KR20210060480A - 전령 rna의 정제 방법 - Google Patents

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트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은, 무엇보다도, 치료적 사용을 위해 정상 유동 여과에 기초하여 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.

Description

전령 RNA의 정제 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/722,674호의 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 통합된다.
전령 RNA(mRNA) 치료제는 유망한 새로운 치료제이며; 예를 들어, mRNA 치료제는 전통적인 단백질 대체 요법, 항체 요법, 백신 요법 및/또는 유전자 요법에 대한 대안일 수 있다. mRNA 치료제의 경우, 특이적 효소, 항체, 항원, 또는 다른 단백질이나 펩티드를 암호화하는 온전한 mRNA가 표적 세포에 전달되고, 세포 자체의 고유한 번역 기계에 의해 온전한 효소, 항체, 항원, 또는 다른 단백질이나 펩티드로 번역된다. 이러한 치료제용 mRNA는 일반적으로 시험관 내 전사 시스템을 이용해, 템플릿 플라스미드 DNA로부터 mRNA를 전사하는 RNA 중합효소와 같은 효소와 합성되는데, 5'-캡핑과 3'-폴리아데닐화가 합성과 함께 이루어지거나 합성 후에 이어진다. 이러한 반응(들)에 의해 전장 mRNA 및 다양한 바람직하지 않은 오염물, 예를 들어, 반응(들)에 사용된 단백질, 염, 완충액, 및 비-RNA 핵산 등을 포함하는 조성물이 생성되는데, mRNA 대체 치료제에 사용할 수 있는 깨끗하고 균질한 mRNA를 제공하기 위해서는 이러한 오염물을 제거해야만 한다.
전통적으로, 작은 규모의 mRNA는 Qiagen RNeasy® 키트와 같은 상업적으로 이용 가능한 실리카 기반 컬럼 시스템에 의하거나, 유기 혼합물(페놀:클로로포름:이소아밀 알코올)로의 단백질 추출에 이어지는 에탄올 침전에 의한 시험관 내 전사 반응을 통해 정제된다. 이들 방법이 제공할 수 있는 깨끗하고 균질한 mRNA는 최대 5 내지 10 mg으로 그 규모가 제한되므로, 이들 방법은 mRNA를 임상적 및 상업적 치료제로서 사용하고자 하는 요구에 부합하지 못한다.
본 발명은, 시험관 내에서 합성한 mRNA를 정상 유동 여과를 사용해 임상적 또는 상업적 치료제로서 사용하기에 적합한 순도까지 효율적으로 정제할 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초하여, 시험관 내에서 합성된 mRNA에 대한 개선된 대규모 정제 방법을 제공한다. 유의하게는, 본원에 기술된 정상적인 유동 여과 방법은 고순도의 무결성 mRNA를 예상 외의 높은 수율로 생성할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 치료적 사용을 위한 고품질 mRNA를 보다 효율적으로 및 저비용으로 생산할 수 있게 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정상 유동 여과(normal flow filtration)"는 정제될 물질을 필터 표면에 대해 법선(즉, 수직) 방향으로 유동시키는 여과 공정을 지칭한다. 필터를 통과하기에 너무 큰 물질은 남는 반면, 더 작은 물질은 필터를 통과해 여액이 된다.
일 양태에서, 본 발명은 전령 RNA(mRNA)를 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) mRNA를 제조하는 단계에서 생긴 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물에 mRNA를 침전시켜, 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액을 제공하는 단계; (b) 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액에 필터를 적용하는 단계로서, 침전된 mRNA는 필터에 잔류하는 단계; (c) 잔류하는 침전된 mRNA를 포함하는 단계 (b)의 필터를 세척함으로써 침전된 mRNA를 세척하는 단계; (d) 단계 (c)에서 필터에 의해 잔류된 침전된 mRNA를 용해시켜, 정제된 mRNA가 필터를 통과할 수 있게 하는 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 정제된 mRNA를 회수하는 단계를 포함하되, 단계 (b), (c), 및 (d) 각각은 정상 유동 여과를 사용해 수행된다.
일부 구현예에서, mRNA를 제조하는 단계는 시험관 내 전사(IVT) 합성을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 제조하는 단계는 합성 후에 mRNA의 5'-캡핑 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 제조하는 단계는 mRNA의 5'-캡핑 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (e)에 이어서, 정제된 mRNA를 5'캡으로 캡핑하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 제조하는 단계는 mRNA의 3'-테일링 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 제조하는 단계는 mRNA의 3'-테일링 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (e)에 이어서, 정제된 mRNA의 3' 테일링 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 제조하는 단계는 mRNA의 5'-캡핑 단계를 포함하지 않고 mRNA의 3'-테일링 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (e)에 이어서, 정제된 mRNA를 5'캡으로 캡핑하는 단계 및 정제된 mRNA의 3' 테일링 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 오염물은 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 효소는 mRNA의 IVT 합성에 사용되는 중합효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 캡핑 효소이다. 일부 구현예에서, 효소는 폴리 A 중합효소이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 오염물은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 오염물은 짧은 미성숙 전사체(abortive transcripts)를 포함한다.
일부 구현예에서, 정상 유동 여과에 적합한 필터는, 침전된 mRNA보다 실질적으로 더 작고 가용성 mRNA 또는 오염 물질보다 더 큰 기공 크기(예: 기공 직경) 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가짐으로써 침전된 mRNA는 필터 상에 잔류할 수 있는 반면, 가용성 오염 물질은 이를 통과한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 필터는 멤브레인 필터(membrane filter)이다. 일부 구현예에서, 멤브레인 필터는 침전된 mRNA보다 실질적으로 작고 가용성 mRNA 또는 오염물보다 큰 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는다.
일부 구현예에서, 멤브레인 필터는 주름형 필터, 래핑형 필터, 또는 캡슐 필터의 포맷을 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 필터 스크린을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 필터는 심층 필터(depth filter)이다. 일부 구현예에서, 심층 필터는 침전된 mRNA보다 실질적으로 작고 가용성 mRNA 또는 오염물보다 큰 기공 크기 또는 기공 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 필터는 불활성 물질로 만들어진다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 불활성 물질은 폴리프로필렌이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 변형된 폴리에테르 술폰(mPES)이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 폴리에테르 술폰(PES)이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 셀룰로오스이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 규조토이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 니트로셀룰로오스이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 폴리에틸렌이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 폴리아크릴로니트릴이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 폴리카보네이트이다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 나일론이다.
일부 구현예에서, 필터는 하나 이상의 3차원 매트릭스를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 3차원 매트릭스는 펠트 매트릭스이다. 일부 구현예에서, 펠트의 두께는 약 1밀리미터(mm) 내지 약 1 센티미터(cm) (예를 들어, 약 1~500 mm, 약 1~400 mm, 약 1~300 mm, 약 1~200 mm, 약 1~100 mm, 약 1~50 mm, 약 1~40 mm, 약 1~30 mm, 약 1~20 mm, 약 1~10 mm, 또는 약 1~5 mm)이다. 일부 구현예에서, 펠트의 두께는 1 내지 10 mm이다. 일부 구현예에서, 펠트의 두께는 1 내지 5 mm이다. 일부 구현예에서, 펠트의 두께는 1 cm 미만, 0.5 cm 미만, 0.4 cm 미만, 0.3 cm 미만, 0.25 cm 미만, 0.2 cm 미만, 0.1 cm 미만, 50 mm 미만, 40 mm 미만, 30 mm 미만, 25 mm 미만, 20 mm 미만, 15 mm 미만, 10 mm 미만, 또는 5 mm 미만이다. 일부 구현예에서, 필터는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 3차원 매트릭스를 포함한다. 일부 구현예에서, 필터는 적층식 3차원 매트릭스를 포함한다.
일부 구현예에서, 필터는 침전된 mRNA의 잔류를 용이하게 하는 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 0.001 μm 내지 500 μm, 0.01 μm 내지 200 μm, 또는 0.05 μm 내지 100 μm의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 0.05 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 0.5 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 5 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 10 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 20 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 25 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 필터는 침전된 mRNA의 포획 및/또는 분포를 용이하게 하는 총 표면적을 갖는다. 특정 구현예에서, 필터는 필터 상에 분포된 mRNA의 양에 대해 겔 층을 제공하지 않는 총 표면적을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 침전된 mRNA를 함유하는 현탁액에 첨가되는 분산제를 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 유기 용매의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 에탄올의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 유기 용매를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 유기 용매를 포함하지 않으며, mRNA는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 침전된다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 PEG를 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 유기 용매를 포함하지 않으며, mRNA를 침전시키기 위한 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 유기 용매를 포함하지 않으며, mRNA를 침전시키기 위한 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 MTEG의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 하나 이상의 염 세척액으로 침전된 mRNA를 세척하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매로 1회 이상 세척하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 에탄올 세척제 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매를 포함하지 않으며 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 PEG를 포함하는 하나 이상의 세척제를 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 90 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 80 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 70 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 60 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 50 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 40 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 30 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 20 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 10 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다.
일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매를 포함하지 않으며 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG를 포함하는 하나 이상의 세척제를 포함한다.
일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매를 포함하지 않으며 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 MTEG를 포함하는 하나 이상의 세척제를 포함한다.
일부 구현예에서, 정상 유동 여과는: 일정한 유동; 일정한 압력; 가변 유동; 가변 압력; 위킹 및 중력 제어에 의한 유동 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 정상 유동 여과는 일회용 시스템 및/또는 필터를 포함한다. 일부 구현예에서, 정상 유동 여과는 여러 번 사용하기 위한 시스템 및/또는 필터를 포함한다.
일부 구현예에서, 회수 단계는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
물/완충액의 재순환;
물/완충액의 1회 관류; 및
물/완충액의 역 방향 관류.
본 발명에 따른 방법은 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 임의의 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 대사 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩티드는 효소이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 수용체 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 분비된 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 분비되지 않은 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 시토졸 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 핵 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 미토콘드리아 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 리소좀 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 소포체(endoplasmic reticulum) 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 골지(Golgi) 단백질 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 또는 펩티드는 구조막 단백질 또는 펩티드이다.
일부 구현예에서, 단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 단백질은 항원이다. 일부 구현예에서, 단백질은 암 관련 항원이다. 일부 구현예에서, 단백질은 백신이다. 일부 구현예에서, 단백질은 ABC7, ABCB3, ABCB7, ABCC7, ABCD1, AKT; AKT2, AKT3, ATF4, AKT2; AKT3; ALAS2, 알파 갈락토시다아제, 알파-1 프로테아제 억제제, APA, APC; APOA1, APOE, 항-트립신 알파 1, 아르기노숙시네이트 합성 효소, ASAT; ATM; ATP7B, ATR; 아트로핀-1; ATX3; Atxn10; ATXN2; Atxn7; ATXNl; Bax; Bcl2; Bcl2; BRCA1; BRCA2; 카바밀 포스페이트 합성 효소, CASP8, CBP (Creb-BP); CDKN2a; CFTR, CREB1, CVAP, CYP1Bl, DBA, DMD, DMPK; EGFR, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, EIF2B4; ERBB2; ERBB3; ERBB4; 에리트로포이에틴, 인자 IX, 인자 V; 인자 VII, 인자 VII; 인자 VIII; 인자 VIIIa 경쇄, 인자 X; 인자 XI (F11); 인자 XII 결핍 (F12, HAF); 인자 XIIIA (F13Al, F13A); 인자 XIIIB (F13B); FBN1, FGF 수용체 패밀리 구성원; FHL3; FKRP, FXN/X25; FXR1, G6PC, G6PT, GAA, 갈락토스-1-포스페이트 유리딜릴트랜스퍼라아제, GLUT2, H1Fla; HBA1; HBB; HBA2, HBB, HBD, 헤파란 N-설파타아제, HIF; HIF3a; HLH3, HPLH2, HPLH3, 헌팅틴, IDH2; IDH1, IGF 수용체; IGF; IGF1R, Igf2 수용체; Igf2; Igfl 수용체; Igfl; ITGB2, KIAA1596; Kras; LCRB, 메틸말로닐-CoA 뮤타아제, MRP7, MUNC13-4, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다아제, NOS3, NPC1, OTC (오르니틴 트랜스카바밀라아제), PAH, PKHD1, PKD1, PKD2, PKD4, PKLR, PKU1, PPAR 감마; PPAR알파; PRF1, PSEN2, PSF2, PTEN; RB, 망막층간 단백질(Retinoschisin); RING11, SBMA/SMAXl/AR; SEC63, SERPINA1, SERPINA2, SERPINA3, SERPINA5, SERPINA6, SFTPA1, SFTPB, SFTPC, SFTPD, SLC2A, SLC7A9, SMPD1, SPTB, TAP2, TAPBP, TPSN, UNC13D, VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c, VLDLR; 및 WT1로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단백질은 CFTR 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 OTC 단백질이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 총 정제된 mRNA의 높은 회수를 야기한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 수율을 야기하는 양으로 회수된다. 일부 구현예에서, 총 정제된 mRNA는 적어도 약 99%의 수율을 초래하는 양으로 회수된다.
일부 구현예에서, 총 정제된 mRNA는 단백질 오염물이 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 총 정제된 mRNA는 짧은 미성숙 전사체 오염물이 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 총 정제된 mRNA는 95% 초과의 무결성을 갖는다.
일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 순도는 전기영동에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, mRNA의 순도는 모세관 전기영동에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 순도는 크로마토그래피에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 순도는 HPLC에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 적어도 약 0.5 그램의 RNA가 정제된다. 일부 구현예에서, 적어도 약 1 그램의 RNA가 정제된다. 일부 구현예에서, 적어도 약 10 그램의 RNA가 정제된다. 일부 구현예에서, 적어도 약 50 그램의 RNA가 정제된다. 일부 구현예에서, 적어도 약 100 그램의 RNA가 정제된다. 일부 구현예에서, 적어도 약 1 킬로그램의 RNA가 정제된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 시험관 내 전사(IVT) 합성에 의해 제조된 mRNA의 100 gm 이상을 포함하는 조성물을 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: IVT 합성에서 유래된 하나 이상의 오염물을 포함하는 IVT-전사 mRNA를 침전시켜 현탁액을 생성하는 단계; 침전된 mRNA 및 오염물을 포함하는 현탁액을 대상으로 필터를 통한 정상 유동 여과를 수행하는 단계로서, 침전된 mRNA는 필터에 의해 잔류하는 단계; 필터 상에 잔류하는 mRNA를 세척하는 단계; mRNA를 필터로부터 용액으로 회수하여, mRNA를 정제하는 단계로서, mRNA의 적어도 85%가 회수되고, 회수된 mRNA는 90% 이상의 무결성을 가지며, 단백질 오염물이 실질적으로 없는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 적절한 필터(예: 폴리프로필렌 펠트 필터)는 최대 약 264 제곱미터 이상의 총 표면적을 갖는다. 다양한 구현예에서, 적절한 필터(예: 폴리프로필렌 펠트 필터)는 최대 약 528 제곱미터 이상의 총 표면적을 갖는다. 다양한 구현예에서, 적절한 필터(예: 폴리프로필렌 펠트 필터)는 최대 약 1056 제곱미터 이상의 총 표면적을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 정상 유동 여과에 기초한 방법을 사용해 정제된 mRNA는 임의의 추가 정제 단계 없이도 임상 등급 순도를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "임상 등급"은 임상적 사용에 충분한 순도의 등급을 지칭한다. 일부 구현예에서, 임상 등급은 미국 약전(USP) 또는 국립 처방집(NF), 또는 영국 약전 및 유럽 약전에 의해 제시된 표준에 의한 요건을 충족하거나 초과하는 순도를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "약전 등급"은 "임상 등급"과 상호 교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 임상 등급 순도는 HPLC 정제, 리간드 또는 결합 기반 정제, TFF 정제, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피로부터 선택된 추가 정제 단계 없이 달성된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 5% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 4% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 3% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 2% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 4% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 3% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 2% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하는 것으로 결정된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 염 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하의 염 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 4% 이하의 염 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 3% 이하의 염 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 2% 이하의 염 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 1% 이하의 염 오염물을 포함하는 것으로 결정된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 5% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 4% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 3% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 2% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 1% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 4% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 3% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 2% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 1% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하는 것으로 결정된다.
다양한 구현예에서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 무결성을 포함하는 것으로 결정된다. 다양한 구현예에서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 95% 이상의 무결성을 포함하는 것으로 결정된다. 다양한 구현예에서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 96% 이상의 무결성을 포함하는 것으로 결정된다. 다양한 구현예에서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 97% 이상의 무결성을 포함하는 것으로 결정된다. 다양한 구현예에서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 98% 이상의 무결성을 포함하는 것으로 결정된다. 다양한 구현예에서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 98% 이상의 무결성을 포함하는 것으로 결정된다. 다양한 구현예에서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 99% 이상의 무결성을 포함하는 것으로 결정된다.
