DE69718924T2

DE69718924T2 - Fusogene liposomzusammensetzung und verfahren

Info

Publication number: DE69718924T2
Application number: DE69718924T
Authority: DE
Inventors: J. Martin; Samuel Zalipsky
Original assignee: Sequus Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2017-10-11
Also published as: WO1998016202A3; US5891468A; DE69718924D1; CA2267904C; WO1998016202A2; BR9712230A; ATE232086T1; AU715063B2; HK1047550A1; ES2191833T3; EP0932391A2; AU4987897A; DK0932391T3; JP2001504093A; CA2267904A1; TW520297B; PT932391E; IL129292A0; EP0932391B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine fusiogene Liposomenzusammensetzung zur Abgabe eines Mittels an das zytoplasmatischen Kompartiment einer Zelle und damit zusammenhängende Verfahren.

Literaturverzeichnis

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Hintergrund der Erfindung

Der therapeutische Nutzen vieler Verbindungen ist eingeschränkt durch die geringe Aufnahme der Verbindung durch die Targetzellen oder durch einen intrazellulären Zerfall der Verbindung nach der Aufnahme. Für einen maximalen therapeutischen Nutzen ist im allgemeinen die Abgabe der Verbindung an das zytoplasmatischen Kompartiment der Zelle erwünscht, in der die Translation der mRNA und die Proteinsynthese stattfinden und in der es eine direkte Verbindung zu dem Kern gibt. Für viele kleine ungeladene Verbindungen kann das Durchdringen der Zellmembran eine relativ effiziente Aufnahme durch die Zelle erlauben. Für eine Vielfalt von größeren und/oder geladenen Verbindungen jedoch, wie zum Beispiel Proteine, Nukleinsäuren und gut wasserlösliche geladene organische Verbindungen, ist die passive Aufnahme durch das Durchdringen der Zellmembran mehr eingeschränkt.
Es wurden mehrere Verfahren zur Verbesserung der Aufnahme solcher Verbindungen in die Zellen vorgeschlagen. Zum Beispiel kann ein Arzneimittel in einer modifizierten oder Proarzneimittelform für den Transport in die Zellen verabreicht werden und dann eine enzymatische Umsetzung in eine aktive Form innerhalb der Zellen erfahren.
Alternativ dazu können die zellulären Prozesse der Phagozytose oder der Endozytose verwendet werden, wobei Arzneimittel-enthaltende Teilchen von den Zellen verschlungen werden. Diese Methode ist jedoch auf bestimmte Zelltypen beschränkt, zum Beispiel ist die Phagozytose auf Zellen der Monozytlinle und auf bestimmte andere myeloide Zellen beschränkt, wie zum Beispiel Neutrophile, und die Endozytose ist auf mesenchymale Zellen beschränkt, wie zum Beispiel vaskuläre endotheliale Zellen und Fibroblasten. Eine weitere Einschränkung dieser Methode liegt darin, dass beim normalen Verlauf der intrazellulären Verarbeitung Teilchen den sauren Endosom/Lysosomkompartimenten und einer Unmenge an zersetzenden Enzymen, einschließlich Proteasen, Lipasen und Nukleasen ausgesetzt werden, was zu einer Zersetzung der therapeutischen Verbindung führt, sofern nicht in das System ein Entkommen vor einer solchen Verarbeitung eingebaut wird.
Eine weitere Methode zur Erhöhung der Arzneimittelaufnahme durch die Zellen betrifft die Verwendung fusiogener Teilchen, die so ausgelegt sind, dass sie mit der Oberflächenmembran einer Targetzelle fusionieren, wobei sie den Teilcheninhalt in das zytoplasmatische Kompartiment der Zelle abgeben. Für diesen Zweck wurden inaktivierte und wiederhergestellte Virusteilchen vorgeschlagen, besonders in der Gentherapie, wo große Nukleinsäurestränge in die Zellen eingeführt werden. Ein weiteres Beispiel sind Virusähnliche Teilchen, die sich aus fusionsfördernden viralen Proteinen zusammensetzen, die in künstliche Lipid-Doppelschichtmembranen eingebettet sind. Jedoch schränken Sicherheitserwägungen und die Ausgaben, die mit dem Wachstum, der Isolierung und Deaktivierung viraler Komponenten zusammenhängen; diese Methoden ein.
Eine weitere Methode ist die Verwendung von Liposomen. Das EP 0 354 855 offenbart Liposomen, die hydrophile Polymere aufweisen, die an ihre Oberfläche über kovalente Bindungen gebunden sind. Die Adsorption von Plasmaproteinen auf den Liposomen wird aufgrund der hydrophilen Polymere verhindert, die sich frei auf der Liposomenoberfläche befinden, mit dem Ergebnis, dass die Agglutination der Liposomen im Plasma verhindert wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfaßt in einem Aspekt eine Liposomenzusammensetzung zur Fusion mit einer Targetmembran einer Zelle, eines Liposoms oder dergleichen. Die Zusammensetzung umfaßt eine Liposomensuspension, welche für das Targeting an die Targetmembran ausgelegt ist. Jedes Liposom enthält ein in die Liposomen eingeschlossenes therapeutisches Mittel. Jedes Liposom ist aus Vesikel-bildenden Lipiden aufgebaut, wobei ein Teil der Lipide mit einem Diblockcopolymer derivatisiert ist, das aus einer hydrophoben Polymerkette, die kovalent an das Lipid gebunden ist, und aus einer hydrophilen Polymerkette aufgebaut ist, wobei die hydrophoben und hydrophilen Ketten durch eine chemisch trennbare Bindung zur Freisetzung der hydrophilen Polymerketten und zum Aussetzen der hydrophoben Polymerketten verbunden sind. Die hydrophoben Polymere sind ursprünglich durch die hydrophile Polymerschicht abgeschirmt und werden dann zur Fusion mit der Targetmembran ausgesetzt, wenn die hydrophile Polymerschicht chemisch freigesetzt wird.
Das hydrophile Polymer und das hydrophobe Polymer bilden ein Diblockcopolymer, in dem die beiden Polymerkomponenten durch eine chemisch trennbare Bindung verbunden sind, wie zum Beispiel eine Disulfidbindung, eine pH-Wert-sensitive Bindung, eine enzymatisch spaltbare Bindung oder eine photochemisch spaltbare Bindung.
Bei Liposomen, die so ausgelegt sind, dass sie eine verlängerte Zeitdauer im Blutkreislauf aufweisen, ist die hydrophile Polymerschicht vorzugsweise aus Polymerketten aus Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglycol oder Polyaspartamid aufgebaut. Die Polymerketten weisen ein bevorzugtes Molekulargewicht von zwischen ungefähr 500-10000 Dalton auf.
Das hydrophobe Polymer ist vorzugsweise eine Kette aus Polypropylenoxid, Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol, Polysulfon, Polyphenylenoxid oder Polytetramethylenether. Die Polymerketten weisen ein bevorzugtes Molekulargewicht von zwischen ungefähr 500-3000 Dalton auf.
Allgemeiner ist das hydrophobe Polymer vorzugsweise ein lineares Polymer, das wirksam ist, die Hämolyse roter Blutkörperchen hervorzurufen, wenn ein wasserlösliches Triblockcopolymer, das die hydrophoben und hydrophilen Polymerketten enthält, die an gegenüberliegenden Enden der hydrophoben Polymerketten über Disulfidbindungen verknüpft sind, mit den Zellen inkubiert wird und das Inkubat mit einem Reduktionsmittel behandelt wird.
Weiterhin kann die Zusammensetzung einen nichtabgeschirmten Liganden umfassen, der an die hydrophile Polymerschicht gebunden ist und der wirksam für die Ligand-spezifische Bindung an ein Rezeptormolekül auf der Oberfläche einer Targetzelle vor dem Freisetzen der hydrophilen Polymerschicht ist. Der nichtabgeschirmte Ligand kann zum Beispiel (i) Folat sein, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorzellen mit Folatrezeptoren auf der Zelloberfläche bestimmt ist, (ii) Pyridoxyl sein, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von virusinfizierten CD4+ Lymphozyten bestimmt ist, oder (iii) Sialyl-Lewisx sein, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung eines entzündeten Bereichs bestimmt ist.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung weiterhin einen an das Liposom gebundenen abgeschirmten Liganden umfassen, der wirksam ist, nur nach der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerschicht an die Oberflächenrezeptormoleküle der Targetzelle zu binden.
In einer entsprechenden Ausführungsform enthalten die Liposomen ein abgeschirmtes kationisches Lipid, das wirksam ist, eine positive Liposomenoberflächenladung zu verleihen, um nur nach der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerschicht die Bindung der Liposomen an Targetzellen zu verstärken.
Das abzugebende Mittel kann ein Polynukleotid sein, das zur Expression eines ausgewählten Proteins in der Lage ist, wenn es durch die Zelle aufgenommen wurde, ein Oligonukleotid oder eine Oligonukleotidanaloges sein, das ausgelegt ist, an eine Sequenz-spezifische Nukleinsäure in der Targetzelle zu binden, oder jedes beliebige andere therapeutische Polymer oder kleine Molekül als therapeutisches oder diagnostisches Mittel sein.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung eine Verwendung der vorstehenden Liposomenzusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments, um eine Verbindung an Targetzellen in einem Patienten abzugeben, umfassend das parenterale Verabreichen der vorstehenden Liposomenzusammensetzung an einen Patienten, dann das Kontaktieren der Liposomen an den Targetzellen mit einem Spaltungsmittel, das wirksam ist, die hydrophilen Polymerketten, die die Oberflächenschicht bilden, freizusetzen, um die hydrophoben Polymere auf der äußeren Liposomenoberfläche zur Wechselwirkung mit den äußeren Zellmembranen der Targetzellen auszusetzen und dadurch die Fusion der Liposomen mit den Targetzellen zu fördern.
In einer allgemeinen Ausführungsform sind die hydrophilen Polymerketten freisetzbar an das Liposom über eine reduzierbare chemische Bindung gebunden und der Schritt des Kontaktierens umfasst das Verabreichen eines Reduktionsmittels, wie zum Beispiel Cystein, Glutathion oder Ascorbat an den Patienten.
In einer anderen allgemeinen Ausführungsform sind die hydrophilen Polymerketten freisetzbar an die Liposome über eine pH-Wert-sensitive chemische Bindung gebunden und der Schritt des Kontaktierens umfaßt das Targeting der Liposomen an eine Stelle, wie zum Beispiel eine solide Tumorstelle, die einen ph-Wert aufweist, der wirksam ist, die Ketten freizusetzen. Für das Tumor-Targeting weisen die Liposomen vorzugsweise Größen mit 0,03- 0,40 um zur Extravasation in einer soliden Tumorregion auf.
Ebenfalls ist ein Verfahren zum Screening eines hydrophoben Polymers für die fusiogene Aktivität mit einer Targetmembran offenbart, das heißt ein zur Verwendung in der Zusammensetzung der Erfindung geeignetes hydrophobes Polymer. Das Verfahren umfaßt die Zugabe eines Triblockcopolymers zu einer Suspension von Targetzellen, das aus einem Segment des zu testenden hydrophoben Polymers und aus einem an jedes Ende des Polymersegments durch eine chemische trennbare Bindung gebundenen hydrophilen Polymersegment aufgebaut ist, das wirksam ist, das hydrophobe Polymersegment in der Suspension zu solubilisieren. Die Suspension wird dann behandelt, um die hydrophilen Polymere freizusetzen, damit die hydrophoben Segmente den Targetzellen ausgesetzt werden. Die Suspension der Zellen, zum Beispiel der roten Blutkörperchen, wird dann bezüglich der Lyse, zum Beispiel der Hämolyse, analysiert.
Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der Erfindung werden besser beim Lesen der nachfolgenden genauen Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den sie begleitenden Zeichungen offenbar.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Abbildung eines Liposoms, das entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung hergestellt wurde;
Die Fig. 2A-2B sind schematische Abbildungen von Diblockcopolymer-Lipidkonjugateri, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind;
Fig. 3 ist eine schematische Abbildung eines Vesikel-bildenden Lipids mit einem daran gebundenen Liganden;
Fig. 4 zeigt ein Reaktionsschema zur Herstellung eines PEG-PPO-PEG Triblockcopolymers;
Fig. 5 ist eine Auftragung, die die Extinktion roter Blutkörperchen bei 480 nm zeigt, die (a) einem mPEG-PPO-mPEG-Triblockcopolmer mit trennbaren Disulfidbindungen und dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT), (b) nur einem mPEG-PPO-mPEG-Triblockcopolymer und (c) nur DTT ausgesetzt wurden;
Die Fig. 6A-6C sind mikrophotographische Aufnahmen der Präparate (a), (b) und (c) in Fig. 5 die phasenkontrastoptisch bei einer 630 fachen Vergrößerung betrachtet wurden, wobei Fig. 6A dem Präparat mit dem mPEG-PPO-mPEG-Triblockcopolymer und DTT (a) entspricht, Fig. 6B dem Präparat nur mit dem mPEG-PPO-mPEG-Triblockcopolymer entspricht (b) und Fig. 6C dem Präparat nur mit DTT entspricht;
Fig. 7 veranschaulicht mehrere -S-S-Bindungen und ihre relative Empfindlichkeit gegenüber einer Spaltung durch ein Nukleophil;
Fig. 8 veranschaulicht ein Reaktionsschema zur Herstellung eines Diblockcopolymer- Lipidkonjugats aus MethoxyPEG und PPO, die durch eine Disulfidbindung kovalent verbunden sind und an einen Distearyllipidanker gebunden sind;
Fig. 9 veranschaulicht ein Reaktionsschema zur Herstellung eines Diblockcopolymer- Lipidkonjugats aus Methoxypolyethylenglycol (mPEG) und Polypropylenoxid (PPO), die durch eine Disulfidbindung kovalent verbunden sind und an das Vesikel-bildende Lipid Distearylphosphatidylethanolamin gebunden sind;
Die Fig. 10A-10B zeigen ein anderes Reaktionsschema zur Herstellung eines Diblockpolymers aus mPEG und PPO, die durch eine Disulfdbindung kovalent verbunden sind und an ein Diacyllipid gebunden sind;
Fig. 11 zeigt eine beispielhafte labile Disulfidbindung, die mPEG- und PPO- Polymersegmente verbindet;
Die Fig. 12A-12B zeigen Reaktionsschemata für die Anlagerung von Folsäure (Fig. 12A) und Pyridoxal (Fig. 12B) an endfunktionalisiertes Polyethylenglycol, das an Distearylphosphatidylethanolamin gebunden ist;
Fig. 13 ist eine mikrophotographische Aufnahme, die die fusiogene Aktivität von Liposomen zeigt, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden und Fluorescein mit den Erythrozytenzellen enthalten; und
Die Fig. 14A-14B sind Auftragungen der relativen Luciferase-einheiten (RLU) pro mg Protein in der Lunge (Fig. 14A) und der Leber (Fig. 14B), nach der in vivo Verabreichung von Liposom/Plasmid-Komplexen an Mäuse, wobei die Liposomen eine äußere Oberflächenschicht von Polyethylenglycol aufwiesen, indem in dem Liposom 2,5 Molprozent kovalent an DSPE (PEG) gebundenes PEG, 1 Molprozent kovalent an DSPE gebundenes PEG und 1 Molprozent PEG, das über eine trennbare Bindung (PEG+R-PEG) an DSPE gebunden war oder 2,5 Molprozent PEG, das über eine trennbare Bindung (R-PEG) an DSPE gebunden war, enthalten waren.

