomerat, enthaltend ein oder mehrere Schichten einer oder mehrerer Tetraetherlipidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
16. Lipidagglomerat nach Anspruch 15, enthaltend weitere Doppelschicht-bildende kationische oder neutrale Lipide.
17. Lipidagglomerat nach Anspruch 16, enthaltend das kationische Lipid DOTMA und/oder DOTAP und/oder DOSPER.
18. Lipidagglomerat nach Anspruch 16, enthaltend das neutrale Lipid DOPE und/oder Cholesterin.
19. Liposom nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder Lipidagglomerat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das Gew.-Verhältnis von Tetraetheriipidderivat zu weiteren Lipiden 5:1 bis 1:5 beträgt.
20. Liposom oder Lipidagglomerat nach Anspruch 19, wobei das Gew.-Verhältnis von Tetraetheriipidderivat zu weiterem Lipid zwischen 1 :2 und 1 :0,5, bevorzugt 1 :1 beträgt.
21. Liposom nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder Lipidagglomerat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, enthaltend weiterhin Nukleinsäuremoleküle.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Liposomen nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder Lipidagglomerate nach einem der Ansprüche 15 bis 18 und physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel.
23. In vitro-Transfektionskit. enthaltend Liposomen nach einem der Ansprüche 11 bis 14 und/oder Lipidagglomerate nach einem der Ansprüche 15 bis 18 sowie geeignete Puffer.
24. Verwendung von Liposomen nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder von Lipi- dagglomeratennach einem der Ansprüche 15 bis 18 zum Herstellen eines Medikamentes für die Gentherapie an Säugern.
25. Verwendung von Liposomen nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder eines Lipidagglomerates nach einem der Ansprüche 15 bis 18 zur Transfektion eu- karyoπtischer Zellen in vitro.
EP98946380A 1997-08-22 1998-08-19 Tetraetherlipidderivate und tetraetherlipidderivate enthaltende liposomen und lipidagglomerate sowie deren verwendung Withdrawn EP1005466A1 (de)

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