무엇보다도, 본 발명은 본원에 기술된 다양한 방법을 사용하여 정제된 mRNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 정제된 mRNA 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 발명은 또한 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 언급된 특허 및 과학 문헌은 당업자가 이용할 수 있는 지식을 확립한다. 본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개 또는 미공개 미국 특허 출원은 참조로서 통합된다. 본원에 인용된 모든 공개 또는 미공개 외국 특허 출원은 본원에 참조로서 통합된다. 본원에 인용된 모든 다른 공개된 참조, 문서, 원고, 및 과학 문헌은 본원에 참조로서 통합된다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 도면, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
전술한 특징 및 추가의 특징은 첨부된 도면과 함께 취해질 때 다음의 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 보다 명확하게 이해될 것이다. 그러나, 도면은 단지 예시를 위한 것이며, 제한하고자 하는 목적은 아니다.
도 1은 예시적인 심층 필터 설계를 도시한다.
도 2는 심층 필터를 사용하는 예시적인 mRNA 정제 연구에서, 필터 상에 로딩된 CFTR-암호화 mRNA의 양에 대한 필터 저항의 변화를 보여준다.
도 3은 에탄올 관류 볼륨의 증가에 따른 필터 전도도의 변화를 보여주며, 이는 침전된 mRNA로부터 염을 제거하는 데 있어서 관류 볼륨의 효과를 나타낸다.
도 4는 재순환 시간의 경과에 따른 시험관 내에서 전사된 CFTR mRNA의 mRNA 회수율을 보여준다.
도 5는 CFTR mRNA의 두 번째 침전(침전 2) 후 필터 상에 로딩된 mRNA의 양에 대한 필터 저항의 변화를 보여준다.
도 6은 심층 여과를 사용하는 예시적인 연구에서 mRNA 로딩 후 및 세척 후 여액의 사진을 보여준다 (좌측 - mRNA 캡핑 및 테일링 반응(C/T) 후의 여액을 처음으로 침전시킨 후(침전 1), 침전물을 용해시켜 용해된 mRNA를 여액으로 수집하기 전에 필터 매트릭스에 의해 포획한 것임; 우측 - 침전 1 중의 mRNA 여액을 두 번째로 침전시킨 후(침전 2), 침전물을 용해시켜 용해된 mRNA를 여액으로 수집하기 전에 필터 매트릭스로 포획한 것임).
도 7은 침전 1 및 침전 2를 80% 에탄올로 관류할 때, 관류 볼륨 대비 여액 전도도의 플롯을 도시한다. 상기 도면은 C/T mRNA의 예시적인 심층 여과 동안 에탄올 관류 볼륨의 증가에 따라 여액 전도도가 감소함을 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 C/T 후 침전 1 및 침전 2에 대한 재순환 시간 대비 mRNA 농도의 플롯을 각각 도시한다. 도 8a는 재순환 시간 대비 회수된 mRNA의 농도(mg/ml)를 보여준다. 도 8b는 재순환 시간 대비 회수된 mRNA 백분율을 나타낸다.
도 9는 심층 여과에 의해 정제된 C/T mRNA의 모세관 전기영동을 보여준다.
도 10은 RNAse 1로 분해하여 정제한 생성물의 전기 영동에 의해 mRNA의 순도를 도시한 것으로서, 겔을 은으로 염색하여 잔여 단백질 오염물을 시각화한 것이다. 레인 1은 양성 대조군이고, 레인 2는 음성 대조군이다. 레인 3은 정제 전의 C/T mRNA이며, 유사하게 RNase 1로 분해한 것이다. 레인 4~5는 침전 1 및 침전 2로부터 mRNA를 각각 1회 및 2회 여과한 후 정제한 mRNA 생성물이다. 레인 6~10은 mRNA를 제조하기 위한 공정의 IVT 및 C/T 반응으로부터 예상되는 오염 단백질에 대한 대조군이다.
도 11은 CFTR mRNA를 만들기 위한 IVT 반응, IVT 및 C/T 반응 후의 제1 침전 반응(침전 1,) 및 제2 침전 반응(침전 2)을 위해 필터 상에 로딩된 mRNA의 양에 따른 필터 저항의 변화를 보여준다.
도 12는 심층 필터에서 3회 여과된 ((1) IVT 반응 생성물, (2) C/T 반응 후 침전 1, 및 (3) 침전 2 후 침전 2) 여액에 임의의 침전물이 없었음을 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로: (1) IVT, (2) C/T 1 침전, 및 (3) C/T 2 침전.
도 13은 15 g 규모의 CFTR mRNA의 IVT 배치 제조 중, 정제 시에 80% 에탄올의 관류 볼륨(L/m2)에 대해 도표화한 여액 전도도를 보여준다.
도 14a 및 도 14b는 15 g 규모의 CFTR mRNA의 IVT 배치 제조 중, 정제 도중 용리 단계에서의 재순환 시간에 대한 mRNA의 회수를 각각 보여준다. 도 14a는 재순환 시간 대비 회수된 mRNA의 농도(mg/ml)를 보여준다. 도 14b는 재순환 시간 대비 회수된 mRNA 백분율을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 정제된 15 g의 IVT 배치 정제 CFTR mRNA의 모세관 전기영동에 의해 수득된 전기영동도를 보여준다. 도 15a - 정상 유동 심층 여과를 사용하지 않고 종래 방법에 의해 정제된 대조군 CFTR mRNA. 도 15b - 정상 유동 심층 여과에 의해 정제된 CFTR mRNA.
도 16은 캡핑 효소, 중합 효소, 및 RNase 효소를 포함하여, mRNA의 제조에 사용된 잔여 효소 및 mRNA 순도를 평가하는 은 염색 분석을 도시한다. 제1 침전 및 제2 침전 후 정상 유동 여과를 통해 정제된 물질에서 잔류 효소는 관찰되지 않았다.
도 17은 15 g의 MUT mRNA의 배치 제조를 위해 정상 유동 여과 정제 단계 이후 80% v/v 에탄올 용액의 볼륨을 달리하여 후속 세척했을 때 여액 전도도에 의해 측정한 잔류 염의 척도를 보여준다.
도 18a 및 도 18b는 IVT에 의해 제조하고 캡핑과 테일링을 하지 않은 mRNA(도 18a)를 정상 유동 여과 정제했을 때 및 상기 mRNA를 캡핑 및 테일링(C/T)한 후 정상 유동 여과 정제했을 때(도 18b), 여액에서 회수된 mRNA를 재순환 시간의 함수로서 (농도의 측면에서) 보여준다.
도 19는 본 발명에 따른 mRNA의 정상 유동 여과 후 모세관 겔 전기영동(CGE) 분석에 의해 평가한 MUT mRNA의 무결성을 보여준다.
도 20은 정제된 MUT mRNA의 은 염색 겔을 대조군 및 기준 효소와 함께 도시한 것으로서, 상기 대조군 및 기준 효소는 mRNA의 제조에 사용되고 본원에 기술된 정상 유동 여과 공정에 의해 제거된다.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥에 의해 명백히 달리 표시되지 않는 한, 단수형은 복수의 지시 대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 용어 "또는(or)"은 포괄적인 것으로 이해되며 "또는(or)" 및 "및(and)" 둘 다를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예를 들어(e.g.)" 및 "즉(i.e.)"는 단지 예시로서 의도된 제한 없이 사용되며, 본 명세서에 명시적으로 열거된 항목들만을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, "포함(comprising, 또는 이의 변형인 comprises 또는 comprising)"은 명시된 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소, 정수, 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소, 정수, 또는 단계의 그룹을 배제하지는 않는다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문맥으로부터 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 용어 "약"은 당업계에서 정상적인 허용 오차의 범위 이내, 예를 들어 평균의 2개의 표준 편차 이내인 것으로 이해된다. "약"은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 또는 0.001% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치 값은 용어 "약"에 의해 수식된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배치(batch)"는 한 번에 합성된, 예를 들어, 동일한 제조 사이클 동안 단일 제조 순서에 따라 생산된 mRNA의 수 또는 양을 지칭한다. 배치는 하나의 반응에서 합성된 mRNA의 양을 지칭할 수 있고, 상기 하나의 반응은 한 세트의 조건 하에서 연속 합성을 위한 효소의 단일 분취액 및/또는 DNA 템플릿의 단일 분취액을 통해 발생한다. 일부 구현예에서, 배치는 반응이 진행될 때 모든 시약 및/또는 성분이 보충되고/되거나 벌충되지는 않는 반응으로 생성된 mRNA를 포함하게 될 것이다. 용어 "배치"는 원하는 양을 달성하기 위해 조합되는 상이한 시간에 합성된 mRNA를 의미하지는 않을 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "오염물(contaminants)"은 구속된 양의 액체, 기체 또는 고체의 내부에 있는 물질로서, 표적 물질 또는 화합물의 화학적 조성과 상이한 물질을 지칭한다. 오염물은 불순물로도 지칭된다. 오염물 또는 불순물의 예는 완충액, 단백질(예: 효소), 핵산, 염, 용매, 및/또는 세척액을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분산제(dispersant)"는 mRNA 침전물이 하이드로겔을 형성할 가능성을 감소시키는 고형 미립자를 지칭한다. 분산제의 예는, 재, 점토, 규조토, 필터링제, 유리 비드, 플라스틱 비드, 중합체, 폴리프로필렌 비드, 폴리스티렌 비드, 염(예를 들어, 셀룰로오스 염), 모래, 및 당 중 하나 이상을 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 구현예에서, 분산제는 중합체 미소구체(예를 들어, 폴리(스티렌-코-다이비닐벤젠) 미소구체)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 다음 이벤트 중 하나 이상을 지칭한다: (1) (예를 들어, 전사에 의해) DNA 서열로부터 mRNA 템플릿을 생성하는 것; (2) (예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 형성에 의해) mRNA 전사물을 가공하는 것; (3) mRNA를 폴리펩티드 또는 단백질로 번역하는 것; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역 후 변형. 본 출원에서, 용어 "발현" 및 "생성" 및 이와 문법적으로 동등한 표현은 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "플럭스(flux)"는 유속을 필터 면적으로 나눈 것이다. 이는 상이한 규모의 필터 간의 비교를 가능하게 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전장 mRNA"는 모세관 전기 영동에 의해 구분된 특정 검정, 예를 들어, 겔 전기영동 또는 UV를 사용하는 검출 및 UV 흡수 분광법을 사용할 때 특성화된 바와 같다. 전장 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA로서, 본원에 기술된 정제 방법 중 어느 하나에 따라 수득된 것과 같은 mRNA 분자의 길이는 표적 DNA로부터 전사되는 전장 mRNA 분자의 길이의 적어도 50%이며, 예를 들어, 표적 DNA로부터 전사되고 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 정제하기 전인 전장 mRNA 분자 길이의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.01%, 99.05%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적인(functional)" 생물학적 분자는 해당 분자가 특징으로 하는 성질 및/또는 활성을 나타내는 형태를 가진 생물학적 분자이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하이드로겔(hydrogel)"은 물이 분산 매질인 콜로이드 겔을 형성하는 친수성 중합체 사슬, 예를 들어 mRNA의 네트워크를 지칭한다. 예를 들어, mRNA를 사용하는 경우, 하이드로겔로부터 mRNA를 추출하거나 정제하는 것이 건조 케이크로부터 추출하거나 정제하는 것 보다 더 어렵다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된(isolated)"은 물질 및/또는 엔티티가 (1) (자연에서 및/또는 실험 환경에서) 최초에 생산될 때, 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생성, 제조, 및/또는 생산될 때 결합된 성분 중 적어도 일부로부터 분리된 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전령 RNA(또는 mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 mRNA는 변형 및 비변형 mRNA 모두를 포함한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 영역 및 비코딩 영역을 포함할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제되거나, 재조합 발현 시스템을 사용해 생산되고 임의로 정제되거나, 시험관 내에서 전사되거나, 화학적으로 합성될 수 있다.
mRNA는 일반적으로 DNA로부터 리보솜에 정보를 전달하는 유형의 RNA로서 간주된다. mRNA의 존재 기간은 일반적으로 매우 짧으며, 가공과 번역, 이어지는 분해를 포함한다. 일반적으로, mRNA는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 영역, 코딩 영역의 상류에 있는 5' 비번역 영역(5' UTR), 코딩 영역의 하류에 있는 3' 비번역 영역(3' UTR), 5' 말단에 있는 캡, 및 3'UTR의 하류에 있는 폴리A 또는 폴리아데닐화 영역을 갖는다. 일반적으로, 진핵 생물에서, mRNA 가공은 DNA로부터 mRNA를 번역하고, N-말단(5') 단부 상에 "캡"을 추가하고 C-말단(3') 단부 상에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 통상적인 캡은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결된 구아노신인, 7-메틸구아노신 캡이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에게 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. 꼬리는 일반적으로 폴리아데닐화 이벤트이며, 이에 의해 폴리아데닐릴 모이어티가 mRNA 분자의 3' 말단에 첨가된다. 이러한 "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 전령 RNA는 일반적으로 리보솜에 의해, 단백질을 구성하는 일련의 아미노산으로 번역된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 mRNA는 캡 및/또는 꼬리 중 하나 또는 둘 다가 결여되어 있다. 따라서, mRNA는 캡을 가지되 꼬리가 결여될 수 있고, mRNA는 꼬리를 갖되 캡이 결여될 수 있으며, mRNA는 캡과 꼬리가 결여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mRNA 무결성"은 일반적으로 mRNA의 품질을 말한다. 일부 구현예에서, mRNA 무결성은 정제 공정(예: 본원에 기술된 방법) 후에 분해되지 않는 mRNA의 백분율을 지칭한다. mRNA 무결성은 TAE 아가로오스 겔 전기영동과 같은 본원에 특히 기술된 방법을 사용하거나, 은 염색을 수반하는 SDS-PAGE에 의하거나, 당업계에 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, RNA 아가로오스 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1997] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 철저한 의학적 판단의 범주내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하고 합리적인 유익/위험 비율(benefit/risk ratio)에 비례하는, 사용에 적합한 물질을 말한다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 생물학적으로 유해하지 않고 달리 유해하지도 않은 약학적 조성물을 제조하기에 적합한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약학적 용도로도 허용 가능한 부형제를 포함한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 하나의 이러한 부형제 및 둘 이상의 이러한 부형제 모두를 포함한다.
통상적으로, 적절한 mRNA 용액은 완충제 및/또는 염을 함유할 수도 있다. 일반적으로, 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨 및 인산나트륨을 포함할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용 가능한 염에 대해 문헌[J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19]에 상세하게 기술하고 있다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 적합한 무기산과 유기산, 및 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 비독성 산 첨가염의 예는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산, 또는 말론산과 같은 유기산으로형성된 아미노기의 염 또는 이온교환과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여형성된 아미노기의 염이다. 기타 약학적으로 허용 가능한 염은 아디핀산염(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코르브산염(ascorbate), 아스파르트산염(aspartate), 벤젠술폰산염(benzenesulfonate), 벤조산염(benzoate), 중황산염(bisulfate), 붕산염(borate), 낙산염(butyrate), 캠포레이트(camphorate), 캠퍼술폰산염(camphorsulfonate), 구연산염(citrate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 다이글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄술폰산염(ethanesulfonate), 포름산염(formate), 푸마르산염(fumarate), 글루코헵토네이트(glucoheptonate), 글리세로인산염(glycerophosphate), 글루코네이트(gluconate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 요오드화수소산염(hydroiodide), 2-하이드록시-에탄술폰산염(2-hydroxy-ethanesulfonate), 락토바이온산염(lactobionate), 젖산염(lactate), 라우린산염(laurate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 말론산염(malonate), 메탄술폰산염(methanesulfonate), 2-나프탈렌술폰산염(2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 질산염(nitrate), 올레산염(oleate), 옥살산염(oxalate), 팔미트산염(palmitate), 팔모에이트(palmoate), 펙티네이트(pectinate), 과황산염(persulfate), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionate), 인산염(phosphate), 피크르산염(picrate), 피발산염(pivalate), 프로피온산염(propionate), 스테아르산염(stearate), 숙신산염(succinate), 황산염(sulfate), 주석산염(tartrate), 티오시안산염(thiocyanate), p-톨루엔술폰산염(p-toluenesulfonate), 운데카노에이트(undecanoate), 발레르산염(valerate salts) 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 추가의 염은, 경우에 따라, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 (할로겐화물, 수산화물, 카르복시산염, 황산염, 인산염, 질산염, 설폰산염 및 아릴 설폰산염과 같은 반대 이온을 사용하여 형성된) 아민 양이온을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 예컨대 알킬 할로겐화물과 같은 적절한 친전자물질을 사용하여 4급 알킬 아미노염(quarternized alkylated amino salt)을 형성하는 아민의 4급화로 형성된 염을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "실질적으로(substantially)"는 관심있는 특징이나 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인(qualititave) 상태를 말한다. 생물학 분야의 당업자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/지거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 현상 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적인 부족을 담아내는 데 사용된다. 따라서, 화합물 'x'가 실질적으로 없는 조성물은 화합물 'x'의 5% 미만, 또는 화합물 'x'의 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 기술 분야의 당업자가 공통적으로 이해하고, 본 출원이 속하는 기술 분야에서 공통적으로 사용되는 것과 같은 의미를 가지며; 이러한 기술 분야는 그 전체가 참조에 의해 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명은 정상 유동 여과에 기반하여 확장 가능한 양의 순수한 고품질 mRNA 염기를 제조하는 방법에 관한 것이다. 시험관 내에서 합성된 mRNA는 합성 공정 중에 생성되었거나 합성 공정으로부터 넘어온 오염물을 포함한다. 본 발명의 방법은 시험관 내에서 합성된 mRNA를 침전시키고, 침전된 mRNA가 필터 매트릭스 또는 시스템 내에 또는 그 상에 보유되면서 합성 공정으로부터의 오염물이 여과물로서 필터 또는 필터 시스템을 통해 흐를 수 있게 하여 침전된 mRNA를 정제하도록 mRNA 제조를 정상 유동 여과하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 포획된 mRNA는 mRNA 침전물을 용해시켜 여과물로 변환되고, 이에 의해 mRNA가 필터 또는 필터 시스템을 통과할 수 있게 되고, 여기서 mRNA를 정제하는 추가 단계(예를 들어, 추가 HPLC 정제, 또는 TFF, 이온 교환 크로마토그래피, 또는 친화도 결합 크로마토그래피 없음) 없이 임상 또는 치료 응용에 적합한 순도 수준으로 수집될 수 있다. 특히, 이 방법은 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 방법의 현저한 회수를 제공하여, 치료 용도에 적합한 놀랍게도 높은 순도 및 완전성으로 대량의 mRNA를 효율적으로 제조할 수 있게 한다.