Genaue Beschreibung der Erfindung

1. Liposomenzusammensetzung

Die vorliegende Erfindung umfasst eine fusiogene Liposomenzusammensetzung zur Fusion mit einer Targetmembran. Die Targetmembran, wie sie hierin verwendet ist, bezieht sich auf eine Lipid-Doppelschichtmembran, zum Beispiel eine Lipid-Doppelschichtmembran einer biologischen Zelle, ein Liposom oder eine künstliche planare Membran. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die fusiogene Liposomenzusammensetzung der Erfindung für das Abgeben einer in dem Liposom eingeschlossenen Verbindung an das Cytoplasmakompartiment einer biologischen Targetzelle verwendet.
Die Zusammensetzung umfasst Liposomen, typischerweise in Form einer Suspension, vom Typ, der nun entsprechend Fig. 1 beschrieben wird, die ein repräsentatives Liposom 10 zeigt. Das Liposom ist aus Vesikel-bildenden Lipiden aufgebaut, wie zum Beispiel die Lipide 12, die jeweils Kopfgruppen, wie zum Beispiel die Gruppen 12a und typischerweise zwei hydrophobe Diacyllipidketten, wie in 12b aufgezeigt ist, enthalten. Beispielhafte Liposomen- bildende Lipide werden nachstehend angegeben.
Das Liposom weist eine äußere Oberflächenschicht 14 aus hydrophilen Polymerketten auf, wie zum Beispiel die Ketten 16, 18, die vorzugsweise dicht gepackt sind zur Bildung einer Bürstenähnlichen Schicht, die wirksam ist, die Oberflächenkomponenten des Liposoms abzuschirmen wie nachstehend beschrieben ist. Entsprechend einer wichtigen Eigenschaft der Erfindung sind die hydrophilen Polymerketten an die Liposomenlipide oder an hydrophobe Ketten gebunden, die an Liposomenlipide durch chemisch trennbare Bindungen gebunden sind - das heißt, chemische kovalente Bindungen, die durch ein geeignetes Spaltungsmittel getrennt werden können, wie zum Beispiel ein Reduktionsmittel, ein erniedrigter oder erhöhter pH-Wert, Hydrolase oder ein photolytisches Stimulans, wie nachstehend beschrieben ist.
Wie in Fig. 1 und im Detail in Fig. 2A gezeigt ist bildet die hydrophile Polymerkette 16 das abgewandte Ende eines Diblockcopolymer-Lipidkonjugats 20, das eine Vesikel-bildende Lipideinheit 20a und eine Diblockcopolymereinheit 20b aufweist. Die Diblockcopolymereinheit 20b besteht wiederum aus einer hydrophoben Kette 22, die mit ihrem nächstgelegenen Ende kovalent an die polare Kopfgruppe der Lipideinheit 20a gebunden ist. Die hydrophobe Kette 22 ist mit ihrem abgewandten Ende an die hydrophile Polymerkette 16 durch eine chemisch trennbare Bindung 24 gebunden.
Im Gegensatz dazu ist die hydrophile Kette 18 direkt mit der polaren Kopfgruppe eines Vesikel-bildenden Lipids 26 durch eine chemisch trennbare Bindung 28 verbunden.
Wie vorstehend aufgezeigt wurde, sind hydrophile Polymerketten, wie zum Beispiel das Segment 16 im Konjugat 20, im Liposom 10 als Teil der Diblockpolymereinheit eines Vesikel-bildenden Lipids auf der äußeren Liposomenoberfläche enthalten. Es ist klar, dass das hydrophile Polymersegment in einem Diblockkonjugat eine Erhöhung der Wasserlöslichkeit der angebundenen hydrophoben Kette bewirkt, um die Destabilisierung der Liposomenmembran, durch eine Partitionierung der hydrophoben Ketten in die doppelschichtige Liposomenregion, zu verhindern. Wie nachstehend erörtert wird, ist eine solche Destabilisierung vorteilhaft zur Förderung der Liposomen/Zellmembranfusion, sie ist jedoch vor dem Fusionsereignis unerwünscht, das heißt während der Liposomenlagerung, der Verabreichung und der biologischen Ausbreitung zur Targetstelle. Die Typen und Molekulargewichte der zum Erreichen dieser Effekte geeigneten hydrophilen und hydrophoben Segmente werden nachstehend diskutiert.
Zusätzlich zu ihrer Funktion des "Solubilisierens" der hydrophoben Ketten und des Abschirmens der hydrophoben Ketten von Wechselwirkungen mit anderen Doppelschichtmembranen, weisen die hydrophilen Ketten ebenfalls vorzugsweise eine Oberflächendichte auf, die ausreicht, eine molekulare Barriere zu erzeugen, die im wesentlichen wirksam ist, die Wechselwirkung von Serumproteinen mit der Liposomenoberfläche zu verhindern. Damit ist die Schicht der hydrophilen Ketten wirksam, um die Zirkulationszeit der Liposomen im Blutstrom auf Zeitdauern bis zu mehreren Stunden und mehreren Tagen zu verlängern. In der letztgenannten Ausführungsform sind die hydrophilen Ketten vorzugsweise in der äußeren Lipidschicht der Liposomen, in einer Menge vorhanden, die ungefähr zwischen 1-20 Molprozent der Liposomenoberflächenlipide entspricht, wobei Polymere mit niedrigerem Molekulargewicht, zum Beispiel 500 Dalton, bei einer höheren Dichte, zum Beispiel 20 Molprozent, vorhanden sind und Polymerketten mit höherem Molekulargewicht, zum Beispiel Ketten von 10000 Dalton, bei einer niedrigeren Dichte, zum Beispiel 1-5 Molprozent, vorhanden sind.
Der prozentuale Anteil der hydrophoben Ketten, das heißt der prozentuale Anteil der Diblocklipidkonjugate in den Liposomen, liegt typischerweise im Bereich zwischen ungefähr 5-100% bezüglich der gesamten Oberflächenlipide, die konjugierte hydrophile Polymere enthalten. Daher würde zum Beispiel in einer Liposomenformulierung, die 5 Molprozent an hydrophilen Polymer-Liposomenoberflächenlipiden und 50% an Diblocklipidkonjugaten enthält, das hydrophobe Polymer 50% · 5%, oder 2,5 Molprozent der Oberflächenlipide ausmachen.
Weiterhin kann das Liposom 10 nichtabgeschirmte Oberflächenliganden umfassen, wie zum Beispiel Ligand 30, für das Targeting der Liposomen an eine spezifische Targetmembran - zum Beispiel an eine spezifische Geweberegion oder einen Zelltyp oder an ein Liposom oder planare Membran, die die passenden Oberflächenrezeptormoleküle trägt. Wie am besten in Fig. 2B ersichtlich ist, wird das Ligandmolekül 30 am abgewandten Ende einer hydrophilen Polymerkette 32 getragen, wie zum Beispiel die Kette in einem Diblockcopolymer- Lipidkonjugat 34 des in Fig. 1 beschriebenen Typs. Mittel zum Konjugieren des Liganden an das entfernte Ende einer hydrophilen Polymerkette sind gut bekannt. Das Anbringen eines Liganden an oder nahe an den entfernten Enden der Polymerketten, das heißt nicht durch die hydrophile Polymerschicht abgeschirmt, erlaubt dem Liganden mit einer Targetzelle zu wechselwirken, die einen Ligand-spezifischen Oberflächenrezeptor enthält, bevor die hydrophilen Ketten von den Liposomen entfernt werden.
Zusätzlich zu den eben beschriebenen Liposomenkomponenten können die Liposomen weiterhin eine oder mehrere Liposomenoberflächenkomponenten umfassen, die von der Wechselwirkung mit Targetzellen bis nach der Entfernung der hydrophilen Polymere abgeschirmt sind. In einer allgemeinen Ausführungsform und in Bezug auf die Fig. 1 und 3 ist die abgeschirmte Komponente ein Ligand, wie zum Beispiel Ligand 36, der an die polare Kopfgruppe 38 eines Vesikel-bildenden Lipids 40 gekoppelt ist. Der Zweck des Liganden besteht darin, spezifisch mit einem Zellrezeptor nach der Entfernung der hydrophilen Polymerschicht zu binden, um das Liposom in die Nähe der Zellmembran zu drängen, und um so die Wechselwirkung der hydrophoben Polymerketten auf den Liposomen mit der Lipid- Doppelschicht der Targetzelle zu verstärken.
Die abgeschirmte Oberflächenkomponente kann alternativ dazu oder zusätzlich Vesikel- bildende Lipide mit positiv geladenen polaren Gruppen umfassen, wie bei 42 in Fig. 1 aufgezeigt wird. Die positive Oberflächenladung auf der Oberfläche der Liposomen wird durch die hydrophile Schicht während der biologischen Ausbreitung der Liposomen zur Targetstelle abgeschirmt. Nach der Entfernung der hydrophilen Schicht bewirkt die elektrostatische Wechselwirkung zwischen der positiven Liposomenoberflächenladung und den negativ geladenen Targetzellen, dass sich die Liposomen zu einem intensiveren Kontakt mit der Zelle nähern, um die durch die hydrophoben Polymerketten vermittelte Fusion zu fördern.
Schließlich wird das Liposom hergestellt, um ein oder mehrere therapeutische oder diagnostische Mittel zu beinhalten, die an den Ort der Targetzelle abgegeben werden sollen. Entsprechend der Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden therapeutische oder diagnostische Mittel, Verbindung und Arzneimittel untereinander austauschbar verwendet. Das Mittel kann, abhängig von der Art des Mittels, in dem inneren wässrigen Kompartiment des Liposoms oder in der Lipid-Doppelschicht eingeschlossen sein. Beispielhafte therapeutische Mittel sind nachstehend beschrieben.

A. Vesikel-bildende Lipidkomponente

Die Liposomenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung besteht hauptsächlich aus Vesikel-bildenden Lipiden. Solche ein Vesikel-bildendes Lipid ist eines, das (a) sich spontan zu Doppelschichtvesikeln in Wasser formen kann, wie anhand der Phospholipide veranschaulicht wurde, oder (b) das stabil in Lipid-Doppelschichten eingeschlossen ist, wobei dessen hydrophobe Einheit mit der inneren hydrophoben Region der Doppelschichtmembran in Kontakt steht und dessen Kopfgruppeneinheit zur äußeren polaren Oberfläche der Membran gerichtet ist.
Die Vesikel-bildenden Lipide dieses Typs sind vorzugsweise solche, die zwei Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acylketten, und eine entweder polare oder unpolare Kopfgruppe aufweisen. Es gibt eine Vielfalt synthetischer Vesikel-bildender Lipide und natürlich vorkommender Vesikel-bildender Lipide, umfassend die Phospholipide, wie zum Beispiel Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidsäure, Phosphatidylinositol und Sphingomyelin, wobei die zwei Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge von zwischen ungefähr 14-22 Kohlenstoffatome aufweisen und variierende Grade der Ungesättigtheit aufweisen. Die vorstehend beschriebenen Lipide und Phospholipide, deren Acylketten variierende Sättigungsgrade aufweisen, sind kommerziell erhältlich oder können entsprechend veröffentlichten Verfahren hergestellt werden. Andere geeignete Lipide umfassen Glycolipide und Sterole, wie zum Beispiel Cholesterol.
Bevorzugte Diacylkettenlipide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, umfassen Diacylglycerol, Phosphatidylethanolamin (PE), Diacylaminopropandiole, wie zum Beispiel Disteroylaminopropandiol (DS) und Phosphatidylglycerol (PG). Diese Lipide werden vorzugsweise als das Vesikel-bildende Lipid, die Hauptkomponente des Liposoms, verwendet und in den Diblockpolymer-Lipidkonjugaten und Lipiden mit direkt verbundenen hydrophilen Polymerketten verwendet, die zusammen vorzugsweise in der äußeren Liposomenschicht mit einem Molverhältnis zwischen ungefähr 1-20 Molprozent enthalten sind.
Zusätzlich wird das Vesikel-bildende Lipid ausgewählt, um einen festgesetzten Grad der Fluidität oder Starrheit zu erreichen, zur Kontrolle der Stabilität des Liposoms im Serum und zur Kontrolle der Freisetzungsrate des in dem Liposom eingeschlossenen Mittels. Die Starrheit des Liposoms, so wie sie durch das Vesikel-bildende Lipid bestimmt wird, kann ebenfalls eine Rolle in der Fusion des Liposoms an eine Targetzelle spielen, wie beschrieben wird.
Liposomen mit einer starreren Lipid-Doppelschicht oder einer flüssigkristallinen Doppelschicht, können durch Einbauen eines relativ starren Lipids erreicht werden, zum Beispiel eines Lipids, das eine relativ hohe Phasenübergangstemperatur, beispielsweise bis zu 60ºC aufweist. Starre, das heißt gesättigte Lipide tragen zu einer größeren Starrheit der Membran in der Lipid-Doppelschicht bei. Von anderen Lipidkomponenten, wie zum Beispiel von Cholesterol, ist ebenfalls bekannt, dass sie zur Starrheit der Membran in Lipid- Doppelschichtstrukturen beitragen.
Andererseits wird die Lipidfluidität durch Einbau eines relativ fluiden Lipids erreicht, typischerweise eines Lipids, das eine Lipidphase mit einer relativ niedrigen Übergangstemperatur von der flüssigen zur flüssigkristallinen Phase aufweist, zum Beispiel bei oder unterhalb der Raumtemperatur.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Liposomen mit einem relativ starren Lipid hergestellt, um der Lipid-Doppelschicht Starrheit zu verleihen. In dieser Ausführungsform weisen die Lipide, die die Liposomen bilden, eine Phasenübergangstemperatur zwischen ungefähr 37-70ºC auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Vesikel-bildende Lipid Distearylphosphatidylcholin (DSPC), das eine Phasenübergangstemperatur von 62ºC aufweist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Lipide, die das Doppelschichtvesikel, das heißt das Liposom, bilden dahingehend wirksam, der Liposomenoberfläche eine positive Ladung zu verleihen. Solche Lipide umfassen diejenigen, die typischerweise als kationische Lipide bezeichnet werden und die eine lipophile Einheit aufweisen, wie zum Beispiel ein Sterol, eine Acyl- oder Diacylkette und bei denen das Lipid eine positive Nettogesamtladung aufweist. Vorzugsweise trägt die Kopfgruppe des Lipids die positive Ladung. Exemplarische kationische Lipide umfassen 1,2-Diolyloxy-3- (trimethylamino)propan (DOTAP); N-[1-(2,3,-Ditetradecyloxy)propyl]-N,N-Dimethyl-N- hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE); N-[1-(2,3,-Diolyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N- hydroxyethylammoniumbromid (DORfE); N-[1-(2,3-Diolyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammoniumchlorid (DOTMA); 3β[N-(N',N'- Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol) und Dimethyldioctadecylammonium (DDAB).
Das kationische Vesikel-bildende Lipid kann ebenfalls ein neutrales Lipid sein, wie zum Beispiel Dioloylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder ein amphipatisches Lipid, wie zum Beispiel ein Phospholipid, das mit einem kationischen Lipid, wie zum Beispiel Polylysin oder anderen Polyaminlipiden, derivatisiert ist. Zum Beispiel kann das neutrale Lipid (DOPE) mit Polylysin unter Bildung eines kationischen Lipids derivatisiert sein.

B. Freisetzbare Polymerschicht

Wie vorstehend beschrieben ist, wird die hydrophile Polymerschicht durch Einfügen von Vesikel-bildenden Lipidkonjugaten, zumindest in der äußeren Lipidschicht der Liposome, die ein Diblockcopolymerkonjugat von dem in Fig. 2A gezeigten Typ und wahlweise hydrophile. Polymere enthalten, die direkt mit der Kopfgruppe eines Vesikel-bildenden Lipids verbunden sind, wie in Fig. 3 gezeigt ist.
Geeignete hydrophile Polymere zur Verwendung in den Konjugaten, wobei die Polymeres ebenfalls dazu bestimmt sind, die Liposomenzirkulationszeitdauer zu verlängern, umfassen Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglycol und Polyaspartamid.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophile Polymer Polyethylenglycol, vorzugsweise als PEG Kette mit einem Molekulargewicht zwischen 500-10000 Dalton, typischerweise zwischen 1000-5000 Dalton.
Die durch die hydrophilen Polymerketten zur Verfügung gestellte Oberflächenschicht sorgt für kolloidale Stabilität und dient bei einer ausreichenden Polymer-Oberflächendichte zum Schutz der Liposomen vor der Aufnahme durch das reticuloendotheliale System, was für eine längere Lebensdauer der Liposomen im Blutkreislauf zum Erreichen der Targetzellen sorgt. Das Ausmaß der Verlängerung der Zeitdauer im Blutkreislauf ist vorzugsweise ein mehrfaches von derjenigen, die bei Abwesenheit der Polymerschicht erreicht wird, wie es im U.S. Patent Nr. 5,013,556, bei dem wir Miteigentümer sind, beschrieben ist. Verfahren zur Herstellung von Diblock- und direkt verbundenen Lipid-hydrophile Polymerkonjugaten werden nachstehend erörtert.

C. Hydrophobes Polymer

Wie vorstehend beschrieben, umfassen die fusiogenen Liposomen ein hydrophobes Polymer zur Förderung der Fusion zwischen dem Liposom und der Targetzellmembran. Das hydrophobe Polymer ist in den Liposomen als Teil des Diblockcopolymer-Lipidkonjugats enthalten und ist direkt an die Kopfgruppe eines Vesikel-bildenden Lipids gebunden, wie zum Beispiel ein Diacylkettenlipid, wie nachstehend in Bezug auf die Fig. 8-10 (Beispiele 2-4) beschrieben ist.
Beispielhafte hydrophobe Polymere, die zur Verwendung in dem Blockcopolymer des Diblockcopolymer-Lipidkonjugats geeignet sind, umfassen Polypropylenoxid, Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol, Polysulfon, Polyphenylenoxid und Polytetramethylenether. Das hydrophobe Polymer weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von zwischen 100-5000 Dalton, bevorzugter zwischen 500-3000 Dalton auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophobe Polymer Polypropylenoxid (PPO) mit einem Molekulargewicht zwischen 500-3000 Dalton:
Ein Verfahren zur Bestimmung der hydrophoben Polymere und der Molekulargewichte, die zur Verwendung in den hierin beschriebenen fusiogenen Liposomen geeignet sind, umfaßt einen anderen Aspekt der Erfindung. Bei diesem Verfahren wird die fusiogene Aktivität eines ausgewählten hydrophoben Polymers mit einer Targetmembran bestimmt, indem ein hydrophiles Polymersegment an mindestens ein Ende und vorzugsweise an jedes Ende des hydrophoben Polymers gebunden wird. Die hydrophilen Polymersegmente werden an die hydrophoben Segmentenden durch eine trennbare Bindung gebunden, wie es nachstehend beschrieben ist. Das Triblockcopolymer wird zu einer Suspension von Targetzellen gegeben, zum Beispiel zu einer Suspension von Erythrozyten. Die hydrophilen Polymersegmente werden von den hydrophoben Segmenten durch Spaltung der trennbaren Bindung freigesetzt, wobei die hydrophoben Segmente der äußeren Membran der Targetzellen ausgesetzt werden. Die Targetzellen werden dann bezüglich der Lyse, zum Beispiel der Hämolyse von Erythrozyten, analysiert.
Beispiel 1 beschreibt die Herstellung eines Triblockcopolymers zur Bestimmung der fusiogenen Aktivität eines hydrophoben Polymers. Wie in Beispiel 1 dargelegt und in Fig. 4 gezeigt ist, ist ein Triblockcopolyrner aus PPO und PEG aufgebaut und wird hergestellt, indem zuerst ein intermediäres mPEG-DTP-OSu (Verbindung III) durch Reaktion von Methoxypoly(ethylenglycol)amin (Verbindung I) mit einem Überschuß an Dithiobis(succinimidylpropionat) (DTSP; Verbindung 1I), gelöst in Dimethylformamid (DMF) gebildet wird. PPO-Diamin (Verbindung IV) wird mit einem geringen Überschuß an mPEG-DTP-OSu (Verbindung III) unter Bildung eines Di-PEGylierten PPO-Produkts (Verbindung V) umgesetzt, zum Beispiel mPEG-PPO-mPEG, bei dem die Polymerblöcke über spaltbare Disulfidbindungen verbunden sind.
Dieses Triblockcopolymer wurde, wie in Beispiel 1C beschrieben ist, auf die Fusionsfördernde Aktivität getestet, indem das Triblockcopolymer in Salzlösung solubilisiert wurde und es zu einer Suspension von roten Blutkörperchen gegeben wurde. Bei einem Teil der Präparate wurde Dithiothreitol (DTT) zur Reduktion der Disulfidbindungen zugegeben, wobei die hydrophilen Polymersegmente freigesetzt wurden und das hydrophobe Polymer den roten Blutkörperchen ausgesetzt wurde. Als Kontrollen wurde DTT einigen der Präparate nicht zugegeben und in einem anderen Präparat wurde das Triblockcopolymer nicht zu den Zellen gegeben, jedoch waren die Zellen DTT ausgesetzt. Alle Proben wurden inkubiert und die hämolytische Aktivität von PPO wurde durch die Analyse der überstehenden Flüssigkeit bezüglich der Extinktion bei 480 nm und durch die phasenkontrastoptische mikroskopische Untersuchung der Zellen bestimmt.
Die Extinktionswerte bei 480 nm wurden für die Präparate, die ein Triblockcopolymer mit 0,78 mg/mL enthielten; und für das Kontrollpräparat gemessen und sind in Fig. 5 gezeigt, in der Block (a) die Extinktion für Proben, die das Triblockcopolymer plus DTT enthalten, zeigt, Block (b) die Extinktion für die Proben, die nur das Triblockcopolymer enthalten, zeigt und Block (c) die Extinktion für das Kontrollpräparat (Zellen plus DTT) zeigt. Mikrophotographische Aufnahmen für die drei Präparate sind in den Fig. 6A-6C gezeigt, wobei Fig. 6A Block (a) aus Fig. 5 entspricht und die Fig. 6B und 6C den Blöcken (b) und (c) entsprechen:
Die Extinktionsdaten und die mikrophotographischen Aufnahmen weisen nur in dem Präparat auf eine offensichtliche Zellyse hin, das das gegenüber DTT ausgesetzte Triblockcopolymer enthielt, bei dem mehr als 80% der Zellen lysierten, wie durch die dunklen transparenten Körper in der mikrophotographischen Aufnahme offensichtlich ist (intakte Zellen sind in den mikrophotographischen Aufnahmen als helle Körper sichtbar, siehe die Kontrolle Fig. 6C). Fig. 6B entspricht dem Präparat, das die nur mit dem Triblockcopolymer inkubierten roten Blutkörperchen ohne DTT enthält und zeigt keinen Beweis für die Zellyse. Das Präparat der roten Blutkörperchen nur in Gegenwart von DTT, Fig. 6C, zeigt keine Zellyse, wie durch keine effektive Extinktion und durch sichtbar intakte Zellen offensichtlich ist.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Zugabe von DTT zu dem Triblockcopolymer die Disulfidbindungen zwischen dem PEG und PPO spaltete, wobei freies PPO freigesetzt wurde. Das freie PPO griff die nahe gelegenen Zellmembranen der röten Blutkörperchen an und führte zur Hämolyse. DTT alleine zeigte keine Wirkung auf die Zellen und verursachte keine Zellyse. Weiterhin weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass PPO&sub2;&sub0;&sub0;&sub0; als ein hydrophobes Polymer wirksam ist, die Fusion zwischen den Liposomen und einer Zelle zu fördern und zur Verwendung in dem Diblockcopolymer-Lipidkonjugat der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
Es ist klar, dass die Targetzellen biologische Zellen sein können, wie zum Beispiel Erythrozyten, Liposome oder planare künstliche Membranen. Die Liposomen können ein eingekapseltes Fluorophor oder ein anderes Material aufweisen, das für die auf die Lyse des Liposoms folgende Analyse geeignet ist.
Beim Screening Verfahren kann die trennbare Bindung eine chemisch trennbare Bindung sein, eine pH-Wert-sensitive Bindung, eine lichtempfindliche Bindung oder eine wärmeempfindliche Bindung. Die Bindung wird durch Aussetzen gegenüber dem geeignetem Stimulans gespalten, wie zum Beispiel einem chemischen Reduktionsmittel, Wärme oder einer Veränderung des pH-Werts oder des Lichts.
Es ist klar, dass jedes hydrophobe Polymer, wie zum Beispiel die vorstehend aufgelisteten, trennbar an ein hydrophiles Polymer durch eine geeignete Endgruppenchemie gebunden werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen ist das hydrophobe Polymer ein lineares Polymersegment aus Polypropylenoxid und das hydrophile Polymer ist Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht zwischen 1000-5000 Dalton.
Die Aktivität der hydrophoben Polymere und der Effekt des Molekulargewichts werden durch dieses Verfahren einfach gescreent. Hydrophobe Polymere mit einer hohen hämolytischen Aktivität fördern die Fusion und sind für die Verwendung in dem Diblockcopolymer- Lipidkonjugat der Erfindung geeignet.

