JP2003527821A - 細胞から非染色体核酸分子を精製するための方法 - Google Patents

細胞から非染色体核酸分子を精製するための方法

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JP2003527821A JP2000565117A JP2000565117A JP2003527821A JP 2003527821 A JP2003527821 A JP 2003527821A JP 2000565117 A JP2000565117 A JP 2000565117A JP 2000565117 A JP2000565117 A JP 2000565117A JP 2003527821 A JP2003527821 A JP 2003527821A
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acid molecule
chromosomal nucleic
chromosomal
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デニス エム. ミッテルスタエド,
デイビッド チ―タン ス,
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カイロン コーポレイション
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

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Abstract

(57)【要約】 細胞から非染色体核酸分子を精製するための方法が提供される。この方法は、以下の一般的工程を包含する:(a)核酸含有溶解物を形成するために細胞を溶解する工程、および(b)精製した非染色体核酸分子を含有する清澄化溶液を得るために、デプスフィルターに溶解物を適用する工程。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (技術分野) 本発明は、一般に生物工学に、より詳細には、細胞溶解物から非染色体核酸分
子を精製するための方法に関する。
【0002】 (発明の背景) 1950年代に、核酸分子(DNAおよびRNA)の構造の発見から、構造、
機能およびこれらの分子の使用の研究が劇的に増加している。特に、疾患を診断
および処置するためこれらの分子を利用するための膨大な量の研究が開始された
。しかし、実験における使用のため、そして疾患の診断および処置のための核酸
の十分量を得るためには、まず、かなりの量の核酸分子が精製されおよび/また
は単離される必要がある。例えば、遺伝子治療の分野では、疾患に対して防御す
るかまたは治療するため、患者は核酸分子でワクチン接種されるかまたは処置さ
れ得る(例えば、PCT公開WO 95/07994を参照のこと)。しかし、
大量の精製した製薬等級の核酸分子の調製は現在、時間を浪費し、そして費用が
かさむ。
【0003】 より詳細には、核酸分子の精製のためには多くの方法が存在するが、このよう
な方法は、この核酸分子が治療目的に生成される場合は、しばしば制限される。
なぜなら、それらは、毒性化合物および抗原性分子のような任意の混入物なしに
調製されねばならないからである。DNA精製の先行技術の方法は、しばしば、
臭化エチジウム、フェノール、クロロホルムおよび塩化セシウムのような非常に
毒性の化合物を利用した(Sambrookら、1992、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual(第2版)、Co
ld Spring Harbor,NY)。さらに、物理的溶解または化学的
溶解の両方を含む多くの方法は、しばしば細胞細片を除去するために遠心分離に
依存した。この工程は、無菌性を維持することが困難であるため所望されない。
さらに、アルカリ溶解を用いる手順(BirnboimおよびDoly、Nuc
leic Acids Res.7;1513,1979)は、pHの増加によ
り生じる分解を通じて、大量のDNAの損失を導き得る。
【0004】 本発明は、薬学適用に、そして大量に用いるのに適切な精製した核酸分子を生
成するための方法を提供する。このような方法は、毒性の抽出剤、変異原性の試
薬または遠心分離のような工程のような伝統的技術を必要としない。本発明はま
た他の関連する利点も提供する。
【0005】 (発明の要旨) 簡略に言えば、本発明は、細胞から非染色体核酸分子を精製するための方法を
提供する。この方法は、以下の一般的工程を包含する:(a)細胞を溶解して核
酸分子含有溶解物を形成する工程、(b)綿状溶液(flocculent s
olution)を形成するために、この溶解物から染色体DNAおよび細胞壁
成分を沈殿させる工程;および(c)非染色体核酸分子が精製されるように、デ
プスフィルターに綿状溶液を適用する工程。
【0006】 さらなる実施態様において、非染色体核酸分子は、非染色体核酸分子をクロマ
トグラフィー分離する工程により(例えば、イオン交換クロマトグラフィーまた