전령 RNA
본원에 기술된 정제 방법은 임의의 mRNA의 정제에 적합하다. 본 발명은 다양한 단백질을 코딩하는 mRNA를 전달하는 데 사용될 수 있다.
다양한 구현예에 따르면, 본 발명은 다양한 길이의 시험관 내 합성된 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 또는 20 kb의 시험관내 합성 mRNA를 전달하는 데 사용될 수있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1~20 kb, 약 1~15 kb, 약 1~10 kb, 약 5~20 kb, 약 5~15 kb, 약 5~12 kb, 약 5~10 kb, 약 8~20 kb, 또는 약 8~15 kb 범위의 시험관내 합성 mRNA를 전달하는 데 사용될 수있다. 예를 들어, 전형적인 mRNA는 길이가 약 1 kb 내지 약 5 kb일 수 있다. 보다 전형적으로, mRNA는 약 1 kb 내지 약 3 kb의 길이를 가질 것이다. 그러나, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 mRNA는 훨씬 더 길다(약 20 kb 초과).
특정 구현예에서, mRNA 뉴클레오티드는 "변형된 mRNA"를 제공하도록 변형된다. 따라서, 본 발명에 따른 변형 mRNA는 예를 들어, 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 암호화하는 항체(예를 들어, mRNA를 암호화하는 중쇄 및 경쇄)는 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U))을 포함하되 이에 한정되지 않는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체(변형 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있고, 퓨린 및 피리미딘의 변형 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서, 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 유사우라실(5-우라실), 다이하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시히드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-슈도우라실, 큐에오신(queosine), 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신(wybutoxosine), 및 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 및 이노신 등으로서 합성될 수 있다. 이와 같은 유사체의 제조는, 예를 들어, 미국 특허 제4,373,071호, 미국 특허 제4,401,796호, 미국 특허 제4,415,732호, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,500,707호, 미국 특허 제4,668,777호, 미국 특허 제4,973,679호, 미국 특허 제5,047,524호, 미국 특허 제5,132,418호, 미국 특허 제5,153,319호, 미국 특허 제5,262,530호 및 제5,700,642호를 통해 당업자에게 공지되어 있고, 이들의 개시 내용은 그 전체 범위가 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 시험관 내에서 합성된, 변형되지 않은 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어, 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 주는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 비번역 영역은 길이가 50 내지 500 뉴클레오티드이거나 더 길 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성이나 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어, 철 반응 요소를 포함한다.
예시적인 3' 및/또는 5' UTR 서열은 센스 mRNA 분자의 안정성을 높이기 위해 안정한 mRNA 분자(예를 들어, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤, 및 구연산 순환 효소)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 5' UTR 서열은 뉴클레아제 내성을 개선시키고/시키거나 폴리뉴클레오티드의 반감기를 개선하기 위해 CMV 극초기(immediate-early) 1(IE1) 유전자의 부분 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 더 안정시키기 위해 인간 성장 호르몬(hGH)을 암호화하는 서열 또는 이의 단편을 폴리뉴클레오티드(예컨대, mRNA)의 3' 말단 또는 비번역 영역에 포함하는 것도 고려된다. 일반적으로, 이러한 특징들은 이러한 특징들을 갖지 않는 동일한 폴리뉴클레오티드에 비해 폴리뉴클레오티드의 안정성 및/또는 약동학적 성질(예컨대, 반감기)을 개선시키며, 이에는, 예를 들어 생체 내 뉴클레아제 분해에 대해 이러한 폴리뉴클레오티드의 내성을 개선시키도록 이루어진 특징이 포함된다.
일부 구현예에서, mRNA는 세포 내 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 시토졸 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 액틴 세포골격과 결합된 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 원형질 막과 결합된 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 막관통 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 이온 채널 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 핵 주위 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 핵 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 전사 인자를 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 샤프롱(chaperone) 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 세포내 효소를 암호화한다(예를 들어, 우레아 순환 장애 또는 리소좀 저장 대사 장애와 관련된 효소를 암호화하는 mRNA). 일부 구현예에서, mRNA는 세포 대사, DNA 복구, 전사, 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 세포외 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 세포외 매트릭스와 결합된 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 분비된 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 mRNA는 하나 이상의 표적 세포에 의해 주변 세포 외액 내로 배설되거나 분비되는 기능성 단백질 또는 효소를 발현하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 호르몬 및/또는 신경 전달 물질을 암호화하는 mRNA). 일부 구현예에서, mRNA는 백신 목적의 면역원성 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 항체 또는 이의 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 대사 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 효소를 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 수용체 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 암 관련 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 백신을 암호화한다.
비 제한적인 예시로서, mRNA는 ABC7, ABCB3, ABCB7, ABCC7, ABCD1, AKT; AKT2, AKT3, ATF4, AKT2; AKT3; ALAS2, 알파 갈락토시다아제, 알파-1 프로테아제 억제제, APA, APC; APOA1, APOE, 항-트립신 알파 1, 아르기노숙시네이트 합성 효소, ASAT; ATM; ATP7B, ATR; 아트로핀-1; ATX3; Atxn10; ATXN2; Atxn7; ATXNl; Bax; Bcl2; Bcl2; BRCA1; BRCA2; 카바밀포스페이트 합성 효소, CASP8, CBP (Creb-BP); CDKN2a; CFTR, CREB1, CVAP, CYP1Bl, DBA, DMD, DMPK; EGFR, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, EIF2B4; ERBB2; ERBB3; ERBB4; 에리트로포이에틴, 인자 IX, 인자 V; 인자 VII, 인자 VII; 인자 VIII; 인자 VIIIa 경쇄, 인자 X; 인자 XI (F11); 인자 XII 결핍 (F12, HAF); 인자 XIIIA (F13Al, F13A); 인자 XIIIB (F13B); FBN1, FGF 수용체 패밀리 구성원; FHL3; FKRP, FXN/X25; FXR1, G6PC, G6PT, GAA, 갈락토스-1-포스페이트 유리딜릴트랜스퍼라아제, GLUT2, H1Fla; HBA1; HBB; HBA2, HBB, HBD, 헤파란 N-설파타아제, HIF; HIF3a; HLH3, HPLH2, HPLH3, 헌팅틴, IDH2; IDH1, IGF 수용체; IGF; IGF1R, Igf2 수용체; Igf2; Igfl 수용체; Igfl; ITGB2, KIAA1596; Kras; LCRB, 메틸말로닐-CoA 뮤타아제, MRP7, MUNC13-4, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다아제, NOS3, NPC1, OTC (오르니틴 트랜스카바밀라아제), PAH, PKHD1, PKD1, PKD2, PKD4, PKLR, PKU1, PPAR 감마; PPAR알파; PRF1, PSEN2, PSF2, PTEN; RB, 망막층간 단백질(Retinoschisin); RING11, SBMA/SMAXl/AR; SEC63, SERPINA1, SERPINA2, SERPINA3, SERPINA5, SERPINA6, SFTPA1, SFTPB, SFTPC, SFTPD, SLC2A, SLC7A9, SMPD1, SPTB, TAP2, TAPBP, TPSN, UNC13D, VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c, VLDLR; 및 WT1과 같은 단백질을 암호화한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 폐 또는 폐 세포의 치료를 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체를 위한 치료 mRNA 백신 중의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 폐 또는 폐 세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 폐 또는 폐 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 낭성 섬유증 막관통 전달 조절자, 즉 CFTR을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 정제된 CFTR mRNA는 낭성 섬유증을 치료하기 위한 치료 조성물을 필요로 하는 대상체의 폐에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 간 또는 간 세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 폐 또는 폐 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 요소 순환 질환과 관련된 것들, 리소좀 저장 장애와 관련된 것들, 글리코겐 저장 장애와 관련된 것들, 아미노산 대사 장애와 관련된 것들, 지질 대사 또는 섬유증 장애와 관련된 것들, 메틸말론 신혈증과 관련된 것들, 또는 정제된 mRNA를 간 또는 간 세포에 전달하거나 이를 이용해 간 또는 간 세포를 치료하는 것이 이점이 되는 임의의 다른 대사 장애와 관련된 것들을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 요소 순환 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 합성효소 1 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 카르바모일 포스페이트 합성효소 I 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 리아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기나아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 리소좀 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 알파 갈로토시다아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루코세레브로시다아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이두로네이트-2-설파타아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이두로니다아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 N-아세틸-알파-D-글루코사미니다아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 헤파란 N-설파타아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 갈락토사민-6 설파타아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 베타-갈락토시다아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 리소좀 리파아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아릴설파타아제 B (N-아세틸갈락토사민-4-설파타아제) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전사 인사 EB(TFEB)를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 산 알파-글루코시다아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루코스-6-포스파타아제 (G6PC) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 포스포릴라아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 포스포글리세레이트 뮤타아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 탈분지 효소를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 아미노산 대사와 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 하이드록실라아제 효소를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루타릴-CoA 디하이드로제나아제 효소를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프로피오닐-CoA 카복실라아제 효소를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 옥살라아제 알라닌-글리옥실레이트 아미노 전이효소를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 지질 대사 장애 또는 섬유증 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 mTOR 억제제를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATPase 인지질 수송 8B1 (ATP8B1) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 NF-카파 B 억제제, 예컨대 I-카파 B 알파, 인터페론 관련 발달성 조절물질 1(IFRD1), 및 시르투인 1(SIRT1) 중 하나 이상을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 PPAR-감마 단백질 또는 활성 변이체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론산혈증과 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 뮤타아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 에피머라아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 간으로의 전달 또는 간의 치료가 치료적 이점을 제공할 수 있는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 윌슨병(Wilson disease) 단백질로도 알려진 ATP7B 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 포르포빌리노겐 디아미나아제 효소를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X와 같은 하나 이상의 응고 효소를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인자 IX를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 혈색소 침착증 (HFE) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포에 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 혈관 내피 성장 인자 A 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 릴랙신 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-9 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-2 수용체 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 근육 또는 근육 세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 근육 또는 근육 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 디스트로핀 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심근 또는 심근 세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 심근 또는 심근 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 칼륨 채널 및 나트륨 채널 중 하나 또는 둘 다를 조절하는 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Kv7.1 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Nav1.5 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신경계 또는 신경계 세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 신경계 또는 신경계 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 1 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 2 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 D 구성원 1 (ABCD1) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CLN3 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 베타 글로빈 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 브루톤 티로신 키나아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 응고 효소, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신장 또는 신장 세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 신장 또는 신장 세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 IV형 콜라겐 알파 5 사슬 (COL4A5) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 안구 또는 안세포로 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체의 안구 또는 안세포를 치료하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 A 구성원 4 (ABCA4) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 망막층간 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 망막 색소 상피-특이적 65 kDa (RPE65) 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 290 kDa의 중심체 단백질(CEP290)을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체 또는 대상체의 세포에 백신을 전달하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체 또는 대상체의 세포를 백신으로 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 바이러스와 같은 감염원의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 광견병 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 사이토메갈로 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 로타 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 간염 바이러스, 예컨대 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 유두종 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 단순 헤르페스 바이러스, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 1형 또는 단순 헤르페스 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스 1형 또는 인간 면역 결핍 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 메타뉴모바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스, 예컨대 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2형, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 말라리아 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 지카 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 치쿤구니야 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암과 연관되었거나 대상체의 암 세포로부터 식별된 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체 본인의 암 세포로부터 결정된 항원, 즉 맞춤화된 암 백신을 제공하기 위한 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 돌연변이체 KRAS 유전자로부터 발현된 항원을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 항체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 이중 특이적 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 OX40에 대한 항체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 VEGF에 대한 항체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 조직 괴사 인자 알파에 대한 항체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CD3에 대한 항체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CD19에 대한 항체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 면역조절물질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 12를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 23을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 36 감마를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 인터페론 유전자의 자극제(STING) 단백질의 구성적 활성 변이체를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 단백질, 예컨대 Cas 9 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메가뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 징크 핑거 뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 안구 질환을 치료하기 위해 암호화하는 mRNA를 정제하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 망막층간 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는 데 사용된다.
mRNA 합성
mRNA는 알려진 다양한 방법 중 어느 하나에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 시험관 내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 본 발명은 시험관 내 전사 반응에 의해 합성된 mRNA를 정제하는 데 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 박테리아, 진균, 식물, 및/또는 동물로부터 생성된 야생형 mRNA를 포함하여 다른 공급원에서 유래된 mRNA가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로서 고려된다.
간단히 말하면, IVT는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다. 여러 구현예에 따르면 이들 시약이 최종 생성물에 존재하는 것은 바람직하지 않으며, 따라서 불순물 또는 오염물로서 지칭될 수 있고, 이들 불순물 또는 오염물 중 하나 이상을 함유하는 제제는 순수하지 않은 제제로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 시험관 내 전사는 단일 배치에서 일어난다. 일부 구현예에서, IVT 반응은 캡핑 및 테일링 반응(C/T)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡핑 및 테일링 반응은 IVT 반응과 별도로 수행된다. 일부 구현예에서, mRNA는 IVT 반응으로부터 회수되고, 이어서 본 출원에 기술된 방법에 의해 mRNA의 제1 침전 및 정제가 이루어지고; 그런 다음, 회수된 정제된 mRNA가 캡핑되고 테일링된 다음, 제2 침전 및 정제가 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 5 g, 10 g, 25 g, 50 g, 75 g, 100 g, 250 g, 500 g, 750 g, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 100 kg, 1000 kg, 또는 그 이상을 함유하는 조성물 또는 배치를 정제하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 분자의 길이는 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10,000 뉴클레오티드 또는 그 이상이며; 그 사이에 있는 임의의 길이를 갖는 mRNA도 본 발명에 포함된다.
IVT 반응
IVT는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7, 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다. 적절한 DNA 주형은 일반적으로, 시험관 내 전사를 위한 프로모터(예: T3, T7 또는 SP6 프로모터)를 가지며, 원하는 mRNA에 대한 원하는 뉴클레오티드 서열 및 종결 신호가 이어진다.
다른 IVT 방법이 당업계에서 이용 가능하고, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
캡핑 및 테일링(C/T) 반응
일반적으로, 진핵 생물에서, mRNA 가공은 N-말단(5') 단부 상에 "캡"을 추가하고 C-말단(3') 단부 상에 "꼬리"를 추가하는 것을 포함한다. 통상적인 캡은 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결된 구아노신인, 7-메틸구아노신 캡이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에게 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. 꼬리는 일반적으로 폴리아데닐화 이벤트이며, 이에 의해 폴리아데닐릴 모이어티가 mRNA 분자의 3' 말단에 첨가된다. 이러한 "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 전령 RNA는 리보솜에 의해, 단백질을 구성하는 일련의 아미노산으로 번역된다.
시험관 내에서 전사된 mRNA는, 구아닐레이트 트랜스퍼라아제를 사용하여 5' N7-메틸구아닐레이트 캡 0 구조를 첨가하고, Pechter, P. 및 Brownlee, G.G.에 의해 기술된 것과 같이 2' O-메틸트랜스퍼라아제를 사용해 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 2' O 위치에 메틸기를 첨가하여 캡 1 구조를 생성함으로써 효소적으로 변환된다(Pechter, P. 및 Brownlee, G.G.의 문헌["Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249] 참조). Cap 1 구조를 첨가한 후, 시험관 내 전사된 mRNA의 3' 말단에 폴리-아데닐화 꼬리를 폴리-A 중합효소를 사용해 효소적으로 첨가한다. 간략하게, 정제된 IVT mRNA를 GTP, S-아데노실 메티오닌, RNase 억제제, 2'-O메틸 트랜스퍼라아제, 구아닐릴 트랜스퍼라아제, 및 트리스-HCl, MgCl2, 및 RNase-무함유 H2O를 포함하는 반응 완충액과 혼합한 다음; 37℃에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 트리스-HCl, NaCl, MgCl2, ATP, 폴리-A 중합효소, 및 RNase-무함유 H2O를 포함하는 테일링 완충액을 첨가하여 테일링 반응을 개시한다. EDTA를 첨가하여 반응을 퀀칭시킨다.