D. Trennbare Chemische Bindungen

Wie vorstehend beschrieben, umfassen die Liposomen der vorliegenden Erfindung eine äußere Oberflächenschicht von freisetzbaren hydrophilen Polymerketten. Das heißt, dass die hydrophilen Polymerketten trennbar an das Liposom über eine spaltbare chemische Bindung gebunden sind.
Solche chemischen Bindungen umfassen diejenigen, die unter selektiven physiologischen Bedingungen gespalten werden können, wie zum Beispiel in Gegenwart von Enzymen oder Reduktionsmitteln. Zum Beispiel werden Ester- oder Peptidbindungen durch Hydrolasen, wie zum Beispiel Esterasen oder Peptidasen gespalten und Disulfidbindungen durch Reduktionsmittel gespalten, wie zum Beispiel durch Glutathion, Cystein oder Ascorbat, die normalerweise im Plasma oder intrazellulär vorhanden sind oder durch dieselben Mittel, die in das Plasma beispielsweise durch Einspritzen eingeführt wurden. Andere trennbare Bindungen umfassen pH-Wert-sensitive Bindungen und Bindungen, die durch Aussetzen gegenüber Licht oder Wärme gespalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die hydrophilen Polymerketten an das Liposom durch pH-Wert-sensitive Bindungen gebunden und die Liposomen werden auf eine Stelle mit einem pH-Wert gerichtet, der wirksam ist, die Bindung zu spalten und die hydrophilen Ketten freizusetzen, wie zum Beispiel eine Tumorregion.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die spaltbare Bindung eine Disulfidbindung, die sich hierin allgemein auf Schwefel-enthaltende Bindungen beziehen soll, wie zum Beispiel diejenigen, die in Fig. 7 gezeigt sind. Die Schwefel-enthaltenden Bindungen werden zum Erreichen eines ausgewählten Grades an Labilität synthetisiert, wie in der Figur aufgezeigt ist, und umfassen eine Disulfldbindung, eine gemischte Sulfld-Sulfonbindung und eine Sulfid-Sulfoxidbindung. Von diesen drei Bindungen ist die Disulfldbindung am geringsten gegenüber Thiolyse anfällig und die Sulfld-Sulfon- (Thiosulfonatbindung) Bindung ist am anfälligsten.
Solche Bindungen sind nützlich, um die Freisetzungsrate des hydrophilen Polymersegments von der Liposomenoberfläche passend zu machen. Zum Beispiel wird eine sehr labile Disulfidbindung für Liposomen bevorzugt, die auf Blutkörperchen oder endotheliale Zellen gerichtet sind, da diese Zellen leicht zugänglich sind und eine kürzere Lebensdauer der Liposomen im Blutkreislauf benötigt wird. Im anderen extremen Fall wird eine lange dauerhafte, kräftige Disulfidbindung bevorzugt, wenn das liposomale Target ein Tumorgewebe, Entzündungs- oder Infektionsorte, Haut oder andere Organe und peripherale lymphatische Gewebe sind. In diesen Fällen wird für die Liposomen im allgemeinen eine längere Lebensdauer der Liposomen im Blutkreislauf benötigt, um das gewünschte Target zu erreichen.
Die spaltbare Bindung, die die hydrophilen Polymerketten an das Liposom bindet, wird in vivo typischerweise als Ergebnis eines Umgebungswechsels gespalten, zum Beispiel wenn die Liposomen einen spezifischen Ort mit einem etwas geringeren pH-Wert erreichen, wie zum Beispiel eine Tumorgeweberegion oder einen Ort mit reduzierenden Bedingungen, wie zum Beispiel ein hypoxischer Tumor. Reduzierende in vivo Bedingungen können ebenfalls durch Verabreichung eines Reduktionsmittels bewirkt werden, wie zum Beispiel Ascorbat, Cystein oder Glutathion. Die spaltbare Bindung kann auch als Reaktion zu einem äußeren Stimulans, wie zum Beispiel Licht oder Wärme, gebrochen werden.
In nachstehend beschriebenen Untersuchungen zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung wurden Liposomen mit einer abtrennbaren Oberflächenschicht aus Polyethylenglycol hergestellt, wobei die Polyethylenglycolketten durch eine labile Disulfldbindung an das Liposom gebunden sind. Die Liposomen wurden zusammen mit einem Reduktionsmittel Mäusen verabreicht, um die Freisetzung der Polymerketten zu bewirken. Die Gewebeanalyse der Mäuselungen und -leber wies darauf hin, dass die hydrophile Polymerschicht zum Erreichen einer Retention der Liposomen in diesen Organen freigesetzt wurde.

E. Ligandenmoleküle

Wie vorstehend bemerkt wurde, können die Liposomen der Erfindung einen nichtabgeschirmten (der Oberfläche ausgesetzten) Liganden umfassen, der wirksam ist, an spezifische Zelloberflächenrezeptoren auf der Targetzellmembran zu binden. Die Ligandmoleküle werden auf den hydrophilen Polyrrierketten mitgeführt, die an dem Liposom durch kovalente Bindung an ein Diacyllipid verankert sind. Die hydrophilen Polymerketten können kovalent an ein Liposomen-gebundenes Lipid durch eine konventionelle Bindung gebunden sein, zum Beispiel irreversibel oder durch eine chemisch trennbare Bindung gebunden, wie zum Beispiel solche, die vorstehend beschrieben sind.
Beispiele von Liganden, die zur Verwendung beim Targeting der Liposomen der vorliegenden Erfindung an spezifische Zelltypen geeignet sind, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1 Ligand-Rezeptor Paare und zugehörige Targetzelle
In einer Ausführungsform der Erfindung ist ein Folatligand an das abgewandte Ende eines PEG-derivatisierten Vesikel-bildenden Lipids, zum Beispiel DSPE, gebunden. Der Folatligand ist wirksam an Folatrezeptoren auf epithelialen Zellen zu binden, um ein eingeschlossenes therapeutisches Mittel an die Targetzelle zu verabreichen, zum Beispiel um ein neoplastisches Mittel zur Behandlung epithelialer Karzinome zu verabreichen.
In einer anderen Ausführungsform ist Sialyl-Lewisx an PEG-DSPE gebunden und in der Liposomenzusammensetzung enthalten, um die Liposomen auf Entzündungsorte, spezifischer auf ELAM-1 exprimierende Zellen zu richten. Die Herstellung von Sialyl-Lewis"-PEG- DSPE-Konjugat wurde beschrieben (DeFrees, 1996).
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Pyridoxylligand, umfassend Pyridoxal, Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal 5'-phosphat und N-(4'-Pyridoxyl)amine, an ein PEG-DSPE-Konjugat gebunden, um die Liposomen auf CD4-Rezeptoren zu richten.
Nachstehend werden synthetische Reaktionsschemata zur Herstellung dieser Ligandkonjugate beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform ist die Targetmembran ein Liposom und verschiedene Rezeptoren können zur Fusion der Liposomen der vorliegenden Erfindung in das Targetliposom eingbaut werden.

II. Liposomenherstellung

A. Herstellung einer abtrennbaren Polymerschicht

Wie vorstehend beschrieben, umfassen die Liposomen in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine chemisch abtrennbare Schicht hydrophiler Polymerketten, wobei die, die Schicht aufbauenden Polymerketten durch eine chemisch trennbare Bindung in einem Diblockcopolymerkonjugat und wahlweise durch eine an dem polaren Ende eines Vesikelbildenden Lipids trennbare Bindung gebunden sind.
In Untersuchungen, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt worden sind, wurden Diblockcopolymer-Lipidkonjugate hergestellt, wobei das Diblockpolymer aus Polypropylenoxid (PPO) und Methoxy(polyethylenglycol) (mPEG) zusammengesetzt war, die durch eine aliphatische Disulfidbindung verknüpft waren und durch den PPO-Block an Distearoyl oder an Distearylphosphatidylethanolamin (DSPE) gebunden war. Die Herstellung dieser Konjugate wird in den Beispielen 2, beziehungsweise 3 beschrieben.
Wie in Beispiel 2 fortgeführt und in Fig. 8 veranschaulicht wird, wurde in Kaliumtetraborattetrahydrat gelöstes Cystamindihydrochlorid (Verbindung VII) mit α- (Imidazol-1-yl)carbonyl-ω-methoxy-poly(ethylenoxid) (Verbindung VI, hergestellt nach der Beschreibung bei Beauchamp, et al., 1983) gemischt und die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur während vier Stunden gerührt. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Lösung auf einen pH-Wert von 1 mit 6 N HCl eingestellt und dann Natriumchlorid bis zur Sättigungsgrenze hinzugefügt. Die wässrige Lösung wurde mit Chloroform extrahiert, die organischen Extrakte vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft und das resultierende farblose Gel in Ethylacetat gelöst. Langsame Zugabe von Diethylether ergab einen weißen Niederschlag, α- [2-Aminoethyldithio-N-ethylcarbamoyl-ω-methoxy-poly(ethylenoxid)hydrochlorid (Verbindung VIII).
Unter fortlaufender Bezugnahme auf Fig. 8 wurde α-ω-Bis(4-Nitrophenoylcarbonat)- poly(propylenoxid) (Verbindung IX) nach der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellt und mit Verbindung VIII unter Gegenwart von TEA nach der Beschreibung in Beispiel 2D umgesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten zeigte die TLC Analyse einen vollständigen Verbrauch der Verbindung VIII an und deshalb die Bildung von mPEG-S-S-PPO- Nitrophenylcarbonat (Verbindung X) als Hauptprodukt und mPEG-S-S-PPO-S-S-mPEG als ein Nebenprodukt an. Die Mischung wurde mit Aminopropandiol behandelt. Nach einer weiteren Reaktionszeit unter Stickstoff wurde das Lösungsmittel verdampft und der gelbe Rückstand einer Säulenchromatographie zum Eluieren von mPEG-S-S-PPO- Aminopropandiol (Verbindung XI) unterzogen.
Eine Lösung der Verbindung XI wurde mit Sterinsäure und 4- (Dimethylamino)pyridiniumtosylat in Dichlormethan in Gegenwart von 1,3- Dicyclohexycarbodiimid (DCC) umgesetzt. Nach der Reaktion, Filtration und Säulenchromatographie wurde ein flockiger weißer Festkörper, der als mPEG-S-S-PPO-DS (Verbindung XII) identifiziert wurde, erhalten. Dieses Konjugat ist, wie nachstehend beschrieben ist, zur Verwendung für die erfindungsgemäße Herstellung von Liposomen geeignet.
Beispiel 3 beschreibt die Herstellung eines ähnlichen Diblockcopolymer-Lipidkonjugats, abgesehen davon, dass das Lipid das Vesikel-bildende Lipid Distearylphospritidylethanolamin (DSPE) war. Wie in Fig. 9 veranschaulicht wird, wurde DSPE (Verbindung XIII) mit Bis- Nitrophenylcarbonatpolypropylenoxid (Verbindung X, hergestellt nach der Beschreibung in Beispiel 2C) in CHCl&sub3; umgesetzt. N-Hydroxy-s-norbornen-2,3-dicarbonsäureimid (HONB) und Triethylamin (TEA) wurden zu der Reaktionsmischung gegeben und nach weiterer Reaktion und Behandlung (genau ausgeführt in Beispiel 3A) wurde Verbindung XIV (DSPE- PPO p-Nitrophenylcarbamat) erhalten. Verbindung VIII (hergestellt nach der Beschreibung in Beispiel 2B) wurde mit Verbindung XIV in CHCl&sub3; unter Bildung des gewünschten mPEG-S- S-PPO-DSPE-Konjugats, Verbindung XV (Beispiel 3B) umgesetzt.
Ein weiteres Reaktionsschema zur Herstellung eines mPEG-S-S-PPO-DSPE-Konjugats ist in Beispiel 4 beschrieben und wird in den Fig. 10A-10B erläutert. Hier wird Distearylphosphatidylglycerol (DSPG, Verbindung XVI) mit Natriumperiodat (NaIOa) oxidiert und dann mit Polypropylenoxiddiamin (Verbindung XVIII) unter Bildung von Amino-PPO-DSPE (Verbindung XIX) reduktiv aminiert. Das nach der Beschreibung in Beispiel 1A hergestellte mPEG-DTP-OSu (Verbindung III) wird an Amino-PPO-DSPE (Verbindung XIX) unter Bildung eines Diblockcopolymer-Lipidkonjugats, mPEG-DTP- Amido-PPO-DSPE (Verbindung XX), gekoppelt. Verbindung 20 weist ein hydrophiles endständiges PEG-Blockpolymer und eine innere spaltbare Disulfidbindung an einen hydrophoben Polypropylenoxidblock auf, der an ein endständiges DSPE-Lipid gebunden ist.
In den vorstehend angegeben Beispielen (Beispiele 2-4) ist die spaltbare Bindung eine Disulfidbindung; jedoch sind andere Bindungen, wie zum Beispiel Peptid oder Ester, geeignet, die unter selektiven physiologischen Bedingungen, wie zum Beispiel in Gegenwart von Peptidase oder Esterase Enzymen gespalten werden können.
Wie vorstehend erörtert wurde, können Disulfidbindungen mit variierender Anfälligkeit gegenüber Reduktion synthetisiert werden, mit der Absicht die Freisetzungsrate der hydrophilen Polymerschicht passend zu machen. In Fig. 11 wird ein Reaktionsschema für die Synthese eines grenzflächenaktiven Polymer-Lipid-Moleküls gezeigt, bei dem die Diblockpolymersegmente (PEG und PPO) durch eine Disulfidbindung mit erhöhter Labilität verbunden sind. mPEG-SH (Verbindung XXI) und Ellman's Reagenz (Verbindung XXII) werden nach der Beschreibung in Beispiel 5 unter Bildung von mPEG-3-Carboxy-4- nitrophenoldisulfid (Verbindung XXIII) umgesetzt. Diese Verbindung wird mit Amino-PPO- DSPE (Verbindung XIX), die nach der Beschreibung in Beispiel 4A hergestellt wurde, und mit Dicyclohexylcarbodiimid (Verbindung XXN) umgesetzt. Das Diblockcopolymer- Lipidkonjugat (Verbindung XXV) weist ein endständiges mPEG-Segment auf, das mit einem PPO-Segment über eine spaltbare Schwefel-enthaltende Bindung verbunden ist, die eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Thiolyse aufweist. Dieses Konjugat (Verbindung XXV) wurde zur Herstellung und zum Testen der Liposomen in vivo verwendet, wie in Beispiel 9 beschrieben ist.