は分離用HPLCにより)、溶解物中のタンパク質および他の化合物から、さら
に単離され得る。他の実施態様では、この清澄化した溶液は、(例えば、遠心分
離または接線方向流により)濃縮され得る。なお他の実施態様では、本明細書に
おいて記載された精製方法および/または単離方法は、滅菌環境および/または
連続的な様式で実行され得る。
【0007】 本明細書において提供される方法は、種々の非染色体核酸分子(例えば、プラ
スミドおよびRNAを含む)を精製および/または単離するために利用され得る
【0008】 本発明の特定の実施態様において、デプスフィルターは、約0.2ミクロンと
20ミクロンとの間の公称孔径を有する、他の実施態様において、非染色体核酸
分子は、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムのような中和剤を利用して沈殿され
る。
【0009】 本明細書において提供される方法は、広範な種々の細胞(例えば、細菌細胞、
酵母細胞および哺乳動物細胞(すなわち、真核生物細胞および非核質細胞)を含
む)から非染色体核酸分子を精製および/または単離するために利用され得る。
【0010】 本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面
を参照して明白となる。さらに種々の参考文献が本明細書に記載されており、こ
れらは、特定の手順または組成物(例えば、プラスミドなど)をより詳細に記載
しており、従ってその全体が参考として援用される。
【0011】 (発明の詳細な説明) (定義) 発明を記載する前に、本明細書中、以降において用いる特定の用語の定義をま
ず記載することが、その理解のために、有益であり得る。
【0012】 「デプスフィルター(depth filter)」とは、所定の媒体から選
択した大きさの粒子を排除し得るフィルターをいう。デプスフィルターは、(メ
ンブレンフィルターと逆に)、媒体のマトリックス内に粒子を捕獲する(メンブ
レンフィルターでは、主に媒体の表面であるのに比較して)ことにより媒体から
粒子を排除する。デプスフィルターは、代表的に繊維性の媒体、通常、セルロー
ス、ガラス繊維、またはポリプロピレン(またはそれらの組み合わせ)からなる
【0013】 「精製した」非染色体核酸分子とは、本発明の文脈において用いる場合、細胞
細片および染色体DNAを実質的に含まない(すなわち、600nmで分光光度
計分析により決定する場合0.010、好ましくは0.005、0.002、ま
たは0.001未満の吸光度を有する)核酸分子をいう。
【0014】 「単離した」非染色体核酸分子とは、本発明の文脈において用いる場合、直線
化され、かつアガロースゲルに適用されて、適切な電圧の印加の際に、核酸分子
単一の広いバンドのを形成する、核酸分子の調製物をいう。核酸分子が直線化さ
れていない場合、スーパーコイル化した核酸(ダイマーまたはオリゴマー)、弛
緩した核酸および/または直線状核酸の広いバンドまたは3つの別の狭いバンド
が得られる。タンパク質含量が10μg/ml未満、そして好ましくは5、2、
または1μg/ml未満であることを確認するために、タンパク質アッセイも実
行され得る。
【0015】 上記のように、本発明は、細胞から非染色体核酸分子を精製するための方法を
提供する。この方法は、以下の一般的工程を包含する:(a)細胞を溶解して核
酸分子含有溶解物を形成する工程、(b)綿状溶液を形成するために、この溶解
物から染色体DNAおよび細胞壁成分を沈殿させる工程;および(c)非染色体
核酸分子が精製されるように、デプスフィルターにこの綿状溶液を適用する工程
。手短には、細胞の溶解に起因して形成される細胞細片および他の沈殿物を除去
するため、デプスフィルターを利用することにより、当業者は、伝統的な分離工
程(遠心分離、またはメンブレンフィルター(例えば、Watman紙)または
チーズクロスを通す濾過)の必要なく非染色体核酸分子を容易に精製し得る。こ
のような方法は、ポリエチレングリコールまたは有機抽出物(例えば、フェノー
ルまたは臭化エチジウム)の使用なく、用意に達成され得る。
【0016】 本発明のさらなる理解のため、以下の記載に、細胞溶解工程、染色体DNAお
よび細胞壁成分沈殿工程、ならびに得られた綿状溶液を濾過する工程についての
方法を手短に考察する。さらに、精製した非染色体核酸分子をさらに単離および
/または濃縮するための方法が提供される。また、研究および薬学的適用におい
て使用する際の考察が提供される。
【0017】 (細胞溶解工程) 本発明の方法を利用して、非染色体核酸分子を、例えば、哺乳動物(例えば、
ヒト、ラットおよびマウス)細胞および非哺乳動物(例えば、細菌、酵母、また
は昆虫)細胞の両方を含む、広範な種々の細胞から精製し得る。簡略には、最初
の工程は、細胞質タンパク質およびプラスミドを含有する溶解物を形成するため
に細胞を溶解することである。細胞を溶解するために、広範な種々の方法、例え
ば、物理的方法(例えば、ホモジナイゼーション、超音波処理またはフレンチプ
レスの使用)ならびに化学的方法(例えば、化学溶解)および酵素的方法(例え