다른 캡핑 및/또는 테일링 방법이 당업계에서 이용 가능하고, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
시험관 내 합성된 mRNA 중의 오염 물질
예를 들어, 전술한 바와 같은 합성 공정의 mRNA 생성물은 mRNA 합성 반응의 부산물인 다양한 오염물(불순물로도 지칭됨)을 함유할 가능성이 있으며, 이에는 잔류 주형 DNA, 미성숙 산물, SP6 또는 T7-중합효소와 같은 중합효소를 포함하는 효소, 구아닐릴 전이효소 또는 메틸 구아닐릴 전이효소와 같은 캡핑 효소, 폴리A 중합효소와 같은 테일링 효소, DNase 1, 다양한 염, 및 조기 중단된 mRNA 올리고뉴클레오티드 등이 포함된다.
mRNA 정제
본 발명에 따른 정제 공정은 합성 동안 또는 그 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 캡 및/또는 꼬리가 mRNA에 첨가되기 전에 본원에 기술된 바와 같이 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡 및/또는 꼬리가 mRNA에 첨가된 후 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡이 첨가된 후 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡 및/또는 꼬리가 mRNA에 첨가되기 전과 후 모두 정제된다. 일반적으로, 본원에 기술된 바와 같은 정제 단계는 mRNA 합성의 각 단계 후에 수행되며, 임의로 투석과 같은 다른 정제 공정과 함께 수행될 수 있다.
mRNA의 침전
본 발명에 따르면, mRNA는 당업계에 공지된 다양한 침전 방법을 사용해, 시험관 내 합성 반응 혼합물과 같은 불순한 제제에 침전될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "침전(또는 이의 임의의 문법적 등가물)"은 용액 중에서 불용성 물질(예를 들어, 고형분)을 형성하는 것을 지칭한다. mRNA와 관련하여 사용될 때, 용어 "침전"은 액체 중에서 불용성 형태 또는 고형 형태의 mRNA를 형성하는 것을 지칭한다.
mRNA를 침전시키는 데 적합한 임의의 및 모든 방법이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, mRNA 침전은 변성 조건을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변성 조건"은 mRNA의 고유 형태를 파괴할 수 있는 임의의 화학적 또는 물리적 조건을 지칭한다. 분자는 고유 형태일 때 일반적으로 가장 수용성이기 때문에, 분자의 2차 및 3차 구조를 파괴하면 용해도를 변화시킬 수 있고 용액으로부터 mRNA를 침전시킬 수 있다.
예를 들어, 불순한 제제로부터 mRNA를 침전시키는 적절한 방법은, mRNA가 침전되도록 변성 시약으로 불순한 제제를 처리하는 단계를 포함한다. 본 발명에 적합한 예시적인 변성 시약은 염화리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화구아니디늄, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 아세트산암모늄, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 적절한 시약은 고형분 형태 또는 용액으로 제공될 수 있다.
비제한적인 예로서, 구아니디늄 티오시아네이트(GSCN)를 사용해 mRNA를 침전시킬 수 있다. 통상적으로, 구아니디늄 티오시아네이트는 약 1 M 이상, 약 2 M 이상, 약 3 M 이상, 약 4 M 이상, 약 5 M 이상, 약 6 M 이상, 약 7 M 이상, 약 8 M 이상, 약 9 M 이상, 또는 약 10 M 이상인 농도의 용액으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 약 4 M, 또는 약 5 M, 또는 약 6 M의 농도로 구아니디늄 티오시아네이트를 함유한다.
변성 시약 외에도, mRNA 침전에 적합한 용액은 추가의 염, 계면활성제, 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용액은 소듐 라우릴 사르코실 및/또는 구연산나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, mRNA 침전에 적합한 용액은 4 M 구아니디늄 티오시아네이트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 약 5 M 구아니디늄 티오시아네이트를 함유할 수 있다.
일반적으로, 불순한 제제를 본원에 기술된 하나 이상의 변성 시약과 함께 상당한 양의 mRNA의 침전을 가능하게 하는 바람직한 온도에서 일정 기간 동안 인큐베이션하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 불순한 제제와 변성제의 혼합물을 일정 기간 동안 실온 또는 주변 온도에서 인큐베이션할 수 있다. 일반적으로, 적절한 인큐베이션 시간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60분 또는 그 이상의 기간이다. 일부 구현예에서, 적절한 인큐베이션 시간은 약 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5분 또는 그 이하의 기간이다. 일부 구현예에서, 혼합물은 실온에서 약 5분 동안 인큐베이션된다. 일반적으로, "실온" 또는 "주변 온도"는 약 20~25℃ 범위의 온도, 예를 들어, 약 20℃, 21℃, 22℃. 23℃, 24℃, 또는 25℃를 지칭한다. 일부 구현예에서, 불순한 제제와 변성제의 혼합물은 실온보다 높은 온도(예를 들어, 약 30~37℃ 또는 특히, 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 또는 37℃) 또는 실온보다 낮은 온도(예를 들어, 약 15~25℃, 또는 특히 약 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 또는 20℃)에서 인큐베이션될 수도 있다. 인큐베이션 기간은 인큐베이션 온도를 기반으로 조정할 수 있다. 일반적으로, 인큐베이션 온도가 높을수록 인큐베이션에 필요한 시간은 짧아진다.
대안적으로 또는 추가적으로, mRNA 침전을 용이하게 하기 위해 용매가 사용될 수 있다. 적합한 예시적인 용매는 이소프로필 알코올, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에탄올, 메탄올, 데나토늄, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 예를 들어, 용매(예를 들어, 절대 에탄올)는 변성 시약과 함께 불순한 제제에 첨가되거나, 본원에 기술된 바와 같이 변성 시약을 첨가하고 인큐베이션한 후에 불순한 제제에 첨가되어 mRNA 침전을 더 강화시키고/시키거나 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위해 에탄올과 같은 유기 용매의 사용을 포함할 수 있다.
그러나, mRNA를 침전시키는 단계는 유기 용매를 사용하지 않고도 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 PEG를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 PEG-6000을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 PEG-400을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 터트-부틸-TEG-O-프로피오네이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이메틸 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이비닐 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-모노부틸 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-메틸 에테르 메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-모노데실 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 침전시키는 단계는 mRNA를 침전시키기 위한 TEG-다이벤조에이트를 사용해 달성될 수 있다. 이들 PEG 또는 TEG-계 시약 중 어느 하나는 mRNA를 침전시키기 위한 구아니디늄 티오시아네이트와 조합하여 사용될 수 있다. 이들 시약 각각의 구조는 아래 표 A에 나타나 있다.
[표 A] mRNA의 정제(mRNA의 침전 및/또는 세척)를 위한 비-유기 용매 시약
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일반적으로, 적절한 용매(예를 들어, 절대 에탄올)를 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 추가의 기간 동안 인큐베이션할 수 있다. 일반적으로, 적절한 인큐베이션 기간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60분 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 적절한 인큐베이션 기간은 약 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5분 또는 그 이하이다. 일반적으로, 혼합물을 실온에서 약 5분 동안 추가로 인큐베이션한다. 인큐베이션 시간을 적절히 조절함으로써 실온 보다 높거나 낮은 온도를 사용할 수 있다. 대안적으로, 침전을 위한 인큐베이션은 4℃ 또는 -20℃에서 이루어질 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 방법에 따라 불순한 제제로부터 상당한 양의 mRNA가 침전된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 불순한 제제로부터 총 mRNA의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 침전된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 불순한 제제로부터 총 mRNA의 실질적으로 100%가 침전된다.
일반적으로, 침전의 결과로서, 본원에 기술된 다양한 오염물 및 침전된 mRNA를 함유하는 현탁액이 형성되어 정상 유동 여과를 거치게 된다.
정상 유동 여과
정상 유동 여과는 정제될 물질 또는 생성물의 전체를 필터 표면에 대해 법선(즉, 수직) 방향으로 유동시키는 여과 공정이다. 필터를 통과하기에 너무 큰 물질은 남는 반면, 더 작은 물질은 필터를 통과해 여액이 된다.
일반적으로, 본원에 기술된 정상 유동 여과 공정은 mRNA를 로딩하는 단계, 세척하는 단계, 및 회수하는 단계를 포함한다. 로딩하는 단계는 피드(예를 들어, 침전된 mRNA를 함유하는 불순한 제제)를 필터 시스템 상에 로딩하는 단계를 포함한다. 피드는 일정한 유동, 일정한 압력, 가변 유동, 가변 압력, 위킹 및/또는 중력 제어에 의한 유동를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 조건 하에서 로딩될 수 있다.
정상 유동 여과는 분산제가 로드(예를 들어, 현탁액)에 첨가되었는지 여부와 상관없이 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액은 분산제 없이 정상 유동 여과를 거친다.
당업계에 공지된 다양한 정상 유동 여과 공정 시스템 및 방법이 본 발명을 실시하는 데 사용되거나 이에 맞게 구성될 수 있다. 다양한 필터가 정상 유동 여과 시스템에 사용될 수 있는데, 이에는 다양한 멤브레인 필터 및 심층 필터가 포함되지만 이들로 한정되지 않으며, 여기서 필터는 하나 이상의 3차원 매트릭스를 포함한다. 다양한 분자 중량 컷오프(MWCO), 기공 크기, 표면적, 또는 포맷을 갖는 하나 또는 다수의 필터가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 필터가 적층될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 필터 스크린이 사용된다. 필터는 침전된 mRNA를 포획하거나 잔류시키면서 오염물을 통과시키는 것을 용이하게 하도록 선택된다. 일반적으로, 적절한 MWCO 또는 기공 크기는 침전된 mRNA보다 더 작고 가용성 mRNA 또는 다른 오염물보다 더 크도록 선택된다. 적절한 표면적은 충분히 많은 양의 침전된 mRNA를 포획하는 것을 용이하게 하고, 막힘이나 겔 층의 형성 없이, 포획된 mRNA를 분포시키는 것을 용이하게 하도록 선택된다. 예시적인 필터는 이하에서 더욱 상세히 설명된다.
필터
본 발명에 적절한 필터는 다양한 포맷, 예를 들어 주름 필터, 래핑된 필터, 또는 캡슐 필터를 포함한다. 일부 구현예에서, 적절한 필터는 심층 필터이다. 일부 구현예에서, 적절한 필터는 멤브레인 필터이다. 일부 구현예에서, 적절한 필터는 필터 스크린을 포함한다. 현탁액 중의 관심 입자(즉, 침전된 mRNA)는 필터 상에 또는 필터 내에 잔류하는 반면, 가용화된 오염물 또는 더 작은 크기를 갖는 오염물 입자는 흘러서 필터를 통과하는데, 이는 일반적으로 여액으로서 지칭된다.
일반적으로, 적절한 기공 크기를 갖는 필터가 선택되므로, 일반적으로 멤브레인의 분자량 컷오프(MWCO) 값은 침전된 mRNA의 최소 분자량보다 작지만, 용해된 오염물의 분자량보다 크다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA의 MWCO보다 2 내지 6배(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6배) 작은 기공 크기를 갖는 멤브레인이 사용된다. mRNA 정제를 위해, 멤브레인 필터는 일반적으로 1 킬로 달톤(kDa) 내지 10,000 킬로 달톤(kDa) 범위(예를 들어, 10 kDa ~ 9,000 kDa, 50 kDa ~ 8,000 kDa, 100 kDa ~ 9,000 kDa, 100 kDa ~ 8,000 kDa, 100 kDa ~ 7,000 kDa, 100 kDa ~ 6,000 kDa, 100 kDa ~ 5,000 kDa, 100 kDa ~ 4,000 kDa, 100 kDa ~ 3,000 kDa, 100 kDa ~ 2,000 kDa, 또는 100 kDa ~ 1,000 kDa)의 MWCO를 갖는다. 예시적인 적합한 멤브레인 필터는 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa 또는 100 kDa 이상의 MWCO 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 멤브레인 필터는 110 kDa, 120 kDa, 130 kDa, 140 kDa, 150 kDa, 160 kDa, 170 kDa, 180 kDa, 190 kDa, 200 kDa, 210 kDa, 220 kDa, 230 kDa, 240 kDa, 250 kDa, 260 kDa, 270 kDa, 280 kDa, 290 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa, 500 kDa, 또는 1000 kDa 이상의 MWCO 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 멤브레인 필터는 약 100 kDa, 300 kDa, 500 kDa, 1,000 kDa, 1,500 kDa, 2,000 kDa, 2,500 kDa, 3,000 kDa, 3,500 kDa, 4,000 kDa, 4,500 kDa, 5,000 kDa, 5,500 kDa, 6,000 kDa, 6,500 kDa, 7,000 kDa, 7,500 kDa, 8,000 kDa, 8,500 kDa, 9,000 kDa, 9,500 kDa, 또는 10,000 kDa 이하의 MWCO 값을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 필터의 기공 크기는 평균 기공 직경으로도 측정된다. 예를 들어, 적합한 필터는 0.001 내지 500 μm, 0.01 μm 내지 400 μm, 0.01 μm 내지 300 μm, 0.01 μm 내지 200 μm, 0.01 μm 내지 100 μm, 0.05 μm 내지 500 μm, 0.05 μm 내지 400 μm, 0.05 μm 내지 300 μm, 0.05 μm 내지 200 μm, 또는 0.05 μm 내지 100 μm 범위의 평균 기공 크기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 필터는 0.001 μm 이상, 0.01 μm 이상, 0.05 μm 이상, 0.01 μm 이상, 0.1 μm 이상, 0.2 μm 이상, 0.3 μm 이상, 0.4 μm 이상, 0.5 μm 이상, 1 μm 이상, 5 μm 이상, 10 μm 이상, 15 μm 이상, 20 μm 이상, 25 μm 이상, 30 μm 이상, 35 μm 이상, 40 μm 이상, 45 μm 이상, 또는 50 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 0.5 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 5 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 10 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 20 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 필터는 25 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 멤브레인은 약 0.10 μm, 0.20 μm, 0.22 μm, 0.24 μm, 0.26 μm, 0.28 μm, 0.30 μm, 0.40 μm, 0.5 μm, 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm, 또는 1.0 μm 이상의 평균 기공 크기를 갖는다.
본 발명에 적합한 필터는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 예시적인 물질은 (비변형) 폴리에테르설폰(PES), 폴리에테르설폰(mPES), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, MCE(혼합 셀룰로오스 에스테르), 초고 MW 폴리에틸렌(UPE), 폴리플루오로테트라에틸렌(PTFE), 나일론, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리프로필렌, 폴리비닐 클로라이드, 규조토, 유리 필터, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 적합한 필터는 다양한 표면적을 가질 수 있다. 일반적으로, 적합한 필터는 mRNA의 대규모 생산을 용이하게 하기에 충분히 큰 표면적을 갖는다. 특히, 적합한 필터는 막힘 또는 겔 층의 형성 없이 많은 양의 침전된 mRNA를 포획할 수 있게 하는 표면적을 갖는다. 예를 들어, 적합한 필터는 약 1,000 cm2, 1,500 cm2, 2,000 cm2, 2,500 cm2, 3,000 cm2, 3,500 cm2, 3,500 cm2, 4,000 cm2, 5,000 cm2, 7,500 cm2, 10,000 cm2, 1 m2, 5 m2, 10 m2, 50 m2, 100 m2, 150 m2, 200 m2, 300 m2, 400 m2, 500 m2, 600 m2, 700 m2, 800 m2, 900 m2, 1000 m2 이상의 표면적을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 필터는 264 m2보다 큰 표면적을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 필터는 528 m2보다 큰 표면적을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 필터는 1056 m2보다 큰 표면적을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 필터는 2112 m2보다 큰 표면적을 가질 수 있다. 단일 층 또는 다수의 여과 층이 사용될 수 있다. 예로는 규조토 매트릭스, 셀룰로오스 매트릭스, 또는 폴리프로필렌 펠트 매트릭스 등이 있다. 일부 구현예에서, 적합한 필터 시스템은 심층 필터를 포함하며, 상기 심층 필터는 단일 매트릭스 유형으로 이루어진 다수의 층 또는 상이한 매트릭스로 이루어진 다수의 층으로 구성될 수 있다. 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액은 정상 유동에 의해 심층 필터를 흘러 통과하는데, 여기서 침전된 mRNA는 적절한 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터 내에 잔류한다. 예시적인 심층 어레이 필터의 어레이는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 필터 층을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 층은 (예를 들어, MWCO 또는 평균 직경에 의해 측정했을 때) 유동 방향으로 갈수록 앞에 있는 것보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 감소하는 기공 크기를 갖는다. 비제한적인 예로서, 적절한 심층 필터는 다음 기공 크기를 순서대로 갖는다: 200 μm, 100 μm, 50 μm, 및 5 μm; 또는 500 μm, 300 μm, 200 μm, 100 μm, 및 20 μm; 또는 100 μm, 50 μm, 20 μm, 또는 5 μm. 예시적인 심층 필터 설계는 도 1에 도시되어 있다.