B. Binden eines Liganden an das hydrophile Polymer

Wie vorstehend beschrieben wurde, umfassen die Liposomen in der fusiogenen Zusammensetzung in einer Ausführungsform der Erfindung einen Liganden für das Targeting der Liposomen an einen ausgewählten Zelltyp oder an ein anderes Liposom, das den passenden Rezeptor enthält. Der Ligand ist an das Liposom durch eine kovalente Bindung an das freie abgewandte Ende einer Lipid-verankerten hydrophilen Polymerkette gebunden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die hydrophile Polymerkette PEG und mehrere Verfahren zum Binden der Liganden an die abgewandten Enden der PEG-Ketten sind beschrieben worden (Allen, Zalipsky (1993), Zalipsky (1994), Zalipsky (1995a), Zalipsky (1995b)). In diesen Verfahren wird die inerte endständige Methoxygruppe von mPEG durch eine reaktive Funktionalität ersetzt, die für Konjugationsreaktionen geeignet ist, wie zum Beispiel eine Amino- oder Hydrazidgruppe. Das endfunktionalisierte PEG wird an ein Lipid, typischerweise DSPE, gebunden. Die funktionalisierten PEG-DSPE-Derivate werden bei der Liposomenbildung angewandt und der gewünschte Ligand wird an das reaktive Ende der PEG-Kette vor oder nach der Liposomenbildung gebunden.
Tabelle 1 (wie vorstehend erörtert) listet beispielhafte Liganden für die Verwendung in der Liposomenzusammensetzung auf. Beispielhaft werden Reaktionsschemata für die Bindung von Folsäure und Pyridoxyl an das abgewandte Ende von PEG-derivatisiertem DSPE in den Fig. 12A beziehungsweise 12B gezeigt.
Folsäure (Verbindung XXVI) ist ein hämopoetisches Vitamin mit einem Molekulargewicht von 441 Dalton. Folsäure bindet an den Folatrezeptor, der ebenfalls als das Membranfolatbindende Protein bekannt ist, das ein Membranprotein ist mit einigen Eigenschaften eines Rezeptors, der mit der Rezeptor-vermittelten Endocytose zu tun hat. Der Rezeptor wird auf der Oberfläche von folatfreien Gewebekulturzellen maximal exprimiert und ist für die Akkumulation mit hoher Affinität von 5-Methyltetrahydrofolsäure in dem Zytoplasma dieser Zellen (Rothberg) verantwortlich. Es wurde ebenfalls berichtet, dass Rezeptoren mit hoher Affmität für Folsäure auf gewissen Krebszellen stark angereichert sind (Lee). Ein Folsäureligand, der in ein Liposom durch Binden an das abgewandte Ende der Lipidverankerten hydrophilen Polymerketten eingebaut wurde, würde die Liposomen auf solche karzinomatöse Zellen richten.
Das Binden von Folsäure an ein DSPE-PEG-Konjugat wird in Beispiel 6 beschrieben und in Fig. 12A veranschaulicht. Folsäure wird mit Amino-PEG-DSPE (Verbindung XXVII, hergestellt nach der Beschreibung von Zalipsky (1994)) gemischt und in Gegenwart von N- Hydroxy-s-norbornen-2,3-dicarbonsäureimid (HONB) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) unter Bildung eines Folsäure-PEG-DSPE-Konjugats (Verbindung XXVIII) umgesetzt. Dieses Konjugat ist in der Lipidmischung während der Liposomenherstellung enthalten zur Bildung von Liposomen, die einen Folsäure-Targetingliganden enthalten.
Fig. 12B erläutert das Binden von Pyridoxal an Hydrazid-aktiviertes PEG-DSPE. Pyridoxal und entsprechende Analoge wurden für die Verwendung beim erleichterten Transport biologisch aktiver Verbindungen (Zhang) und für die Verwendung in der AIDS Therapie (Salhany) untersucht. In der AIDS Therapie bindet Pyridoxal 5'-phosphat an das CD4- Protein, den Rezeptor für HIV-1 auf T-Helferzellen. Pyridoxal 5'-Phosphat bindet fest an das lösliche CD4-Protein mit einer Stöchiometrie von ungefähr 1 Mol Pyridoxal 5'phosphat/Mol Protein. Diese Affinität und Targeting an das CD4-Protein ist nützlich für das Targeting von Liposomen an T-Zellen für die AIDS Therapie. Das Binden von Pyridoxal (Verbindung XXIX) an Hydrazid-aktiviertes PEG-DSPE (Verbindung XXX) wird in Beispiel 7 beschrieben und in Fig. 12B gezeigt.
Als ein weiteres Beispiel wird der Ligand Sialyl-Lewis" an PEG-DSPE gebunden und in die fusiogene Liposomenzusammensetzung eingefügt. Die Entzündung bewirkt die Expression eines Polypeptids, das endotheliale Leukozyten-Adhäsionsmolekül-1 (ELAM-1 oder E- Selektin), auf der Oberfläche von endothelialen Zellen der Blutgefäße, die an die Orte der Entzündung angrenzen. ELAM-1 wiederum erkennt und bindet die Polysaccharideinheit Sialyl-Lewis" auf Oberflächen von Neutrophilen und rekrutiert die Neutrophile zu den Orten der Entzündung. Sialyl-Lewis" kann dazu verwendet werden Liposomen zur Abgabe eines therapeutischen Mittels auf Zellen zu richten, die ELAM-1 exprimieren. Die Herstellung eines Sialyl-Lewisx-PEG-DSPE-Derivats ist beschrieben worden (DeFrees).
Wie vorstehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 und Fig. 3 beschrieben wurde, enthalten die Liposomen optional einen Liganden, der an die Oberfläche des Lipids durch Binden an Oberflächenlipidkomponenten gebunden ist. Ein solcher Ligand ist ursprünglich durch die hydrophile Oberflächenschicht von der Wechselwirkung mit Targetzellen bis nach der Entfernung der hydrophilen Polymere abgeschirmt. Im allgemeinen ist ein solcher Ligand an die polare Kopfgruppe eines Vesikel-bildenden Lipids gekoppelt und verschiedene Verfahren wurden für das Binden von Liganden an Lipide beschrieben.
In einem bevorzugten Verfahren wird die Affinitätseinheit an das Lipid durch eine nachstehend beschriebene Kopplungsreaktion unter Bildung eines Affinitätseinheit- Lipidkonjugats gekoppelt. Dieses Konjugat wird zu einer Lösung von Lipiden zur Bildung von Liposomen gegeben, wie beschrieben wird. In einem anderen Verfahren wird ein Vesikel-bildendes Lipid in Liposomen eingebaut, das für das kovalente Binden einer Affinitätseinheit aktiviert worden ist. Die gebildeten Liposomen werden den Affinitätseinheiten ausgesetzt, um ein Binden der Affinitätseinheit an die aktivierten Lipide zu erreichen.
Eine Vielfalt von Verfahren ist zur Herstellung eines aus einer Affinitätseinheit und einem Vesikel-bildenden Lipid zusammengesetzten Konjugats verfügbar. Zum Beispiel können wasserlösliche, Amin-enthaltende Affinitätseinheiten an Lipide kovalent gebunden werden, wie zum Beispiel Phosphatidylethanolamin, indem die Amin-enthaltende Einheit mit einem Lipid umgesetzt wurde, das so derivatisiert wurde, dass es einen aktivierten N- Hydroxysuccinimidester enthielt.
Als ein weiteres Beispiel können Biomoleküle und insbesondere große Biomoleküle wie zum Beispiel Proteine an Lipide entsprechend den berichteten Verfahren gekoppelt werden. Ein Verfahren betrifft die Schiffsche Base-Bildung zwischen einer Aldehydgruppe auf einem Lipid, typischerweise ein Phospholipid, und einer primären Aminosäure auf der Affinitätseinheit. Die Aldehygruppe wird vorzugsweise durch Periodatoxidation des Lipids gebildet. Nach der Entfernung des Oxidationsmittels wird die Kopplungsreaktion in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie zum Beispiel Dithiothreitol, ausgeführt, wie bei Heath (1981) beschrieben ist. Typische in dem Verfahren geeignete Aldehyd-Lipidvorläufer umfassen Lactosylceramid, Trihexosylceramin, Galactocerebrosid, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinisitol und Ganglioside.
Ein zweites allgemeines Kopplungsverfahren ist auf Thiol-enthaltende Affinitätseinheiten anwendbar und betrifft die Bildung einer Disulfld- oder Thioetherbindung zwischen einem Lipid und der Affinitätseinheit. Bei der Disulfidreaktion wird ein Lipidamin, wie zum Beispiel Phosphatidylethanolamin, so modifiziert, dass es ein Pyridyldithioderivat enthält, das mit einer exponierten Thiolgruppe in der Affinitätseinheit reagieren kann. Die Reaktionsbedingungen für ein solches Verfahren können bei Martin (1981) gefunden werden. Die von Martin (1982) beschriebene Thioetherkopplung wird durch Bildung eines Sulfhydryl- reaktiven Phopholipids, wie zum Beispiel N-(4)P-Maleimido- phenyl(butyryl)phosphatidylethanolamin, und Umsetzen des Lipids mit der Thiol- enthaltenden Affinitätseinheit durchgeführt.
Ein weiteres Verfahren zur Umsetzung einer Affinitätseinheit mit einem Lipid betrifft die Umsetzung der Affinitätseinheit mit einem Lipid, das so derivatisiert wurde, dass es einen aktivierten N-Hydroxysuccinimidester enthält. Die Reaktion wird typischerweise in Gegenwart eines milden Detergens, wie zum Beispiel Deoxycholat, durchgeführt. Wie die vorstehend beschriebenen Reaktionen wird diese Kopplungsreaktion vorzugsweise vor dem Einbau des Lipids in das Liposom durchgeführt.
Die vorstehend beschriebenen Kopplungstechniken sind beispielhaft und es ist klar, dass in dem Fachgebiet andere geeignete Verfahren bekannt und beschrieben worden sind, wie zum Beispiel in den U. S. Patenten mit den Nummern 6,605,630, 4,731,324, 4,429,008, 4,622,294 und 4,483,929.

C. Liposomenherstellung

Die Liposomen können durch eine Vielfalt von Techniken hergestellt werden, wie zum Beispiel diejenigen, über die bei Szoka, et al., 1980 ausführlich berichtet wurde. Multilamellare Vesikel (MLVs) können durch einfache Lipidfilm-Hydratationstechniken gebildet werden. In diesem Verfahren wird eine Mischung Liposom-bildender Lipide, vom vorstehenden genau ausgeführten Typ, die in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst sind, in einem Gefäß verdampft, wobei sich ein dünner Film bildet, der dann durch ein wässriges Medium bedeckt wird. Der Lipidfilm hydratisiert unter Bildung von MLVs, die typischerweise Größen zwischen 0,1 bis 10 Mikrometer aufweisen.
Die bei der Bildung der fusiogenen Liposomen der vorliegenden Erfindung verwendeten Lipidkomponenten sind vorzugsweise in einem Molverhältnis mit ungefähr 70-90 Prozent an Vesikel-bildenden Lipiden, 1-20 Prozent an Diblockcopolymer-Lipidkonjugat und 0,1-5 Prozent an einem Lipid mit einem gebundenen Ligandmolekül vorhanden. Wie vorstehend bemerkt wurde, kann das zugegebene hydrophile Polymer völlig aus einem Diblockcopolymer-Lipidkonjugat bestehen oder aus einer Kombination von Diblockcopolymer-Lipidkonjugat und direkt an ein Lipid gebundenem Polymer. Der prozentuale Anteil an Diblock-Lipidkonjugat in dieser Mischung ist idealerweise der maximale prozentuale Anteil, der noch mit der Liposomenstabilität zu vereinbaren ist. Zur Optimierung der Formulierung für eine spezielle Diblock-Lipidzusammensetzung würde man daher verschiedene Verhältnisse der zwei hydrophilen Polymerlipidarten auswählen und das höchste Verhältnis verwenden, das eine gute Liposomenstabilität zeigt, wie zum Beispiel durch einen geringen Verlust eines fluoreszierenden Reporters aus den Liposomen offensichtlich wird. Die Menge an Diblockcopolymer-Lipidkonjugat liegt vorzugsweise zwischen 5-100% bezüglich des gesamten hydrophilen Polymerlipids, das bei der Lipidherstellung enthalten ist.
Eine beispielhafte Formulierung umfaßt 80-90 Molprozent Phosphatidylcholin, 1-20 Molprozent Polymerlipidkonjugate und 0,1-5 Molprozent Ligand-PEG-DSPE, wobei das Diblockcopolymer-Lipidkonjugat 20-100 Prozent bezüglich der gesamten hydrophilen Polymerlipidkonjugate ausmacht. In der Formulierung kann Cholesterol mit zwischen ungefähr 1-50 Molprozent enthalten sein. Die Herstellung einer beispielhaften Liposomenformulierung ist in Beispiel 10 beschrieben.
Ein anderes für die Herstellung der fusiogenen Liposomen der vorliegenden Erfindung geeignetes Verfahren betrifft die Diffusion von Polymerlipidkonjugaten in die vorgebildeten Liposomen. In diesem Verfahren werden Liposomen mit einem eingeschlossenen therapeutischen Mittel aus Vesikel-bildenden Lipiden hergestellt. Die vorgebildeten Liposomen werden zu einer Lösung gegeben, die eine konzentrierte Dispersion von Micellen aus Diblockpolymer-Lipidkonjugaten und wahlweise Ligand-PEG-DSPE enthält, und die Mischung wird unter Bedingungen inkubiert, die wirksam sind eine Insertion der micellaren Lipide in die vorgebildeten Liposomen zu erreichen. Ein Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass die hydrophobe Polymereinheit indem Diblocklipid auf die äußere Lipidschicht der Liposomen begrenzt ist und daher möglicherweise weniger destabilisierend ist, als wenn die Diblockkomponente in alle das Liposom bildende Lipidschichten eingebaut wird.
Alternativ dazu können die Liposomen mit dem direkt verbundenen hydrophilen Polymerlipid vorgeformt werden und unter Bedingungen für den Lipidaustausch mit dem Diblockpolymerkonjugat inkubiert werden, um das Diblocklipid in die äußere Liposomenschicht auszutauschen.
Das gemäß der Erfindung an die Zellen über Zellfusion zu verabreichende therapeutische oder diagnostische Mittel kann in die Liposomen durch Standardverfahren eingebaut werden, umfassend (i) das passive Einschließen einer wasserlöslichen Verbindung durch Hydratisieren eines Lipidfilms mit einer wässrigen Lösung des Mittels, (ii) das passive Einschließen einer lipophilen Verbindung durch Hydratisieren eines Lipidfilms, der das Mittel enthält und (iii) das Beladen eines ionisierbaren Arzneimittels gegenüber einem pH-Wert-Gradienten bezüglich innerhalb/außerhalb des Liposoms. Ebenfalls sind andere Verfahren verfügbar, wie zum Beispiel die Rückverdampfungsphasen-Liposomenherstellung.
Die fusiogenen Liposomen der Erfindung werden vorzugsweise so hergestellt, dass sie im wesentlichen homogene Größen in einem ausgewählten Größenbereich aufweisen, typischerweise zwischen ungefähr 0,01 bis 0,5 Mikrometer, bevorzugter zwischen 0,03-0,4 Mikrometer. Ein wirksames Dimensionierungsverfahren für REVs und MLVs betrifft das Extrudieren einer wässrigen Suspension der Liposomen durch eine Reihe von Polycarbonatmembranen mit einer ausgewählten einheitlichen Porengröße in dem Bereich von 0,03 bis 0,2 Mikrometer, typischerweise 0,05, 0,08, 0; 1 oder 0,2 Mikrometer. Die Porengröße der Membranen entspricht grob den größten Ausmaßen der Liposomen, die durch Extrusion durch diese Membran produziert werden, insbesondere wenn das Präparat zweimal oder mehrere Male durch dieselbe Membran extrudiert wurde. Ebenfalls sind Homogenisierungsverfahren für die Abwärtsdimensionierung von Liposomen auf Größen von 100 nm oder weniger (Martin) nützlich.

1. Herstellung und in vitro Fusion beispielhafter Liposomen mit roten Blutkörperchen

Zur Unterstützung der Erfindung wurde eine Untersuchung durchgeführt, um zu zeigen, dass erfindungsgemäß hergestellte Liposomen, nach dem Freisetzen des hydrophilen Anteils des Copolymerlipidkonjugats und dem Aussetzen des hydrophoben Polymerblocks, eine fusiogene Aktivität zeigen. Wie in Beispiel 8 beschrieben ist, wurden Liposomen, die eingeschlossenes Carboxyfluorescein enthielten, aus den Vesikel-bildenden Lipiden 1,2- Diolyloxy-3-(trimethylamino)propan (DOTAP), Lysophosphatidylcholin und teilweise hydriertes Sojaphosphatidylcholin hergestellt. Die Liposomen enthielten ebenfalls Cholesterol und 5 Molprozent des Diblockcopolymer-Lipidkonjugats mPEG-S-S-PPO-DS, das nach der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellt wurde (Verbindung XII, Fig. 8).
Die Fluorescein-enthaltenden Liposomen wurden mit wiederversiegelten Erythrozytenghosts inkubiert, die nach der Beschreibung in Beispiel 8A hergestellt wurden. Die Liposomen und Ghostzellen wurden zum Sicherstellen des Kontakts zentrifugiert und dann wurde das Freisetzungsmittel Dithiothreitol (DTT) zugegeben, um den mPEG-Block von dem in dem Liposom enthaltenen mPEG-S-S-PPO-DS-Konjugat abzuspalten (Beispiel 8C). Nach der Inkubation wurden die Zellen resuspendiert und mit einem fluoreszenzoptischen System und einer in Fig. 13 gezeigten mikrophotographischen Aufnahme untersucht. Die in der mikrophotographischen Aufnahme sichtbaren Erythrozytenghosts zeigen eine innere Fluoreszenz, was darauf hinweist, dass die Fluorescein-enthaltenden Liposomen mit den Zellen verschmolzen. Erythrozytenghostzellen, die nicht mit einem Liposom verschmolzen, sind ebenfalls in der mikrophotographischen Aufnahme sichtbar als dunklere transparente Zellen. Ebenfalls sind Fluorescein-enthaltende Liposomen sichtbar. Ein Kontrollpräparat, das Erythrozytenghosts enthielt und dasselbe Liposomenpräparat, das jedoch nicht dem freisetzenden Mittel DTT ausgesetzt worden war, zeigten keinen Beweis für eine Liposomen- Zellfusion, da nachgewiesen wurde, dass keine der Zellghosts in dem optischen Feld eines Fluoreszenzoptischen Systems eine innere Fluoreszens zeigte. In der mikrophotographischen Aufnahme von Fig. 13 weisen näherungsweise mehr als 30% der Erythrozytenghostzellen eine innere Fluoreszens auf, was auf eine Fusion mit den fusiogenen Liposomen hinweist.