ば、リゾチーム)を利用し得る。
【0018】 簡略には、細胞をホモジナイズするために、細胞性物質を、乳鉢および乳棒ま
たはブレンダーを用いて初めにブレンドする。代表的には、細菌から非染色体核
酸分子の精製のためには、細菌ペレットを溶液中に再懸濁し、乳鉢および乳棒ま
たはブレンダーを用いて細胞壁を破裂させる。ホモジナイズの代替法の1つはフ
レンチプレスである。簡略には、このようなプレスの中で、細胞ペレットを溶液
中に懸濁し、そして2つの硬性表面の間で圧搾する。一旦細胞壁が破裂すると、
細胞質タンパク質およびプラスミドを含有する細胞成分が放出される。
【0019】 細胞を超音波処理するため、細胞を超音波処置槽にいれるか、またはプローブ
型の振動子を細胞を含む容器に入れる。適切な超音波処理器の代表例としては、
Sonifier II(登録商標)Cell Disrupter(Bran
son)、またはUltrasonic Cleaner(Branson)が
挙げられる。
【0020】 化学的溶解は、種々の方法により容易に達成され得る。例えば、1つの実施態
様において、細菌ペレットを緩衝液中に懸濁する。この溶液を、0.2M Na
OHおよび1%SDS(または当量)と迅速にかつ完全に混合する。これを最大
5分間インキュベートさせる。次いで、この溶液を酢酸カリウムまたは酢酸ナト
リウムのいずれかで中和する。これにより細胞の細片およびゲノムDNAからな
る沈殿を形成する。この工程中に、遊離のRNAを減少させるためRNaseを
導入することも可能である。
【0021】 細胞はまた、リゾチームのような通常利用可能な酵素を用いる酵素的手段によ
り溶解され得る。
【0022】 細胞質タンパク質およびプラスミドを含有する溶解物を形成するために、上記
の任意の手順を利用して、細胞を溶解し得る。簡略には、これらの手順は、細胞
から遊離されているタンパク質またはプラスミドを生じ、主に細胞壁に大きな孔
を生じる。細胞細片および細胞内に捕捉された染色体DNAは沈殿を形成する。
この沈殿の分離は、必要な材料に依存して異なる方法により生じ得る。
【0023】 (綿状溶液から溶解物を沈殿させる工程) 綿状溶液から溶解物(例えば、細胞細片および染色体DNA)を沈殿させるた
めに広範な種々の方法が利用され得る。この方法には、例えば、化学的方法(例
えば、pH変化または塩の添加による)、または物理的方法(例えば、熱の使用
による)が挙げられる。例示としては、化学的溶解の間に、溶解緩衝液への水酸
化ナトリウムの添加により溶解物の高いpHが達成され得、その後、酢酸ナトリ
ウムまたは酢酸カリウムの添加により溶解物を中和し、そして細胞細片および染
色体DNAの沈殿を生じ得る。細胞の溶解のためにホモジナイゼーションを用い
る場合、溶解物を沈殿させるために、硫酸ストレプトマイシンまたは硫酸アンモ
ニウムのいずれかを用い得る。
【0024】 本明細書において提供される方法を用いて、綿状溶液の少なくとも5〜6リッ
トルを、10平方フィートの表面積を有する単一のフィルターを利用して処理し
得る。液体の処理をスケールアップするため、複数のフィルターを追加して、平
行して(あるいは、連続して)大量の液体を処理し得る。
【0025】 (溶解物の濾過工程) 上記のように、一旦、綿状溶液が生成されれば、この溶液をデプスフィルター
に適用する。上記のように、用語「デプスフィルター」は、所定の媒体から選択
したサイズの粒子を排除し得るフィルターをいう。デプスフィルターは、(メン
ブレンフィルターと逆に)媒体のマトリックス内に粒子を捕獲する(メンブレン
フィルターでは、主に媒体の表面であるのに比較して)ことにより媒体から粒子
を排除する。
【0026】 デプスフィルターは、代表的に繊維性の媒体、通常、セルロース、ガラス繊維
、またはポリプロピレン(またはそれらの組み合わせ)からなる。本発明におけ
る使用に適切なデプスフィルターは、例えば、GillmanのSartori
us Corporation(Edgewood、N.Y.)、Millip
oreから商業的に購入され得る。デプスフィルターはまた、米国特許第4,5
94,202号(「Method of Making Cylindrica
l Fibrous filter Structures」)、米国特許第4
,726,901号(「Cylindrical Fibrous Struc
ture With Graded Pore Size」と題される)、およ
び欧州特許 0148638(「Cylindrical Fibrous S
tructure and Method of Manufacture」と
題される)に記載される。
【0027】 このような技術を利用して、非染色体核酸分子は、従来の方法よりも実質的に
速い速度で、細胞1リットルあたり、少なくとも10、15、または25グラム
(湿重量)さえ、容易に精製され得る。さらに、本明細書において記載するプロ
セスは拡張可能であり、1、2、3、4、5リットル(またはより大量でも)の
細胞を溶解し、かつ非染色体核酸分子を濾過することを可能にする。例えば、5
リットル中で125グラム(湿重量)の細胞を、5〜10平方フィートの表面積