심층 필터는 다음과 같은 여러 제조업체에 의해 상업적으로 제조된다: Millipore Sigma (Clarisolve 60HX 필터, Millistak 필터), Pall Corporation, Sartorius Biotech, 등. 필터는 불활성 물질, 예를 들어, 펠트형 폴리프로필렌 또는 규조토로 제조된다. 필터 하우징 및 어댑터 피팅은 유리로 충진된 폴리프로필렌을 포함한다. 일부 구현예에서, 불활성 물질은 변형된 폴리에테르 술폰(mPES)이다. 필터용 불활성 물질의 다른 예는 폴리에테르 술폰(PES), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 및 셀룰로오스를 포함한다. 필터는 다양한 두께를 가질 수 있다. 필터의 두께는 1 cm 이상일 수 있다. 심층 필터는 쉽게 확장할 수 있으며, 예를 들어, 필터를 추가해 여과 면적을 증가시킬 수 있다. 표면적 및 상응하는 예측 mRNA 정제 용량을 갖는 예시적인 필터는 다음과 같다: 23 cm2 필터는 약 290 mg의 mRNA를 정제하는 용량을 가질 수 있고; 135 cm2 필터는 약 1.7 gm의 mRNA를 정제하는 용량을 가질 수 있고; 270 cm2 필터는 약 3.4 gm의 mRNA를 정제하는 용량을 가질 수 있고; 0.11~1.65 m2 필터는 약 14 gm~200 gm의 mRNA를 정제하는 용량을 가질 수 있rh; 11.5 m2 필터는 약 1.4 Kg의 mRNA를 정제하는 용량을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 필터는 최대 약 264 평방미터 이상, 또는 최대 약 528 평방미터 이상, 또는 최대 약 1056 평방미터 이상의 총 표면적을 포함한다.
로딩
일반적으로, 로딩 단계는 본원에 기술된 필터 시스템 상에 피드, 예컨대 침전된 mRNA를 함유하는 현탁액을 로딩하는 단계를 포함한다. 피드는 일정한 유동, 일정한 압력, 가변 유동, 가변 압력, 및 위킹 및/또는 중력 제어에 의한 유동을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 조건 하에서 로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, IVT 반응으로부터 침전된 mRNA를 함유하는 현탁액은 적절한 유속으로 하나 이상의 필터 상에 로딩된다. 침전된 mRNA를 함유하는 현탁액의 예시적인 적절한 농도는 약 0.01 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 유속은 적어도 약 1 mg/ml, 또는 1.2 mg/ml, 또는 1.3 mg/ml, 또는 1.4 mg/ml, 또는 1.5 mg/ml, 또는 1.6 mg/ml, 또는 1.7 mg/ml, 또는 1.8 mg/ml, 또는 1.9 mg/ml, 또는 2 mg/ml, 및 그 사이의 임의의 농도일 수 있다. 일부 구현예에서, 멤브레인 면적에 대해 정규화된 현탁액의 유속은 10 내지 10000 리터/m2/시간(LMH)의 범위일 수 있다. 예시적인 적절한 유속은 10 LMH, 50 LMH, 100 LMH, 200 LMH, 300 LMH, 400 LMH, 500 LMH, 600 LMH, 700 LMH, 800 LMH, 900 LMH, 1,000 LMH, 1,100 LMH, 1,200 LMH, 1,300 LMH, 1,400 LMH, 1,500 LMH, 1,600 LMH, 1,700 LMH, 1,800 LMH, 1,900 LMH, 2,000 LMH, 2,100 LMH, 2,200 LMH, 2,300 LMH, 2,400 LMH, 2,500 LMH, 2,600 LMH, 2,700 LMH, 2,800 LMH, 2,900 LMH, 3,000 LMH, 3,100 LMH, 3,200 LMH, 3,300 LMH, 3,400 LMH, 3,500 LMH, 3,600 LMH, 3,700 LMH, 3,800 LMH, 3,900 LMH, 4,000 LMH, 4,100 LMH, 4,200 LMH, 4,300 LMH, 4,400 LMH, 4,500 LMH, 4,600 LMH, 4,700 LMH, 4,800 LMH, 4,700 LMH, 4,800 LMH, 4,900 LMH, 또는 5,000 LMH이다. 일부 구현예에서, 적절한 유속은 5,500 LMH, 6,000 LMH, 6,500 LMH, 7,000 LMH, 7,500 LMH, 8,000 LMH, 8,500 LMH, 9,000 LMH, 9,500 LMH, 또는 10,000 LMH를 포함한다.
일반적으로, 유속은 로딩 도중에 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 압력은 로드의 증가에 따라 유속을 유지하도록 조정된다. 예시적인 로드 유동 시간 및 유속은 본 명세서에 제공된 실시예에서 제공된다.
mRNA의 세척 및 회수
포획되거나 잔류된 불용성의 침전된 mRNA는 필터(들) 상에 잔류된 불순물을 제거하기 위해 용리 전에 세척될 수 있다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 단일 헹굼 사이클 또는 하나 이상의 세척액을 사용하는 다수의 헹굼 사이클을 포함한다. 예를 들어, 세척 단계는 구아니디늄 완충액(GSCN) 및 에탄올에 이어서 70~80% 에탄올(예를 들어, 약 70%, 75%, 또는 80% 에탄올)을 사용하는 다수의 헹굼 사이클에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 다수의 헹굼 사이클은 2회 초과, 3회 초과, 4회 초과, 5회 초과, 6회 초과, 7회 초과, 8회 초과, 9회 초과, 또는 10회 초과 사이클을 포함한다.
다양한 세척 완충액이 사용될 수 있다. 예를 들어, 포획된 mRNA는 1회 이상의 염 세척 및/또는 1회 이상의 에탄올 세척을 거칠 수 있다. 세척은 수성 용매 또는 유기 용매를 사용해 수행될 수 있다. 예시적인 세척 완충액은 미국 특허 제9,957,499호 및 제9,850,269호, 및 미국 특허 출원 제15/907,086호 및 제15/906,864호에 추가로 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 1회 이상의 염 세척으로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 에탄올 세척으로 달성될 수 있다.
침전된 mRNA를 세척하는 단계는 에탄올과 같은 유기 용매의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매를 사용하지 않고도 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 PEG를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 PEG-6000을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 PEG-400을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 90 센티스트로크 이하의 점도를 갖는 PEG를 포함하는 1회 이상의 세척을 포함한다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 80 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 70 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 60 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 50 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 40 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 30 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 20 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 데 사용되는 PEG는 10 센티스트로크 이하의 점도를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 트리에틸렌 글리콜(TEG)를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 터트-부틸-TEG-O-프로피오네이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이메틸 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이비닐 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-모노부틸을 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-메틸 에테르 메타크릴레이트를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-모노데실 에테르를 사용해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 TEG-다이벤조에이트를 사용해 달성될 수 있다. 이들 시약 각각의 구조는 상기 표 A에 나타나 있다.
일반적으로, 포획되거나 잔류된 mRNA는 침전된 mRNA를 용액으로 재가용화함으로써 용출될 수 있다. 예를 들어, 포획된 mRNA는 RNase-무함유 물로 용리될 수 있다. 특정 구현예에서, 포획된 mRNA를 용리하는 단계는 RNase-무함유 물을 재순환시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, RNase-무함유 물은 약 5~100분 동안 (예를 들어, 약 5~90분, 약 5~80분, 약 5~70분, 약 5~60분 또는 약 5~30분 동안) 순환될 수 있다. 특정 구현예에서, RNase-무함유 물은 약 5~10분 동안(예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10분 동안) 재순환된다.
일부 구현예에서, 재가용화된 mRNA는 원하는 농도의 원하는 제형으로 투석될 수 있다. 투석을 위해 다양한 제형이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 1 mM 구연산나트륨을 사용해 투석된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 아세트산나트륨, 탄산암모늄, 중탄산암모늄, 아세트산피리디늄, 포름산피리디늄, 아세트산암모늄, 요소, 염화칼륨 등을 사용해 투석된다. 관심 mRNA의 크기에 따라, 적절한 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 투석 멤브레인이 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 투석 멤브레인은 약 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa, 또는 500 kDa의 MWCO를 가질 수 있다.
정제된 mRNA의 특성 분석
정제된 mRNA는 당업계에서 이용 가능한 임의의 방법을 사용하여 특성화할 수 있고 정량화할 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 분자는 블롯팅, 모세관 전기영동, 크로마토그래피, 형광, 겔 전기영동, HPLC, 은 염색, 분광법, 자외선(UV), 또는 UPLC, 또는 이들의 조합을 사용해 특성화된다. 당업계에 공지된 다른 방법이 본 발명에 포함된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 분자는 모세관 전기영동에 의해 분리된 UV 흡수 분광법을 사용하여 검출된다. 일부 구현예에서, mRNA는 겔 전기영동 이전에 글리옥살 염료에 의해 먼저 변성된다("글리옥살 겔 전기영동").
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 정제된 mRNA는, 본원에 기술되고 당업계에 공지된 다양한 검출 방법(예: 모세관 전기영동, 겔 전기영동, HPLC, 또는 UPLC)에 의해 결정된 전장 mRNA 이외에 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만의 불순물을 포함한다. 불순물은 IVT 오염물, 예를 들어, 단백질, 효소, 유리 뉴클레오티드, 및/또는 쇼트머를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "쇼트머(shortmers)" 또는 "미성숙 전사체(abortive transcripts)"는 전장보다 짧은 임의의 전사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "쇼트머" 또는 "미성숙 전사체"는 길이가 100 뉴클레오티드 미만, 90 뉴클레오티드 미만, 80 뉴클레오티드 미만, 70 뉴클레오티드 미만, 60 뉴클레오티드 미만, 50 뉴클레오티드 미만, 40 뉴클레오티드 미만, 30 뉴클레오티드 미만, 20 뉴클레오티드 미만, 또는 10 뉴클레오티드 미만이다. 일부 구현예에서, 쇼트머는 5'-캡 및/또는 3'-폴리 A 꼬리를 첨가한 후에 검출되거나 정량화된다.
무엇보다도, 본원에 기술된 정제 방법은 치료적 사용을 위한 mRNA를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 다양한 특성화 기술에 의해 결정된 정제된 mRNA의 순도 및/또는 무결성은 배치 방출 기준으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 공정에서 mRNA의 배치 생산의 방출 기준은 다음 중 하나 이상을 모세관 전기영동에 의해 결정하는 것을 포함한다: 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하거나, 단백질 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하거나, 짧은 미성숙 RNA 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 염 오염물을 포함하거나, 염 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 무결성을 포함함.
일부 구현예에서, 제조 공정에서 mRNA의 배치 생산의 방출 기준은 다음 중 하나 이상을 HPLC에 의해 결정하는 것을 포함한다: 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하거나, 단백질 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 짧은 미성숙 RNA 오염물을 포함하거나, 짧은 미성숙 RNA 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 염 오염물을 포함하거나, 염 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 무결성을 포함함.
또한, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 높은 수율을 초래한다. 예를 들어, 총 정제된 mRNA는 적어도 약 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 수율을 초래하는 양으로 회수된다.
본 발명에 따르면, mRNA는 대규모로 정제될 수 있다. 예를 들어, 적어도 0.5 그램, 1 그램, 5 그램, 10 그램, 15 그램, 20 그램, 35 그램, 40 그램, 45 그램, 50 그램, 60 그램, 70 그램, 80 그램, 90 그램, 100 그램, 200 그램, 300 그램, 400 그램, 500 그램, 1 킬로그램, 10 킬로그램, 50 킬로그램, 100 킬로그램의 mRNA가 단일 배치로 정제될 수 있다.
조성물 및 치료 방법
본 발명에 따라 정제된 mRNA는 네이키드 mRNA(비패키징)로서 전달되거나 전달 비히클을 통해 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전달 비히클", "수송 비히클", "나노입자" 또는 문법적으로 동등한 용어는 상호 교환적으로 사용된다.
전달 비히클은 하나 이상의 추가적인 핵산, 담체, 표적 리간드, 또는 안정화 시약과 조합하여 제형화되거나, 적합한 부형제와 혼합된 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa.,] 최신판에서 확인할 수 있다. 특정 전달 비히클은 핵산을 표적 세포에 형질감염시키는 것을 용이하게 하는 능력에 기초하여 선택된다.
다양한 구현예에 따르면, 적합한 전달 비히클은 중합체계 담체, 예컨대 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI), 지질 나노입자(LNP) 및 리포솜, 나노리포솜, 세라미드(ceramide)-함유 나노리포솜, 프로테오리포솜(proteoliposomes), 천연 및 합성-유래 엑소좀 둘 다, 천연, 합성 및 반-합성 라멜라체(lamellar bodies), 나노미립자(nanoparticulates), 칼슘 포스포실리케이트(phosphor-silicate) 나노미립자, 칼슘 포스페이트 나노미립자, 실리콘 다이옥사이드 나노미립자, 나노결정 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 졸-겔, 나노덴드리머(nanodendrimers), 전분-기반(starch-based) 전달 시스템, 미셀(micelles), 에멀전, 니오좀(niosomes), 다중-도메인-블록 폴리머(비닐 폴리머, 폴리프로필(polypropyl) 아크릴산 폴리머, 다이나믹 다중접합체(dynamic polyconjugates)), 건조 분말 제형, 플라스미드, 바이러스, 칼슘 포스페이트 뉴클레오티드, 압타머(aptamers), 펩타이드 및 기타 벡터형 태그(vectorial tags)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
리포솜 전달 운반체
일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 리포솜 전달 비히클, 예를 들어, 지질 나노입자(LNP) 또는 리포솜이다. 일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 4개 이하의 구별되는 지질 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 3개 이하의 구별되는 지질 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 구별되는 지질 성분은 스테롤계 양이온성 지질이다.