2. Herstellung und in vivo Test beispielshafter Liposomen

Zur Unterstützung der Erfindung wurden Untersuchungen durchgeführt, wobei Liposomen verwendet wurden, die eine durch den Einschluß der Verbindung XXV (Fig. 11) in die Liposomen abtrennbare Schicht aus PEG-Ketten aufwiesen. Diese Liposomen wurden in vivo bezüglich der Freisetzung der PEG-Ketten getestet. Wie in Beispiel 9 beschrieben ist, wurden Komplexe hergestellt, die kationische Liposomen mit der abtrennbaren Schicht aus PEG- Keifen und Luciferase-enthaltende Plasmide enthielten. Die Komplexe wurden hergestellt durch Bildung eines kationischen Liposom-kondensierten Plasmidkompexes und Inkubieren des Komplexes mit PEG-DTP-DSPE-Micellen (Verbindung XXV, Fig. 11) oder mit PEG- DSPE-Micellen (zum Beispiel PEG, das an DSPE über eine herkömmliche nichtspaltbare Bindung gebunden ist (Zalipsky 1992a)). Die PEG-DSPE- und PEG-DTP-DSPE-Micellen insertieren in die kationischen Liposomen bei der Inkubation bei Raumtemperatur und leichtem Aufwirbeln während S Minuten.
Es wurden drei Liposomenformulierungen hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben ist. In der ersten Formulierung war die PEG-Schicht nicht abtrennbar, da heißt, dass das PEG in den Liposomen als ein irreversibel an DSPE gebundenes PEG enthalten war. In der zweiten Formulierung wiesen die Liposomen eine PEG-Oberflächenschicht auf, wobei die Hälfte der PEG-Ketten trennbar an die Liposomenoberfläche gebunden war und die andere Hälfte nichttrennbar gebunden war. In der dritten Formulierung war die PEG-Oberflächenschicht auf den Liposomen abtrennbar. Diese Formulierungen sind in den Fig. 14A-14B als "PEG", "PEG + R-PEG" beziehungsweise "R-PEG" bezeichnet.
Die Liposomenkomplexe wurden Mäusen intravenös verabreicht. Fünf Minuten nach der Verabreichung wurde das Reduktionsmittel Cystein zur Reduktion der Disulfidbindungen zugegeben, wobei das trennbare PEG von den Liposomen freigesetzt wurde. 24 Stunden nach der Einspritzung wurden die Lunge und die Leber auf die Luciferaseaktivität hin analysiert. Die in den Fig. 14A-14B gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Luciferaseaktivität für Liposomen mit freisetzbaren PEG-Ketten höher ist, zum Beispiel werden in dem Gewebe mehr Liposomen zurückbehalten. Die Daten demonstrieren die wichtige in vivo Freisetzung von PEG-Ketten durch die Reduktion einer trennbaren Bindung. Die Freisetzung der PEG- Ketten exponiert die positiven Liposomenoberflächenladungen der kationischen Liposomen, wodurch das Binden an die negativen Zellmembranen verstärkt wird und die Retention der Liposomen in den Geweben verbessert wird, wie durch eine höhere Luciferaseaktivität für die liposomalen Formulierungen mit freisetzbarem PEG augenscheinlich wurde.

III. Nutzen der fusiogenen Liposomenzusammensetzung

Die beschriebene fusiogene Liposomenzusammensetzung ist von Nutzen JUr die in vivo oder in vitro Abgabe diagnostischer oder biologisch aktiver therapeutischer Mittel, wie zum Beispiel Arzneimittel, Proteine, genetisches Material oder andere Mittel oder Rezeptormoleküle, entweder in eine Zellmembran, ein Rezeptorliposom oder in das Cytoplasma einer Zelle.
Gemäß der Erindung wird das im Liposom eingeschlossene Mittel direkt an das Cytosol der Targetzelle durch Fusion des Liposoms mit den Zellen abgegeben, anstatt über einen endocytotischen oder phagocytischen Mechanismus. Daher sind die Liposomen besonders vorteilhaft für die Abgabe therapeutischer Mittel, wie zum Beispiel Genkonstrukte, Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloge, Peptide, Proteine und andere biologische Makromoleküle, die nicht leicht eine Zellmembran durch passiven oder aktiven Transport durchdringen.
Die fusiogene Liposomenzusammensetzung kann in vivo durch eine Vielfalt von Wegen verabreicht werden, umfassend subkutan, intramuskulär, interläsional (keine Tumore), intertracheal durch Inhalation, topisch, internasal, intraocular, über direkte Einspritzung in die Organe und intravenös.

A. Verabreichung der Liposomenzusammensetzung

Die fusiogene Liposomenzusammensetzung ist für die Verwendung zur Abgabe eines Mittels oder einer Verbindung an eine Targetzelle, entweder an einer in vivo Stelle oder an in vitro Zellkulturen, ausgelegt. Die Abgabe des Mittels wird durch die Fusion der Vesikel mit der Plasmamembran der Targetzellen erreicht, wobei das Mittel in das Cytoplasma-Kompartiment der Zelle freigesetzt wird. Mehrere Anwendungen werden nachstehend erörtert.
1. Abgabe eines therapeutischen Mittels. Eine Vielfalt therapeutischer Verbindungen, einschließlich allgemeiner pharmakologischer Arzneimittel, Peptide und Nukleinsäuren, können begrenzte therapeutische Anwendungen aufweisen, aufgrund des Problems der geringen Aufnahme in die Targetzellen. Mit der Verwendung der Liposomenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann eine eingeschlossene therapeutische Verbindung an Targetzellen mit einer hohen Aufnahme über die Vesikel- Zellfusion abgegeben werden.
Bei dieser allgemeinen Anwendung werden fusiogene Liposomen, die ein eingeschlossenes Arzneimittel enthalten, zum Beispiel intravenös verabreicht. Die fusiogenen Liposomen, wie sie vorstehend beschrieben sind, können einen spezifischen Liganden für das Targeting an die Zellen umfassen, die das eingeschlossene Arzneimittel benötigen. Zum Beispiel können Liposomen, die ein Anti-Tumor Arzneimittel mit sich führen, wie zum Beispiel Doxorubicin, auf die vaskulären endothelialen Zellen von Tumoren gerichtet werden, indem ein VEGF- Ligand in das Liposom eingefügt wird zur selektiven Bindung an Flk-1,2-Rezeptoren, die auf den sich stark vermehrenden endothelialen Tumorzellen exprimiert werden. Die hydrophile Schicht auf den Liposomen schützt die Liposomen vor der Aufnahme durch das retikuloendotheliale System, was für eine lange Lebensdauer im Blutkreislauf zum wirksameren Targeting sorgt. Gleichzeitig wird der Ligand, der an die abgewandten Enden der Lipid-verankerten hydrophilen Polymerketten gebunden war, zum Zwecke der Rezeptorbindung und des Targetings exponiert.
Alternativ kann das Targeting an ausgewählte Targetzellen oder ein Gewebe passiv sein, das heißt durch die normale biologische Ausbreitung der Liposomen nach der Verabreichung, ohne dass ein nichtabgeschirmter Ligand erforderlich ist. Beispielsweise können lange zirkulierende Liposomen, die vorzugsweise Größen von weniger als ungefähr 0,2 um aufweisen, nach der IV Verabreichung an soliden Tumorregionstellen oder Entzündungsstellen über Extravasation durch das gefährdete Gefäßsystem akkumulieren.
Wenn die Liposomen einen ausgewählten Targetort erreicht haben, zum Beispiel durch Ligand-spezifisches Binden der Liposomen an Targetzellen oder Akkumulation der Liposomen in der Nähe der Targetzellen durch biologische Ausbreitung der eingespritzten Liposomen, werden die Liposomen an den Targetzellen mit einem chemischen Mittel in Kontakt gebracht, das wirksam ist, die die Oberflächenschicht bildenden Ketten freizusetzen. Dieses Freisetzen setzt die hydrophoben Polymere auf der Liposomenoberfläche bezüglich den Targetzellen aus, wodurch die Fusion der Liposomen mit der Targetzelloberfläche gefördert wird, wie nachstehend beschrieben ist.
In einer allgemeinen Ausführungsform sind die hydrophilen Polymerketten mit den hydrophoben Ketten (oder direkt mit den Liposomenlipiden) über Disulfidbindungen verbunden. In dieser Ausführungsform wird der Patient zum Beispiel durch IV Verabreichung eines Reduktionsmittels, wie beispielsweise Ascorbat, Cystein oder Glutathion behandelt.
In einer anderen Ausführungsform kann die chemisch trennbare Bindung eine pH-Wert- sensitive Bindung sein, wobei die Liposomen auf eine Region gerichtet werden, wie zum Beispiel die Region eines soliden Tumors, in der ein typischerweise niedrigerer pH-Wert das Abfallen der hydrophilen Polymere fördern kann.
Das vollständige oder teilweise Entfernen der hydrophilen Polymerketten setzt das hydrophobe Polymer auf der Liposomenoberfläche der Oberfläche der Targetzellmembran aus. Das nun in einer wässrigen Umgebung vorhandene hydrophobe Segment wird nach einer vorteilhafteren, zum Beispiel hydrophoben Umgebung sowohl in der Liposomendoppelschicht als auch in der benachbarten Targetzellmembran streben. Das Partitionieren der hydrophoben Ketten in die Targetzellen wird sowohl ein Annähern des Liposoms zur Targetzellmembran als auch eine Destabilisierung der Targetzelldoppelschicht bewirken, was es für eine Fusion mit der Liposomendoppelschicht anfälliger macht.
Zur Optimierung oder Vergrößerung der Effizienz des Fusionsereignisses können eine Anzahl von Strategien verwendet werden.
Zuerst ist es wünschenswert die Tendenz der ausgesetzten hydrophoben Ketten zur Partitionierung in die Targetzelldoppelschicht statt in die Liposomendoppelschicht zu erhöhen. Dies kann teilweise durch eine Zunahme in der Konzentration der Lipide in den Liposomen mit hohem Phasenübergang durchgeführt werden.
Zweitens ist es wünschenswert die Liposomen in nächste Nähe zur Targetmembran zu bringen. Wie vorstehend erörtert wurde, kann dies durchgeführt werden, indem ein abgeschirmter Ligand oder eine positiv geladene Lipidkomponente zur Verfügung gestellt wird, die in der Lage ist nach dem Freisetzen der hydrophoben Polymere mit der Targetmembran in Wechselwirkung zu treten, wodurch die zwei Doppelschichten näher zusammengedrängt werden.
Schließlich kann der Typ und die Größe der hydrophoben Polymerketten zur Erhöhung der Fusionseffiziens optimiert werden. Das vorstehend erörterte Verfahren zur Untersuchung der Fähigkeit hydrophober Polymerketten zur Lyse von Erythrozyten kann zur Identifizierung der optimalen Polymergröße und des Polymertyps verwendet werden.
2. Gentherapie. Fusiogene Liposome, die ein eingeschlossenes Gen enthalten (cDNA- Plasmid) werden an Targetzellen für die ex vivo oder in vivo Gentherapie abgegeben: Im letzteren Fall wird ein Gen direkt einem Patienten zugeführt (intravenös, intraperitoneal). Bei dem ex vivo (oder in vitro) Gentransfer wird das Gen in die Zellen eingeführt, nachdem die Zellen aus dem spezifischen Gewebe einer Person entfernt worden sind. Die transfizierten Zellen werden dem Patienten dann zurück zugeführt.
Eine Vielfalt von Genen für die Behandlung verschiedener Zustände sind beschrieben worden und für spezifische interessierende Gene codierende Sequenzen können aus Datenbanken, wie zum Beispiel der GenkBank oder EMBL geholt werden. Die ausgewählten codierenden Sequenzen können beliebige aus einer Vielfalt von Arten von Proteinen oder Polypeptiden codieren, in Abhängigkeit von der besonderen Anwendung. Zum Beispiel könnte das fusiogene Liposom dazu verwendet werden, Sequenzen, die Enzyme codieren in zum Beispiel Stammzellen oder Lymphozyten von Personen einzuführen, die an einem Enzymmangel leiden. Beispielsweise können im Falle von Personen mit Adenosindeaminase(ADA)mangel Sequenzen, die ADA codieren in Stammzellen oder Lymphozyten solcher Personen transfiziert werden.
In entsprechenden Anwendungen können die Liposome Gene enthalten, die beliebige aus einer Vielfalt von zirkulierenden Proteinen codieren, wie zum Beispiel α&sub1;-Antitrypsin, Blutgerinnungsfaktoren (zum Beispiel Faktor VIII, Faktor IX) und Globine (zum Beispiel β- Globin, Hämoglobin), für die Behandlung von Hämophilie, Sichelzellenanämie und andere mit dem Blut zusammenhängende Krankheiten. Andere Beispiele Gen-codierender Sequenzen, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind umfassen Sequenzen, die folgendes codieren, strukturelle Proteine; Rezeptoren, wie zum Beispiel den Lipoproteinrezeptor niedriger Dichte (LDL-R) für die Transfektion von Hepatozyten zur Behandlung von Patienten mit LDL-Mangel, menschliches CD4 und lösliche Formen davon und dergleichen; Transmembranproteine, wie zum Beispiel den zystischen Fibrose- Transmembrankonduktanzregulator (CFTR) zur Behandlung von Patienten mit zystischer Fibrose; Signalmoleküle; Cytokine, wie zum Beispiel verschiedene Wachstumsfaktoren (zum Beispiel TGF-α, TGF-β, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, CSF, SCF), Interleukine, Interferone, Erythropoietin und dergleichen, sowie auch Rezeptoren für solche Cytokine; Antikörper, einschließlich chimäre Antikörper; für das Targeting bösartiger Tumore nützliche Gene (zu n Beispiel bösartige Melanome durch Transformation von zum Beispiel in Tumor eindringende Lymphozyten, TIL), Tumorsuppressorgene, wie zum Beispiel p53 oder RB- Gene, die die Apoptose regulieren, wie beispielsweise das Bc1-2-Gen für die Thymidinkinase gefolgt von dem Glanciclovirgen für Cytosindeaminase, gefolgt von dem 5-Fluorcytosingen für die Überexpression des MDR-1-Genprodukts zum Schutz normaler Zellen vor der zytotoxischen Chemotherapie, mit für Tumore schädlichen Genen, wie zum Beispiel den Tumornekrosefaktor, Leukämiehemmfaktor oder verschiedene andere toxische Gene; Hormone, wie zum Beispiel Insulin und Wachstumshormone, Transkriptions- und Translations-regulierende Elemente; und dergleichen. Die Liposome können auch Enzyme kodieren, um ein nichtzytotoxisches Proarzneimittel in ein zytotoxisches Arzneimittel in Tumorzellen oder endothelialen Zellen, die zu dem Tumor benachbart sind, umzuwandeln.
In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die Liposomen ein Polynukleotid, das so ausgelegt ist, dass es in das Genom der Targetzelle aufgenommen wird, oder das für eine autologe Replikation innerhalb der Zelle ausgelegt ist. In einer anderen Ausführungsform ist die Verbindung, die in den Lipid-Vesikeln eingeschlossen ist, ein Oligonukleotidsegment, das für ein Sequenz-spezifisches Binden an zelluläre RNA oder DNA ausgelegt ist.
Polynukleotide, Oligonukleotide oder Nukleinsäuren, wie zum Beispiel ein DNA-Plasmid können durch Kondensieren der Nukleinsäure in Einzelmolekülform in das Liposom eingeschlossen werden. Unter Bedingungen, die wirksam sind die Nukleinsäure in kleine Teilchen zu kondensieren wird die Nukleinsäure in einem wässrigen Medium suspendiert, das Spermin, Spermidin, Histon, Lysin, Mischungen davon oder andere geeignete polykationische kondensierende Mittel enthält, wie in Beispiel 11 beschrieben ist. Die Lösung der kondensierten Nukleinsäuremoleküle wird zur Rehydratisierung eines getrockneten Lipidfilms verwendet, unter Bildung von Liposomen mit der kondensierten Nukleinsäure in eingeschlossener Form.

B. Verwendung in in vitro Assays

Die fusiogene Liposomenzusammensetzung kann zur Verwendung in einem homogenen Immunoassayformat in vitro auf eine Zelle oder ein Targetliposom gerichtet sein.
In dieser Anwendung führt das Fusionsereignis ein Effektormolekül, das in dem fusiogenen Liposom mitgeführt wurde, in die Targetzelle ein, zum Beispiel in eine biologische Zelle oder in ein anderes Liposom. Das Effektormolekül wechselwirkt mit einer Verbindung, die in der Targetzelle enthalten ist, unter Erzeugung eines messbaren Signals.

IV. Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Verfahren zur Herstellung, Charakterisierung und die Verwendung der fusiogenen Liposomen der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele beabsichtigen in keiner Art den Rahmen der Erfindung einzuschränken.

Beispiel 1

Herstellung des Di-PEG-PPO-Copolymers für das Screening der Fusionsaktivität

A. Herstellung von N-Succinimidyl-(2-(ω-methoxypoly-(oxyethylen)-α- aminocarbonyl)ethyldithiopropionatintermediat, (mPEG-DTP-OSu)

Dieses Syntheseschema wird in Fig. 4 erläutert. N-Succinimidyl-(2-(ω-methoxypoly- (oxyethylen)-α-aminocarbonyl)ethyldithiopropionat (Verbindung III) wird nach dem - Verfahren von Kirpotin, 1996 hergestellt.
Eine aus Dithiodipropionsäure (Aldrich, Milwaukee, WI) hergestellte Lösung von Dithiobis(succinimidylpropionat) (873 mg, 2 mmol) (DTSP, Verbindung II) wird in Dimethylformamid (10 ml) gelöst und mit Methoxypoly(ethylenglycol)amin (2 g, 1 mmol) mPEG-NH&sub2; (Verbindung I), hergestellt nach dem Verfahren von Zalipsky (Zalipsky, 1983), und Triethylamin (140 ml) behandelt. Das resultierende N-Succinimidylester- Polymerintermediat, N-Succinimidyl-(2-(ω-methoxypoly(oxyethylen)-α- aminocarbonyl)ethyldithiopropionat (mPEG-DTP-OSu, Verbindung III) wird dann durch zweimaliges Umkristallisieren aus Isopropanol gereinigt, gefolgt von Trocknen unter Vakuum über Phosphorpentoxid, um restliches Wasser zu entfernen. Das Intermediat wird durch ¹H NMR unter Verwendung von deuteriertem Methanol als Lösungsmittel charakterisiert. ¹H- NMR (CD&sub3;OD): δ 2,6 (m, SCH&sub2;CH&sub2;CON), 2,85 (s, Su, 4H), 3,0 (überlappend m, SCH&sub2;CH&sub2;C&sub0;&sub2;-Su und SCH&sub2;CH&sub2;CON), 3,38 (s, CH&sub3;, #h), 3,64 (s, PEG, 180H). Die Zusammensetzung der Produktmischung, das heißt die relative Menge von Mono-PEG- yliertem (mPEG-DTP-OSu) zu Di-PEG-yliertem Dithiodipropionatprodukt (mPEG)2DTP, wird bestimmt durch Vergleich der relativen Integrale der Peaks bei 2,6 ppm und 2,85 ppm feldabwärts bezüglich TMS, die dem gewünschten Succinat zugeordnet sind, gegenüber einer Resonanz bei 3,0 ppm, die (mPEG)&sub2;DTP zugeordnet ist.