を有するデプスフィルターを用いて濾過し得る。
【0028】 (非染色体核酸分子を単離および/または濃縮する工程) 綿状溶液をデプスフィルターに適用した後、精製した非染色体核酸分子を含有
する得られた溶液を、必要に応じて、非染色体核酸分子を単離および/またはさ
らに濃縮するため、さらなる処理工程に適用し得る。
【0029】 例えば、クロマトグラフィー技術を利用して(例えば、イオン交換および/ま
たはサイズ排除クロマトグラフィー)、当業者らは、非染色体核酸分子を容易に
単離し得る。手短には、イオン交換は、DEAE樹脂またはQ樹脂のいずれかを
含むアニオンカラムを利用する。Qiagen,Santa Claritaは
、プラスミド精製におけるDEAE樹脂の使用のための特許を有する。一方、プ
ラスミドDNAにおける使用のための最初のQ樹脂の特許は、Biosepra
,Bostonによる。代替の樹脂での実験は、結果の一貫性を示している。イ
オン交換後に使用され得る、Puresyn,Bostonから入手可能なアフ
ィニティー樹脂もある。代表的には、クロマトグラフィー後のプラスミドDNA
の濃度は希釈される。
【0030】 精製したおよび/または単離した非染色体核酸の濃度はまた、沈殿および接線
方向流濾過(Tangential Flow Filtration)のよう
な技術を利用して達成され得る。
【0031】 簡略には、沈殿は、通常、溶液へのアルコール(例えば、イソプロパノールま
たはエタノール)の添加、その後の遠心分離を含む。プラスミドDNAは、ペレ
ットを形成し、次いでこれをエタノールでリンスし、そして風乾させる。次いで
プラスミドDNAは任意の緩衝液中に溶解され得る。
【0032】 接線方向流濾過は、カットオフサイズを制限すること、ならびに容積を減少す
ること、小粒子混入物を除去すること、および緩衝液交換として作用させること
の両方により使用され得る。接線方向流濾過を用いると、必要なカットオフサイ
ズは、スーパーコイル化したプラスミドの小型の特性に起因して、予期されるよ
りもかなり小さい。
【0033】 (精製または単離した核酸、および薬学的組成物の利用のための方法) 本発明の精製または単離した核酸分子は種々の用途を有する。例えば、本発明
の1つの実施態様において、単離した核酸分子は、診断アッセイに、あるいは治
療目的に利用され得る。
【0034】 治療目的で利用する場合、精製した核酸分子および/または単離した核酸分子
は、1つ以上の賦形剤、緩衝液または安定化剤とともにさらに処方され得る。さ
らに、核酸分子は代表的に、無菌、発熱物質なしの形態で、意図される目的の投
与に適切な用量で提供される。
【0035】 このような治療技術および方法の代表例は、PCT公開番号 WO 95/0
7994および同第WO 96/40952、ならびに米国特許第5,580,
859号および同第5,589,466号に提供される。
【0036】 以下の実施例は、例示の目的で提供され、そして限定の目的ではない。
【0037】 (実施例) (実施例1) (E.coli DH5−α細胞からのプラスミドDNAの精製) 本実施例は、E.coli DH5−α細胞からのプラスミド精製方法を示す
。簡略には、ELVS 1.5β−galプラスミド(WO 97/38087
を参照のこと)を含有するE.coli DH5−α細胞を、抗生物質カナマイ
シン(50mg/ml、Sigma,St.Louis,Mo)を含有する、リ
ン酸(Digene,Beltsville,Md)を有するDigeneスー
パーブロス中で増殖させた。この細胞を振盪浴中で37℃で20〜28時間イン
キュベートした。次いでこの細胞を2〜10℃で15分間、遠心分離(5000
×G)により回収した。この上清を廃棄し、そしてペレットを2リットルのP1
−RNase−A緩衝液(50mM Tris/HCl、10mM EDTA、
pH8.0(1リットルあたり100mg RNase−Aを含有)、Qiag
en,Santa Clarita,CA)中に再懸濁した。次いで、この細胞
を2.15リットルの溶解緩衝液P2(200mM NaOH、1% SDS、
Qiagen,Santa Clarita,CA)の添加により溶解した。こ
の細胞を、3のチュービングと連結した「Y」コネクターチューブ(図1を参照
のこと)を通して溶解緩衝液と接触させることにより、再懸濁した細胞を達成し
た。この混合の方法は、反転する必要がない。二重頭部の蠕動ポンプを用いて、
流体を流通させた。
【0038】 第2ポンプを用いて、P3緩衝液に対する溶解物の比が約2:1で同時に流量
を調節したこと以外は、3.0M酢酸カリウムpH5.5を含有するP3緩衝液
(Qiagen,Santa Clarita,CA)を、類似の型の「Y」コ
ネクターチューブを通じて、上記の溶解した細胞に添加した。この溶液は沈殿を
形成し、そしてこの溶液を最短30分間、氷上でインキュベートをさせた。
【0039】 Sartopure PP2 0.5mデプスフィルターカプセル(Sart
orius,Inc.,Yauca,P.R.)を通じて、沈殿した溶液を直接
ポンピングした。Endotoxin Removal(ER)Buffer(