본원에서 사용되는 용어 "양이온성 지질"은 생리적인 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 띄는 임의의 많은 지질 및 지질 종을 말한다. 몇몇 양이온성 지질은 문헌에 개시되어 있고, 그 중 많은 것이 상업적으로 이용가능하다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 폐 또는 폐 세포에 전달하거나 대상체의 폐 또는 폐 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍될 수 있거나 비기능적일 수 있는 내인성 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 폐 또는 폐 세포에 전달하거나 대상체의 폐 또는 폐 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 낭성 섬유증 막관통 전달 조절자, 즉 CFTR을 암호화하는 mRNA를 제조하는 방법에 유용하다. CFTR mRNA는 낭성 섬유증을 치료하기 위한 치료 조성물을 필요로 하는 대상체의 폐에 전달된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 간 또는 간 세포에 전달하거나 대상체의 간 또는 간 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 요소 회로 질환과 관련된 것들, 리소좀 저장 장애와 관련된 것들, 글리코겐 저장 장애와 관련된 것들, 아미노산 대사 장애와 관련된 것들, 지질 대사 또는 섬유증 장애와 관련된 것들, 메틸말론 신혈증과 관련된 것들, 또는 풍부한 전장 mRNA를 간 또는 간 세포에 전달하거나 이를 이용해 간 또는 간 세포를 치료하는 것이 치료적 이점이 되는 임의의 다른 대사 장애와 관련된 것들을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 요소 순환 질환과 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 오르니틴 트랜스카르바밀라에제(OTC) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 합성효소 1 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 카바모일 포스페이트 합성효소 I 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 리아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아르기나아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 리소좀 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 알파 갈라토시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루코세레브로시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이두로네이트-2-설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이두로니다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 N-아세틸-알파-D-글루코사미니다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 헤파린 N-설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 갈락토사민-6 설파타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 베타-갈락토시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 리소좀 리파아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 아랄설파타아제 B (N-아세틸갈락토사민-4-설파타아제) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전사 인자 EB(TFEB)를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 저장 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 산 알파-글루코시다아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루코스-6-포스파타아제 (G6PC) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 간 글리코겐 포스포릴라아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 포스포글리세레이트 뮤타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글리코겐 탈분지 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 아미노산 대사 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 하이드록실라아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 글루타릴-CoA 디하이드로제나아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프로피오닐-CoA 카복실라아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 옥살라아제 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소를 암호화하는 전장 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 지질 대사 장애 또는 섬유증 장애와 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 mTOR 억제제를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATPase 인지질 수송 8B1 (ATP8B1) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 NF-카파 B 억제제, 예컨대 I-카파 B 알파, 인터페론 관련 발달성 조절물질 1 (IFRD1), 및 시르투인 1(SIRT1) 중 하나 이상을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 PPAR-감마 단백질 또는 활성 변이체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론산혈증과 관련된 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 뮤타아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메틸말론 CoA 에피머라아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 간으로의 전달 또는 간의 치료가 치료적 이점을 제공할 수 있는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 윌슨병(Wilson disease) 단백질로도 알려진 ATP7B 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 포스포빌리노겐 디아미나아제 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X와 같은 하나 이상의 응고 효소를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 혈색소 침착증(HFE) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포에 전달하거나 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 혈관 내피 성장 인자 A 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 릴랙신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-9 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 골 형성 단백질-2 수용체 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 근육 또는 근육 세포에 전달하거나 대상체의 근육 또는 근육 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 디스트로핀 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 심근 또는 심근 세포에 전달하거나 대상체의 심근 또는 심근 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 칼륨 채널 및 나트륨 채널 중 하나 또는 둘 다를 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Kv7.1 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Nav1.5 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신경계 또는 신경계 세포에 전달하거나 대상체의 신경계 또는 신경계 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 1 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 2 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 D 구성원 1 (ABCD1) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CLN3 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포에 전달하거나 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 베타 글로빈 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 브루톤 티로신 키나아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 응고 효소, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 신장 또는 신장 세포에 전달하거나 대상체의 신장 또는 신장 세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 IV형 콜라겐 알파 5 사슬 (COL4A5) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 안구 또는 안세포에 전달하거나 대상체의 안구 또는 안세포를 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 A 구성원 4 (ABCA4) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 망막층간 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 망막 색소 상피-특이적 65 kDa (RPE65) 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 290 kDa의 중심체 단백질(CDP290)을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체 또는 대상체의 세포에 백신을 전달하거나 대상체 또는 대상체의 세포를 백신으로 치료하는 데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 바이러스와 같은 감염원의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 광견병 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 사이토메갈로 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 로타 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 간염 바이러스, 예컨대 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 유두종 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 단순 헤르페스 바이러스, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 1형 또는 단순 헤르페스 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스 1형 또는 인간 면역 결핍 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 메타뉴모바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스, 예컨대 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2형, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 말라리아 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 지카 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 치쿤구니야 바이러스의 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암과 연관되었거나 대상체의 암 세포로부터 식별된 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대상체 본인의 암 세포로부터 결정된 항원, 즉 맞춤화된 암 백신을 제공하기 위한 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 KRAS 유전자로부터 발현된 항원을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 항체는 이중 특이적 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 OX40에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 VEGF에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 조직 괴사 인자 알파에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CD3에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CD19에 대한 항체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 면역조절물질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 12를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 23을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터류킨 36 감마를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 인터페론 유전자의 자극제(STING) 단백질의 구성적 활성 변이체를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 엔도뉴클레아제를 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 단백질, 예컨대 Cas 9 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 메가뉴클레아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 징크 핑거 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 안구 질환을 치료하기 위해 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 망막층간 단백질을 암호화하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태는 전술한 양태 또는 구현예에 의해 제조된 정제된 mRNA 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 양태의 정제된 mRNA 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 일 양태는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 양태의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 전술한 양태 또는 구현예에 의해 제조된 정제된 mRNA 조성물을 포함하는 용액이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 전술한 정제된 mRNA 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 양태의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 상기 양태 및/또는 구현예에 의해 생산된 정제된 mRNA 침전물을 포함하는 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명은 상기 양태 및/또는 구현예에 의해 생산된 정제된 mRNA 침전물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명은 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 상기 양태 및/또는 구현예의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태 또는 구현예는 본원에 개시된 임의의 다른 양태 또는 구현예와 조합될 수 있다. 본 발명은 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용과 함께 설명되었지만, 상기 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하도록 의도된 것이며 이를 제한하도록 의도된 것은 아니다. 다른 양태, 장점, 및 변형은 다음의 청구범위의 범주에 포함된다.
본 발명과 관련된 추가 교시는 다음 중 하나 이상에 기술되어 있다: WO　2010/053572; WO　2011/068810; WO　2012/075040; WO　2012/170889; WO　2012/170930; WO　2013/063468; WO　2013/149140; WO　2013/149141; WO　2013/185067; WO　2013/185069; WO　2014/089486; WO　2014/152513; WO　2014/152659; WO　2014/152673; WO　2014/152774; WO　2014/152966; WO　2014/153052; WO　2015/061461; WO　2015/061467; WO　2015/061491; WO　2015/061500; WO　2015/148247; WO　2015/164773; WO　2015/184256; WO　2015/200465; WO　2016/004318; WO　2016/149508; WO/2014/152940; PCT/US16/57044; US　62/320,073; US　62/349,331; US　62/420,413; US　62/420,421; US　62/420,428; US　62/420,435; US　62/421,007; US　62/421,021, 및 "LARGE SCALE SYNTHESIS OF MESSENGER RNA" (US 62/464,043), "METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA" (US 62/463,998), 및 "NOVEL CODON-OPTIMIZED CFTR MRNA" (US　62/464,215)의 명칭으로 2017년 2월 27일에 출원인에 의해 출원된 관련 출원(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시와 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 아래에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다. 본원에 인용된 참조 문헌이 청구된 발명의 종래 기술로서 인정되는 것은 아니다. 또한, 물질, 방법 및 예시는 예시적인 것에 불과하며 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: mRNA의 정상 유동 여과 정제
이 실험에서, 전령 RNA(mRNA)의 정제를 위해 심층 여과(Clarisolve 60HX)를 사용하는 정상 유동 여과의 실현 가능성을 평가하였다. 상기 방법 단계는 (1) mRNA를 침전하는 단계, (2) 침전된 mRNA를 필터에 의해 필터 내 및/또는 필터 상에 포획하는 단계, (3) 포획된 침전된 mRNA를 세척하는 단계, (4) 침전된 mRNA를 용해시켜 이를 필터 투과물로 변환시키는 단계, 및 (5) 용해된 것을 회수하는 단계를 포함하였다. 특히, 이 실험에서, 침전 조건 및 세척 완충액을 변화시켜 mRNA의 수율 및 순도를 평가하였다. 이러한 정상 유동 여과의 실현 가능성을 정제의 다양한 지점에서 평가하였다: (i) 여액의 육안 검사로 나타낸 바와 같이, 심층 필터 내에 침전된 mRNA의 잔류; (ii) 여액 전도도로 나타낸 바와 같이, 침전된 mRNA 세척의 효과; (iii) 분광광도법으로 나타낸 바와 같이, 정제를 통한 mRNA의 회수.
IVT 반응
본 실시예 및 본원에 기술된 모든 실시예의 경우, 일반적으로, mRNA를 표준 방법에 의해 시험관 내 전사(IVT)하였다. 요약하자면, 전사된 mRNA의 매 그램 마다, RNA 중합효소-특이적 프로모터, RNA 중합효소(예를 들어, SP6 중합효소 또는 T7 중합효소), RNase 억제제, 피로포스파타아제, NTP, DTT, 및 반응 완충액이 포함된 선형 이중 가닥 DNA 플라스미드를 함유하는 반응물을 RNase-무함유 물로 제조한 다음, 37℃에서 지정된 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 정제를 준비하는 동안, DNase I 및 DNase I 완충액을 첨가하여 반응물을 퀀칭시켜 이중-가닥 DNA 템플릿의 분해를 용이하게 하였다.
RNA 침전 및 여과
물질: 피드 mRNA: CFTR을 암호화하는 시험관 내 합성 mRNA; GSCN 완충액: 구아니딘 티오시아네이트, 구연산나트륨, N-라우릴 사르코신의 혼합물; 침층 필터: Clarisolve 60HX, 카탈로그 번호: CS60HX01L3(유효 면적 23 cm2). GSCN 세척 완충액: GSCN 완충액, 에탄올, 물.
A. 침전
mRNA를 구아니디늄 티오-시아나이드(GSCN) 완충액과 먼저 혼합하여 CFTR을 암호화하는 시험관 내 합성 mRNA(피드 mRNA)를 침전시킨 다음, 혼합하여 mRNA를 변성시켰다. 100% 에탄올(EtOH)을 혼합물에 첨가하고 혼합하여 mRNA를 침전시켰다.
B. 여과
침전된 혼합물을 일정한 피드 플럭스로 심도 필터 상에 로딩하였다. 초기 피드 플럭스는 3~4시간의 공정 시간을 달성하도록 선택하였다. 플럭스를 실험 중에 조정하였다. 로딩이 완료된 후, 포획된 침전된 mRNA를 GSCN/에탄올 세척 완충액으로 헹구고(세척하고), 이어서 0.0 mS/cm의 여액 전도도가 달성될 때까지 80% 에탄올로 헹구었다(세척했다). 로딩 단계 및 세척 단계 동안 여액 질량, 피드 압력, 및 여액 전도도를 모니터링하였다. 세척한 침전된 mRNA를 용해시킨 다음, 헹굼액을 80% 에탄올에서 물로 변경하여 용해물을 여액으로 변형시켰다. 이 경우, 심층 필터 및 필터 시스템을 통해 물을 재순환시켰다. 그런 다음, 용해된 mRNA가 포함된 물을 수집하고, 260 nm에서의 흡광도를 통해 mRNA 회수를 측정하였다.
mRNA 분석: 본 실시예 및 본원에 기술된 다른 실시예에서, 로드를 증가시키면서 mRNA를 필터에 로딩하는 동안의 저항 변화를 기록하고, 피드 압력을 피드 플럭스로 나눔으로써 저항 변화를 측정하였다. 이 파라미터는 유속 변화로 인한 압력 변화를 정규화하기 위한 압력을 나타내는 대신에 표시하였다. 표준 mRNA 분석 키트(Advanced Analytical Tech)가 구비된 CE Fragment AnalyzerTM를 사용해 총 mRNA 부하가 300 ng에 대해 mRNA 무결성(캡핑 및 테일링된(C/T) mRNA를 포함할 수 있으며, 이 경우 무결성 분석에는 폴리-A 꼬리 길이의 평가가 포함됨)을 분석하였다. NuPAGE 샘플 로딩 및 환원 완충액 중 20 μg의 RNase I 분해된 mRNA를 제조하고, 200 V에서 NuPage 10% 비스-트리스 겔(Invitrogen) 상에서 35분 동안 샘플을 분리함으로써 잔류 공정 효소를 분석하였다. 그런 다음, SilverQuestTM 은 염색 키트(Invitrogen)를 사용해 잔류 단백질을 시각화하였다. 정제할 mRNA의 시작 질량은, mRNA를 제조하는 데 사용된 IVT 및/또는 캡/꼬리 반응에서의 초기 시약의 양에 의해 결정했을 때, 이론적으로 예상되는 생성물의 양에 기초하여 계산하였다. 수율은 이론적으로 예상되는 생성물의 양 대비 수득된 생성물의 비율로서 계산하였다.
로딩 단계 동안, mRNA 로딩이 증가할 때 저항의 증가는 관찰되지 않았다. 저항 대 mRNA 로딩의 추세는 도 2에 도시되어 있다. 저항은 피드 압력을 피드 플럭스로 나누어 계산하였다.
로딩 및 세척 단계 이후의 여액을 침전물의 존재에 대해 검사하였는데, 침전물의 존재는 침전된 mRNA의 일부가 필터를 통과하였음을 나타내는 것이다. 여액에서 침전물은 관찰되지 않았다.
전술한 바와 같이, 필터 중의 침전된 mRNA를 GSCN/에탄올 세척 완충액으로 세척하고, 이어서 80% EtOH로 세척하였다. 제조용 염 오염물을 제거하는 이러한 필터 시스템의 효과는, 전도도를 측정하고 이를 EtOH 세척 완충액의 볼륨 증가에 대해 플롯팅함으로써 입증하였으며, 이는 도 3에 도시되어 있다. 오염물 염에 의해 부여된 전도도는 관류 볼륨의 증가에 따라 0으로 감소하여 염이 제거되었음을 나타냈고, 이는 80% 에탄올이 필터와 침전된 mRNA로부터 염 오염물을 효과적으로 제거하였음을 보여준다. 특히, 0.0 mS/cm의 여액 전도도는 mRNA 1 그램 당 약 2.0 L의 관류 볼륨 이후에 관찰되었다.
이러한 정제 방법을 통한 mRNA 회수는 표 1에 요약되어 있다. 도 4는 재순환 시간의 경과에 따른, 시험관 내에서 전사된 CFTR mRNA의 mRNA 회수율을 보여준다. 40분 동안 시스템을 통해 물을 재순환시켜 침전된 mRNA를 용해시킨 후, 여액을 수집하고, A260에서의 흡광도를 통해 mRNA를 측정하였다. 놀랍게도, 이 정제를 통해 mRNA의 94%를 회수하였다. 전도도 측정치가 0일 때 생성된 이처럼 놀랍게 높은 회수율은 (a) 침전된 mRNA가 심층 필터 매질 내에 성공적으로 포획/잔류되었고, (b) 심층 필터 매질 내에 포획된 침전된 mRNA로부터 염 오염물이 효과적으로 세척되었으며, (c) 심층 필터 매질 내에 포획된 침전된 mRNA가 효과적으로 회수되었음을 나타냈다.
생성물 회수 요약
시작 질량 373 mg
회수된 질량: 352 mg
회수율 (%) 94%
표 1에 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 정상 유동 여과 공정을 사용하여 높은 회수율을 수득하였다.
실시예 2. 캡핑 및 테일링 반응 후 mRNA의 정상 유동 필터 정제.
본 실험에서, IVT로 제조된 mRNA를 대상으로 캡핑 및 테일링(C/T) 반응 후 심층 필터를 사용해 정상 유동 필터 정제를 수행하였다. 캡핑 및 테일링된 mRNA의 정제는 다음 기준을 사용해 평가하였다: (i) 여액 및 생성물 회수를 육안 검사로 나타냈을 때, C/T 반응 후 심층 필터(Clarisolve 60HX) 내에 침전된 mRNA의 잔류 여부; (ii) 여액 전도도 및 생성물 회수로 나타냈을 때, 오염물을 제거하고 mRNA를 잔류시키기 위한 침전된 mRNA 세척의 효과; (iii) 분광광도계로 나타냈을 때, mRNA의 회수(mRNA를 침전된 형태로 용해시켜, 필터 내에 및/또는 필터 상에 포획된 mRNA를 필터 여액으로 변환시킨 후); (iv) 모세관 전기영동(CE)으로 나타냈을 때, mRNA의 무결성; 및 (v) 은 염색 겔 분석에 의해 나타내을 때, mRNA 순도.
캡핑 및 테일링(C/T) 반응
전술한 바와 같이 시험관 내 전사에 의해 mRNA를 합성한 후, 구아닐레이트 트랜스퍼라아제를 사용하여 5' N7-메틸구아닐레이트 캡 0 구조를 첨가하고, Pechter, P. 및 Brownlee, G.G.에 의해 기술된 것과 같이 2' O-메틸트랜스퍼라아제를 사용해 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 2' O 위치에 메틸기를 첨가하여 캡 1 구조를 생성함으로써, 시험관 내에서 전사된 mRNA를 효소적으로 변환시켰다(Pechter, P. 및 Brownlee, G.G.의 문헌["Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249] 참조). Cap 1 구조를 첨가한 후, 시험관 내 전사된 mRNA의 3' 말단에 폴리-아데닐화 꼬리를 폴리-A 중합효소를 사용해 효소적으로 첨가하였다.
C/T 반응은 침전 및 심층 필터 시험 직전에 수행하였다.
A. 침전
C/T 물질을 희석없이 침전시켰다(침전 1). 먼저 mRNA 피드 물질을 GSCN 완충액과 혼합하여 침전을 수행하였다(그런 다음, 14분 동안 혼합하여 mRNA를 변성시켰다). 100% 에탄올을 혼합물에 첨가하고 6분 동안 혼합하여 mRNA를 침전시켰다.
B. 여과
침전된 mRNA를 포함하는 생성된 용액을 (이전의 시험에 기초하고 공정 시간을 감안하여) 약 1600 LMH의 일정한 피드 플럭스로 심도 필터 상에 로딩하였다. 로딩이 완료된 후, 포획된 침전물을 (전술한 바와 같이) GSCN/에탄올 세척 완충액으로 헹구고(세척하고), 이어서 0.0 mS/cm의 여액 전도도가 달성될 때까지 80% 에탄올로 세척하였다. 로딩 단계 및 세척 단계 동안 여액 질량, 피드 압력, 및 여액 전도도를 모니터링하였다. 심층 필터를 통해 물을 재순환시킴으로써 심층 필터 내의 세척되고 침전된 mRNA를 용해시켜, 포획된 mRNA를 여액으로 변형시켰다. 그런 다음, 용해된 mRNA를 여액으로서 회수하고, 260 nm에서의 흡광도를 통해 시간에 따른 회수율을 측정하였다.
또한, 심층 필터에서 용리된 mRNA에 대해 2차 침전(침전 2)을 수행하였다. 이러한 2차 침전은 1차 침전에 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 수행하였다. 필터에 의해 포획된 침전된 mRNA를 대상으로 2차 세척을 수행한 다음, 전술한 동일한 절차에 따라 용해시키고 여액으로서 수집하였다.
C/T 침전 1 및 2에 대한 저항 대 mRNA 로딩의 추세는 도 4 및 도 5에 각각 도시되어 있다. 로딩 단계 동안에는 (있다 하더라도) 저항의 최소 증가가 관찰되었다. 로딩 및 세척 단계 이후의 여액을 침전물의 존재에 대해 검사하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 모든 경우에, 여액에서 침전물이 관찰되지 않았다.