B. TRIBLOCKCOPOLYMERHERSTELLUNG

PPO-Diamin, das zwei enständige primäre Aminogruppen (Verbindung IV) enthält, wird solange in Methylenchlorid gerührt, bis es sich aufgelöst hat. Zu dieser Lösung wird ein geringer Überschuß (1,2 Äquivalente) an mPEG-DTP-OSu (Verbindung III) gegeben. Die Reaktionsmischung wird dann während mehreren Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Reaktionsfortschritt wird durch TLC überwacht; die Vollständigkeit wird durch das Verschwinden eines Punktes, der PPO-Diamin entspricht angezeigt. Das Di-Peg-ylierte PPO- Produkt, Di(mPEG-amido-DTP-amido)PPO (Verbindung V) wird durch Säulenchromatographie auf Silikagel gereinigt, mit nachfolgender Charakterisierung durch ¹H NMR Spektroskopie (CDCl&sub3;) zur Bestätigung der Abwesenheit irgendeines restlichen Mono- PEG-yliertem PPO-Produkts.

C. Screeningverfahren für die fusionsfördernde Aktivität hydrophober Polymere

Ein Triblockcopolymer von PEG2000 und PP02000 (Verbindung V) wurde nach einem entsprechend dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. 50 mg Triblockcopolymer wurden in 1,2 ml Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) aufgelöst. 0,5 ml wurden in die ersten zwei Röhrchen der zwei Reihen mit je 10 Röhrchen gegeben, die jeweils 0,5 ml PBS enthielten. In den beiden Röhrchenreihen wurden zehn serielle 2-fache Verdünnungen des Copolymers hergestellt. Zu jedem der 20 Röhrchen wurde 0,5 ml von 10% Volumen/Volumen der Suspension frischer menschlicher roter Blutkörperchen mit der Blutgruppe 0 (die in Heparin gezogen wurden und dreimal mit PBS gewaschen wurde) gegeben. Es wurde ebenfalls eine Zellkontrolle durch Kombinieren von 0,5 ml PBS und 0,5 ml der roten Zellensuspension in einem einzigen Röhrchen hergestellt. Alle Röhrchen wurden während 10 Minuten in einen Kühlschrank gestellt und nach dieser Zeit wurde 0,1 ml 0,5 M Dithiothreitol (DTT) zu einer der Lösungen gegeben während 0,1 ml PBS zu dem anderem Satz der Verdünnungen gegeben wurde. Zu dem Röhrchen, das die Zellkontrolle enthielt wurden 0,1 ml DTT zugegeben. Die Röhrchen wurden für 2 Stunden in den Kühlschrank gestellt. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen in eine Zentrifuge gesetzt und zum Pelletisieren der Zellen mit 2000 · G während 10 Minuten geschleudert.
Die überstehenden Flüssigkeiten wurden sorgfältig entfernt und in getrennte Röhrchen gegeben. Die Extinktionswerte wurden bei 480 nm für die überstehenden Flüssigkeiten der 5ten Verdünnung (das heißt die Röhrchen, die eine Konzentration des Triblockcopolymers von 0,78 mg/ml enthielten) und für das Kontrollpräparat gemessen und sind in Fig. 5 gezeigt, wobei Block (a) die Extinktion für die Proben, die das Triblockcopolymer plus DTT enthielten zeigt, Block (b) die Extinktion für die Proben, die nur das Triblockcopolymer enthielten zeigt und Block (c) die Extinktion für das Kontrollpräparat (Zellen plus DTT) zeigt.
Die Zellen wurden ebenfalls mikroskopisch mittels Phasenkontrastoptik bei einer 630 fachen Vergrößerung untersucht und in den Fig. 6A-6C sind mikrophotographische Aufnahmen gezeigt. Fig. 6A zeigt das Zellpräparat, das dem Triblockcopolymer und DTT ausgesetzt war, Fig. 6B entspricht den Zellen, die nur dem Triblockcopolymer ausgesetzt waren und Fig. 6C zeigt die Zellen, die nur DTT ausgesetzt waren. Wie ersichtlich ist, gibt es eine augenscheinliche Zellyse nur in dem Präparat, das das gegenüber DTT ausgesetzte Triblockcopolymer enthielt, bei dem mehr als 80% der Zellen lysierten, wie durch die dunklen, transparenten Körper in der mikrophotographischen Aufnahme deutlich wird (intakte Zellen sind als helle Körper in den mikrophotographischen Aufnahmen sichtbar).

Beispiel 2

Herstellung eines Diblockcopolymer-Lipidkonjugats: mPEG-S-S-PPO-DS (Verbindung XII)

A. Materialien und Verfahren

Materialien: Sofern nicht anders angegeben wurden die Materialien von kommerziellen Anbietern bezogen und so verwendet, wie sie geliefert wurden. A-(Imidazol-1-yl)carbonyl-ω- methoxy-poly(ethylenoxid) wurde nach bekannten Verfahren synthetisiert (Beauchamp, et al. 1983).
Verfahren: Der Ausdruck "eingedampft unter Vakuum" bedeutet die Verwendung eines Rotationsverdampfers mit einer Badtemperatur nicht über 40ºC unter Verwendung einer Wasserstrahlpumpe. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde auf Analtech 60F-254 Silikagelplatten ausgeführt und der Nachweis der Komponenten auf den TLC-Platten wurde durch Färben mit Ioddampf, Färben mit dem Dragendorf Reagenz (zum Polyethernachweis) oder durch Behandlung mit einer Kupfersulfat/Schwefelsäurelösung, gefolgt von Erhitzen ausgeführt. Die Lösungsmittelsysteme werden als ein Prozentsatz der polareren Komponente bezüglich des Gesamtvolumens (v/v%) ausgedrückt. Merck Grad 9385 Silikagel 230-400 mesh (60 Å) wurde für die Chromatographie verwendet (Merck Sharpe & Dohme; Philadelphia, PA), die unter Anwendung der von Sill, et al. (1978) dargelegten Richtlinien ausgeführt wurde. Die ¹H NMR Spektren wurden auf einem 360 MHz GE Gerät bei Acorn NMR Inc. (Fremont, CA) aufgenommen und die Werte der chemischen Verschiebungen sind durch A-Werte (Parts per million) bezüglich Tetramethylsilan als innerer Standard ausgedrückt. Die Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisations- Flugzeitmassenspektroskopie (MALDI-TOFMS) wurde mit dem PH-EVANS MALDI Flugzeitmassenspektrometer mit dreifach elektrostatischem Analysator bei Charles Evans & Associates (Redwood City, CA) erhalten.

B. Herstellung von α-[2-Aminoethyldithio-N-ethylcarbamoyl-ω-methoxypoly(ethylenoxid)hydrochlorid (Verbindung VIII)

Die folgende Reaktion wird ist in Fig. 8 gezeigt. Ein 250 ml Rundkolben wurde mit Cystamindihydrochlorid (Verbindung VII, 4,5 g, 20 mmol) gelöst in 50 ml einer 0,01 M Kaliumtetraborattetrahydratlösung beschickt. Zu dieser gerührten Lösung wurde in einer Portion α-(Imidazol-1-yl)carbonyl-ω-methoxypoly(ethylenoxid) (Verbindung VI, n = 45) zugegeben, das nach der Beschreibung von Beauchamp, et al., 1983 hergestellt worden ist, und die resultierende klare Lösung wurde bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt. Dann wurde die Lösung mit 6 N HCl auf einen pH-Wert von 1 eingestellt und Natriumchlorid wurde bis zur Sättigungsgrenze zugegeben. Die wässrige Lösung wurde mit Chloroform (2 · 75 ml) extrahiert, die organischen Extrakte vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft und das resultierende farblose Gel in näherungsweise 70 ml Ethylacetat gelöst. Zu dieser klaren Lösung wurde langsam 120 ml Diethylether zugegeben, was 1,97 g (88%) eines weißes Niederschlags von α-[2- Aminoethyldithio-N-ethylcarbamoyl-ω-methoxy-poly(ethylenoxid)hydrochlorid (Verbindung VIII) ergab, der für die nächste Reaktion von ausreichender Reinheit war. Rp = 0,49 (2 : 18 : 90 Wasser/Methanol/Chloroform). ¹H NMR (360 MHz, DMSO-d&sub6;) Δ 7,74 (bs, 3), 7,38 (t, 1, J = 5,1 Hz), 4,05 (pt, 2, J = 4,5 Hz), 3,69 (pt, 1, J = 4,7 Hz), 3,50 (bm, ~180); 3,41 (m, 2), 3,23 (s, 3), 3,08 (pt, 2, J = 46,7 Hz, 7,1 Hz), 2,90 (pt, 2 J = 7,6 Hz), 2,79 (pt, 2, J = 6,9 Hz; 6,6 Hz).

C. Herstellung von Bis-p-Nitrophenylcarbonatpolypropylen (Verbindung IX)

Polypropylenoxid (PPO, 1 g, 0,5 mmol) wurde azeotropisch mit Benzol getrocknet. p- Nitrophenylchloroformat (604 mg, 3 mmol, 6 eq) und Triethanolamin (TEA, 418 ml, 3 mmol, 6 eq) wurden zu PPO in CH&sub2;Cl&sub2; (3 ml) gegeben. Nach 30 Minuten zeigte die TLC, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Die Lösung wurde filtriert und bis zur Trockene eingedampft. Das Rohprodukt wurde in DHCl&sub3;:CH&sub3;COCH&sub3; (90 : 10) gelöst, auf eine Siliziumdioxidsäule gegeben (die Aufschlämmung wurde mit demselben Lösungsmittel hergestellt) und mit den folgenden Lösungsmitteln eluiert, CHCl&sub3;:CH&sub3;COCH&sub3; = 90 : 10 (Eluierung der p-Nitrophenylgruppe), CHCl&sub3;:CH&sub3;COCH&sub3; = 50 : 50 (Eluierung des Produkts). Lösungen mit passenden Faktoren wurden vereinigt, eingedampft und unter Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet, woraus sich das Produkt als ein klares Öl ergab. Ausbeute: 1 g (86%). ¹H NMR (d&sub6;-DMSO): δ 1,05 (d, CH&sub3;CHCH&sub2;, 105 H); 1,15 (δ, CH&sub3;CHCH&sub2;, End 6H); 3,30 (m, CH&sub3;CHCH&sub2;, 35 H); 3,45 (m, CH&sub3;CHCH&sub2;, 70 H); 4,90 (m, endständig CH&sub3;CHCH&sub2;, 2H); 7,50 (d, NO&sub2;C&sub6;H&sub4;PPO, 4H), 8,30 (d, NO&sub2;C&sub6;H&sub4;PPO, 4 H).

D. Herstellung von mPEG-S-S-PPO-DS (Verbindung XII)

Ein ofengetrockneter 25 ml Rundkolben wurde unter Stickstoff mit α,ω-Bis-(4- Nitrophenoylcarbonat)poly(propylenoxid) (Verbindung IX, m = 35, 611 mg, 236 umol) (hergestellt nach der vorstehenden Beschreibung in Beispiel 2C, nach den Verfahren von Veronese, et al., 1985) und Verbindung VIII (512 mg, 230 umol) in 4,0 ml trockenem Dimethylformamid beschickt. Dann wurde Triethylamin (98 ul, 700 umol) zu dieser hellgelben Lösung zugegeben, wodurch sich eine trübe helle gelbe Mischung ergab, die bei Raumtemperatur unter Stickstoff während 60 Minuten gerührt wurde. Zu diesem Zeitpunkt zeigte die TLC-Analyse einen vollständigen Verbrauch der Verbindung VIII an (und die Bildung von mPEG-S-S-PPO-Nitrophenylcarbonat [Verbindung X, Hauptprodukt] und mPEG-S-S-PPO-S-S-mPEG [Nebenprodukt]). Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur unter Stickstoff während 21 Stunden rühren. Dann wurde das Lösungsmittel verdampft und der gelbe Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen (SiO&sub2;, 25 · 150 mm, (1) 10% Aceton/Chloroform zur Eluierung von p-Nitrophenol, dann (2) 5% Methanol/Chloroform zur Eluierung der ersten Mischung, (3) 8% Methanol/Chloroform), um die zweite Mischung, die mPEG-S-S-PPO-Aminopropandiol (Verbindung XI) enthielt zu eluieren. Das Eindampfen des Lösungsmittels der passenden Fraktionen ergab 260 mg eines Öls, das nach der TLC-Analyse zwei Materialien mit Rf = 0,58 und Rf = 0,57 (10% Methanol/Chloroform) enthielt, die positiv auf die Iodfärbung und Polyether-spezifische Dragendorf-Färbung reagierten. Dieses Material wurde ohne irgendwelche weitere Reinigung verwendet. Ein ofengetrockneter 5 ml Kolben wurde unter Stickstoff mit Stearinsäure (52 mg, 182 umol), 4- (Dimethylamino)pyridiniumtosylat (Moore und Stupp, 1990) (9 mg, 30 umol) und einer Lösung von Verbindung XI (260 mg Mischung) in 2,0 ml trockenem Dichlormethan beschickt. Zu dieser klaren Lösung wurde 1,3-Dicyclohexycarbodiimid (5 mg, 25 umol) gegeben und man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur unter Stickstoff rühren. Nach 30 Minuten begann sich ein Niederschlag zu bilden (1,3-Dicyclohexylharnstoff) und die TLC- Analyse zeigte die Bildung eines neuen Produktflecks bei Rf = 0,57 (9% - Methanol/Chloroform, Ausgangsmaterial Rf = 0,49). Die Reaktion wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Mischung wurde durch Kieselgur filtriert, mit Dichlormethan gewaschen, das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen (SiO&sub2;, 25 · 100 mm, [a] 10&supmin;&sup5;&sup0;% Gradient von 2- Propanol/Chloroform, [b] 2 : 48 : 50 Methanol/2-Propanol/Chloroform, [c] 5 : 45 : 50 Methanol/2- PropanollChloroform, [d] 5% Methanol/Chloroform, [e] 7,5% Methanol/Chloroform; insgesamt 100 ml Lösungsmittel), woraus sich nach Eindampfen des Lösungsmittels und Lyophilisation von 2-Methyl-2-propanol/Wasser, 58 mg (10%) eines flockigen weißen Festkörpers ergab, der als mPEG-S-S-PPO-DS (Verbindung XII) identifiziert wurde. 1H NMR (360 MHz, CDCl&sub3;) δ 5,32 (bs, 1), 6,20 (bs, 1), 5,09 (m, 1), 4,91 (bm, 3), 4,28 (dd, 1, J = 4,0 Hz, 12,2 Hz), 4,22 (pt, 2, J = 4,7 Hz), 4,12 (dd, 1, J = 5,6 Hz, 11,8 Hz), 3,83 (m, 1), 3,64 (m, ~180), 3; 58-3,51 (bm, ~70), 3,39 (bm, 35), 3,37 (s, 3), 2,80 (pt, 4, J = 6,8 Hz, 5,9 Hz), 2,30 (pt, 4, J = 7,4 Hz, 7,5 Hz), 1,61 (bm, 4), 1,32-1,22 (bm, ~62), 1,13 (d, ~99, J = 6,9 Hz), 0,88 (t, 6, J = 6,6 Hz). MALDI-TOF Massenspektrum (DHB, Verwendung von 2,5- Dihydroxybenzoat als Matrixmaterial) zeigte das Molekülion des Konjugats, das durch eine bei 4800 zentrierte Linienverteilung dargestellt wurde. Das Spektrum zeigte auch zwei Verteilungen, die die Konjugatfragmente darstellten, die durch Spaltung der Disulfidbindung erzeugt wurden, bei 2100 und 2700 m/z. Die erste war aus Spektrallinien zusammengesetzt, die im gleichen Abstand von jeweils 44 m/z voneinander entfernt wären (Oxyethylen Wiederholungseinheiten), und die zweite Verteilung enthielt Spektrallinien, die im gleichen Abstand von jeweils 58 Einheiten voneinander entfernt waren (Oxypropylen Wiederholungseinheit).

Beispiel 3

Herstellung eines Diblockcopolymer-Lipidkonjugats mPEG-S-S-PPO-DSPE (Verbindung XV)

A. Herstellung von DSPE-PPO-p-Nitrophenylcarbamat (Verbindung XIV)

Die folgende Reaktion ist in Fig. 9 erläutert. DSPE (Verbindung XIII), 220 mg, 0,294 mmol) wurde zu Bis-Nitrophenylcarbonatpolypropylenoxid (Verbindung DC, 1 g, 0,482 mmol, 3 eq) in CHCl3 (5 ml) gegeben. N-Hydroxy-s-norbornen-2,3-dicarbonsäureimid (HONB, 79 mg, 0,441 mmol, 1,5 eq) und TEA (304 ml, 2; 19 mmol, 7; 44 eq) wurden der Reaktionsmischung zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde eine gelbe trübe Lösung. Nach 4 Stunden bei 42ºC wurde die Reaktionsmischung klar (gelb). TLC (CHCl&sub3; : MeOH : H&sub2;O = 90 : 18 : 2) zeigte einen vollständigen Ablauf der Reaktion. Die Produktmischung wurde mit Aberlist 15 Ionenaustauscherharz (sauer, 1,5 g, 4,6 meq/g) und Amberlist 21 Ionenaustauscher (basisch, 1,5 g, 4,8 meq/g) verwirbelt. Dann wurde die Produktmischung in MeOH (3 ml) aufgelöst, Sliziumdioxid (3 g, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, Silika 60 Å, 230-400 mesh) wurde zugefügt und sie wurde eingedampft: Das Produkt wurde durch die folgenden Lösungsmittel eluiert, CHCl&sub3; : CH&sub3;COCH&sub3; = 90 : 10 (100 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 98 : 2 (100 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 96 : 4 (100 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 94 : 6 94 : 6 (100 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 92 : 8 (100 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 92 : 8 (100 ml); CHCl&sub3; : iPrOH = 90 : 10 (200 ml). Fraktionen, die das reine Produkt enthielten, wurden vereinigt und eingedampft. t-BuOH (5 ml) wurde zu dem Produkt gegeben. Das Produkt (Verbindung XIV) wurde unter Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet und als weißer Festkörper (350 mg, 41%) erhalten. ¹H NMR (CDCl&sub3;): δ 0,88 (m, 6H), 1,15 (s, PPO (CH&sub3;CHCH&sub2;), ~105 H), 1,26 (s, CH&sub2;, 56 H), 1,58 (br m, CH&sub2;CH&sub2;CO, 4H) 2,31 (2 · t, CH&sub2;C = 0,4 H), 3,38 (m, PPO(CH&sub3;CHCH&sub2;), 35 H), 3,54 (m, PPO(CH&sub3;CHCH&sub2;), ~70H), 5,20 (m, PO&sub4;CH&sub2;CH, 1 H), 7,38 (d, NO&sub2;C&sub6;H&sub4;PPO, 4 H), 8,38 (d, NO&sub2;C&sub6;H&sub4;PPO, 4 H).