Qiagen,Santa Clarita,CA)を濾過したプールに添加し
均一に混合することにより、内毒素を除去した。
【0040】 最短1時間の氷上でのインキュベーション後、ER緩衝液および濾過した溶解
物プールの組み合わせをクロマトグラフィーユニットであるイオン交換カラム(
Ultrapure 100,Qiagen,Santa Clarita,C
A)に移した。実行サイクルを、QC緩衝液(1M NaCl、50mM MO
PS、15%エタノール、pH7.0)での洗浄の18時間前には、5mL/分
の流速に、2時間半では20ml/分の流速に設定した。プラスミドをQN緩衝
液(1.6M NaCL、50mM MOPS,15%エタノール、pH7.0
)で溶出した。次いで、このプラスミドを最終濃度42%のイソプロパノールで
沈殿し、2〜8度で13,000×Gで60分間、遠心分離し、70%エタノー
ルで洗浄し、そしてTE(10mM TRIS−HCl、1mM EDTA)中
に再懸濁した。引き続き、Pierce Protein Microassa
yを利用する分析により、1.25μg/ml未満のタンパク質を検出した。
【0041】 前述から、本発明の特定の実施態様が例示の目的で本明細書に記載されている
が、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ること
が理解される。従って、本発明は添付の特許請求の範囲による以外には限定され
ない。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、本発明の代表的精製方法の1つの略図である。
【図2】 図2は、沈殿した細片の除去を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),CA,JP Fターム(参考) 4B024 AA20 CA01 CA11 DA06 EA04 GA19 HA20

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 細胞から非染色体核酸分子を精製するための方法であって、
    以下: a)細胞を溶解して核酸分子含有溶解物を形成する工程; b)綿状溶液を形成するために、該溶解物から染色体DNAおよび細胞壁成分
    を沈殿させる工程;および c)非染色体核酸分子が精製されるように、デプスフィルターに該綿状溶液を
    適用する工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項2】 前記溶解工程が細胞をホモジナイズする工程により達成され
    る、請求項1に記載の方法
  3. 【請求項3】 前記溶解工程が化学的溶解により達成される、請求項1に記
    載の方法。
  4. 【請求項4】 前記精製した非染色体核酸分子をクロマトグラフィー単離す
    る工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項5】 前記精製した非染色体核酸分子がイオン交換カラム上で分離
    される、請求項4に記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記精製した非染色体核酸分子を濃縮する工程をさらに包含
    する、請求項1に記載の方法。
  7. 【請求項7】 前記精製した非染色体核酸分子が接線方向流により濃縮され
    る、請求項4に記載の方法。
  8. 【請求項8】 前記非染色体核酸分子がプラスミドである、請求項1に記載
    の方法。
  9. 【請求項9】 前記非染色体核酸分子がRNAである、請求項1に記載の方
    法。
  10. 【請求項10】 前記デプスフィルターが0.2ミクロンと20ミクロンと
    の間の公称孔径を有する、請求項1に記載の方法。
  11. 【請求項11】 前記工程a)〜c)のいずれか1つが無菌環境で実行され
    る、請求項1に記載の方法。
  12. 【請求項12】 前記工程a)〜c)のいずれか1つが連続様式で実行され
    る、請求項1に記載の方法。
  13. 【請求項13】 前記細胞が細菌である、請求項1に記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記細胞が真核生物細胞である、請求項1に記載の方法。
JP2000565117A 1998-08-10 1999-07-30 細胞から非染色体核酸分子を精製するための方法 Pending JP2003527821A (ja)

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US09/363,209 1999-07-29
US09/363,209 US6268492B1 (en) 1998-08-10 1999-07-29 Methods for purifying non-chromosomal nucleic acid molecules from cells
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