잔류 염을 제거하는 80% 에탄올 관류의 효과는 도 7에 도시되어 있다. 80% 에탄올은 필터와 침전된 mRNA로부터 잔류 염을 효과적으로 제거하였다. mRNA를 용해시키고 회수하기 전에, mRNA 1 그램 당 약 9 L의 80% 에탄올을 각각의 필터를 통해 관류시켰다.
C/T 반응 후 침전된 mRNA를 성공적으로 용해시키고 심층 필터로부터 회수하였는데, 이는 침전된 mRNA가 심층 필터 매질 내에 잔류하였고, 80% 에탄올 관류가 필터 상에 및/또는 필터 내에 포획된 mRNA를 침전된 상태로 유지시키는 것 및 염 오염물을 제거하는 것 모두에서 효과적이었음을 추가로 나타낸다. 재순환 동안의 생성물 회수는 도 8a 내지 도 8b에 도시되어 있고, 회수 질량 및 회수율을 요약한 표 2에 요약되어 있다.
생성물 회수 요약
C/T 침전 1 C/T 침전 2
시작 질량 289 mg* 270 mg
회수된 질량: 274 mg 269 mg
회수율 (%) 95% 100%
* 시작 질량은 예상 꼬리 길이를 기준으로 C/T 반응 농도 대비 10% 증가한 것으로 가정한다.
모세관 전기영동을 사용해, 회수된 정제된 mRNA의 분취물을 검사함으로써 mRNA 무결성 평가를 수행하였다. 결과는 도 9에 도시된 바와 같이 높은 순도 및 무결성을 나타낸다. 유의한 숄더가 없는 단일 피크가 관찰되었다. 이는 심층 필터 공정이 오염물(예: 쇼트머)을 성공적으로 제거함과 동시에 mRNA 품질과 무결성에 악영향을 미치지 않았을 뿐만 아니라, 오히려 높은 수준의 mRNA 무결성을 갖는 고도로 정제된 mRNA를 생성하였음을 나타낸다.
mRNA 순도의 분석은 mRNA 생성물을 RNase I로 분해하고, 분해된 생성물을 겔에서 전기영동시키고 은 염색으로 시각화함으로써 잔여 오염물을 시각화하여 추가로 평가하였다. 은 염색은 조성물 중의 소량의 단백질에도 민감하므로, 적은 양의 잔여 캡핑 효소 또는 테일링 효소까지도 검출할 수 있다. 도 10의 레인 4 및 5에 도시된 바와 같이, 침전시키고 여과한 mRNA 생성물에는 단백질이 없었으며, 고도로 순수한 mRNA의 음성 대조군인 레인 2와 유사하였다. 레인 6~10에서는 효소에 상응하는 잔류 효소가 관찰되지 않았다. 이는 본원에 기술된 바와 같은 정상 유동 여과의 사용이 mRNA의 제조에 사용된 염 및 효소를 제거하여 고도로 순수한 mRNA 생성물을 생산하는데 효과적임을 나타낸다.
실시예 3. 대규모 mRNA 정제를 위한 정상 유동 여과의 평가
이 실험에서는, 심층 필터를 사용하여 15 그램의 IVT 합성된 CFTR mRNA의 정제를 위한 정상 유동 여과를 수행하였다. 공정 단계의 요약은 표 3에 기술되어 있다.
15 g CFTR mRNA 배치 제조 공정
공정 단계 설명
IVT 반응 시험관 내 전사 반응
IVT 정제 GSCN 및 에탄올 침전. 심층 필터(Clarisolve 60HX)를 사용한 포획, 세척 및 재용해.
IVT UF/DF 정용여과 및 한외여과를 통한 농축 및 완충액 교환.
C/T 캡핑 및 테일링 반응.
C/T 정제물 1 GSCN 및 에탄올 침전. 심층 필터(Clarisolve 60HX)를 사용한 포획, 세척 및 재용해.
C/T 정제물 2 GSCN 및 에탄올 침전. 심층 필터(Clarisolve 60HX)를 사용한 포획, 세척 및 재용해
C/T UF/DF 정용여과 및 한외여과를 통한 농축 및 완충액 교환.
멸균 필터 및 충진 멸균 여과, PETG 병에 충진, ≤-20℃에서 보관
15 그램의 mRNA의 정상 유동 여과 정제의 경우, 특히 침전된 mRNA의 포획 및 세척을 위해 0.11 m2의 Clarisolve 60HX 심도 필터, Process Scale 모듈(CS60HX01F1-X)을 사용하였다. mRNA 로딩은 약 130 g/m2으로 수행하였다.
3가지 침전 모두에 대한 내성 대 mRNA 로딩의 추세는 도 11에 도시되어 있다. 모든 침전이 동일한 플럭스로 로딩되었기 때문에, 압력 강하도 추세에 포함시켰다.
15 그램의 CFTR mRNA를 침전시키고, 필터 시스템에 로딩하고, 필터 상에 및/또는 필터 내에 포획하고, GSCN/에탄올 완충액을 사용해 세척하고, 이어서 80% 에탄올 완충액을 사용해 세척한 다음, 전술한 바와 같이 여액으로 용해시켰다. 로딩 및 세척 단계(여기서 침전된 mRNA가 필터 내에 잔류됨) 후의 여액을 침전물의 존재 여부에 대해 검사하였다. 로딩 후 여과물의 사진은 도 12에 도시되어 있다. 여액에서 침전물은 관찰되지 않았다. 모든 3가지 침전 단계에 대해, 잔류 염을 제거하는 80% 에탄올 관류의 효과가 도 13에 도시되어 있다. mRNA 1 그램 당 약 3 L의 80% 에탄올 관류 볼륨 후에 0.0 mS/cm의 여액 전도도가 달성되었다. 재순환 전에 총 5 L/g의 80% 에탄올을 관류시켰다. 0.0 mS/cm에 도달하기 위해 필요한 에탄올 관류 볼륨은 규모가 작을 때와 비슷하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 80% 에탄올 관류는 필터와 침전된 mRNA로부터 잔류 염을 효과적으로 제거하였다.
이어서, 전술한 바와 같이, 재순환된 물을 이용한 물 관류로 전환하여 mRNA를 용해시켰다. 재순환 동안 재용해된 mRNA의 회수는 도 14a 내지 도 14b에 도시되어 있다. 도 14a는 시간 경과에 따라 회수되는 mRNA의 농도를 보여준다. 도 14b는 시간 경과에 따른 mRNA의 회수율(%)을 나타낸다. mRNA 농도는 30~60분 동안의 재순환 후에 안정화되었고, 그 이후에 mRNA를 여액으로서 회수하였다. 각각의 침전 후, 침전된 mRNA를 성공적으로 재용해시키고 심층 필터로부터 회수하였는데, 이는 80% 에탄올 관류 동안 생성물이 심층 필터 매질 내에 성공적으로 포획되었음을 추가로 나타낸다.
표 4는 각 여과 단계에서 mRNA의 수율을 요약한 것이다. 시작 질량은 예상 꼬리 길이를 기준으로 C/T 반응 농도 대비 10% 증가한 것으로 가정한다. 총 15.4g의 mRNA를 15 g의 IVT로부터 생성하였다. 이러한 종류의 회수는 놀랍고 예상치 못한 것이었으며; mRNA의 시작 질량이 15 g일 때 대략 8~10 g의 mRNA가 수득될 것으로 예상되는, 당업계에서 사용되는 통상적인 공정보다 상당히 양호하였다.
수율 요약
단계 설명 mRNA 질량 (g) 단계 수율(%)
IVT 반응 미측정 해당 없음
IVT 침전물 1 16.0 해당 없음
IVT UFDF 16.3 102%
C/T 반응 미측정 해당 없음
C/T 침전물 1* 16.1 90%
C/T 침전 2 15.7 98%
C/T UFDF 15.4 98%
* 수율 계산은, 꼬리를 첨가함으로써 질량의 10%가 증가하는 것으로 가정한다.
정제된 mRNA의 품질을 모세관 전기영동에 의해 평가하였다. mRNA 무결성 및 꼬리 길이를 평가하는 전기영동도는 도 15a 및 도 15b에 도시되어 있다. CFTR mRNA 생성물을 심층 여과를 사용하지 않는 방법에 의해 일찍 정제한 고 무결성 대조군 샘플의 예가 도 15a에 도시되어 있다. 도 15b는 2회의 사후 C/T 침전 후, 심층 필터로부터 용리한 mRNA의 전기영동도를 도시하며, 그 결과는 고 무결성 대조군 샘플보다 더 양호하였다. 유의한 숄더는 관찰되지 않았다. 심층 필터 공정은 mRNA 품질과 무결성에 악영향을 미치지 않았다.
도말 분석 결과는 표 5에 나타냈다. 심층 필터 배치의 도말 분석은, mRNA의 품질이 다른 방법에 의해 이전에 제조된 배치의 mRNA와 유사하였음을 나타낸다.
CE 도말 분석
로트 번호 샘플 종류 주요 피크 (%) 숄더 (%)
심층 필터 정제 mRNA 원료 의약품 - 심층 필터 78 21
대조군 mRNA 원료 의약품 - 대조군 샘플 70 28
또한, 정제된 mRNA 샘플에 대해 꼬리 길이를 분석하고 및 캡핑 효율을 평가하였다. 꼬리 길이 분석은 표 6에 요약되어 있다. 작제물 크기 및 꼬리 길이는 기대치와 일치하며, 이는 심층 필터 정제가 캡핑 반응에 악영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 캡핑 검정의 결과를 표 7에 나타냈다. 캡 백분율은 기대치와 일치하였는데, 이는 심층 필터 정제가 테일링 반응에 악영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
mRNA 꼬리 길이 분석
샘플 평균 크기 (nt) 꼬리 길이 (nt)
IVT 4649 해당 없음
원료 의약품 5141 492
mRNA 캡핑 분석
캡핑 없음 5
캡 0 0
캡 G 0
캡 1 95
mRNA 순도 및 잔류 효소를 평가하는 은 염색 분석은 도 16에 도시되어 있다. mRNA 순도는 1차 C/T 침전 후 뿐만 아니라 2차 C/T 침전(원료 의약품) 후에도 평가하였으며, 레인 6과 7에 각각 도시되어 있다. 1차 침전 및 제2 침전 후, 심층 여과를 통해 정제된 물질에 대해서는 잔류 효소 밴드가 관찰되지 않았다. 은 염색은 C/T 침전 1 후의 샘플에 잔류 효소가 없었음을 나타냈다.
요약하자면, 이들 결과는 각각의 IVT 및 C/T 반응 후에 심층 필터가 대량의 mRNA를 효과적으로 포획, 세척, 및 회수하였음을 나타낸다. 2가지 C/T 정상 유동 여과 각각에 대한 단계 수율은 90%를 초과하였다. 본원에 기술된 바와 같은 정상 유동 여과 정제 공정을 사용하여 제조된 mRNA의 무결성은 예상치 및 참조 표준 품질과 일치하였는데, 이는 심층 필터 정제가 무결성에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 이는, 심층 필터 기반 정제 공정이 캡핑 및 테일링 반응에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 추가로 보여주었다. 캡핑 백분율 및 꼬리 길이는 기준과 일치하였다. 마지막으로, 침전 1 또는 침전 2 후에 잔류 캡핑 또는 테일링 효소 밴드가 검출되지 않았는데, 이는 심층 필터가 이들 효소뿐만 아니라 염과 짧은 미성숙 RNA 종의 제거를 용이하게 하는 데 효과적이었음을 나타낸다.
요약하면, 본 실시예는 본원에 기술된 바와 같은 정상 유동 여과 공정을 사용하여 정제된 대량의 mRNA(예: CFTR mRNA)가 높은 순도와 무결성을 가지며, 임상 용도에 적합한 대규모로 생산될 수 있음을 입증한다.
실시예 4. 100 g 배치 mRNA 정제를 위한 정상 유동 여과의 평가
이 실험에서는, 심층 필터를 사용해 정상 유도 여과를 수행하여, 100 그램의 IVT 합성되고 캡핑 및 테일링된 (C/T) CFTR mRNA를 정제하였다. 전체 공정 단계에 대한 요약이 표 8에 기술되어 있는데, 각각의 정제 단계(표 8의 IVT 정제 및 C/T 정제 단계)에서 수행된 정상 유동 여과 정제가 함께 기술되어 있다.
100 g CFTR mRNA 배치 제조 공정
공정 단계 설명
IVT 반응 시험관 내 전사 반응
IVT 정제 5 M GSCN 및 에탄올 침전. 심층 필터(Clarisolve 60HX)를 사용한 포획, 세척 및 재용해.
IVT UF/DF 정용여과 및 한외여과를 통한 농축 및 완충액 교환.
C/T 캡핑 및 테일링 반응.
C/T 정제물 5 M GSCN 및 에탄올 침전. 심층 필터(Clarisolve 60HX)를 사용한 포획, 세척 및 재용해.
C/T UF/DF 정용여과 및 한외여과를 통한 농축 및 완충액 교환.
멸균 필터 및 충진 멸균 여과, PETG 병에 충진, ≤-20℃에서 보관
각 정제 단계(즉, IVT 정제 및 C/T 정제)를 시작할 때, 5 M GSCN 완충액에 이어서 에탄올을 첨가하여 mRNA를 현탁액 중 미세 침전물로 침전시켰다. 그런 다음, 정제를 위해, 침전된 mRNA를 정상 유동 여과 시스템으로 옮겼다. 각각의 정제 단계에 대해, 0.66 m2의 Clarisolve 60HX 심층 필터(2 x 0.33 m2 process scale 모듈, CS60HX03F1-X)를 사용하여 100 그램의 mRNA를 정제하였으며, 필터 상에 로딩된 mRNA는 대략 150 g/m2였다.
각각의 정제 단계에 대해, 100 그램의 CFTR mRNA를 (1) 침전시키고, (2) 필터 시스템에 로딩하고(여기서, 침전된 mRNA가 필터에 의해 포획됨), (3) 80% 에탄올 완충액을 사용하여 필터 상에서 세척한 다음, (4) (필터 시스템을 통해 mRNA의 재순환시키는 것을 포함시켜) 여액으로 용해시켰다. 80% 에탄올 세척을 통해 mRNA로부터 모든 잔류 염을 제거하였는데, 이는 mRNA 1 그램 당 약 3 L의 80% 에탄올 세척으로 달성된 0.0 mS/cm의 여액 전도도에 의해 입증된다.
물 관류로 전환시켜 mRNA를 여액으로 용해시켰는데, 물은 대략 60분 동안 재순환시켜 회수율을 최대화하였고, mRNA는 그 이후에 여액으로서 회수하였다.
전술한 정상 유동 여과를 사용하여 정제된 CFTR mRNA의 100 g 배치의 경우, (예를 들어, 표 8의 모든 단계를 통해) 최종 양으로 97.9 그램의 mRNA를 회수하였다. 가공되는 mRNA의 양이 이처럼 대량인 것을 감안하면, 정제된 mRNA의 이러한 97.9% 회수율은 놀랍고 예상치 못한 것이었다.
정제된 mRNA의 품질을 여러 가지 척도에 의해 평가하였는데, 이에는, 잔여 효소 및 단백질 함량을 측정하기 위한 은 염색 겔, mRNA 무결성을 측정하기 위한 모세관 겔 전기영동, 및 캡핑 백분율 및 폴리 A 꼬리 길이를 측정하기 위한 공지된 기술이 포함된다. 결과를 하기 표 9에 나타낸다.
정제된 100 g CFTR mRNA의 품질
규모 (g) 수율 (g) 수율 (%) 잔류 효소 (겔) mRNA 무결성 (CGE) 캡1 (%) 꼬리 길이 (nt)
100 g 97.9 g 97.9 기준에 부합함 52.7% (기준에 부합함) 100% 해당 없음
요약하자면, 이들 결과는 심층 필터가 mRNA의 100 g 배치를 효과적으로 포획, 세척 및 회수하였음을 나타낸다. mRNA의 수율은 95%를 초과하였다. 본원에 기술된 바와 같은 정상 유동 여과 정제 공정을 사용하여 제조된 mRNA의 무결성은 예상치 및 참조 표준 품질과 일치하였는데, 이는 심층 필터 정제가 무결성에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 이는, 심층 필터 기반 정제 공정이 캡핑 및 테일링 반응에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 추가로 보여주었다. 캡핑 백분율 및 꼬리 길이는 기준과 일치하였다. 마지막으로, 정제된 mRNA에서 잔류 캡핑 또는 테일링 효소 밴드가 검출되지 않았는데, 이는 심층 필터가 mRNA의 100 그램 배치로부터 이들 효소뿐만 아니라 염과 짧은 미성숙 RNA 종의 제거를 용이하게 하는 데 효과적이었음을 나타낸다. 요약하면, 본 실시예는 본원에 기술된 바와 같은 정상 유동 여과 공정을 사용하여 mRNA(예: CFTR mRNA)의 100 그램 배치를 임상 용도에 적합한 수준의 고 순도 및 무결성으로 정제할 수 있음을 입증한다.