B. Herstellung von mPEG-S-S-PPO-DSPE (Verbindung XV)

Weiterhin wird entsprechend Fig. 9 Verbindung VIII (Beispiel 2B: mPEG- O(C=O)NHCH&sub2;CH&sub2;S-SCH&sub2;CH&sub2;-NH&sub2;; 56 mg, 0,027 mmol, 1,4 eq), Hydroxybenzotriazol (HOBt, 15,2 mg, 0,113 mmol, 6 eq), Molekularsieb (50 mg) und TEA (20 ml, 0,143 mmol, 7,7 eq) zu Verbindung XIV (DSPE-PPO p-Nitrophenylcarbamat) (55 mg, 0,019 mmol, 1 eq) in CHCl&sub3; (600 ml) gegeben. Nach 3 Stunden zeigte die TLC (CHCl&sub3; : MeOH : IPA = 50 : 1 : 49) die Produktbildung jedoch war der Produktfleck sehr hell. Dann wurde DMF (0,2 ml) zu der Reaktionsmischung gegeben und diese bei Raumtemperatur gerührt. Nach 24 Stunden erschien der Produktfleck dunkler als am vorherigen Tag. Die Produktmischung wurde filtriert, lyophilisiert und dann durch Silikagel-Säulenchromatographie gereinigt. Die Produktmischung wurde in CH&sub3;COCH&sub3; : CHCl&sub3; (90 : 10) gelöst und auf die Säule gegeben. Die Säule wurde mit den folgenden Lösungsmitteln eluiert: CHCl&sub3; : CH&sub3;COCH&sub3; = 90 : 10 (50 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 80 : 20 (20 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 60 : 40 (20 ml), CHCl&sub3; : iPrOH : MeOH = 50 : 49 : 1 (20 ml); CHCl&sub3; : iPrOH : MeOH = 50 : 48 : 2 (20 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 92 : 8 (100 ml), CHCl&sub3; : iPrOH = 92 : 8 (100 ml); CHCl&sub3; : iPrOH = 90 : 10 (200 ml). Fraktionen, die die reinen Produkt enthielten wurden vereinigt und eingedampft. t-BuOH (5 ml)wurde zu dem Produkt gegeben. Das Produkt, Verbindung XV, wurde unter Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet und als weißer Festkörper erhalten (350 mg, 41%). ¹H NMR (CDCl&sub3;): δ 0,88 (m, 6 H), 1,15 (s, CH&sub3;CHCH&sub2;, ~105 H); 1,26 (s, CH&sub2;, 56 H), 1,58 br, m, CHCH&sub2;), ~35 H), 3,54 (m, PPO CH&sub3;CHCH&sub2;, ~70 H), 3,64 (s, PEG, 180 H); 5,20 (m, PO&sub4;CH&sub2;CH, 1 H).
MALDI-TOF Massenspektren (DHB Matrix) zeigten das Molekülion des Konjugats, das durch eine bei 5000 zentrierte Linienverteilung dargestellt wurde. Das Spektrum zeigte auch zwei Verteilungen, die die Konjugatfragmente darstellten, die durch Spaltung der Disulfidbindung erzeugt wurden, bei 2100 und 3000 m/z. Die erste war aus Spektrallinien zusammengesetzt, die im gleichen Abstand von jeweils 44 m/z Einheiten voneinander entfernt waren (PEG Wiederholungseinheiten), und die zweite Verteilung enthielt Llinien, die im gleichen Abstand von jeweils 58 Einheiten voneinander entfernt waren (PPO Wiederholungseinheit).

Beispiel 4

Herstellung eines Diblockcopolymer-Lipidkonjugats mPEG-DTP-Amido-PPO-DSPE (Verbindung XX)

A. Herstellung eines Lipidisierten hydrophoben Polymerintermediats Amino-PPO-DSPE (Verbindung XIX)

Nach der Beschreibung von Torchilin wird Distearylphosphatidylglycerol (DSPG, Verbindung XVI Fig. 10A) mit Natriumperiodat (NaIO&sub4;) behandelt. Das resultierende oxidierte Produkt, oxidiertes DSPE (Verbindung XVII) wird dann mit einem Überschuß an Polypropylenoxiddiamin (Diamino-PPO, Verbindung XVIII, n = 10-20) (zum Beispiel Jeffamine®, Texaco, Houston, TX) in Gegenwart von NaCNBH&sub3; reduktiv aminiert unter Bildung des gewünschten Amino-verbundenen Lipid-funktionalisierten hydrophoben Polymers, Amino-PPO-DSPE (Verbindung XIX, Fig. 10A).

B. Herstellung eines Diblockcopolymer-Lipidkonjugats mPEG-DTP-Amido-PPO-DSPE (Verbindung XX)

Das gewünschte Konjugat, mPEG-DTP-Amido-PPO-DSPE (Verbindung XX), das ein hydrophiles endständiges Blockpolymer, PEG, eine innere spaltbare Disulfidbindung und einen an ein endständiges Lipid gebundenen hydrophoben Polypropylenoxidblock aufweist, wird hergestellt durch Kopplung der Intermediate, PEG-DTP-OSu (Verbindung III) und Amino-PPO-DSPE (Verbindung XIX), die nach der Beschreibung in den vorstehenden Beispielen 1A und 4A hergestellt wurden, unter Bildung des gewünschten Copolymer- Lipidkonjugatprodukts, mPEG-DTP-Amido-PPO-DSPE (Verbindung XX):
mPEG-DTP-OSu (Verbindung III) wird nach der Beschreibung in dem vorstehenden Beispiel 1A hergestellt und in CHCl&sub3; gelöst. Eine äquimolare Menge Amino-PPO-DSPE (Verbindung XIX) wird zu der CHCl&sub3;-Lösung von mPEG-DTP-OSu gegeben und in Gegenwart von Triethylamin bei 45ºC bis zur Klärung inkubiert. Das Produkt (Verbindung XX) wird, wie von Zalipsky, 1993 beschrieben ist, gereinigt und das gereinigte Produkt wird dann mittels 1H NMR charakterisiert. Die Abwesenheit von Protonen, die der reaktiven Succinatgruppe zugeordnet werden können, weist auf eine Kupplung der zwei Polymerteile unter Bildung des gewünschten Produkts hin. Dieses Reaktionsschema ist in den Fig. 10A-10B zusammengefasst.

Beispiel 5

Herstellung des Copolymer-Lipidkoniugats verbunden durch eine Disulfidbindung mit erhöhter Labilität

Die Herstellung eines durch ein Disulfid verbundenes mPEG-PPO-DSPE-Konjugats, das eine modifizierte Disulfidbindung mit erhöhter Anfälligkeit gegenüber Spaltung enthält, (zum Beispiel Thiolyse und/oder Hydrolyse) wird ausgeführt, wie nachstehend beschrieben, und ist in Fig. 11 erläutert.
Methoxypoly(ethylenglycol)thiol, mPEG-SH (Verbindung XXI) wird nach dem Verfahren von Zalipsky (1987) hergestellt. Zu einer Lösung mPEG-SH (Verbindung XXI) in Wasser oder Dimethylformamid wird ein Überschuß an 5'5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure), "Ellman's Reagenz" (Verbindung XXII) zugegeben und man lässt die resultierende Reaktionsmischung bei Raumtemperatur (20-25ºC) rühren. Die Reaktionsmischung wird mittels TLC bezüglich des Verschwindens des mPEG-Thiol Ausgangsmaterials kontrolliert oder sie kann alternativ über IR-Analyse (S-H Streckschwingung) von Aliquoten der Reaktionsmischung verfolgt werden. Das resultierende gemischte Disulfidprodukt, mPEG-3- Carboxy-4-nitrophenyldisulfid (Verbindung XXII) wird dann durch Silikagel- Säulenchromatographie zrückgewonnen und gereinigt. Das resultierende Disulfid wird durch 1H NMR Spektroskopie charakterisiert und die relativen Integrale (Peakflächen) der Hochfeldresonanzen, die dem PEG-Teil des Moleküls zugeordnet werden können, und diejenigen der Peaks, die den aromatischen Protonen auf dem substituierten Phenylring entsprechen, werden verglichen, um das Ausmaß der Bildung des Di-PEGylierten Disulfid Nebenprodukts, Di(mPEG)disulfid, zu bestimmen.
Das gemischte Disulfid, mPEG-3-Carboxy-4-nitrophenyldisulfid (Verbindung XXIII) wird vollständig in Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wird Amino-PPO-DSPE (Verbindung XIX), das nach der vorstehenden Beschreibung in Beispiel 4A hergestellt wurde, und das Kopplungsmittel Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, Verbindung XXIV) zugegeben.
Die resultierende Reaktionsmischung wird übernacht bei Raumtemperatur gerührt, bis ein vollständiges Verschwinden von H&sub2;H-PPO-DSPE beobachtet wird, wie durch TLC bestimmt wird. Das resultierende grenzflächenaktive Copolymer-Lipid-Produkt, mPEG-(3-Amido- PPO-DSPE)-(4-nitrophenyl)disulfid (Verbindung XXV) wird durch Silikagel- Säulenchromatographie gereinigt und durch NMR charakterisiert. Das modifizierte Disulfidprodukt besitzt eine erhöhte Anfälligkeit bezüglich der Spaltung der Disulfldbindung, zum Beispiel Angriff durch ein ankommendes Thiol, wie zum Beispiel Cystein oder Glutathion.

Beispiel 6

Herstellung von Folsäure-PEG-DSPE

Aufgrund der geringen Anfälligkeit von Folsäure wurde dieses Verfahren unter wenig geschützten Bedingungen durchgeführt. Wie in Fig. 12A erläutert ist, wurden Folsäure (Verbindung XXVI, 25 mg 5,6 · 10&supmin;&sup5;, 1,6 eq), Amino-PEG-DSPE (Verbindung XXVII, 97 mg, 3,4 · 10&supmin;&sup5;, 1 eq, hergestellt nach der Beschreibung in Zalipsky (1994)) und N-Hydroxy-s- norbomen-2,3-dicarbonsäureimid (HONB, 10 mg, 5,5 · 10&supmin;&sup5;, 1,6 eq) in DMSO (1,0 ml) und Pyridin (0,5 ml) gelöst.
Die Mischung wurde gerührt, bis sie vollständig gelöst war. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 32 mg, 1,5 · 10&supmin;&sup4;, 4,4 eq) wurden zur Einleitung der Reaktion zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt und die Vollständigkeit der Reaktion bei der Bildung von Folsäure-PEG-DSPE (Verbindung XXVIII) wurde mittels TLC (Amino- PEG-DSPE sollte abwesend sein) bestätigt. Dann wurde Pyridin aus der Reaktionsmischung verdampft.
Für die TLC wurden die Proben in 50 ul DMSO gelöst und mit 1,0 ml Chloroform verdünnt. Die Reaktionsmischungen wurden mit Chloroform verdünnt, um Folsäure zu lösen. Mit DMSO übereinstimmende Matrizen behalten den RF-Wert zwischen den Proben bei. Die TLC-Laufmittel waren:
(1) Isopropylalkohol/Ammoniak/Wasser 10 : 1 : 2 (erfordert 40 Minuten) und
(2) Chloroform/Methanol/Wasser 75 : 30 : 5 (erfordert 14 Minuten).
Die Visualisierungstechniken sind U.V. und Dragendorff-Spray. Die RF-Werte und Visualisierungstechniken in TLC-Lösungsmitteln waren:

Beispiel 7

Herstellung von Pyridoxal-PEG-DSPE

Pyridoxal (Verbindung XXIX) und Hydrazid-derivatisiertes an DSPE gebundenes PEG (Verbindung XXX, hergestellt nach der Beschreibung in Zalipsky (1993)) werden bei Raumtemperatur (20-25ºC) in DMF gemischt unter Bildung von dem Pyridoxal-PEG-DSPE- Konjugat (Verbindung XXXI), das in Fig. 12B gezeigt ist.

Beispiel 8

In vitro Liposomenfusion mit wiederversiegelten Erythrozytenghosts

A. Herstellung wiederversiegelter menschlicher Erythrozytenghosts

Menschliches Vollblut der Blutgruppe 0 wurde in ein Heparin-enthaltendes Röhrchen gezogen und die Zellen wurden dreimal mit einem 5x Volumen an kalter Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Nach dem dritten Mal Waschen wurden die Zellen zu einer 50% Volumen/Volumen Suspension in kalter PBS resuspendiert. Die Zellen wurden durch langsames Zuführen von einem ml der 50% Zellsuspension in 100 ml eiskaltes destilliertes Wasser, das 5 mM MgSO&sub4; enthielt unter konstantem Rühren lysiert. Nach 10 Minuten wurden 848 mg festes NaCl der Suspension zugegeben, um die Isotonizität wiederherzustellen. Die Ghosts wurden durch Inkubieren der Suspension bei 37ºC während einer Stunde wiederversiegelt. Die Suspension wurde in Zentrifugenröhrchen überführt und bei 10000 rpm während 30 Minuten bei 4ºC geschleudert. Die pelletisierten "rosa" Erythrozytenghosts wurden in 5% Glucose (5% Volumen/Volumen) resuspendiert.

B. Herstellung der Liposomen

Lipide mit einer Gesamtmenge von 20 mg, wie sie in der Tabelle aufgezeigt sind, wurden in 1 ml Diethylether in einem 10 ml Schraubdeckel-Kulturröhrchen gelöst.
Menge (Mol%) Lipidkomponente
5 1,2-Diolyloxy-3-(Trimethylamino)propan (DOTAP)
10 Lysophosphatidylcholin
5 mPEG-S-S-PPO-DS (Verbindung XII, Fig. 8)
40 Cholesterol
40 teilweise hydriertes Sojaphosphatidylcholin (IV 40-45)
Die Mischung wurde leicht erhitzt, um die Lipide zu lösen und 0,3 ml einer 100 mM Lösung von 6-Carboxyfluorescin (6-CF) in destilliertem Wasser (300 mOsm) wurden zugegeben. Die zwei Phasen wurden durch Beschallung in einem Beschaller vonm Badtyp während 10 Minuten bei Raumtemperatur emulgiert. Das Röhrchen wurde in eine Verdampfungsbuchse gesetzt und an einem Rotationsverdampfer befestigt. Ein ausreichendes Vakuum wurde angewandt, um langsam den Ether über einer Zeitdauer von ungefähr 10 Minuten zu verdampfen. Die Muffe wurde in ein Wasserbad bei 37ºC getaucht und das Vakuum wurde langsam erhöht. Als der Ether verdampfte, bildete sich ein Gel, das schließlich zusammenfiel. Zusätzlich wurden 0,05 ml der 6-CF-Lösung zugegeben und die Suspension verwirbelt. Der übrige restliche Ether wurde entfernt, indem an das Röhrchen während 10 Minuten ein Hochvakuum angelegt wurde. Die auf diese Weise gebildete Liposomensuspension wurde über eine Sephadex G-75 Säule (10 mm · 25 cm) gegeben, die mit einer 5% Glucoselösung äquilibriert worden war. Die Liposomen, die mit dem Hohlraumvolumen der Säule eluierten wurden gesammelt und ohne weitere Reinigung verwendet.

C. Liposomen-Erythrozytenghost Fusionsexperiment

0,5 ml der eiskalten Suspension wiederversiegelter Erythrozytenghosts wurde in zwei Zentrifugenröhrchen gegeben und zu jedem wurden 10 Mikroliter der Liposomenlösung gegeben. Die Liposomen banden schnell an die Ghosts, wie durch die Ausweitung der unmittelbaren Agglutination der Ghosts augenscheinlich wurde. Beide Röhrchen ließ man in einem Eisbad während 1 Stunde inkubieren, um die Liposomen die Ghosts vollständiger binden zu lassen. Zur Sicherstellung eines engen Kontakts zwischen den Liposomen und den Ghostmembranen wurde die Mischung bei 1000 · G während 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Nach dem Zentrifugierungsschritt wurden 10 Mikroliter einer 0,1 M Lösung von Dithiothreitol (DTT) in 5%-iger Glucoselösung zu einem Röhrchen gegeben und 10 Mikroliter 5%-iger Glucoselösung zu dem anderen als Kontrolle. Man ließ die Röhrchen während 2 Stunden in dem Kühlschrank inkubieren. Die Röhrchen wurden zum Resuspendieren der Ghostzellen aufgewirbelt und von jedem wurde eine 10 Mikroliter Probe entfernt und auf einen Glasobjektträger für ein Mikroskop gegeben. Ein Deckglas wurde über die Suspension gelegt und die Objektträger wurden sowohl phasenkontrastoptisch als auch fluoreszensoptisch bei einer Vergrößerung von x630 untersucht. Eine mikrophotographische Aufnahme der Probe, die DTT ausgesetzt war und fluoreszenzoptisch beobachtet wurde, ist in Fig. 13 gezeigt. Die Kontrolle, die Ghosts enthielt, die an Liposomen gebunden waren, die nicht DTT ausgesetzt waren, zeigte keinen Beweis für eine Lipsomen-Zellfusion, das heißt keine der Ghosts in dem optischen Feld unter Fluoreszenzoptik zeigte eine innere Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu zeigten mehr als 30% der gesamten Ghostzellen, die an Liposomen gebunden waren und die DTT ausgesetzt waren, eine intensive innere Fluoreszenz, die darauf hinwies, dass die 6-CF-enthaltenden Liposomen mit den Ghostmembranen verschmolzen.