실시예 5: MUT mRNA의 정상 유동 여과 정제의 평가
이 실험에서는, 메틸말로닐-CoA 뮤타아제 단백질(MUT)을 코딩하는 전령 RNA(mRNA)의 정제를 위해, 심층 여과를 사용하는 정상 유동 여과를 평가하였다. Clarisolve 60HX 심층 필터를 사용하는 2가지 정상 유동 여과 단계를 포함하여, 하기 표 10에 기술된 단계들을 사용해 15 그램의 MUT mRNA를 제조하였다. 정제된 MUT mRNA의 중요한 품질 속성을 사용해 공정 성능 및 최종 원료 의약품 프로파일을 평가하였다.
15 g MUT mRNA 배치 제조 공정
공정 단계 설명
IVT 반응 시험관 내 전사 반응
IVT 정제 5 M GSCN 및 에탄올 침전. 심층 필터(Clarisolve 60HX)를 사용한 포획, 세척 및 재용해.
IVT UF/DF 정용여과 및 한외여과를 통한 농축 및 완충액 교환.
C/T 캡핑 및 테일링 반응.
C/T 정제물 5 M GSCN 및 에탄올 침전. 심층 필터(Clarisolve 60HX)를 사용한 C/T mRNA의 포획, 세척 및 재용해.
C/T UF/DF 정용여과 및 한외여과를 통한 농축 및 완충액 교환.
멸균 필터 및 충진 멸균 여과, PETG 병에 충진, ≤-20℃에서 보관
IVT 정제 및 C/T 정제 단계 각각에 대해, mRNA 로딩 필터가 아래 표 11에 기술되어 있다.
정제 단계 동안의 mRNA 로딩
파라미터 IVT 정제
(캡핑되지 않은 mRNA)		 C/T 정제물
(캡핑되고 테일링된 mRNA)
심층 필터 카탈로그 # CS60HX01F1-X CS60HX01F1-X
총 표면적 (m2): 0.11 0.11
로딩된 mRNA (g) 15.0 18.6
조정된 로딩 (g/m2) 136 169
각각의 정제 단계에서 심층 필터를 사용하여 mRNA를 정제하는 단계에는, 다음의 3가지 공정을 mRNA의 침전 후에 포함시켰다: (1) 침전된 mRNA를 로딩하는 공정, (2) 포획된 mRNA의 세척하는 공정, 및 (3) 멤브레인으로부터 mRNA를 용리하는 공정. 각각의 개별 공정의 결과는 아래에 추가로 기술된다.
(1) 침전된 mRNA의 로딩
제조된 mRNA(캡핑하지 않은 것 및 캡핑한 것)를 먼저 변성시키고, 원하는 시간 동안 연속 혼합 조건 하에서 정의된 비율의 GSCN/에탄올 용액에 침전시킨 다음, 미리 컨디셔닝한 Clarisolve 60HX 심층 필터 장치를 통해 침전된 용액을 펌핑하여 필터 멤브레인 상에 침전된 mRNA를 포획한다. 여액 샘플을 빈번한 간격으로 수집하였으며, 침전된 mRNA의 유실은 관찰되지 않았다.
(2) 완충액과 염을 제거하기 위한 80% 에탄올 세척
IVT 정제 및 C/T 정제 단계 각각에 경우, 침전된 mRNA를 로딩한 후, 80% v/v 에탄올 용액으로 필터 시스템을 헹구어 완충액, 염, 및 다른 공정 잔류 효소를 제거하였다. 도 17은 80% v/v 에탄올 용액 볼륨으로 연속 세척할 때의 여액 전도도로 측정했을 때 잔류 염의 측정치를 제공한다. 잔류 염의 제거 추세는 두 가지 정제 단계 모두에 대해 일치하였다. 대략 2.5 L/g의 80% 에탄올 후에 0.0 mS/cm의 여액 전도도가 달성되었다. 재순환 전에 총 1.5 L/g의 80% 에탄올을 관류시켰다. 0.0 mS/cm에 도달하기 위해 필요한 에탄올 관류 볼륨은 이전의 규모가 작을 때와 비슷하였다. 이는, 이러한 80% 에탄올 관류가 필터와 침전된 mRNA로부터 잔류 염을 효과적으로 제거하였음을 입증한다.
(3) mRNA의 회수
IVT 정제 및 C/T 정제 단계 각각의 경우, 37℃의 RNase-무함유 물을 재순환시켜 심층 필터로부터의 mRNA를 회수하였고, 여액 풀의 mRNA 농도를 빈번하게 측정하여 포화 지점을 결정하였다. 포화 수준에 도달한 후, 여액 풀을 신선한 RNase-무함유 물로 대체하여 나머지 mRNA를 용리시켰다. 이 단계는 여액 풀 내의 mRNA의 농도가 무시할 수 있을 정도가 될 때까지 수행하였다. 도 18a 및 도 18b는 (농도 측면에서) 여액 중 mRNA의 회수를 재순환 시간의 함수로서 보여준다.
도면에 도시된 바와 같이, 여액 mRNA 농도는 재순환 25분 후에 안정화되었다. 이는, 각각의 침전 후, 침전된 mRNA가 성공적으로 재용해되었고 심층 필터로부터 성공적으로 회수되었음을 보여주는데, 이는 생성물이 심층 필터 매질 내에 잔류되었다는 것, 및 80% 에탄올 관류의 효과를 추가로 나타낸다.
mRNA 수율
표 10에 기술된 바와 같이 모든 제조 공정 단계에 걸쳐 mRNA에 대한 총 수율은 mRNA 15g의 IVT 반응 이후 mRNA의 시작 표적 질량을 기준으로 95%를 초과하였는데, 캡 및 3' 꼬리의 첨가로 인해 C/T 반응 후 질량이 10% 증가한 것으로 가정하였다.
분석 결과 정제된 mRNA의 품질을 여러 가지 척도에 의해 평가하였는데, 이에는, mRNA 무결성을 측정하기 위한 모세관 겔 전기영동(CGE), 및 캡핑 백분율 및 폴리 A 꼬리 길이를 측정하기 위한 공지된 기술이 포함된다. 표 10에 기술된 바와 같은 두 가지 정상 유동 여과 단계를 포함하는 제조 단계 후, MUT mRNA의 무결성 및 꼬리 길이를 평가하는 전기영동도가 도 19에 도시되어 있다. 2회의 침전(IVT 및 C/T) 후의 심층 필터 물질에 대한 전기영동도는 기대치와 일치하였다. 유의한 숄더가 관찰되지 않았으며, 이는 심층 필터 공정이 mRNA의 품질과 무결성에 악영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 도말 분석 결과는 하기 표 12에 나타냈다.
정제된 MUT mRNA 원료 의약품의 도말 분석
샘플 종류 주요 피크 (%) 숄더 (%)
원료 의약품 - 심층 필터 80 18
대조군 샘플 78 20
꼬리 길이 분석은 표 13에 요약되어 있다. 작제물 크기 및 꼬리 길이는 기대치와 일치한다.
MUT mRNA 원료 의약품의 꼬리 길이 분석
샘플 평균 크기 (nt) 꼬리 길이 (nt)
IVT 2577 해당 없음
원료 의약품 2923 380
캡핑 검정의 결과를 표 14에 나타냈다. 캡핑 백분율은 기대치와 일치했다.
MUT mRNA 원료 의약품에 대한 캡핑 효율
캡 종 백분율 (%)
캡핑 없음 5
캡 0 0
캡 G 0
캡 1 95
mRNA 순도 및 잔류 효소를 평가하는 은 염색 분석은 도 20에 도시되어 있다. 1 mg/mL 및 2 mg/mL 농도 모두에서 C/T 침전(레인 3~6) 후 심층 여과를 통해 정제된 물질에 대해 잔류 효소 밴드가 관찰되지 않았는데, 이는 잔류 효소를 제거하는 데 있어서 심층 필터 공정이 효율이 있음을 나타낸다.
요약하면, IVT 및 C/T 반응 후 심층 필터를 통해 mRNA를 효과적으로 포획, 세척, 및 회수하여 고도로 순수한 mRNA 원료 의약품을 수득하였다. 이들 정제 단계를 이용한 전체 공정 수율은 95%를 초과하였다.
심층 필터 기반 정제 공정에 의해 제조된 mRNA의 무결성은 예상치 및 참조 표준과 일치하였는데, 이는 심층 필터 정제가 무결성에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 또한, 심층 필터 기반 정제 공정은 캡핑 및 테일링 반응에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 캡 백분율 및 꼬리 길이는 기대치 및 분석 사양 이내였다. 또한, 잔류 효소 밴드는 침전 단계 후에 검출되었는데, 이는 심층 필터가 잔류 공정 효소의 제거를 용이하게 하여 mRNA의 순도를 개선하는 데 효과적이었음을 나타낸다.
균등물
당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에서 설명되는 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되도록 의도되는 것이 아니라, 오히려 하기의 청구범위에서 기재된 바와 같다.

Claims (96)

  1. RNA(mRNA)를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) mRNA의 제조 단계에서 생긴 하나 이상의 오염물을 포함하는 용액으로부터 mRNA를 침전시켜 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액을 제공하는 단계;
    (b) 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액을 필터에 적용하는 단계로서, 침전된 mRNA는 필터에 잔류하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 필터에 의해 잔류된 침전된 mRNA를 용해시켜, 정제된 mRNA가 필터를 통과할 수 있게 하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)에서 정제된 mRNA를 회수하는 단계를 포함하되;
    단계 (b) 및 (c) 각각은 정상 유동 여과를 사용하여 수행되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제조 단계는 mRNA의 시험관 내 전사(IVT) 합성을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제조 단계는 mRNA의 5'-캡핑 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조 단계는 mRNA의 3'-테일링 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 오염물은 효소를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 효소는 중합효소인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 효소는 캡핑 효소인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 오염물은 염을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 오염물은 짧은 미성숙 전사체를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 필터 상에 잔류된 침전된 mRNA를 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 멤브레인 필터 또는 심층 필터인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 필터는 심층 필터인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 주름 필터, 래핑된 필터, 또는 캡슐 필터의 포맷을 갖는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 필터 스크린을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 불활성 물질로 만들어지는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 폴리프로필렌인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 변형된 폴리에테르 술폰(mPES)인, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 폴리에테르 술폰(PES)인, 방법.
  19. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)인, 방법.
  20. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 셀룰로오스인, 방법.
  21. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 규조토인, 방법.
  22. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)인, 방법.
  23. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 니트로셀룰로오스인, 방법.
  24. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 폴리에틸렌인, 방법.
  25. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 폴리아크릴로니트릴인, 방법.
  26. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 폴리카보네이트인, 방법.
  27. 제15항에 있어서, 불활성 물질은 나일론인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 하나 이상의 3차원 매트릭스를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 3차원 매트릭스는 펠트 매트릭스인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 펠트의 두께는 1 내지 10 mm 범위인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 펠트의 두께는 1 내지 5 mm 범위인, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 적어도 2개의 3차원 매트릭스를 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 적층식 3차원 매트릭스를 포함하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 용해된 오염물을 통과시키면서 침전된 mRNA의 잔류를 용이하게 하는 평균 기공 크기를 갖는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 평균 기공 크기는 0.001 μm 내지 500 μm, 0.01 μm 내지 200 μm, 또는 0.05 μm 내지 100 μm인, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 평균 기공 크기는 0.05 μm 이상인, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 평균 기공 크기는 0.5 μm 이상인, 방법.
  38. 제34항에 있어서, 평균 기공 크기는 5 μm 이상인, 방법.
  39. 제34항에 있어서, 평균 기공 크기는 10 μm 이상인, 방법.
  40. 제34항에 있어서, 평균 기공 크기는 20 μm 이상인, 방법.
  41. 제28항에 있어서, 평균 기공 크기는 25 μm 이상인, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 필터 상에 분포된 mRNA의 양에 대해 겔 층을 제공하지 않는 총 표면적을 갖는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 현탁액에 첨가되는 분산제를 필요로 하지 않는, 방법.
  44. 제10항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 하나 이상의 염 세척액으로 침전된 mRNA를 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제10항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매를 사용해 수행되는 1회 이상의 세척을 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 에탄올을 포함하는 하나 이상의 세척제를 포함하는, 방법.
  47. 제10항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 유기 용매를 포함하는 세척제를 포함하지 않는, 방법.
  48. 제10항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 하나 이상의 세척제를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 하나 이상의 세척제는 각각 50 센티스트로크 이하의 점도를 갖는, 방법.
  50. 제10항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 트리에틸렌 글리콜(TEG)을 포함하는 하나 이상의 세척제를 포함하는, 방법.
  51. 제10항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 mRNA를 세척하는 단계는 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(MTEG)를 포함하는 하나 이상의 세척제를 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 유동 여과는:
    일정한 유동;
    일정한 압력;
    가변 유동;
    가변 압력;
    위킹에 의한 유동; 및
    중력 제어 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 유동 여과는 1회용 시스템 및/또는 필터를 포함하는, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 유동 여과는 여러 번 사용하기 위한 시스템 및/또는 필터를 포함하는, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 단계는:
    물/완충액의 재순환;
    물/완충액의 1회 관류; 및
    물/완충액의 역 방향 관류 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 대사 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 효소인, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 수용체 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  60. 제56항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 분비된 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  61. 제56항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 분비되지 않은 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 시토졸 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  63. 제61항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 핵 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  64. 제61항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 미토콘드리아 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  65. 제61항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 리소좀 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  66. 제61항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 소포체 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  67. 제61항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 골지 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  68. 제61항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 구조막 단백질 또는 펩티드인, 방법.
  69. 제56항에 있어서, 단백질 또는 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  70. 제56항에 있어서, 단백질 또는 펩티드는 항원인, 방법.
  71. 제56항에 있어서, 단백질은 CFTR 단백질인, 방법.
  72. 제56항에 있어서, 단백질은 OTC 단백질인, 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 회수된 총 정제된 mRNA는 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 수율을 초래하는 양으로 회수되는, 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 총 정제된 mRNA는 적어도 약 90%의 수율을 초래하는 양으로 회수되는, 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA는 추가 정제 없이 임상 등급 순도를 갖는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하거나, 단백질 오염물이 실질적으로 없는, 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만의 염 오염물을 포함하거나, 염 오염물이 실질적으로 없는, 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 짧은 미성숙 전사체를 포함하거나, 짧은 미성숙 전사체가 실질적으로 없는, 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 무결성을 갖는, 방법.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 임상 등급 순도는 HPLC 정제, 리간드 또는 결합 기반 정제, TFF 정제, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피로부터 선택된 추가 정제 없이 달성되는, 방법.
  81. 전령 RNA(mRNA)를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) mRNA의 제조 단계에서 생긴 하나 이상의 오염물을 포함하는 용액으로부터 mRNA를 침전시켜 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액을 제공하는 단계;
    (b) 침전된 mRNA를 포함하는 현탁액을 대상으로, 정상 유동 여과의 하나 이상의 단계로 본질적으로 이루어진 정제 시스템을 거치게 하여 mRNA를 정제하는 단계를 포함하되;
    정제된 mRNA는 추가 정제 없이 임상 등급 순도를 갖는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하거나, 단백질 오염물이 실질적으로 없는, 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만의 염 오염물을 포함하거나, 염 오염물이 실질적으로 없는, 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA는 HPLC에 의해 결정했을 때 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 짧은 미성숙 전사체를 포함하거나, 짧은 미성숙 전사체가 실질적으로 없는, 방법.
  85. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA는 모세관 전기영동에 의해 결정했을 때 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 무결성을 갖는, 방법.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 임상 등급 순도는 HPLC 정제, 리간드 또는 결합 기반 정제, TFF 정제, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피로부터 선택된 추가 정제 없이 달성되는, 방법.
  87. 시험관 내 전사(IVT) 합성에 의해 제조된 100 gm 이상의 mRNA를 포함하는 조성물을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은:
    IVT 합성 단계에서 생긴 하나 이상의 오염물을 포함하는 IVT-전사 mRNA를 침전시켜 현탁액을 생성하는 단계;
    침전된 mRNA 및 오염물을 포함하는 현탁액을 대상으로 필터를 통한 정상 유동 여과를 거치게 하는 단계로서, 침전된 mRNA는 필터에 의해 잔류되는 단계;
    mRNA를 필터로부터 용액으로 회수하여, mRNA를 정제하는 단계를 포함하되,
    mRNA의 적어도 85%가 회수되고, 회수된 mRNA는 90% 이상의 무결성을 가지며, 단백질 오염물이 실질적으로 없는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 단백질 오염물은 중합효소인, 방법.
  89. 제87항에 있어서, 단백질 오염물은 캡핑 효소인, 방법.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 잔류된 침전된 mRNA를 포함하는 단계 (b)의 필터를 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA는 짧은 미성숙 전사체 오염물이 실질적으로 없는, 방법.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 최대 약 264 평방미터 이상의 총 표면적을 포함하는, 방법.
  93. 제87항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 최대 약 528 평방미터 이상의 총 표면적을 포함하는, 방법.
  94. 제87항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 필터는 최대 약 1056 평방미터 이상의 총 표면적을 포함하는, 방법.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항의 방법을 사용해 정제된 mRNA를 포함하는 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
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