Beispiel 9

In vivo Verabreichung von freisetzbarern PEG-Liposomen

A. Liposomenformulierungen

Kationische Liposomen, die eine PEG-Oberflächenschicht aufwiesen und die an Luciferase- enthaltende Plasmide komplexiert waren, wurden folgendermaßen hergestellt.

B. Herstellung kationischer Liposomen/Plasmid-Komplexe

Kationische Liposomen, die aus den Lipiden Dimethyldioctadecylammonium und Cholesterol (DDAB : Chol) zusammengesetzt waren, wurden nach Standardverfahren hergestellt, indem 10 umol DDAB und 10 umol Chol in einem organischen Lösungsmittel, das hauptsächlich CHCl&sub3; enthielt, gelöst wurden. Die Lipidlösung wurde durch Rotation unter vermindertem Druck als dünner Film getrocknet. Der Lipidfilm wurde durch die Zugabe der gewünschten wässrigen Phase hydratisiert, zum Beispiel Wasser, Salzlösung oder Puffer, unter Bildung von Liposomen (bei einer gesamten Lipidkonzentration von 20 umol/ml), die durch Beschallung oder durch sequentielle Extrusion durch Nucleopore Polycarbonatmembranen mit Porengrößen von 0,4 um, 0,2 um, 0,1 um und 0,05 um dimensioniert wurden, um Liposomen mit einer Größe von 100-150 nm zu erhalten.
Ein Luciferaseplasmid wurde als Reportergen verwendet. Das Plasmid wurde zur Komplexierung mit den kationischen Liposomen durch Zugabe von 100 ul einer Lösung, die insgesamt 1 mg/ml Histon in einem wässrigen Medium enthielt, zu 400 ul eines solubilisierten Plasmids (1 mg Plasmid/ml) kondensiert. Das kondensierte Plasmid hatte einen mittleren Durchmesser von näherungsweise 150 nm, wie durch dynamische Lichtstreuung gemessen wurde.
Kationische Liposomen/kondensierte Plasmid-Komplexe wurden hergestellt durch Zugabe von 280 ul der kationischen Liposomensuspension (20 umol/ml) zu S00 ul der Histon- kondensierten Plasmidteilchen. Die Liposom-Plasmid-Komplexe hatten einen mittleren Durchmesser von ungefähr 200 nm, wie durch dynamische Lichtstreuung gemessen wurde.

C. Insertion von PEG

Distearylphosphatidylethanolamin (DSPE) wurde mit PEG derivatisiert, wie von Zalipsky, 1992a beschrieben wurde. PEG-DSPE-Micellen wurden aus PEG-DSPE hergestellt durch Lösen von 1 mM in Wasser und Beschallen.
PEG-DTP-DSPE-Micellen, das heißt an DSPE über eine spaltbare Disulfidbindung gebundenes PEG (Verbindung XXV, hergestellt nach der vorstehenden Beschreibung in Beispiel 5), wurden durch Lösen von 1 mM PEG-DTP-DSPE in Wasser und Beschallen hergestellt.
Liposome, die 2,5 Mol% PEG-DSPE enthielten, wurden hergestellt durch Zugabe von 140 ul derPEG-DSPE-Micellensuspension (1 umol Lipid/ml) zu 5,6 umol Lipid der kationischen Lipid/Plasmid-Komplexe. Die Micellen-Komplex-Suspension wurde während 5 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Aufwirbeln inkubiert, um eine Insertion des PEG-DSPE in die kationischen Liposomen (Uster) zu erreichen. Diese Liposomenformulierung ist in den Fig. 14A-14B als "PEG" bezeichnet.
Liposomen, die 1 Mol% PEG-DSPE und 1 Mol% PEG-DTP-DSPE enthielten, wurden hegestellt, wie vorstehend für die 2,5% PEG-DSPE lipsomale Zusammensetzung beschrieben wurde, außer, dass der kationische Liposom-Plasmid-Komplex mit PEG-DSPE- und PEG- DTP-DSPE-Micellen inkubiert wurde unter Bildung von Liposomen mit einer Oberflächenschicht aus PEG-Ketten, bei der die Hälfte der PEG-Ketten trennbar an die Liposomenoberfläche gebunden war. Diese Liposomenformulierung wird in den Fig. 14A-14B als "PEG + R-PEG" bezeichnet.
Liposomen, die 2,5 Mol% PEG-DTP-DSPE enthielten, wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt, außer, dass das die gesamte enthaltene PEG- Menge PEG PEG-DTP-DSPE war. Diese Liposomenformulierung wird in den Fig. 14A-14B als "R-PEG" bezeichnet.

D. In vivo Verabreichung

Die PEG-beschichteten kationischen Liposomen-Plasmid-Komplexe wurden an BALB/c Mäuse, die von Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) bezogen wurden, durch Einspritzen von ungefähr 100 nmol Lipid in 0,2-0,25 ml (näherungsweise 100 ug Plasmid) in die Schwanzvenen von 3 Mäusen verabreicht. 5 Minuten nach der Verabreichung der Liposomen wurde 250 ul von 100 mM Cystein über die Schwanzvene in jede Maus eingespritzt. 24 Stunden nach der Einspritzung wurden die Mäuse geopfert und die Gewebe (Lunge, Leber) wurden nach Perfusion mit heparinisiertem PBS (4ºC) unter Anästhesie gesammelt.
Bei einer Temperatur von zwischen 0,4ºC wurde 0,75 ml des Zellysereagenz (Promega, Madison, WI) zu jedem Gewebe gegeben und das Gewebe wurde 1 Minute bei 20000 rpm homogenisiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde in ein Mikrozentrifugen-Röhrchen überführt und bei 10000 g während 5 Minuten geschleudert. Die überstehende Flüssigkeit wurde für Luciferase- und Proteinassays gesammelt. 20 ul wurden von jeder Probe unmittelbar mit einem Luminometer gemessen (der Assaypuffer enthielt 100 ul Luciferin und ATP, 10 Sekunden Messung). Die relative Lichteinheit wurde durch die Proteinmenge in den Extrakten skaliert.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 14A-14B gezeigt.

Beispiel 10

Liposomenherstellung

Fusiogene Liposomen wurden nach Standardverfahren hergestellt durch Auflösen der folgenden Lipide in Chloroform: 85 Mol% Distearylphosphatidylglycerol (DSPG), 10 Mol% des nach der Beschreibung in den Beispielen 2, 3 oder 4 hergestellten Copolymer- Lipidkonjugats, 1 Mol% des nach der Beschreibung in den Beispielen 6 oder 7 hergestellten Ligand-PEG-DSPE und 4 Mol% Cholesterol. Die Lipide werden als dünner Film durch Rotation unter vermindertem Druck getrocknet. Der Lipidfilm wird durch Zugabe einer wässrigen Phase unter Bildung von Liposomen hydratisiert, die durch Beschallung oder durch sequentielle Extrusion durch Nucleopore Polycarbonatmembranen mit Porengrößen von 0,4 um, 0,2 um, 0,1 um und 0,5 um in ihrer Größe dimensioniert werden, wodurch Liposomen mit einer Größe von 100-150 nm erhalten wurden.

Beispiel 11

Liposomen mit eingeschlossenem DNA-Plasmid

Das DNA-Plasmid pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI) wird mit Spermidin kondensiert (freie Base, Sigma Chemical Co (St Louis, MO)) und dann in die fusiogenen Liposomen folgendermaßen eineschlossen.
Eine 10 inM Tris-Pufferlösung, mit einem pH-Wert von 7,5, die 0,1 mM Spermidin enthält wird hergestellt. Zu 1 ml der Pufferlösung (14,52 ug Spermidin) werden 30 ug Plasmid von einer wässrigen Lösung, die 0,6 ug pGL3/ul enthält, zugegeben. Die Plasmid- Permidinlösung, die ungefähr 2 ug Plasmid/ug Spermidin enthält, wird unter Bildung von kondensierten einzelnen pGL3-Molekülen gemischt.
Ein trockener Lipidfilm wird nach der Beschreibung in Beispiel 10 hergestellt und dann mit der Plasmid-Spennidinlösung rehydratisiert unter Bildung von fusiogenen Liposomen mit eingeschlossenen kondensierten pGL3-Plasmidmolekülen.

Claims

1. Liposomenzusammensetzung zur Fusion mit einer Targetmembran, umfassend eine Liposomensuspension, welche für das Targeting an die Targetmembran ausgelegt ist, wobei jedes Liposom (i) ein in die Liposomen eingeschlossenes therapeutisches Mittel enthält und (ii) aus Vesikelbildenden Lipiden aufgebaut ist, wobei ein Teil der Lipide mit einem Diblockcopolymer derivatisiert ist, das aus einer hydrophoben Polymerkette, welche kovalent an das Lipid gebunden ist, und aus einer hydrophilen Polymerkette aufgebaut ist, wobei die hydrophoben und hydrophilen Ketten durch eine chemisch trennbare Bindung zur Freisetzung der hydrophilen Polymerketten und zum Aussetzen der hydrophoben Polymerketten verbunden sind.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Liposomen ferner aus Vesikel-bildenden Lipiden aufgebaut sind, welche eine hydrophile Polymerkette aufweisen, die mit einem Vesikel-bildenden Lipid über eine chemisch-trennbare Bindung verbunden ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die trennbare Bindung eine Disulfidbindung oder eine pH-sensitive chemische Verknüpfung ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die hydrophilen Polymerketten aus einem hydrophilen Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglycol und Polyaspartamid, aufgebaut ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die hydrophilen Polymerketten aus Polyethylenglycolketten mit einem Molekulargewicht von zwischen 500-10.000 Dalton aufgebaut sind.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe Polymer aus der Gruppe, bestehend aus Polypropylenoxid, Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol, Polysulfon, Polyphenylenoxid und Polytetramethylenether, ausgewählt ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das hydrophobe Polymer Polypropylenoxid mit einem Molekulargewicht von zwischen 500-3.000 Dalton ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe Polymer ein lineares Polymer ist, welches wirksam ist, die Hämolyse roter Blutkörperchen zu bewirken, wenn ein wasserlösliches Triblockcopolymer, welches die hydrophoben Polymerketten und die hydrophilen Polymerketten enthält, die an den gegenüberliegenden Enden mit den hydrophoben Polymerketten durch Disulfidbrücken verknüpft sind, zusammen mit solchen Zellen inkubiert wird und das Inkubat mit einem reduzierenden Mittel behandelt wird.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Liposomen ferner einen Liganden enthalten, welcher an einem abgewandten Ende der hydrophilen Polymerketten gebunden ist, wobei der Ligand für die Liganden- spezifische Bindung an ein Rezeptormolekül auf einer Targetzellenoberfläche vor der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerketten wirksam ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (1) Folat, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorzellen mit Folatrezeptoren an der Zelloberfläche bestimmt ist, (ii) Pyridoxil, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von virusinfizierten CD&sup4;&spplus;-Lymphozyten bestimmt ist, und (iii) Sialyl-Lewisx, wobei die Zusammensetzung für die Behandlung eines entzündeten Bereichs bestimmt ist, ausgewählt ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Liposomen ferner einen mit der Liposomenoberfläche verbundenen Liganden einschließen, wobei der Ligand wirksam ist, an ein Rezeptormolekül auf der Targetzellenoberfläche nach, aber nicht vor der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerketten zu binden.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Liposomen ferner ein kationisches Lipid enthalten, welches wirksam ist, den Liposomen eine positive Oberflächenladung zu verleihen, um das Binden der Liposomen an die Targetzellen nach, aber nicht vor der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerketten zu steigern.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das in die Lipidvesikel eingeschlossene Mittel ein Polynukleotid ist, welches befähigt ist, ein ausgewähltes Protein zu exprimieren, wenn durch eine Targetzelle aufgenommen.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das in die Liposomen eingeschlossene Mittel ein Oligonukleotid ist, welches für die Sequenzspezifische Bindung an zelluläre RNA oder DNA wirksam ist.

15. Verwendung einer Liposomenzusammensetzung für die Herstellung eines Medikamentes zum Abgeben einer Verbindung an Targetzellen in einem Patienten, umfassend

die parenterale Verabreichung von Liposomen, die zum Erreichen der Targetzellen über den Blutstrom ausgelegt sind, an den Patienten, wobei jedes Liposom die Verbindung in eingeschlossener Form enthält und aus Vesikel-bildenden Lipiden aufgebaut ist, wobei ein Teil der Lipide mit einem Diblockcopolymer derivatisiert ist, welches aus einer hydrophoben Polymerkette, die kovalent an das Lipid gebunden ist, und einer hydrophilen Polymerkette aufgebaut ist, wobei die hydrophoben und hydrophilen Ketten durch eine chemisch trennbare Bindung zur Freisetzung der hydrophilen Polymerketten und zum Aussetzen der hydrophoben Polymerketten verknüpft sind, und

das Kontaktieren der Liposomen an den Targetzellen mit einem chemischen Mittel, welches wirksam ist, die hydrophilen Ketten, welche die Oberflächenschicht bilden, freizusetzen, um so die hydrophoben Polymere zur Wechselwirkung mit äußeren Zellmembranen der Targetzellen auszusetzen und die Fusion das Liposoms mit den Targetzellen zu fördern.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Kontaktieren das Verabreichen eines reduzierenden Mittels an den Patienten einschließt, welches wirksam ist, die Ketten freizusetzen.

17. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die chemische Verknüpfung eine Disulfidverknüpfung ist und das reduzierende Mittel aus der Gruppe, bestehend aus Cystein, Glutathion und Ascorbat, ausgewählt ist.

18. Verwendung nach Anspruch 15, wobei jede der hydrophilen Polymerketten an das Liposom über eine pH-Wert-sensitive chemische Bindung freisetzbar gebunden ist und das Kontaktieren das Targeting der Liposomen an eine Stelle einschließt, die einen pH-Wert aufweist, der wirksam ist, die Ketten freizusetzen.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Liposomen Größen zwischen 0,03 bis 0,40 um für die Extravasation in einen soliden Tumor aufweisen.

20. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Liposomen ferner einen Liganden enthalten, der an ein abgewandtes Ende der hydrophilen Polymerketten gebunden ist, wobei der Ligand für die Liganden-spezifische Bindung an ein Rezeptormolekül auf einer Targetzellenoberfläche vor der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerschicht wirksam ist.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (i) Folat, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorzellen mit Folatrezeptoren auf der Zelloberfläche bestimmt ist, (ii) Pyridoxil, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von virusinfizierten CD&sup4;&spplus;-Lymphozyten bestimmt ist, und (iii) Sialyl-Lewisx, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung eines entzündeten Bereichs bestimmt ist, ausgewählt ist.

22. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Liposomen ferner einen mit der Liposomenoberfläche verbundenen Liganden einschließen, wobei der Ligand wirksam ist, an ein Rezeptormolekül einer Targetzelleoberfläche nach, aber nicht vor der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerschicht zu binden.

23. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Liposomen ferner ein kationisches Lipid enthalten, das wirksam ist, eine positive Liposomenoberflächenladung zu verleihen, um das Binden der Liposomen an die Targetzellen nach, aber nicht vor der chemischen Freisetzung der hydrophilen Polymerschicht zu steigern.

24. Verfahren zum Screenen eines hydrophoben Polymers hinsichtlich fusiogener Aktivität mit einer Targetmembran, umfassend

das Zugeben eines Triblockcopolymers, welches aus einem Segment eines zu testenden hydrophoben Polymers aufgebaut ist und wobei an jedem Ende des Polymersegments durch eine chemisch trennbare Bindung ein hydrophiles Polymersegment gebunden ist, welches wirksam ist, das hydrophobe Polymersegment in der Suspension zu solubilisieren, zu einer Suspension von Targetzellen,

das Freisetzen der hydrophilen Polymere, um die hydrophoben Segmente den Targetzellen auszusetzen, und

das Analysieren der Suspension auf die Lyse der Targetzellen.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Targetzellen Erythrozyten sind.

26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die trennbare Bindung eine Disulfidbindung ist und das Freisetzen das Zugeben eines reduzierenden Mittels zu der Suspension einschließt.

27. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das hydrophile Polymer Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von zwischen 1.000-5.000 Dalton ist.

28. Polymer-Lipid-Konjugat zur Verwendung der Fusionsförderung zwischen Targetmembranen, umfassend

ein erstes, aus einem hydrophilen Polymer aufgebautes Segment,

ein zweites, aus einem hydrophoben Polymer aufgebautes Segment, wobei das zweite Segment an das erste Segment durch eine chemisch trennbare Bindung gebunden ist, und

ein an das zweite Segment gebundenes Vesikel-bildendes Lipidteil.

29. Konjugat nach Anspruch 28, wobei eine der Targetmembranen eine Doppelschichtmembran eines Liposomenlipids ist.

30. Konjugat nach Anspruch 29, wobei das Konjugat in die Liposomenlipidmembran eingebracht ist, wobei die ersten und zweiten Segmente orientiert sind, sich von der Liposomenoberfläche zu erstrecken.

31. Konjugat nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei das zweite Segment ein hydrophobes Homopolymer ist.

32. Konjugat nach Anspruch 31, wobei das Homopolymer aus der Gruppe, bestehend aus Polypropylenoxid, Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol, Polysulfon, Polyphenylenoxid und Polytetramethylenether, ausgewählt ist.

33. Konjugat nach Anspruch 31, wobei das hydrophobe Polymer ein Polypropylenoxid mit einem Molekulargewicht von zwischen 500-3.000 Dalton ist.

34. Konjugat nach Anspruch 31, wobei die Bindung eine Schwefelhaltige Bindung ist.

35. Konjugat nach Anspruch 31, wobei die Bindung pH-Wert-sensitiv ist oder für Thiolyse oder Hydrolyse empfindlich ist.

36. Konjugat nach Anspruch 31, wobei die hydrophile Polymerketten aus einem hydrophilen Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglycol und Polyaspartamid, aufgebaut sind.

37. Konjugat nach Anspruch 31, wobei die hydrophilen Polymerketten aus Polyethylenglycolketten mit einem Molekulargewicht von zwischen 500- 10.000 Daltons aufgebaut sind.

38. Konjugat nach Anspruch 31, welches ferner einen Liganden einschließt, der an ein abgewandtes Ende der hydrophilen Polymerketten gebunden ist, wobei der Ligand für die Liganden-spezifische Bindung an ein Rezeptormolekül auf einer Targetzellenoberfläche wirksam ist.